Artykuł metodologiczny

Opracowanie modelu przewlekłego uszkodzenia stożka rotatorów u królika do badania zwłóknienia i zwyrodnienia mięśniowego

DOI:

10.3791/64828

⸱

31 marca 2023

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Institute for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 3Center for Neuromusculoskeletal Restorative Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 4Key Laboratory for Regenerative Medicine, Ministry of Education, School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 5Department of Orthopaedics and Traumatology, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie szczegółowo opisuje procedury ustalania przewlekłego uszkodzenia stożka rotatorów u królika (RC). W szczególności uraz powstaje w jednostce mięśniowo-ścięgnistej / mięśniowo-ścięgnistej podłopatkowej (SSC), aby naśladować ludzką anatomię i patofizjologię RC, w tym ciężkie zwyrodnienie tłuszczowe mięśni (FD). Protokół ten może być stosowany do badania urazów RC i oceny terapii regeneracyjnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patofizjologia stożka rotatorów królika (RC) może prowadzić do postępujących i wysoce zwyrodnieniowych zmian w związanych z nim mięśniach i ścięgnach, co negatywnie wpływa na klinicznie istotne parametry, takie jak siła i retrakcja mięśnia-ścięgna/mięśniowo-ścięgnistego, ostatecznie powodując utratę funkcji barku i negatywnie wpływając na wyniki naprawy RC. Modele zwierzęce, które naśladują aspekty anatomii i patofizjologii RC człowieka, mają kluczowe znaczenie dla pogłębienia koncepcyjnego zrozumienia progresji urazów oraz opracowania skutecznych terapii opartych na inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej.

W tym kontekście, model podłopatkowy królika (SSC) jest odpowiedni ze względu na (i) jego anatomiczne podobieństwo do ludzkiej jednostki nadgrzebieniowo-mięśniowej kości, ścięgna i mięśnia nadgrzebieniowego, która jest najczęściej uszkadzonym miejscem RC; (ii) jego patofizjologiczne podobieństwo do człowieka pod względem zwłóknienia i zwyrodnienia tłuszczowego mięśni (FD); oraz (iii) jego przydatność do zabiegów chirurgicznych. Dlatego celem niniejszej pracy jest opisanie technik chirurgicznych wywoływania urazu RC SSC. Krótko mówiąc, procedura polega na izolacji SSC poprzez identyfikację mięśnia kruczo-bolesnego, a następnie transsekcję pełnej grubości na połączeniu mięśniowo-ścięgnistym i owinięcie wolnego końca połączenia mięśniowo-ścięgnistego rurką Penrose'a na bazie silikonu, aby zapobiec spontanicznemu ponownemu przyczepieniu. Oceny histologiczne są wykonywane w celu monitorowania postępu FD mięśni po 4 tygodniach od operacji przy użyciu hematoksyliny i eozyny (H&E), a także barwienia trichromem Massona.

Utrata mięśni i FD były widoczne 4 tygodnie po przecięciu połączenia mięśniowo-ścięgnistego SSC, podobnie jak w stanach patofizjologicznych u ludzi. Protokół ten demonstruje kroki do pomyślnego ustanowienia chronicznego modelu urazów RC SSC u królika, który może służyć jako potężne narzędzie do badania zmian w mięśniach szkieletowych związanych z patofizjologią RC i pomóc w opracowaniu nowych strategii terapeutycznych dla przewlekłych łez RC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewlekłe naderwania stożka rotatorów (RC) charakteryzują się zmianami zwyrodnieniowymi mięśni i ścięgien, w tym zanikiem mięśni, nagromadzeniem tkanki tłuszczowej i zwłóknieniem, co może zagrozić wynikowi naprawy RC i ostatecznie spowodować ból i dysfunkcję barku1,2,3,4,5. Aby lepiej zrozumieć patogenezę łez RC i poprawić wyniki chirurgiczne, kluczowe jest opracowanie odpowiednich modeli zwierzęcych, które mogą naśladować aspekty anatomii i patofizjologii RC człowieka. W szczególności modele urazów RC powinny spełniać następujące kryteria: (i) brak spontanicznego gojenia się po urazie; (ii) zawierają znaczącą obecność zwłóknienia, zaniku mięśni i nagromadzenia tkanki tłuszczowej; oraz (iii) mieć odpowiedni rozmiar, aby umożliwić przybliżenie technik chirurgicznych stosowanych u ludzi6.

W tym kontekście, mięsień podłopatkowy królika (SSC) może być używany jako dokładny i wiarygodny model zwierzęcy do badania patofizjologii RC, biorąc pod uwagę jego unikalną anatomię, patofizjologiczną reakcję i właściwości biomechaniczne7. Rzeczywiście, anatomia SSC RC królika jest podobna do ludzkiego nadgrzebieniowego RC (SSP), który jest jednostką mięśniowo-ścięgnistą najczęściej związaną z urazem wynikającym z przeciążenia8,9. W szczególności kompleks ścięgna SSC królika przechodzi przez tunel kostny i pod mięśniem kruczo-ramiennym, co jest analogiczne do sytuacji u ludzi, gdzie kompleks ścięgna SSP przechodzi przez podbarkowy tunel kostny i pod więzadłem kruczo-ramiennym7. To anatomiczne podobieństwo powoduje, że SSC królika przechodzi podobne ruchy mięśniowo-szkieletowe jak ludzki SSP, w którym ścięgno przemieszcza się pod wyrostkiem barkowym podczas podnoszenia i odwodzenia kości ramiennej7,10.

Ponadto, zmiany patohistologiczne, podobne do ludzkich łez RC11, zaobserwowano u królika po rozdarciu SSC. W szczególności brzuch mięśniowy ulega poważnemu FD, ze znaczną utratą masy mięśniowej, zmniejszoną powierzchnią przekroju poprzecznego włókien mięśniowych i zwiększoną otyłością. Ponadto, Otarodifard i in. ocenili charakterystykę biomechaniczną SSC królika po (1) technikach naprawy RC jednorzędowej, (2) dwurzędowej i (3) transkostnej równoważnej równoważnej RC i stwierdzili, że początkowe cechy biomechaniczne tych napraw były podobne do napraw RC TPK u ludzi wykonanych w próbkach zwłok12. W związku z tym anatomiczne, fizjologiczne i biomechaniczne podobieństwo SSC królika do ludzkiego SSP sprawia, że jest on przydatny do modelowania urazów RC.

Chociaż wiele gatunków zwierząt, w tym szczury, myszy, psy i owce, zostało wykorzystanych do badań nad chorobami RC i naprawami6,13,14,15, stopień przewlekłości obrażeń jest kluczowym czynnikiem. Dzieje się tak dlatego, że łzy RC mogą przebiegać bezobjawowo i często mogą zostać zdiagnozowane znacznie później, gdy rozdarcie powiększyło się i stało się przewlekłe, a zarówno ścięgno, jak i mięsień wykazują poważne zwyrodnienie16,17,18. Jednak większość modeli naprawczych RC wykorzystuje modele ostrych urazów, w których zdrowe ścięgno jest transektowane, a następnie natychmiast naprawiane19,20,21,22. Dzieje się tak głównie ze względu na celowość logistyczną i łatwość techniczną, co skutkuje nielicznymi badaniami, które badają patofizjologię RC w warunkach przypominających przewlekłość. Co więcej, kilka modeli zwierzęcych może posiadać cechy, które utrudniają ich wykorzystanie w badaniach nad przewlekłym RC.

Na przykład, chociaż szczur był szeroko wykorzystywany do modelowania rozdarcia RC i interwencji, brak znaczącej akumulacji tkanki tłuszczowej po urazie kontrastuje z kondycją ludzką, a jego mały rozmiar sprawia, że powtarzające się zabiegi chirurgiczne stanowią wyzwanie23. Ponadto, mimo że Gerber i in. wykorzystali infraspinatus owiec do badania atrofii mięśni i FD po przewlekłym RC tear24, istnieje pewna anatomiczna odmienność między owczym infraspinatus a ludzkim TPK, a także liczne wyzwania logistyczne związane z badaniem i trzymaniem tak dużego modelu zwierzęcego. Ponadto Gerber i wsp. opracowali model opóźnionego uszkodzenia RC u owiec poprzez uwolnienie powierzchownej głowy mięśnia podgrzebieniowego i ścięgna, aby naśladować cechy przewlekłego zerwania RC, a następnie ocenili skuteczność różnych technik naprawy ścięgna po 4 do 6 tygodniach. Niestety, ten chroniczny model owcy miał pewne ograniczenie, polegające na tym, że koniec uwolnionego ścięgna stał się nie do odróżnienia od tkanki bliznowatej podczas drugiego zabiegu chirurgicznego25.

Coleman i wsp. opracowali również model przewlekłego rozdarcia RC u owiec, pokrywając przecięty koniec ścięgna syntetyczną membraną podczas pierwszej operacji, co pozwoliło na dyfuzję składników odżywczych i skutecznie zminimalizowało tworzenie się tkanki bliznowatej wokół uszkodzonej tkanki, jednocześnie poprawiając rozróżnianie między ścięgnem a tkanką bliznowatą26. Tymczasem Turner i wsp. zasugerowali, że opóźniona naprawa powinna zostać przeprowadzona w ciągu 4 tygodni, ponieważ bezpośrednie ponowne przyczepienie rzadko zdarza się w przypadku masywnego retrakcji ścięgna27. Łącznie badania te przyczyniły się do opracowania powtarzalnych i wiarygodnych protokołów w celu pomyślnego ustanowienia chronicznego modelu urazów RC SSC u królików.

W tym protokole, po 4 tygodniach ustalany jest model przewlekłego uszkodzenia RC u królika, w którym zmiany patologiczne związane ze zwłóknieniem i zanikiem mięśni za pośrednictwem FD mogą być badane za pomocą oceny histologicznej. W szczególności owinięcie wolnego końca połączenia mięśniowo-ścięgnistego za pomocą rurki Penrose na bazie silikonu w czasie początkowej operacji umożliwia wyraźną identyfikację tkanek RC podczas drugiego zabiegu chirurgicznego, a w konsekwencji ułatwia bezpieczną naprawę w celu zbadania gojenia RC z augmentacją rusztowania i bez niej. Ogólnie rzecz biorąc, chroniczny model SSC królika może lepiej naśladować patofizjologię RC i stwarzać minimalne wymagania techniczne i logistyczne.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury muszą być wykonywane przy użyciu sterylnej techniki chirurgicznej w odpowiednio wyposażonym pomieszczeniu przeznaczonym do operacji na zwierzętach, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez komisję etyki eksperymentów na zwierzętach instytutu. W niniejszym badaniu operacje na królikach przeprowadzono zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komitet Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Chińskiego Uniwersytetu w Hongkongu.

1. Zabieg chirurgiczny

  1. Aby przygotować obszar operacyjny, podgrzej poduszkę grzewczą i przykryj ją sterylnymi obłożeniami chirurgicznymi, aby utrzymać temperaturę ciała królika. Następnie ułóż wysterylizowane narzędzia i materiały chirurgiczne (zgodnie ze Tabelą materiałów) i uporządkuj je zgodnie z preferencjami chirurga.
  2. Wywołać znieczulenie poprzez domięśniowe podanie 35 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny białym królikom nowozelandzkim (o wadze od 3,5 do 4,5 kg, w wieku około 5-6,5 miesiąca; w tym badaniu wykorzystano dwa samce i jedną samicę królika). Następnie potwierdź znieczulenie za pomocą testu szczypania łapy i/lub ogona.
  3. Jeśli do podtrzymania płaszczyzny operacyjnej wymagane jest dodatkowe znieczulenie, należy podać dożylnie 10 mg/kg ketaminy i 3 mg/kg ksylazyny przez żyłę ucha brzeżnego28 i monitorować częstość oddechów zwierzęcia w regularnych odstępach czasu 5-10 min.
  4. Aby przygotować okno operacyjne, należy ogolić zamierzone miejsce nacięcia (obszar skóry powierzchowny w stosunku do jednostki mięśniowo-ścięgnistej SSC) i oczyścić trzema naprzemiennymi aplikacjami betadyny i 70% alkoholu. Za pomocą bawełnianego wacika nałóż betadynę i 70% alkohol okrężnymi ruchami (od wewnątrz na zewnątrz). Użyj maści do oczu, aby oczy królika były wilgotne i nawilżone. Cefaleksynę należy podawać domięśniowo w dawce 20 mg/kg mc. jako środek przeciwinfekcyjny.
  5. Wykonaj 3-4 cm nacięcie skóry poniżej obojczyka, podziel odstęp naramienny za pomocą skalpela chirurgicznego nr 11 i cofnij się, aby uzyskać dostęp do ramienia (Rysunek 1A, B).
  6. Aby zlokalizować jednostkę mięśniowo-ścięgnistą SSC, najpierw zidentyfikuj mięsień kruczo-ścięgnisty (jako tkankę pokrywającą przyczep ścięgna SSC) i podziel go. Następnie zidentyfikuj ścięgno SSC i włóż zacisk pod kątem prostym, aby odsłonić całe ścięgno SSC w momencie jego przyczepienia do mniejszej guzowatości kości ramiennej (Rysunek 1C).
  7. Przed wprowadzeniem urazu należy odizolować mięsień-ścięgno SSC (Ryc. 1D) i podać śródoperacyjne znieczulenie (0,2 mg/kg 0,5% bupiwakainy) lokalnie w pobliżu miejsca przecięcia. Owiń jednostkę mięśniowo-ścięgnistą SSC rurką penrose'a na bazie silikonu (ryc. 1E), aby zapobiec niepożądanemu przyczepieniu się do otaczających tkanek i ułatwić późniejsze pobieranie tkanek.
  8. Aby wywołać uraz, wykonaj transsekcję o pełnej grubości na połączeniu mięśniowo-ścięgnistym za pomocą skalpela chirurgicznego nr 11 (Ryc. 1F). W razie potrzeby zatamuj krwawienie, uciskając kawałkiem gazy i w razie potrzeby użyj soli fizjologicznej do przepłukania rany.
  9. Aby zamknąć ranę, użyj nici 4-0 z kwasu poliglikolowego (PGA), aby ponownie zbliżyć tkankę mięśnia naramiennego (Rysunek 1G) i nylonowy szew 4-0 aby zamknąć ranę skóry (Rysunek 1H).
  10. Zapewnienie opieki pooperacyjnej poprzez podskórne podanie 0,03 mg/kg buprenorfiny jako środka przeciwbólowego (raz bezpośrednio po operacji i dwa razy dziennie przez następne 48 godzin29).
  11. Pozwól królikom dojść do siebie na przykrytej poduszce grzewczej i załóż miękką obrożę, aby zapobiec niepożądanym zachowaniom, w tym samookaleczeniom, lizaniu miejsc operowanych i usuwaniu szwów (Rysunek 1I).
  12. Monitoruj zwierzęta pod kątem zmian w wadze i zachowaniu. Zgłaszaj weterynarzowi każdy spadek masy ciała o więcej niż 10% i silny ból, którego nie można kontrolować (oceniany na podstawie pięciu działań behawioralnych: zaciśnięcie oczodołu, spłaszczenie policzków, zmiany kształtu nozdrzy, zmiany pozycji wąsów oraz zmiany kształtu i pozycji uszu) do weterynarza, aby ustalić, czy wymagana jest interwencja, taka jak wczesna eutanazja.

2. Pobieranie próbek

  1. Poddaj króliki eutanazji po 4 tygodniach od momentu urazu. Znieczulić króliki i podać śmiertelną dawkę pentobarbitalu sodu (ponad 60 mg/kg). Potwierdź zgon przez torakotomię.
  2. Zidentyfikuj głowę kości ramiennej i wytnij ją chirurgicznie, zachowując większe i mniejsze guzki oraz wszystkie przyczepy tkanek miękkich. Utrwalić 4% paraformaldehydem (PFA) przez 72 godziny w temperaturze 4 °C przed przeniesieniem do roztworu 10% kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) na 1 miesiąc w temperaturze pokojowej (ze zmianą podłoża co 72 godziny) w celu odwapnienia kości.
  3. Po odwapnieniu należy poddać próbki standardowej obróbce histologicznej przy użyciu stopniowego odwadniania etanolu, zatapiania parafiny, cięcia histologicznego (skrawki 8 μm) oraz barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz roztworami trichromu Massona30,31,32.
  4. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu pionowego przy 10-krotnym powiększeniu.
  5. Przeprowadź półkwantyfikację obrazów trichromowych H&E i Massona, mierząc powierzchnię i procent mięśni, tkanki włóknistej i tłuszczu w mięśniach, zgodnie z wcześniejszym opisem33,34 przy użyciu wybranego oprogramowania do projektowania graficznego. W tym przykładzie używane jest oprogramowanie Adobe Photoshop (https://www.adobe.com).
    1. Wybierz obszar o określonym kolorze reprezentujący określony typ tkanki za pomocą narzędzia magicznej różdżki (czerwony to tkanka mięśniowa, niebieski to zwłóknienie, a biały reprezentuje tłuszcz).
    2. Kliknij punkty menu Wybierz | Odwrotność | Zapisz wybór | Nazwij sekcję.
    3. Policz liczbę pikseli w zaznaczonym obszarze, klikając pozycje menu Okno | Dziennik pomiarów | Rejestruj pomiar, aby zarejestrować te wartości pikseli i ręcznie obliczyć procent wybranych typów tkanek.

3. Analiza statystyczna

  1. W przypadku danych histologicznych należy przeprowadzić analizę statystyczną przy użyciu wybranego oprogramowania analitycznego. Wykonaj test t-Studenta w celu porównania dwóch niezależnych próbek między grupą kontrolną a grupą poszkodowaną.
  2. Wyrazić dane jako średnią ± błąd standardowy średniej. Uznajmy, że wartość p <0,05 jest statystycznie istotna.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić przewlekłość patologii RC po przecięciu jednostek mięśniowo-ścięgnistych SSC, ogólna morfologia tkanki i zmiany komórkowe zostały scharakteryzowane za pomocą oceny ogólnej i analizy histologicznej (odpowiednio barwienie trichromowe H&E i Massona), po 4 tygodniach od urazu (Rysunek 2, Rysunek 3, oraz Rysunek 4). Reprezentatywne obrazy morfologii tkanek dużych wykazały pojawienie się białej tkanki tłuszczowej w uszkodzonych mięśniach SSC, której nie było w grupie kontrolnej (Ryc. 2). Barwienie H&E potwierdziło utratę komórkowości i organizacji mięśni, która została zastąpiona dużą liczbą adipocytów (puste przestrzenie otoczone cienkimi brzegami cytoplazmy, które zawierały ściśnięte jądra) w uszkodzonych mięśniach SSC w porównaniu z grupą kontrolną (Figura 3A).

Półilościowa ocena obrazów H&E wykazała wysoki stopień obecności adipocytów wewnątrzmięśniowych w uszkodzonych mięśniach SSC (36,5% ± 8,5%) w porównaniu z grupą kontrolną (0,69% ± 0,18%) (Rysunek 3B). Barwienie trichromowe Massona potwierdziło również atrofię mięśni i zdezorganizowane ułożenie włókien kolagenowych w uszkodzonych mięśniach SSC w porównaniu z grupą kontrolną (Figura 4A). Półilościowa ocena obrazów trichromowych Massona wykazała zmniejszenie komórkowości mięśni dla uszkodzonych mięśni SSC (41,3% ± 2,6%) w porównaniu z grupą kontrolną (99,2% ± 0,16%) (Figura 4B). Chociaż dalsza ocena półilościowa nie wykazała żadnej istotnej różnicy w tworzeniu tkanki zwłóknieniowej między uszkodzonymi mięśniami SSC (22,3% ± 13,1%) a grupą kontrolną (0,07% ± 0,05%), wysoki stopień zwłóknienia zaobserwowano w uszkodzonych mięśniach SSC (Rysunek 4C). Morfologia tkanki ogólnej i analiza histologiczna wykazały, że uszkodzone ścięgno mięśniowe SSC królika wykazywało poważny zanik mięśni, akumulację tłuszczu i zwłóknienie, które są znanymi cechami charakterystycznymi przewlekłej patofizjologii RC.

figure-results-1
Rysunek 1: Zabieg chirurgiczny dla modelu przewlekłego uszkodzenia mięśnia i ścięgna SSC. (A) Stworzono okno chirurgiczne, a anatomiczne punkty orientacyjne, takie jak kość ramienna, głowa kości ramiennej i obojczyk, zostały zidentyfikowane za pomocą badania palpacyjnego. (B) Nacięcie skóry o długości 3,0 cm wykonano poniżej obojczyka. (C) Mięsień kruczo-rakowy został podzielony, aby odsłonić mięsień SSC. (D) Izolowano jednostkę mięśniowo-ścięgnistą SSC. (E) Do owinięcia tkanki mięśniowo-ścięgnistej SSC użyto drenażu penrose'a na bazie silikonu. (F) Mięsień i ścięgno SSC został przecięty. (G) Mięsień kruczy został ponownie aproksymowany za pomocą szwów PGA. (H) Nacięcie skóry zostało zamknięte za pomocą szwów nylonowych. (I) Po operacji króliki otrzymały miękką obrożę do noszenia. Skróty: SSC = subscapularis; PGA = kwas poliglikolowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Ogólna morfologia reprezentatywnych mięśni SSC. Czarne strzałki reprezentują białą tkankę tłuszczową. Skrót: SSC = subscapularis. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza histologiczna modelu przewlekłego urazu RC po 4 tygodniach. (A) Reprezentatywne obrazy histologiczne wybarwione H&E wykazały zanik włókien mięśniowych i nagromadzenie adipocytów. (B) Kwantyfikacja procentowego nagromadzenia uszkodzonej tkanki tłuszczowej w mięśniach. n = 3 króliki. Słupki błędów wskazują SEM. *, statystycznie istotne (p≤ 0,05). Podziałka = 5 000 μm (A, lewa kolumna), 600 μm (A, prawa kolumna). Skróty: SSC = subscapularis; RC = stożek rotatorów; H&E = hematoksylina i eozyna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza histologiczna modelu przewlekłego urazu RC po 4 tygodniach. (A) Obrazy Massona zabarwione trichromem wykazały znaczne zwłóknienie. Włóknista tkanka łączna jest zabarwiona na niebiesko. (B) Kwantyfikacja proporcji tkanki mięśniowej i (C) zwłóknieniowej. n = 3 króliki. Słupki błędów wskazują SEM. *, statystycznie istotne (p≤ 0,05). Podziałka liniowa = 5 000 μm (A, lewa kolumna), 200 μm (A, prawa kolumna). Skróty: SSC = subscapularis; RC = stożek rotatorów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powtarzalny i fizjologicznie istotny model zwierzęcy umożliwia pogłębienie wiedzy na temat patogenezy choroby, ocenę wyników terapii klinicznych oraz ulepszenie i dalszy rozwój leczenia chirurgicznego35. W tym badaniu ustalono wiarygodny i dokładny model SSC królika, który naśladuje aspekty anatomii i patofizjologii człowieka RC. Łzy RC są związane z postępującymi i prawdopodobnie nieodwracalnymi zmianami zwyrodnieniowymi mięśni, co skutkuje zmniejszonym potencjałem gojenia. Na przykład, Ko i wsp. wykazali, że ponowne przyłączenie króliczego TPK po 6 tygodniach nie odwróciło atrofii mięśni lub FD w ciągu następnych 6 tygodni. Taki zanik mięśni za pośrednictwem FD wpływa na kilka ważnych parametrów klinicznych, w tym siłę ścięgien i zakres ruchu stawów, co może wpływać na wyniki operacji36,37.

Ustalony tu protokół wykazywał istotne cechy podobne do przewlekłych po przecięciu jednostek mięśniowo-ścięgnistych SSC. W szczególności zmiany te obejmują widocznie zmniejszoną masę mięśniową oraz zwiększoną zawartość tkanki tłuszczowej i zwłóknieniowej (ryc. 2, ryc. 3 i ryc. 4). Wyniki te są zgodne ze zmianami zwyrodnieniowymi zgłaszanymi w ludzkich łzach RC38. W ostatnich latach szczur stał się jednym z najintensywniej badanych modeli zwierzęcych pod kątem chorób i urazów RC ze względu na swoje wysokie podobieństwa anatomiczne zarówno do ludzkich, jak i szczurzych TPK podróżujących pod wyrostkiem barkowym 38,39,40. Należy jednak zauważyć, że część TPK szczura, która przechodzi pod łukiem barkowym, jest mięśniowa, a nie ścięgnista, jak ma to miejsce u ludzi41. Co najważniejsze, Barton i wsp. stwierdzili brak znaczącej akumulacji tłuszczu po oderwaniu ścięgna SSP u szczurów23, co kontrastuje z kondycją ludzką42. W związku z tym uważa się, że kompleks SSC królika może stanowić odpowiedni model do naśladowania przewlekłego rozdarcia RC u ludzi.

Aby zapewnić odtwarzalność tego modelu, podczas wykonywania tego protokołu warto zwrócić uwagę na dwa punkty. Po pierwsze, po przecięciu jednostek mięśniowo-ścięgnistych, wolny koniec przeciętego ścięgna może być zagrożony tworzeniem zrostów, co może utrudnić odzyskanie ścięgna przy kolejnych manipulacjach. Aby uniknąć tego problemu, zastosowano niewchłanialną rurkę silikonową do owinięcia wolnego końca połączenia mięśniowo-ścięgnistego po przecięciu, aby uniknąć spontanicznego przylegania do otaczających tkanek, a także spontanicznego gojenia (ryc. 1E). Co więcej, przecięta jednostka mięśniowo-ścięgnista podczas drugiej procedury interwencji (tj. w celu wykonania bezpiecznej naprawy; dane nie są pokazane) może być wyraźnie zidentyfikowana poprzez owinięcie końca uszkodzonych tkanek w czasie początkowej operacji. Technika ta jest ekonomiczna, skuteczna i może być łatwo wdrożona w chirurgii43. Po drugie, króliki są bardzo wrażliwym gatunkiem, który może wykazywać szkodliwe zachowanie po operacji. Aby uniknąć takich problemów, zdecydowanie zaleca się również zastosowanie miękkiego kołnierza, aby zapobiec niepożądanym zachowaniom, w tym samookaleczeniom, lizaniu miejsc operowanych i usuwaniu szwów (ryc. 1I). W porównaniu z konwencjonalnymi obrożami elektronicznymi, które są wykonane ze sztywnego tworzywa sztucznego, samodzielnie wykonana miękka obroża nie spowodowała żadnych obrażeń skóry ani innych skutków ubocznych, które wpłynęłyby na dobrostan zwierząt lub jakość badań naukowych. Łącznie takie kroki mają kluczowe znaczenie dla stworzenia dokładnie powtarzalnego modelu urazów RC królików i dają możliwość badania strategii naprawy regeneracyjnej.

Aby badać patofizjologię ścięgien i gojenie się w modelu zwierzęcym, należy stworzyć wyraźny i powtarzalny uraz, a punkty czasowe badania muszą być starannie dobrane. Zdecydowana większość badań nad uszkodzeniem ścięgien i gojeniem została przeprowadzona na w pełni przeciętych ścięgnach zwierzęcych44, ponieważ przecięcie jest prostą procedurą, która jest wysoce powtarzalna i może odpowiednio symulować scenariusz kliniczny 45,46. Huegel i wsp. wykazali, że uraz częściowo przeciętego ścięgna był mniej poważny niż w przypadku ścięgna w pełni przeciętego, a unieruchomienie miało szkodliwy wpływ na mechanikę ścięgna, w tym zwiększoną sztywność stawu47. Aby ocenić atrofię i FD, które są widoczne w otoczeniu masywnego rozdarcia RC, konieczne jest zdefiniowanie eksperymentalnie zaobserwowanych charakterystycznych punktów czasowych. Gupta i in. zwalidowali model urazu RC u samca królika i zaobserwowali zanik mięśni w 2 i 6 tygodniach, ze zwiększoną zawartością tłuszczu w późniejszych punktach czasowych (mniej niż 5% zawartości tłuszczu w 2 tygodniach w porównaniu z ponad 10% zawartością tłuszczu w 6 tygodniach), zgodnie z procesem patologicznym obserwowanym w ludzkich łzach RC11. W tym badaniu masywne rozdarcie RC powstało w wyniku przecięcia jednostki mięśniowo-ścięgnistej SSC u samców i samic królików przez 4 tygodnie, co spowodowało FD mięśnia SSC (36,5% zawartości tłuszczu). Tak więc, 4-tygodniowy punkt czasowy jest odpowiedni do generowania mięśni SSC FD u samców i samic białych królików nowozelandzkich.

Istnieje kilka ograniczeń tego badania. Obejmują one: (i) etapy związane z generowaniem modeli zwierzęcych, takie jak stosunkowo krótki punkt czasowy i potencjalnie zapalne materiały (rurki penrose na bazie silikonu) do generowania przewlekłych urazów; (ii) charakterystyka i analiza modelu zwierzęcego, np. brak analizy chodu i elektromiografii w celu oceny kinematyki stawów i generowania siły kurczliwości mięśni; oraz (iii) porównanie modeli zwierzęcych, takie jak brak porównania z innymi miejscami urazów RC.

Jeśli chodzi o generowanie modeli, urazy RC u ludzi zazwyczaj obejmują postępującą atrofię i FD, które mogą wystąpić w ciągu kilku lat, czyli stosunkowo dłużej niż 4-tygodniowy punkt czasowy opisany tutaj. Jest to uważane za dopuszczalne, ponieważ model zwierzęcy, który generuje około 36,5% tłuszczu śródmięśniowego w stosunkowo krótkim czasie, będzie logistycznie wygodny i może zostać przedłużony, jeśli zostanie uznany za konieczny. Co więcej, biokompatybilność implantów na bazie silikonu, takich jak rurki Penrose'a, jest źródłem długotrwałych kontrowersji ze względu na doniesienia o komórkowej odpowiedzi immunologicznej i zapaleniu47; w związku z tym alternatywny materiał obojętny, taki jak glikol polietylenowy (PEG), może być zastąpiony do owijania wyciętego ścięgna w przypadku prowadzenia badań RC związanych ze stanem zapalnym.

Jeśli chodzi o charakterystykę i analizę modelu zwierzęcego, brak analizy chodu49 i badań elektromiografem50 może ograniczyć wyniki badania do jakościowych danych histologicznych. Aspekty te mogą zostać uwzględnione w przyszłych badaniach przy użyciu analizy ruchu wideo51 i elektromiografii powierzchniowej50 w celu wygenerowania danych ilościowych na temat kinematyki barku i wydajności mięśni RC.

Jeśli chodzi o porównanie modeli, ponieważ TPK i ścięgna podgrzebieniowe u królików były również szeroko stosowane w badaniach RC, porównanie ciężkości urazu, w tym FD między tymi różnymi miejscami urazu w przyszłości, pozwoli zidentyfikować dodatkowe miejsca do optymalizacji modelu.

Podsumowując, w ramach tego badania opracowano protokół modelowania przewlekłych urazów RC u samców i samic królików. Model ten jest wygodny dla badaczy ze względu na swoją prostotę (przecięcie) i stosunkowo krótki okres indukcji przewlekłości (4 tygodnie) przy jednoczesnym generowaniu dużego stopnia (36,5%) domięśniowego FD. W związku z tym oczekuje się, że protokół ten pomoże badaczom w badaniu patofizjologii RC, a także ułatwi opracowanie nowych terapii naprawy i regeneracji ścięgien mięśniowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania Dai Fei Elmera Kera są wspierane przez fundusze z Biura ds. Żywności i Zdrowia, Hong Kong SAR (Health Medical and Research Fund: 08190466), Innovation and Technology Commission, Hong Kong SAR (Tier 3 Award: ITS/090/18; Health@InnoHK programie), Research Grants Council of Hong Kong, Hong Kong SAR (Early Career Scheme Award: 24201720 and General Research Fund: 14213922) oraz The Chinese University of Hong Kong (Faculty Innovation Award: FIA2018/A/01). Badania Dana Wanga są wspierane przez fundusze Biura ds. Żywności i Zdrowia, Hongkong SAR (Health Medical and Research Fund, 07180686), Komisji ds. Innowacji i Technologii, Hongkong SAR (nagroda Tier 3: ITS/333/18; Health@InnoHK) oraz Research Grants Council of Hong Kong, Hong Kong SAR (General Research Fund: 14118620 i 14121121).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Narzędzia chirurgiczne
4-0 Szwy z kwasem poliglikolowym (PGA)GBK884
Ząbkowane kleszcze AdsonTaobao, Chiny
Cienkie nożyczki Taobao, Chiny
Kleszcze hemostatyczneTaobao, Chiny
Uchwyty do igiełTaobao, Chiny
Skalpel chirurgiczny z rękojeściąTaobao, ChinySzew z ostrzem nr 11
(nylon 4-0)Taobao, Chiny19054Do zamykania skóry dopuszczalne są szwy nylonowe lub jedwabne. Każdy szew ma swoje zalety i wady, a użytkownikom zaleca się wybór jednego zgodnie z własnymi preferencjami.
Akcesoria chirurgiczne
Cotton ballsTaobao, Chiny
GauzeTaobao, Chiny
RazorTaobao, Chiny
Chirurgiczna poduszka grzewczaTaobao, Chiny
Lampa
Strzykawka z igłamiTaobao, Chiny1 mL, 5 mL, 10 mL
Drugs
BuprenorphineLASEC, CUHK0,12 mg/kg
BupiwakainaSigma-Aldrichb5274-5g1-2 mg/kg
CefaleksynaSanta Cruz Biotechnologysc-48755620 mg/kg
Ketamina LASEC, CUHK35 mg/kg
Pentobarbital soduLASEC, CUHKponad 60 mg/kg
KsylazynaLASEC, CUHK5 mg/kg
Sprzęt
Nikon Ni-U Eclipse Mikroskop pionowyNikon Instruments Inc, USA
silny>Oprogramowanie
Adobe Photoshop 20.01Adobe Inc, USA
silny>Inne odczynniki 
BetadineTaobao, Chiny5%
etanoluTaobao, Chiny70%
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-AldrichEDS-1KG10%
Paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa Nauki157134%
rurki silikonoweEasy Thru, Chiny
Sól fizjologicznaTaobao, Chiny
Odczynniki do barwienia histologicznego
Eosin Stain Roztwór barwnikaSigma-AldrichR030405% wodny
roztwór hematoksylinySigma-AldrichHHS32
Plama trójchromowa ( Masson)  ZestawSigma-AldrichHT15
chirurgiczna<<ISO13485

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goutallier, D., Postel, J. -M., Bernageau, J., Lavau, L., Voisin, M. -C. Fatty muscle degeneration in cuff ruptures. Pre-and postoperative evaluation by CT scan. Clinical Orthopaedics and Related Research. 304 (304), 78-83 (1994).
  2. Itoigawa, Y., Kishimoto, K. N., Sano, H., Kaneko, K., Itoi, E. Molecular mechanism of fatty degeneration in rotator cuff muscle with tendon rupture. Journal of Orthopaedic Research. 29 (6), 861-866 (2011).
  3. Mal Kim, H., et al. Relationship of tear size and location to fatty degeneration of the rotator cuff. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 92 (4), 829-839 (2010).
  4. Melis, B., DeFranco, M. J., Chuinard, C., Walch, G. Natural history of fatty infiltration and atrophy of the supraspinatus muscle in rotator cuff tears. Clinical Orthopaedics and Related Research. 468 (6), 1498-1505 (2010).
  5. Li, K., Zhang, X., Wang, D., Tuan, R. S., Ker, D. F. E. Synergistic effects of growth factor-based serum-free medium and tendon-like substrate topography on tenogenesis of mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. , 146(2023).
  6. Derwin, K. A., Baker, A. R., Codsi, M. J., Iannotti, J. P. Assessment of the canine model of rotator cuff injury and repair. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S140-S148 (2007).
  7. Grumet, R. C., Hadley, S., Diltz, M. V., Lee, T. Q., Gupta, R. Development of a new model for rotator cuff pathology: The rabbit subscapularis muscle. Acta Orthopaedica. 80 (1), 97-103 (2009).
  8. Renström, P., Johnson, R. J. Overuse injuries in sports. Sports Medicine. 2 (5), 316-333 (1985).
  9. Hertel, R., Lambert, S. M. Supraspinatus rupture at the musculotendinous junction. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (4), 432-435 (1998).
  10. Oh, J. H., Chung, S. W., Kim, S. H., Chung, J. Y., Kim, J. Y. Neer Award: Effect of the adipose-derived stem cell for the improvement of fatty degeneration and rotator cuff healing in rabbit model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 23 (4), 445-455 (2013).
  11. Gupta, R., Lee, T. Q. Contributions of the different rabbit models to our understanding of rotator cuff pathology. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S149-S157 (2007).
  12. Otarodifard, K., Wong, J., Preston, C. F., Tibone, J. E., Lee, T. Q. Relative fixation strength of rabbit subscapularis repair is comparable to human supraspinatus repair at time 0. Clinical Orthopaedics and Related Research. 472 (8), 2440-2447 (2014).
  13. Liu, X., Manzano, G., Kim, H. T., Feeley, B. T. A rat model of massive rotator cuff tears. Journal of Orthopaedic Research. 29 (4), 588-595 (2011).
  14. Liu, X., et al. A mouse model of massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 94 (7), 41(2012).
  15. Neer,, et al. Award 2007: Reversion of structural muscle changes caused by chronic rotator cuff tears using continuous musculotendinous traction. An experimental study in sheep. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 18 (2), 163-171 (2009).
  16. Warner, J. J., Parsons, I. M. Latissimus dorsi tendon transfer: A comparative analysis of primary and salvage reconstruction of massive, irreparable rotator cuff tears. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 10 (6), 514-521 (2001).
  17. Galatz, L. M., Ball, C. M., Teefey, S. A., Middleton, W. D., Yamaguchi, K. The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. American. 86 (2), 219-224 (2004).
  18. Kim, H. M., Galatz, L. M., Lim, C., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The effect of tear size and nerve injury on rotator cuff muscle fatty degeneration in a rodent animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 21 (7), 847-858 (2012).
  19. Carpenter, J. E., Thomopoulos, S., Flanagan, C. L., DeBano, C. M., Soslowsky, L. J. Rotator cuff defect healing: A biomechanical and histologic analysis in an animal model. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (6), 599-605 (1998).
  20. Jal Soslowsky, L., et al. Rotator cuff tendinosis in an animal model: Role of extrinsic and overuse factors. Annals of Biomedical Engineering. 30 (8), 1057-1063 (2002).
  21. Thomopoulos, S., et al. The localized expression of extracellular matrix components in healing tendon insertion sites: An in situ hybridization study. Journal of Orthopaedic Research. 20 (3), 454-463 (2002).
  22. Su, W., et al. Effect of suture absorbability on rotator cuff healing in a rabbit rotator cuff repair model. The American Journal of Sports Medicine. 46 (11), 2743-2754 (2018).
  23. Barton, E. R., Gimbel, J. A., Williams, G. R., Soslowsky, L. J. Rat supraspinatus muscle atrophy after tendon detachment. Journal of Orthopaedic Research. 23 (2), 259-265 (2005).
  24. Gerber, C., Meyer, D. C., Schneeberger, A. G., Hoppeler, H., von Rechenberg, B. Effect of tendon release and delayed repair on the structure of the muscles of the rotator cuff: An experimental study in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 86 (9), 1973-1982 (2004).
  25. Gerber, C., Schneeberger, A. G., Perren, S. M., Nyffeler, R. W. Experimental rotator cuff repair. A preliminary study. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 81 (9), 1281-1290 (1999).
  26. Hal Coleman, S., et al. Chronic rotator cuff injury and repair model in sheep. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 85 (12), 2391-2402 (2003).
  27. Turner, A. S. Experiences with sheep as an animal model for shoulder surgery: strengths and shortcomings. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 16, S158-S163 (2007).
  28. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder MA, Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  29. Cooper, C. S., Metcalf-Pate, K. A., Barat, C. E., Cook, J. A., Scorpio, D. G. Comparison of side effects between buprenorphine and meloxicam used postoperatively in Dutch belted rabbits (Oryctolagus cuniculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (3), 279-285 (2009).
  30. Eal Ker, D. F., et al. Functionally graded, bone-and tendon-like polyurethane for rotator cuff repair. Advanced Functional Materials. 28 (20), 1707107(2018).
  31. Toumi, H., et al. Regional variations in human patellar trabecular architecture and the structure of the proximal patellar tendon enthesis. Journal of Anatomy. 208 (1), 47-57 (2006).
  32. Noor, R. A. M., Shah, N. S. M., Zin, A. A. M., Sulaiman, W. A. W., Halim, A. S. Disoriented collagen fibers and disorganized, fibrotic orbicularis oris muscle fiber with mitochondrial myopathy in non-syndromic cleft lip. Archives of Oral Biology. 140, 105448(2022).
  33. Wang, D., et al. Growth and differentiation factor-7 immobilized, mechanically strong quadrol-hexamethylene diisocyanate-methacrylic anhydride polyurethane polymer for tendon repair and regeneration. Acta Biomaterialia. 154, 108-122 (2022).
  34. Wang, D., et al. Combinatorial mechanical gradation and growth factor biopatterning strategy for spatially controlled bone-tendon-like cell differentiation and tissue formation. NPG Asia Materials. 13 (1), (2021).
  35. Kuyinu, E. L., Narayanan, G., Nair, L. S., Laurencin, C. T. Animal models of osteoarthritis: Classification, update, and measurement of outcomes. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 11, (2016).
  36. Safran, O., Derwin, K. A., Powell, K., Iannotti, J. P. Changes in rotator cuff muscle volume, fat content, and passive mechanics after chronic detachment in a canine model. The Journal of Bone and Joint Surgery. American. 87 (12), 2662-2670 (2005).
  37. Gerber, C., Fuchs, B., Hodler, J. The results of repair of massive tears of the rotator cuff. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 82 (4), 505-515 (2000).
  38. Longo, U. G., Berton, A., Khan, W. S., Maffulli, N., Denaro, V. Histopathology of rotator cuff tears. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 19 (3), 227-236 (2011).
  39. Schneeberger, A. G., Nyffeler, R. W., Gerber, C. Structural changes of the rotator cuff caused by experimental subacromial impingement in the rat. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 7 (4), 375-380 (1998).
  40. Soslowsky, L. J., Carpenter, J. E., DeBano, C. M., Banerji, I., Moalli, M. R. Development and use of an animal model for investigations on rotator cuff disease. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 5 (5), 383-392 (1996).
  41. Rowshan, K., et al. Development of fatty atrophy after neurologic and rotator cuff injuries in an animal model of rotator cuff pathology. The Journal of Bone and Joint Surgery. 92 (13), 2270-2778 (2010).
  42. Gladstone, J. N., Bishop, J. Y., Lo, I. K., Flatow, E. L. Fatty infiltration and atrophy of the rotator cuff do not improve after rotator cuff repair and correlate with poor functional outcome. The American Journal of Sports Medicine. 35 (5), 719-728 (2007).
  43. Chen, W. F., Kim, B. -S., Lin, Y. -T. Penrose drain interposition-A novel approach to preventing adhesion formation after tenolysis. The Journal of Hand Surgery. Asian-Pacific Volume. 27 (1), 174-177 (2022).
  44. Lui, P. P. Y. Stem cell technology for tendon regeneration: Current status, challenges, and future research directions. Stem Cells and Cloning: Advances and Applications. 8, 163-174 (2015).
  45. Howell, K., et al. Novel model of tendon regeneration reveals distinct cell mechanisms underlying regenerative and fibrotic tendon healing. Scientific Reports. 7, 45238(2017).
  46. Sharma, P., Maffulli, N. Tendinopathy and tendon injury: The future. Disability and Rehabilitation. 30 (20-22), 1733-1745 Forthcoming.
  47. Huegel, J., et al. Quantitative comparison of three rat models of Achilles tendon injury: A multidisciplinary approach. Journal of Biomechanics. 88, 194-200 (2019).
  48. Pal Heggers, J., et al. Biocompatibility of silicone implants. Annals of Plastic Surgery. 11 (1), 38-45 (1983).
  49. Liu, Y., et al. Evaluation of animal models and methods for assessing shoulder function after rotator cuff tear: A systematic review. Journal of Orthopaedic Translation. 26, 31-38 (2020).
  50. Disselhorst-Klug, C., Schmitz-Rode, T., Rau, G. Surface electromyography and muscle force: Limits in sEMG-force relationship and new approaches for applications. Clinical Biomechanics. 24 (3), 225-235 (2009).
  51. Kwon, D. R., Park, G. -Y., Moon, Y. S., Lee, S. C. Therapeutic effects of umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells combined with polydeoxyribonucleotides on full-thickness rotator cuff tendon tear in a rabbit model. Cell Transplantation. 27 (11), 1613-1622 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rabbit Injury ModelMuscle Fatty DegenerationFibrosis ProgressionSubscapularis MuscleTendon TransectionHistologic EvaluationMasson s TrichromeMuscle AtrophyTissue Engineering

Powiązane artykuły