Artykuł metodologiczny

System detekcji wirusów DNA oparty na RPA-CRISPR/Cas12a-SPM i głębokim uczeniu

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64833

⸱

10 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Precision Medicine and Healthcare, Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute, 2Institute of Biopharmaceutics and Health Engineering, Tsinghua Shenzhen International Graduate School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy protokół, który łączy amplifikację polimerazy rekombinazy z systemem CRISPR/Cas12a do wykrywania śladów wirusów DNA i tworzy przenośną mikroskopię smartfonów z klasyfikacją wspomaganą sztuczną inteligencją do wykrywania wirusów DNA w miejscu opieki nad pacjentem.

Streszczenie

Informujemy o szybkim, łatwym do wdrożenia, wysoce czułym, specyficznym dla sekwencji i przyłóżkowym (POC) systemie wykrywania wirusów DNA, który łączy w sobie amplifikację polimerazy rekombinazy (RPA) i system CRISPR/Cas12a do wykrywania śladów wirusów DNA. Docelowy DNA jest amplifikowany i rozpoznawany oddzielnie przez RPA i CRISPR/Cas12a, co wyzwala aktywność rozszczepienia pobocznego Cas12a, która rozszczepia reporter DNA znakowany fluoroforem i uogólnia fluorescencję. Do wykrywania POC przenośna mikroskopia smartfonowa jest zbudowana do wykonywania obrazów fluorescencyjnych. Poza tym w systemie wdrożono modele głębokiego uczenia do binarnej klasyfikacji próbek dodatnich lub ujemnych, osiągające wysoką dokładność. Wirus żaby 3 (FV3, rodzaj Ranavirus, rodzina Iridoviridae) został przetestowany jako przykład dla tego systemu wykrywania wirusa DNA POC, a granice wykrywalności (LoD) mogą osiągnąć 10 rano w ciągu 40 minut. Bez wykwalifikowanych operatorów i nieporęcznych urządzeń, przenośny i miniaturowy RPA-CRISPR/Cas12a-SPM z klasyfikacją wspomaganą sztuczną inteligencją (AI) wykazuje ogromny potencjał w wykrywaniu wirusów POC DNA i może pomóc w zapobieganiu rozprzestrzenianiu się takich wirusów.

Wprowadzenie

W ostatnich latach często dochodziło do epidemii chorób zakaźnych wywoływanych przez różne wirusy, w tym epidemia wirusa Ebola (EVD) w 2014 roku1 i 20182, bliskowschodni zespół oddechowy (MERS) w 2015 roku3, epidemia choroby wirusa Zika w 2015 roku4, choroba koronawirusowa 2019 (COVID-19) wywołana przez koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2)5 i trwająca w 2022 roku małpia ospa wywołana przez wirusa małpiej ospy (MKPV)6. Te nagłe wybuchy epidemicznych chorób zakaźnych powodują dużą liczbę zgonów i przynoszą ogromne straty gospodarcze oraz niepokoje społeczne. Pilnie potrzebny jest szybki i dokładny system wykrywania, aby szybko zdiagnozować infekcję i zapobiec dalszemu rozprzestrzenianiu się wirusa.

Ostatnio, zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) i białka związane z CRISPR (Cas) zyskały światową uwagę i wykazały obiecujące wyniki w wykrywaniu kwasów nukleinowych7,8,9,10,11,12,13,14,15. Białko CRISPR/Cas12a, kierowane przez CRISPR RNA (crRNA), wiąże się z docelowym DNA i rozszczepia je. Aktywność ta prowadzi do uwolnienia niespecyficznego jednoniciowego DNA (ssDNA), znanego jako trans-rozszczepienie, i może być wykorzystana do wzmocnienia sygnału detekcji do wykrywania kwasów nukleinowych. Niektóre tradycyjne metody wykrywania, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) i test immunoenzymatyczny (ELISA), są skomplikowane, czasochłonne i kosztowne w wykrywaniu w miejscu opieki nad pacjentem (POC). W ramach naszych wcześniejszych prac udało się opracować zautomatyzowany, zintegrowany i opłacalny system wykrywania wirusa afrykańskiego pomoru świń (ASFV) oparty na technologii CRISPR/Cas12a. W tym systemie osiągnęliśmy granicę wykrywalności na poziomie 1 pM w ciągu 2 godzin bez konieczności amplifikacji. System CRISPR/Cas12a i amplifikacja polimerazy rekombinazy (RPA) zostały połączone w celu poprawy czułości i swoistości wykrywania śladowych DNA. W porównaniu z innymi technikami amplifikacji izotermicznej, RPA jest prosta w konstrukcji i wygodna w obsłudze, ponieważ ma krótszy czas reakcji bez zaawansowanych urządzeń do kontroli temperatury.

Do wykrywania patogenów w POC, do odczytu wyników opracowane są takie instrumenty jak mikroskopia smartfonowa (SPM), ręczny fluorymetr lub paski przepływu bocznego16,17,18. SPM przechwytuje obrazy za pomocą kamery i przesyła je do niektórych aplikacji mobilnych w celu szybkiej analizy danych. Taka mikroskopia tworzy przenośny, tani i miniaturowy system akwizycji sygnału o wysokiej czułości i wykazał zalety w wykrywaniu patogenów, takich jak H5N1, wirus Zika i SARS-CoV-219,20. Dlatego budujemy przenośny SPM do wychwytywania sygnałów fluorescencyjnych wyzwalanych przez detekcję RPA-CRISPR/Cas12a docelowego wirusa DNA. Sonda reporterowa ssDNA łącząca fluorofor i wygaszacz zostanie rozszczepiona, gdy CRISPR/Cas12a rozpozna docelowego wirusa DNA, a fluorescencja emitowana przez fluorofor może zostać wychwycona przez SPM.

W porównaniu do profesjonalnego oprogramowania zwykle używanego do uzyskiwania informacji o wynikach z obrazów fluorescencyjnych z SPM21, niektórzy eksperci używają uczenia maszynowego i głębokiego uczenia się do ilościowego określania stężeń DNA wirusa po uzyskaniu obrazów fluorescencyjnych22, co jest bardziej czasochłonne. Jeśli chodzi o klasyfikację obrazów medycznych, konwencjonalne sieci neuronowe (CNN) są często używane do uczenia się funkcji z surowych obrazów z pikselami w sposób kompleksowy23,24,25,26. Popularne modele głębokiego uczenia oparte na CNN, takie jak AlexNet, DenseNet-121 i EfficientNet-B7, zostały z powodzeniem zastosowane w tej dziedzinie27,28. Jednak uzyskanie dużych zbiorów danych w określonych domenach może być trudne, co wymaga uczenia transferowego29,30. Takie podejście wstępnie trenuje model uczenia głębokiego przy użyciu dużego zestawu danych, a wstępnie wytrenowany model jest używany jako punkt wyjścia dla nowego zadania z małym zestawem danych. Ta technika może zmniejszyć zapotrzebowanie na duże zestawy danych, zwalczać nadmierne dopasowanie i skrócić czas szkolenia31. W tym celu wykorzystujemy modele uczenia głębokiego z uczeniem transferowym do binarnej klasyfikacji obrazów fluorescencyjnych próbek dodatnich i ujemnych.

W tej metodzie łączymy RPA i system CRISPR/Cas12a do wykrywania śladów wirusów DNA. Docelowy DNA jest amplifikowany i rozpoznawany oddzielnie przez RPA i CRISPR/Cas12a, co wyzwala aktywność rozszczepienia pobocznego Cas12a, która rozszczepia reporter DNA znakowany fluoroforem i uogólnia fluorescencję. Budujemy przenośny SPM, aby pobierać obrazy fluorescencyjne do wykrywania POC i opracowywać modele głębokiego uczenia się do klasyfikacji binarnej. Schemat zbudowanego systemu detekcji POC pokazano w Rysunek 1. Bez wykwalifikowanych operatorów i nieporęcznych urządzeń, RPA-CRISPR/Cas12a-SPM z klasyfikacją wspomaganą sztuczną inteligencją (AI) wykazuje ogromny potencjał wykrywania wirusa POC DNA.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat systemu detekcji RPA-CRISPR/Cas12-SPM wraz z klasyfikacją AI dla zebranych obrazów. Kwasy nukleinowe w próbkach pochodzenia zwierzęcego są uwalniane przez PINDBK. Docelowy DNA wirusa jest amplifikowany i rozpoznawany specyficznie przez system RPA-CRISPR/Cas12a. CRISPR/Cas12a wiąże się z crRNA, a kompleks Cas12a-crRNA wiąże się z docelowym DNA, co powoduje poboczne rozszczepienie CRISPR/Cas12a na sondach reporterowych ssDNA. Fluorofor na reporterze jest uwalniany, a fluorescencja jest wykrywana przez skomercjalizowany czytnik płytek lub zbudowany przez nas SPM. Do klasyfikacji obrazów fluorescencyjnych wykorzystywane są trzy różne modele głębokiego uczenia, w tym AlexNet, DenseNet-121 i EfficientNet-B7 z uczeniem transferowym. Ten rysunek został ponownie wykorzystany za zgodą Lei et al.35. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Przetwarzanie próbek

  1. Weźmy na przykład wirusa żaby 3 (FV3, rodzaj Ranavirus, rodzina Iridoviridae), dwuniciowy wirus DNA. Wybierz gen głównego kapsydu (mcp) jako cel do wykrycia FV3, ponieważ jest on wysoce konserwatywny i zwykle uważany za cel do wykrycia ranawirusa. Wybrana sekwencja docelowa jest przedstawiona w tabeli 1.
    UWAGA: Frog Virus 3 jest traktowany jako przykład w tym protokole.
  2. Do przygotowania docelowych fragmentów DNA należy użyć fragmentów DNA genu mcp z FV3 i zakaźnego wirusa martwicy śledziony i nerek (ISKNV, innego Ranawirusa).
    UWAGA: W tym badaniu docelowe fragmenty DNA zostały uzyskane komercyjnie od firmy wymienionej w Tabeli Materiałów. Są one traktowane jako cel i kontrola późniejszego wykrycia.
nazwaSekwencja
FV3 MCPNTS: 5' ...gtaacccggctttcGGGCAGCAGTTTCGGGGGGtcccagg... 3' (240 punktów bazowych)
TS: 5' ...ccgacctgggaACGCCGACCGAAACTGCTGCCCtgctgcccgaaagc... 3' (240 punktów bazowych)
MCP ISKNVNTS: 5' ...ggccatgccaatttTGGGCAGGAGTTTAGTGTGACGgtggcgaggg... 3' (231 pz)
TS: 5' ...ccctcgccaccgtcACACTAAACTCCTGCCCAAATtggcatggcc... 3' (231 pz)

Tabela 1: Sekwencja docelowa wybrana w tej metodzie.

2. Reakcja RPA

  1. Zaprojektuj i zsyntetyzuj pary starterów RPA dla sekwencji docelowej. Sekwencje par starterów RPA opisano w tabeli 2.
  2. Przygotować 5x bufor reakcyjny RPA (Tabela 3) i MgCl2 (100 mM).
  3. Wymieszaj cztery kluczowe enzymy RPA (UvsX, UvsY, GP32, białko Bsu) w buforze reakcyjnym 1x RPA, wraz z wcześniej zaprojektowanymi starterami, jak opisano w Tabeli 4.
  4. Dokładnie wymieszaj mieszaninę.
  5. Dodać 1 μl tarczy otrzymanej z kroku 1 dla każdej reakcji RPA i ponownie dokładnie wymieszać przez wirowanie.
  6. Dodać 7 μl MgCl2 (100 mM), aby rozpocząć reakcję. Końcowa objętość każdej reakcji RPA wynosi 50 μL.
  7. Przeprowadzić test w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  8. Produkt RPA może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka dni. W miarę degradacji produktów RPA należy je stosować w celu dalszego wykrywania tak szybko, jak to możliwe, aby uzyskać lepsze wyniki diagnozy.
  9. [Opcjonalnie] Przeprowadź elektroforezę w żelu DNA.
    1. Wyjmij 5 μl produktów RPA, dodaj odpowiednią objętość 6-krotnego buforu ładującego DNA i przeprowadź elektroforezę żelu DNA w buforze tris-octanu EDTA (TAE).
    2. Uruchomić elektroforezę pod napięciem 120 V na około 20 minut, aż pasma bufora ładującego dotrą do dna żelu.
    3. Określ, czy sekwencja docelowa została pomyślnie amplifikowana z próbki, porównując rozmiar prążków próbki z prążkami markera.
nazwakolejność
Podkład do RPA FATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
Podkład do RPA RGGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG powiedział:

Tabela 2: Startery RPA używane w tej metodzie.

cyfrowa
składnikPierwotne stężeniedodatek
PEG 20,000-114 mg tabletki powlekania
Atp100 mM125 μL
Serwery dNTP25 mM48 μL
Tris-HCl1 mln125 μL
Naziemna telewizja1 mln125 μL
Fosfokreatyny1 mln250 μL
Kinaza kreatynowa10 μg/μL50 μL
ddH2O-277 μL
Całkowita objętość-1 ml

Tabela 3: Skład 5x buforu reakcyjnego RPA (pH 7,5).

składnikPierwotne stężeniedodatek
5x bufor reakcyjny RPA-10 μL
Białko UvsX5 mg/ml2,6 μl
Białko UvsY5 mg/ml0,9 μl
Białko GP325 mg/ml2,54 μl
Białko Bsu5 mg/ml0,88 μl
Podkład do przodu100 μM0,25 μL
Odwrócony podkład100 μM0,25 μL
ddH2O-24,58 μl
cel-1 μL
*MgCl2100 mM7 μL
Całkowita objętość50 μL
*MgCl2 musi zostać dodany na końcu, aby zainicjować reakcję RPA.

Tabela 4: Skład reakcji RPA.

3. Wykrywanie CRISPR/Cas12a bez SPM

  1. Użyj crRNA (Tabela materiałów) sekwencji docelowej i sondy reporterowej ssDNA łączącej fluorofor i wygaszacz dla CRISPR/Cas12a. Tutaj karboksyltetrametylorodamina (TAMRA) jest połączona jako fluorofor na końcach 5' sond reporterowych ssDNA i Black Hole Quencher-2 (BHQ2) jako wygaszacz na końcach 3'. Szczegółową sekwencję crRNA i reportera ssDNA opisano w tabeli 5.
  2. Przygotować białko Cas12a (LbCas12a) bakterii Lachnospiraceae z 10-krotnym buforem reakcyjnym CRISPR/Cas12a.
  3. Rozpuścić 1 μL produktu reakcji RPA z sekcji 2 w 1x buforze reakcyjnym CRISPR/Cas12a z kompleksami LbCas12a-crRNA i sondą reporterową ssDNA 500 nM w objętości reakcyjnej 100 μL.
  4. Po wymieszaniu LbCas12a i crRNA pozostaw mieszaninę na co najmniej 5 minut, aby utworzyć funkcjonalny kompleks. Po inkubacji dodać inne składniki do mieszaniny reakcyjnej i przeprowadzić całą reakcję w temperaturze 37 °C. Końcowa objętość każdej reakcji CRISPR/Cas12a wynosi 100 μL. Szczegółowe stężenia każdego składnika w każdej reakcji CRISPR/Cas12a opisano w tabeli 6.
  5. Przeprowadzić reakcję detekcji 100 μl CRISPR/Cas12a w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  6. Badaj sygnały fluorescencji w sposób ciągły za pomocą czytnika mikropłytek o długości fali wzbudzenia 535 nm i długości fali emisji 595 nm ze wzmocnieniem 60,
    UWAGA: Detekcja różnych długości fal światła wzbudzonego i emisyjnego zależy od wyboru fluoroforu i wygaszacza w wcześniej zaprojektowanych sondach reporterowych ssDNA.
  7. W przypadku tych zebranych danych podziel wartość kontrolną przez pomiar próbek dodatnich, aby znormalizować wszystkie dane, a następnie zintegruj je w celu analizy testu t dla dwóch prób.
nazwaSekwencja
LbCas12a crRNA dla FV3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT
Reporter ssDNA/5TAMRA/TTATT/3BHQ2

Tabela 5: Sekwencje crRNA CRISPR/Cas12a i reportera ssDNA użyte w tej metodzie.

powiedział: .
składnikPierwotne stężeniedodatek
NEBuffer r2.1 -10 μL
Lba Cas12a (Cpf1)10 μM0,5 μL
Wirus crRNA10 μM0,625 μL
Poczekaj co najmniej 5 minut, aby kompleks LbCas12a/crRNA się połączył
Reporter DNA100 μM0,5 μL
ddH2O-87.375 μL
cel-1 μL
Całkowita objętość-100 μL

Tabela 6: Skład reakcji CRISPR/Cas12a.

4. Konfiguracja SPM

  1. Dla ścieżki wzbudzenia ustaw wiązkę laserową tak, aby przechodziła przez filtry o neutralnej gęstości (ND), aby osłabić intensywność lasera.
  2. Wygeneruj skolimowaną wiązkę z soczewki asferycznej (zwanej dalej L1) i odbij ją przez zwierciadło dichroiczne (DM).
  3. Skieruj światło na szklane szkiełko, na którym próbka jest umieszczana przez obiektyw (20x), aby oświetlić i wzbudzić fluorescencję próbki. Stolik na próbkę umożliwia precyzyjną regulację płaszczyzny ogniskowej, kierując wiązkę światła na tylną płaszczyznę ogniskową obiektywu. Kroki wymienione powyżej tworzą ścieżkę wzbudzenia przyrządu SPM.
  4. Dla ścieżki emisji należy ustawić soczewkę zewnętrzną (zwaną dalej L2) tak, aby utworzyć obraz pośredni po drugiej stronie obiektywu. Obiektyw jednocześnie oświetla próbkę i zbiera sygnał emisyjny.
  5. Zarejestrować sygnał fluorescencji z próbki za pomocą smartfona umieszczonego na końcu ścieżki emisji. Użyj stabilnego wspornika, aby uniknąć potrząsania.
  6. Ustaw filtr pasmowo-przepustowy między L1 a aparatem smartfona, aby odfiltrować wzbudzone światło, jednocześnie pozwalając, aby tylko światło emitowane z próbki dotarło do kamery, co może zoptymalizować wykrywanie.
  7. Unieruchom, w którym konfiguracja SPM znajduje się na płytce stykowej w celu wdrożenia przenośnego.
    UWAGA: Schemat i wygląd fizyczny urządzenia SPM do detekcji fluorescencji w oparciu o reakcję RPA-CRISPR/Cas12a pokazano na Rysunek 2. Detekcja CRISPR/Cas12a odbywa się na wstępnie obrobionym szkiełku szkiełkowym opisanym w następnym kroku.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schemat i fizyczny wygląd urządzenia SPM używanego do wykrywania fluorescencji. (A) Fizyczny wygląd urządzenia SPM do zbierania obrazów fluorescencyjnych po reakcji RPA-CRISPR/Cas12a. (B) Schemat urządzenia SPM do detekcji fluorescencji w oparciu o reakcję RPA-CRISPR/Cas12a. Ten rysunek jest modyfikowany (dostosowana pozycja i kolor obrazu) za zgodą Lei et al.35. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Traktowanie szkiełek szklanych do wykrywania za pomocą SPM

  1. Przygotować polidimetylosiloksan (PDMS), mieszając bazę i utwardzacz w stosunku 10:1, a następnie piec na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C przez 2 godziny.
  2. Traktuj zarówno PDMS, jak i szkiełko podstawowe (długość: 75 mm; Wysokość: 50 mm) z obróbką plazmą tlenową przez 120 s, a następnie ściskać je razem.
  3. Piec szklankę/PDMS w temperaturze 95 °C przez 2 godziny; jest ona trwale uszczelniona spoiwem Si-O-Si. PDMS charakteryzuje się wysoką przezroczystością i brakiem autofluorescencji, co sprzyja wykrywaniu SPM. Obróbka szkiełka szkiełkowego i PMDS jest wykonywana zgodnie z He et al.32

6. Wykrywanie CRISPR/Cas12a za pomocą SPM

  1. Użyj crRNA (Tabela materiałów) sekwencji docelowej i sondy reporterowej ssDNA łączącej fluorofor i wygaszacz dla CRISPR/Cas12a. W tej metodzie karboksyltetrametylorodamina (TAMRA) jest połączona jako fluorofor na końcach 5' sond reporterowych ssDNA i Black Hole Quencher-2 (BHQ2) jako wygaszacz na końcach 3'. Szczegółową sekwencję crRNA i reportera ssDNA opisano w tabeli 5.
  2. Przygotuj białko bakterii Lachnospiraceae Cas12a (LbCas12a) z 10x buforem reakcyjnym CRISPR/Cas12a.
  3. Rozpuścić 1 μL produktu reakcji RPA z sekcji 2 w 1x buforze reakcyjnym CRISPR/Cas12a z kompleksami LbCas12a-crRNA i sondą reporterową ssDNA 500 nM w objętości reakcyjnej 100 μL.
  4. Po wymieszaniu LbCas12a i crRNA pozostaw mieszaninę na co najmniej 5 minut, aby utworzyć funkcjonalny kompleks. Po inkubacji dodać inne składniki do mieszaniny reakcyjnej i zakończyć reakcję w temperaturze 37 °C. Końcowa objętość każdej reakcji CRISPR/Cas12a wynosi 100 μL. Szczegółowe stężenia każdego składnika w każdej reakcji CRISPR/Cas12a opisano w tabeli 6.
  5. Przeprowadzić reakcję detekcji 100 μl CRISPR/Cas12a na szkiełku podstawowym poddanym obróbce i przykryć je szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować szkiełko podstawowe z reakcją w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  6. Zmierz sygnały fluorescencyjne za pomocą SPM. Umieść szklany szkiełko z reakcją detekcji na stoliku SPM, zachowaj odpowiednią odległość, dostosuj ogniskową i klarowność, a następnie poszukaj pola widzenia reakcji i ustaw je, aby uchwycić obraz.
    UWAGA: Najpierw należy uzyskać krzywą wzorcową, aby dane z próbek można było przeskalować do przybliżonego zakresu stężeń. Stosuje się różne stężenia oczyszczonych celów, w tym 10 nM, 1 nM, 100 pM i 10 pM, innego wirusa jako kontrolę negatywną (przed RPA).

7. Rozszerzenie zbioru danych i danych

  1. Zbierz obrazy fluorescencji z testu wykrywania w sekcji 6 jako zestawy danych. Powtórz co najmniej trzy detekcje równoległe dla każdej próbki, aby zapewnić równoległość danych.
    1. Można zatwierdzić kilka odpowiednich sposobów osiągnięcia większej równoległości. Na przykład, zbierając obrazy fluorescencyjne z każdej próbki, ręcznie ustaw ostrość i poszukaj stosunkowo jaśniejszego pola do zrobienia zdjęć. W tym samym czasie sfotografuj każdą próbkę, aby uzyskać sygnał fluorescencyjny w więcej niż pięciu różnych miejscach.
  2. Zmierz średnią wartość szarości każdego obrazu i odchylenie standardowe średniej wartości szarości w grupie stężeń za pomocą ImageJ.
  3. Ustaw zakres intensywności [mediana - odchylenie standardowe, mediana + odchylenie standardowe] dla czyszczenia danych.
    UWAGA: Na obrazach uzyskanych we wczesnych krokach mogą znajdować się obrazy z dużymi różnicami, dlatego konieczne jest przesiewanie obrazów. Jeśli intensywność obrazów wykracza poza ustawiony próg, należy je uznać za wartości odstające i wykluczyć.
  4. Oznacz obrazy dla oczyszczonego celu przy rosnących stężeniach odpowiednio od 0 do 6 w kolejności rosnącej.
  5. Aby zwiększyć niezawodność systemu i zapobiec nadmiernemu dopasowaniu, zaimplementuj techniki powiększania obrazu, takie jak odwracanie w poziomie, odwracanie w pionie i losowy szum za pomocą funkcji transformacji w Pythonie. Pomaga to wprowadzić zmiany w zbiorze danych.

8. Transfer nauki

  1. Jako sieć szkieletową zastosuj model głębokiego uczenia AlexNet33 do klasyfikacji.
  2. Aby spełnić ograniczenie wstępnie wytrenowanego modelu w sekcji 7, przekształć obrazy wejściowe na 224 piksele x 224 piksele x 3 kanały (wysokość i szerokość 224 pikseli oraz głębokość 3 kanałów dla kanałów koloru czerwonego, zielonego i niebieskiego) za pomocą funkcji transformacji w Python.
    UWAGA: Ten krok jest typowym przetwarzaniem wstępnym dla danych heterogenicznych w uczeniu transferowym, w tym transformacji.
  3. Użyj wstępnie wytrenowanej sieci szkieletowej z zestawem danych ImageNet, aby wyodrębnić obiekty, wykorzystując jednocześnie wagę pośrednich ukrytych warstw, które zostały poznane.
  4. W kontekście zadania klasyfikacji fluorescencji zastąp końcową, w pełni połączoną warstwę sieci neuronowej, która pierwotnie zawierała 1000 neuronów dla zadania ImageNet, w pełni połączoną warstwą z 2 lub 7 neuronami.
  5. Oceń wydajność modelu trenowania konfiguracji przy użyciu szeregu wskaźników, w tym macierzy pomyłek, dokładności, precyzji, kompletności i wyniku F1 na podstawie Lawton i Viririri34.

Wyniki

Ta metoda skupia się na szybkim, łatwym do wdrożenia, bardzo czułym i przyłóżkowym systemie wykrywania wirusów DNA w miejscu opieki nad pacjentem. Projekt par starterów dla reakcji RPA i projekt crRNA dla reakcji CRISPR/Cas12a to dwie z podstawowych części, ponieważ wpłyną na wydajność reakcji RPA-CRISPR/Cas12a i wpłyną na późniejsze wykrywanie i klasyfikację.

W tej metodzie, FV3 jest uważany za przykład wykrywania wirusów DNA. Niektóre pary starterów RPA dla FV3 są projektowane, a najbardziej wydajna z nich jest wybierana i upewniana się, że wykazuje dobrą wydajność wzmocnienia, co można potwierdzić, zapewniając jasność i rozmiar pasm za pomocą elektroforezy żelowej produktów RPA, jak wspomniano w kroku 2.8. Równolegle zaprojektowaliśmy crRNA CRISPR/Cas12a i wybraliśmy najbardziej wydajny z nich w oparciu o silniejszy sygnał fluorescencyjny wyzwalany w reakcji CRISPR/Cas12a bez RPA. Sekwencję trzech starterów do przodu i trzech do tyłu dla RPA i trzech crRNA dla Cas12a przedstawiono w tabeli 7. Na podstawie wyników elektroforezy w żelu agarozowym pokazanych na Rysunek 3,szósta para starterów daje lepszą wydajność amplifikacji (F2 i R1), która jest wybrana dla tej metody. Jak pokazano w Rysunek 4, crRNA-3 jest najbardziej efektywny dla rozszczepienia bocznego, które jest wybrane w metodzie.

Podkład do RPA F1ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAG
Podkład do RPA F2ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
Podkład RPA F3TCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCAAAGTGGT
Podkład do RPA R1GGCGTTGAGGATGATGATAATCCCCCGACCTGGG
Podkład RPA R2GGCGTTGAGGATGATGATGATGATATCCCCCGACCTGGGAA
Podkład do RPA R3CGTTGAGGATGATGATGATGATGATCCAATCCCCCGACCTGGGAACG
LbCas12a crRNA-1uaauuucuacuaguguagauATCGACTTGGCCACTTATGACAA
LbCas12a crRNA-2uaauuucuacuaguguaguagauTCAAGGAGCACTACCCCGTGGGG
LbCas12a crRNA-3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT

Tabela 7: Startery RPA i sekwencje crRNA do optymalizacji reakcji.

figure-results-1
Rysunek 3: Wyniki elektroforezy w żelu agarozowym do oceny efektywności RPA. Reakcje RPA przeprowadzono przy użyciu różnych kombinacji starterów w tych samych warunkach z oczyszczoną tarczą o długości 1 nM. Numer 1 został uznany za połączenie RPA-F3 i RPA-R3, 2 jako RPA-F3 i RPA-R2, 3 jako RPA-F3 i RPA-R1, 4 jako RPA-F2 i RPA-R3, 5 jako RPA-F2 i RPA-R2, 6 oznaczało RPA-F2 i RPA-R1, 7 jako RPA-F1 i RPA-R3, 8 jako RPA-F1 i RPA-R2, 9 jako RPA-F1 i RPA-R2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 4: Wykrywanie docelowych fragmentów FV3 z trzema różnymi crRNA przez CRISPR/Cas12a. Stężenia oczyszczonych fragmentów zastosowanych w detekcji wynosiły od 10 nM do 100 pM docelowego DNA w porównaniu z kontrolnym DNA 10 nM przy 30-minutowej inkubacji. Ten rysunek został ponownie wykorzystany za zgodą Lei et al.35. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby wygenerować dane w Rysunek 5, zastosowaliśmy zoptymalizowane startery RPA, crRNA i konfigurację SPM. Aby uzyskać lepsze zrozumienie stężenia w próbkach, amplifikowaliśmy 240 pz fragmenty DNA wysoce konserwatywnego genu głównego kapsydu (MCP) z FV3 i zakaźnego wirusa martwicy śledziony i nerek (ISKNV, Iridoviridae) jako celu i kontroli za pomocą zestawu do amplifikacji PCR, który jest uruchamiany zgodnie z procedurami pokazanymi w Tabeli 8. Wielkość amplifikowanego DNA potwierdza się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a my wyekstrahowaliśmy oczyszczony cel dsDNA i kontrolę z żelu. Oczyszczone fragmenty DNA są oznaczane ilościowo za pomocą spektrofotometru NanoDrop 2000.

figure-results-3
Rysunek 5: Obrazy fluorescencyjne oczyszczonego DNA docelowego i DNA kontrolnego. (A) Kontrola negatywna. (B) Oczyszczony docelowy DNA (100 pM). Ten rysunek został ponownie wykorzystany za zgodą Lei et al.35. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział
scenaTemperatura (°C)GodzinaCykl(e)
Gorący start95 Rozdział 95Czas trwania: 5 min1
denaturacja95 Rozdział 9530 sekund35
Wyżarzanie6045 sekund
rozszerzenie72 Rozdział 7230 sekund
rozszerzenie72 Rozdział 72Czas trwania: 5 min1
składowanie4--

Tabela 8: Procedura amplifikacji PCR.

Tylko dla porównania, po oczyszczeniu danych uzyskuje się zestaw danych zawierający 162 obrazy fluorescencyjne. Liczba obrazów fluorescencyjnych do dalszej analizy musi zostać rozszerzona, a my wytrenowaliśmy zestaw danych, używając 337 obrazów fluorescencyjnych do klasyfikacji binarnej i 398 do klasyfikacji wieloklasowej.

Osiągnęliśmy wykrycie w ciągu około 40 minut, w tym 30 minut dla wzmocnienia RPA i 10 minut dla detekcji LbCas12a po RPA. W przypadku zastosowania opracowanego systemu detekcji z wybranymi starterami RPA i crRNA, natężenie sygnału 10 aM FV3 i kontroli wykazuje istotne różnice, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1.

Rysunek uzupełniający 1: Statystyki intensywności sygnału dla obrazów fluorescencyjnych zebranych w reakcjach RPA-LbCas12a z różnymi stężeniami oczyszczonych fragmentów. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001; : p < 0,0001; F: FV3, I: ISKNV; A.U.: Jednostka absorbancji. Ten rysunek został ponownie wykorzystany za zgodą Lei et al.35. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tej metodzie opracowujemy szybki, łatwy do wdrożenia, wysoce czuły, specyficzny dla sekwencji i POC system wykrywania wirusów DNA z pomocą sztucznej inteligencji. Po uzyskaniu próbek stosuje się RPA w celu amplifikacji sekwencji docelowej, a następnie CRISPR/Cas12a może rozpoznać docelowe DNA i uwolnić fluorescencję, co zwiększa sygnał detekcji. Przenośna mikroskopia smartfonowa jest przystosowana do wykonywania obrazów fluorescencyjnych, a modele głębokiego uczenia z uczeniem transferowym służą do binarnej klasyfikacji obrazów próbek dodatnich i ujemnych. FV3 jest pobierany jako próbka dodatnia w tej metodzie, a następnie badany z wielu perspektyw w celu poprawy specyficzności i czułości proponowanego systemu.

Pierwszą strategią jest zaprojektowanie konkretnych starterów RPA i odsianie najbardziej wydajnych starterów. Na wydajność amplifikacji reakcji RPA mają wpływ różne startery36. Specyficzność starterów używanych do amplifikacji docelowego genu szczepów wirusa DNA może być potwierdzona przez przetarcie ze standardową bazą danych sekwencjonowania nukleotydów. Ponieważ nie ma przewodnika dotyczącego projektowania wydajnych par starterów RPA, wymagana jest walidacja eksperymentalna37.

Innym podejściem jest zaprojektowanie crRNA docelowego wirusa dla reakcji CRISPR/Cas12a, ponieważ skuteczność rozszczepienia pobocznego znacząco przyczynia się do czułości wykrywania38,39. Przy wyborze lepszego crRNA należy wziąć pod uwagę siłę wyzwalanego sygnału fluorescencji w reakcji CRISPR/Cas12a bez RPA. Poza tym aktywność uboczna białka LbCas12a jest stale aktywowana przez 24 godziny32, co może korzystnie wpłynąć na wykrywanie.

W celu identyfikacji wirusów i wizualizacji cząstek wirusowych zastosowano mikroskopię fluorescencyjną40,41. Jednak konwencjonalna mikroskopia jest kłopotliwa i kosztowna w przypadku szybkiej diagnozy POC. W związku z tym w proponowanym systemie zbudowano przenośny SPM o niższych kosztach, aby uzyskać sygnał fluorescencyjny poprzez przechwytywanie obrazów w celu wykrycia POC. Taki przenośny SPM kosztuje znacznie mniej niż komercyjny czytnik płytek lub maszyna do PCR w czasie rzeczywistym, która jest przyjazna dla konfiguracji systemu wykrywania.

Proponowana platforma wymaga również dalszego ulepszenia w niektórych aspektach. Stosując tę platformę detekcji do wykrywania innych wirusów DNA, należy przeprojektować zarówno starter RPA, jak i sekwencję Cas12a-crRNA. Ponieważ nie ma przewodnika dotyczącego ich projektowania, należy przeprowadzić eksperymenty, aby ocenić ich skuteczność. Chociaż proponowany system może spełniać zalety przenośności, rozmiar całego systemu nadal musi zostać jeszcze bardziej zmniejszony, aby uzyskać lżejszy. Ponieważ sam aparat w telefonie komórkowym nie jest łatwy do ustawienia ostrości w przypadku fotografowania z bliskiej odległości, potrzeba czasu, aby dostosować się podczas procesu uzyskiwania obrazów fluorescencyjnych, w tym pola widzenia, w celu uzyskania obrazów o lepszej jakości.

Dzięki postępowi w powiązanych technologiach i ich nowym zastosowaniom, skuteczność wykrywania poc będzie się nadal poprawiać. Przedstawiona tutaj metoda jest jednym z przykładów ulepszenia, które może pomóc w wykrywaniu POC w oparciu o system CRISPR/Cas12a i platformę SPM, z nowatorską pomocą sztucznej inteligencji. Dodatkowo, zintegrowany system może być wykorzystany do identyfikacji dowolnego celu DNA ze względu na możliwość przeprogramowania crRNA. System RPA-CRISPR/Cas12a-AI będzie miał znaczącą pozycję w identyfikacji patogenów DNA pod względem czułości wykrywania, swoistości, czasu i wiarygodności.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin 31970752, Naukę, Technologię, Komisję ds. Innowacji Gminy Shenzhen JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; Otwarte finansowanie Laboratorium Zatoki Shenzhen, SZBL2020090501004; Chińska Fundacja Nauk Podoktoranckich 2020M680023; i Generalnej Administracji Celnej Chińskiej Republiki Ludowej 2021HK007.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20-krotne wzmocnienieOLYMPUSOPLN20X
532 nm zielony laserThorlabsPL201o mocy wyjściowej 0,9 mW
535 nm długość fali odcięciachromAT535
6x bufor ładowania DNAThermo scientificR0611
96-dołkowa mikropłytkaCorning Incorporated3603z płaskim przezroczystym dnem
Soczewka asferycznaLubangN/A
Filtr pasmowoprzepustowySEMROCKFF01-542/27-25
Bsu DNA PolimerazaATG BiotechnologyM103Duży fragment
crRNASangon BiotechN/A
Fragmenty DNASangon BiotechN/A
Uchwyty dichroiczneRuicageN/A
Lustro dichroiczneSEMROCKFF555-Di03-25x36o długości fali granicznej 535 nm
Zestaw do ekstrakcji żelu E.Z.N.AOmega BiotekD2500-02
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)New England Biolabs (Beijing) LTDM0653T
Uchwyty filtrówRuicageN/A
Sondy reporterskie Fluorophore-ssDNA-QuencherSangon BiotechN/ATAMRA (karboksyltetrametylorodamina) jako fluorofor na 5 końcach; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) jako wygaszacz na 3 końcach
GP32ATG BiotechnologyM104
ImageJOpen-sourceWersja 1.53t 24Pobrane z https://imagej.nih.gov/ij/ 
Czytnik mikropłytekSPARK, TECANN/A
Multi-Block thermal Cycler Przyrząd do PCRLongGeneN/A
NanoDrop 2000/2000c SpektrofotometryThermo ScientificND-2000
NEBuffer r2.1New England Biolabs (Beijing) LTDB6002S10x CRISPR/Cas12a Bufor reakcyjny
Obróbka plazmą tlenową Elektrotechnika  Produktyekstrakcji kwasów
nukleinowych, bufor bezpośrednio do PCR z proteinazą K (PINDBK)EbioPINDBK -25 ml
par starterów PCR SangonBiotechN/A
PDMSDow CorningSylgard 184
RPA Pary starterówSangon BiotechN/A
SmartphoneHuaweiMate10
Etapy translacjiRuicageN/A
Filtry o neutralnej gęstościThorlabsND40A
Potrójne soczewki achromatyczneThorlabsTRH127-020-A
UvsXATG BiotechnologyM105
UvsYATG BiotechnologyM106
N/A Pathogen Inactivate, bez

Bibliografia

  1. Gire, S. K., et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Science. 345 (6202), 1369-1372 (2014).
  2. The Ebola Outbreak Epidemiology Team. Outbreak of Ebola virus disease in the Democratic Republic of the Congo, April-May 2018: an epidemiological study. Lancet. 392 (10143), 213-221 (2018).
  3. Zumla, A., Hui, D. S., Perlman, S. Middle East respiratory syndrome. Lancet. 386 (9997), 995-1007 (2015).
  4. Plourde, A. R., Bloch, E. M. A literature review of Zika virus. Emerg Infect Dis. 22 (7), 1185-1192 (2016).
  5. Yuan, X., et al. Current and perspective diagnostic techniques for COVID-19. ACS Infect Dis. 6 (8), 1998-2016 (2020).
  6. Minhaj, F. S., et al. Monkeypox outbreak - nine states, May 2022. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 71 (23), 764-769 (2022).
  7. Bao, M., et al. Challenges and opportunities for clustered regularly interspaced short palindromic repeats based molecular biosensing. ACS Sens. 6 (7), 2497-2522 (2021).
  8. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  9. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  10. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  11. Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).
  12. Mukama, O., et al. An ultrasensitive and specific point-of-care CRISPR/Cas12 based lateral flow biosensor for the rapid detection of nucleic acids. Biosens Bioelectron. 159, 112143(2020).
  13. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  14. Yin, L., Man, S., Ye, S., Liu, G., Ma, L. CRISPR-Cas based virus detection: Recent advances and perspectives. Biosens Bioelectron. 193, 113541(2021).
  15. Dronina, J., Bubniene, U. S., Ramanavicius, A. The application of DNA polymerases and Cas9 as representative of DNA-modifying enzymes group in DNA sensor design (review). Biosens Bioelectron. 175, 112867(2021).
  16. Fozouni, P., et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell. 184 (2), 323-333.e9 (2021).
  17. Kumar, M., et al. FnCas9-based CRISPR diagnostic for rapid and accurate detection of major SARS-CoV-2 variants on a paper strip. eLife. 10, e67130(2021).
  18. Lee, R. A., et al. Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).
  19. Ganguli, A., et al. Hands-free smartphone-based diagnostics for simultaneous detection of Zika, Chikungunya, and Dengue at point-of-care. Biomed Microdevices. 19 (4), 73(2017).
  20. Yeo, S. J., et al. Smartphone-based fluorescent diagnostic system for highly pathogenic H5N1 viruses. Theranostics. 6 (2), 231-242 (2016).
  21. von Chamier, L., et al. Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic. Nat Commun. 12 (1), 2276(2021).
  22. Shiaelis, N., et al. Virus detection and identification in minutes using single-particle imaging and deep learning. ACS Nano. 17 (1), 697-710 (2020).
  23. Liu, Y., et al. Mixed-UNet: Refined class activation mapping for weakly-supervised semantic segmentation with multi-scale inference. Front. Comput. Sci. 4, 1036934(2022).
  24. Lawrimore, J., Doshi, A., Walker, B., Bloom, K. AI-assisted forward modeling of biological structures. Front Cell Dev Biol. 7, 279(2019).
  25. Yang, Y., Hu, Y., Zhang, X., Wang, S. Two-stage selective ensemble of CNN via deep tree training for medical image classification. IEEE Trans Cybern. 52 (9), 9194-9207 (2022).
  26. Zhang, R., et al. RCMNet: A deep learning model assists CAR-T therapy for leukemia. Comput Biol Med. 150, 106084(2022).
  27. Xie, Y., et al. Stroke prediction from electrocardiograms by deep neural network. Multimed Tools Appl. 80, 17291-17297 (2021).
  28. Wang, J., Zhu, H., Wang, S., Zhang, Y. -D. A review of deep learning on medical image analysis. Mobile Netw Appl. 26, 351-380 (2021).
  29. Artoni, P., et al. Deep learning of spontaneous arousal fluctuations detects early cholinergic defects across neurodevelopmental mouse models and patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23298-23303 (2020).
  30. Li, J., et al. DeepLearnMOR: a deep-learning framework for fluorescence image-based classification of organelle morphology. Plant Physiol. 186 (4), 1786-1799 (2021).
  31. Yosinski, J., Clune, J., Bengio, Y., Lipson, H. How transferable are features in deep neural networks. Proceedings of the 27th International Conference on Neural Information Processing Systems. 2, 3320-3328 (2014).
  32. He, Q., et al. High-throughput and all-solution phase African Swine Fever Virus (ASFV) detection using CRISPR-Cas12a and fluorescence based point-of-care system. Biosens Bioelectron. 154, 112068(2020).
  33. Krizhevsky, A., Sutskever, I., Hinton, G. E. ImageNet classification with deep convolutional neural networks. Commun. ACM. 60 (6), 84-90 (2017).
  34. Lawton, S., Viriri, S. Detection of COVID-19 from CT lung scans using transfer learning. Comput Intell Neurosci. 2021, 5527923(2021).
  35. Lei, Z., et al. Detection of frog virus 3 by integrating RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with deep learning. ACS Omega. 8 (36), 32555-32564 (2023).
  36. Chen, Z., Huang, J., Zhang, F., Zhou, Y., Huang, H. Detection of shrimp hemocyte iridescent virus by recombinase polymerase amplification assay. Mol Cell Probes. 49, 101475(2020).
  37. Fu, X., Sun, J., Ye, Y., Zhang, Y., Sun, X. A rapid and ultrasensitive dual detection platform based on Cas12a for simultaneous detection of virulence and resistance genes of drug-resistant Salmonella. Biosens Bioelectron. 195, 113682(2022).
  38. Habimana, J. D., et al. Mechanistic insights of CRISPR/Cas nucleases for programmable targeting and early-stage diagnosis: A review. Biosens Bioelectron. 203, 114033(2022).
  39. Liang, Y., Lin, H., Zou, L., Deng, X., Tang, S. Rapid detection and tracking of Omicron variant of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas12a-based assay. Biosens Bioelectron. 205, 114098(2022).
  40. Sivaraman, D., Biswas, P., Cella, L. N., Yates, M. V., Chen, W. Detecting RNA viruses in living mammalian cells by fluorescence microscopy. Trends Biotechnol. 29 (7), 307-313 (2011).
  41. Wang, I. H., Burckhardt, C. J., Yakimovich, A., Greber, U. F. Imaging, tracking and computational analyses of virus entry and egress with the cytoskeleton. Viruses. 10 (4), 166(2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

diagnostyka w miejscu opieki Point Of Caremikroskopia smartfonowamodel g bokiego uczeniawirus ab 3 Frog Virus 3detekcja sygna u fluorescencyjnegoci cie kolateralneklasyfikacja obraz wocena adunku wirusowego

Powiązane artykuły