Artykuł metodologiczny

System detekcji wirusów DNA oparty na RPA-CRISPR/Cas12a-SPM i głębokim uczeniu

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64833

⸱

10 maja 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Precision Medicine and Healthcare, Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute, 2Institute of Biopharmaceutics and Health Engineering, Tsinghua Shenzhen International Graduate School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy protokół, który łączy amplifikację polimerazy rekombinazy z systemem CRISPR/Cas12a do wykrywania śladów wirusów DNA i tworzy przenośną mikroskopię smartfonów z klasyfikacją wspomaganą sztuczną inteligencją do wykrywania wirusów DNA w miejscu opieki nad pacjentem.

Streszczenie

Informujemy o szybkim, łatwym do wdrożenia, wysoce czułym, specyficznym dla sekwencji i przyłóżkowym (POC) systemie wykrywania wirusów DNA, który łączy w sobie amplifikację polimerazy rekombinazy (RPA) i system CRISPR/Cas12a do wykrywania śladów wirusów DNA. Docelowy DNA jest amplifikowany i rozpoznawany oddzielnie przez RPA i CRISPR/Cas12a, co wyzwala aktywność rozszczepienia pobocznego Cas12a, która rozszczepia reporter DNA znakowany fluoroforem i uogólnia fluorescencję. Do wykrywania POC przenośna mikroskopia smartfonowa jest zbudowana do wykonywania obrazów fluorescencyjnych. Poza tym w systemie wdrożono modele głębokiego uczenia do binarnej klasyfikacji próbek dodatnich lub ujemnych, osiągające wysoką dokładność. Wirus żaby 3 (FV3, rodzaj Ranavirus, rodzina Iridoviridae) został przetestowany jako przykład dla tego systemu wykrywania wirusa DNA POC, a granice wykrywalności (LoD) mogą osiągnąć 10 rano w ciągu 40 minut. Bez wykwalifikowanych operatorów i nieporęcznych urządzeń, przenośny i miniaturowy RPA-CRISPR/Cas12a-SPM z klasyfikacją wspomaganą sztuczną inteligencją (AI) wykazuje ogromny potencjał w wykrywaniu wirusów POC DNA i może pomóc w zapobieganiu rozprzestrzenianiu się takich wirusów.

Wprowadzenie

W ostatnich latach często występowały epidemie chorób zakaźnych wywoływanych przez różne wirusy, w tym epidemia choroby wywołanej wirusem Ebola (EVD) w 20141 i 20182 roku, zespół bliskowschodniegoy respiratorowego (MERS) w 20153 roku, epidemia choroby wywołanej wirusem Zika w 20154 roku, choroba zakaźna COVID-19 wywołana przez koronawirusa SARS-CoV-25 oraz trwająca od 2022 roku epidemia ospy małpiej wywołana przez wirusa ospy małpiej (MKPV)6. Te nagłe wybuchy epidemii chorób zakaźnych powodują dużą liczbę zgonów oraz niosą ze sobą ogromne straty ekonomiczne i niepokoje społeczne. Pilnie potrzebny jest szybki i dokładny system detekcji, aby sprawnie diagnozować infekcje i zapobiegać dalszemu rozprzestrzenianiu się wirusów.

W ostatnim czasie systemy CRISPR (skumulowane regularnie rozmieszczone krótkie palindromiczne powtórzenia) oraz białka Cas (białka związane z CRISPR) zyskały światowe uznanie i wykazały obiecujące wyniki w detekcji kwasów nukleinowych7,8,9,10,11,12,13,14,15. Białko CRISPR/Cas12a, kierowane przez CRISPR RNA (crRNA), wiąże się z docelowym DNA i przecina je. Aktywność ta prowadzi do uwalniania niespecyficznego jednoniciowego DNA (ssDNA), zjawisko to znane jest jako trans-cleavage i może być wykorzystane do wzmocnienia sygnału detekcji kwasów nukleinowych. Niektóre tradycyjne metody detekcji, takie jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), ilościowa PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) oraz test immunoenzymatyczny (ELISA), są skomplikowane, czasochłonne i kosztowne w zastosowaniach w punktach opieki nad pacjentem (POC). W naszej poprzedniej pracy opracowano z sukcesem zautomatyzowany, zintegrowany i tani system detekcji wirusa afrykańskiego pomoru świń (ASFV) w oparciu o technologię CRISPR/Cas12a. W systemie tym osiągnięto granicę detekcji na poziomie 1 pM w czasie 2 h bez konieczności amplifikacji. W celu poprawy czułości i swoistości detekcji śladowych ilości DNA połączono system CRISPR/Cas12a z amplifikacją polimerazy wspomaganą rekombinazą (RPA). W porównaniu z innymi technikami amplifikacji izotermicznej, RPA charakteryzuje się prostą konstrukcją i wygodą obsługi, ponieważ ma krótszy czas reakcji i nie wymaga zaawansowanego sprzętu do kontroli temperatury.

Do detekcji patogenów w punkcie opieki (POC) opracowano instrumenty takie jak mikroskopia smartfonowa (SPM), przenośne fluorometry lub testy paskowe z przepływem bocznym do odczytu wyników16,17,18. SPM rejestruje obrazy za pomocą kamery i przesyła je do aplikacji mobilnych w celu szybkiej analizy danych. Taka mikroskopia stanowi przenośny, tani i zminiaturyzowany system akwizycji sygnałów o wysokiej czułości, wykazując zalety w wykrywaniu patogenów takich jak H5N1, wirus Zika oraz SARS-CoV-219,20. W związku z tym zbudowaliśmy przenośny system SPM do rejestracji sygnałów fluorescencyjnych wyzwalanych przez detekcję docelowego wirusa DNA za pomocą RPA-CRISPR/Cas12a. Sonda raportująca ssDNA łącząca fluorofor i wygaszacz zostanie przecięta, gdy CRISPR/Cas12a rozpozna docelowy wirus DNA, a fluorescencja emitowana przez fluorofor może zostać zarejestrowana przez SPM.

W porównaniu do profesjonalnego oprogramowania zazwyczaj stosowanego do uzyskiwania informacji o wynikach z obrazów fluorescencyjnych z SPM21, niektórzy eksperci wykorzystują uczenie maszynowe i głębokie uczenie do ilościowego określania stężeń DNA wirusa po uzyskaniu obrazów fluorescencyjnych22, co jest bardziej czasochłonne. W przypadku klasyfikacji obrazów medycznych często stosuje się konwolucyjne sieci neuronowe (CNN) do uczenia cech z surowych obrazów zpikselowanych w sposób end-to-end23,24,25,26. W tej dziedzinie z powodzeniem zastosowano popularne modele głębokiego uczenia oparte na CNN, takie jak AlexNet, DenseNet-121 i EfficientNet-B727,28. Jednak pozyskiwanie dużych zbiorów danych w specyficznych dziedzinach może być trudne, co sprawia, że niezbędne staje się uczenie transferowe (transfer learning)29,30. Podejście to polega na wstępnym trenowaniu modelu głębokiego uczenia na dużym zbiorze danych, a tak wytrenowany model służy jako punkt wyjścia dla nowego zadania z małym zbiorem danych. Technika ta może zmniejszyć zapotrzebowanie na duże zbiory danych, przeciwdziałać przeuczeniu (overfitting) oraz skrócić czas trenowania31. W niniejszej pracy wykorzystujemy modele głębokiego uczenia z uczeniem transferowym do binarnej klasyfikacji obrazów fluorescencyjnych próbek pozytywnych i negatywnych.

W tej metodzie łączymy RPA z systemem CRISPR/Cas12a w celu wykrywania śladowych ilości wirusów DNA. Docelowe DNA jest amplifikowane i rozpoznawane osobno przez RPA i CRISPR/Cas12a, co uruchamia aktywność kolateralną nukleazy Cas12a, która przecina znakowany fluoresceina-gaszyciel reporter DNA, generując sygnał fluorescencyjny. Budujemy przenośny system SPM do rejestracji obrazów fluorescencyjnych w diagnostyce w punkcie opieki (POC) oraz opracowujemy modele głębokiego uczenia do klasyfikacji binarnej. Schemat zbudowanego systemu detekcji POC przedstawiono na Rysunku 1. Bez konieczności angażowania wykwalifikowanych operatorów i użycia obszernych instrumentów, system RPA-CRISPR/Cas12a-SPM z klasyfikacją wspomaganą przez sztuczną inteligencję (AI) wykazuje duży potencjał w diagnostyce wirusów DNA w punkcie opieki.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat systemu detekcji RPA-CRISPR/Cas12-SPM wraz z klasyfikacją AI dla zebranych obrazów. Kwasy nukleinowe z próbek pochodzenia zwierzęcego są uwalniane przez PINDBK. Docelowe DNA wirusa jest amplifikowane i specyficznie rozpoznawane przez system RPA-CRISPR/Cas12a. CRISPR/Cas12a wiąże się z crRNA, a kompleks Cas12a-crRNA wiąże się z docelowym DNA, co wyzwala niespecyficzne cięcie (collateral cleavage) sond reporterowych ssDNA przez CRISPR/Cas12a. Fluorofor na reporterze zostaje uwolniony, a fluorescencja jest wykrywana przez komercyjny czytnik płytek lub zbudowany przez nas system SPM. Trzy różne modele głębokiego uczenia, w tym AlexNet, DenseNet-121 i EfficientNet-B7 z wykorzystaniem uczenia transferowego, są używane do klasyfikacji obrazów fluorescencyjnych. Rysunek powtórzono za zgodą Lei et al.35. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Protokół

1. Obróbka próbek

  1. Należy użyć wirusa Frog Virus 3 (FV3, rodzaj Ranavirus, rodzina Iridoviridae), który jest wirusem o dwuniciowym DNA. Jako cel detekcji FV3 wybrano gen głównego białka kapsydu (mcp), ponieważ jest on wysoce konserwatywny i zazwyczaj uznawany za cel wykrywania ranawirusów. Wybrana sekwencja docelowa została przedstawiona w Tabeli 1.
    UWAGA: W niniejszym protokole jako przykład przyjęto Frog Virus 3.
  2. Do przygotowania fragmentów docelowego DNA należy wykorzystać fragmenty DNA genu mcp z FV3 oraz wirusa Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus (ISKNV, inny ranawirus).
    UWAGA: W niniejszym badaniu docelowe fragmenty DNA zostały pozyskane komercyjnie z firmy wymienionej w Tabeli Materiałów. Służą one odpowiednio jako cel i kontrola w dalszej detekcji.
NazwaSekwencja
FV3 MCPNTS: 5’ …gtaacccggctttcGGGCAGCAGTTTCGGTCGGCGTtcccaggtcg… 3’ (240 bp)
TS: 5’ …ccgacctgggaACGCCGACCGAAACTGCTGCCCtgctgcccgaaagc… 3’ (240 bp)
ISKNV MCPNTS: 5’ …ggccatgccaatttTGGGCAGGAGTTTAGTGTGACGgtggcgaggg… 3’ (231 bp)
TS: 5’ …ccctcgccaccgtcACACTAAACTCCTGCCCAAAATtggcatggcc… 3’ (231 bp)

Tabela 1: Sekwencja docelowa wybrana w tej metodzie.

2. Reakcja RPA

  1. Zaprojektować i zsyntezować pary starterów RPA dla sekwencji docelowej. Sekwencje par starterów RPA opisano w Tabeli 2.
  2. Przygotować 5x bufor reakcyjny RPA (Tabela 3) oraz MgCl2 (100 mM).
  3. Wymieszać cztery kluczowe enzymy RPA (białka UvsX, UvsY, GP32, Bsu) w 1x buforze reakcyjnym RPA wraz z wcześniej zaprojektowanymi starterami, zgodnie ze szczegółami w Tabeli 4.
  4. Dokładnie wymieszać mieszaninę za pomocą wirówka typu vortex.
  5. Do każdej reakcji RPA dodać 1 µL produktu docelowego uzyskanego w kroku 1 i ponownie dokładnie wymieszać za pomocą vortexa.
  6. Dodać 7 µL MgCl2 (100 mM), aby zainicjować reakcję. Końcowa objętość każdej reakcji RPA wynosi 50 µL.
  7. Przeprowadzić analizę w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  8. Produkt RPA można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka dni. Ze względu na degradację produktów RPA, należy wykorzystać je do dalszej detekcji jak najszybciej, aby uzyskać lepsze wyniki diagnostyczne.
  9. [Opcjonalnie] Przeprowadzić elektroforezę żelową DNA.
    1. Odebrać 5 µL produktów RPA, dodać odpowiednią objętość 6x buforu do ładowania DNA i przeprowadzić elektroforezę żelową DNA w buforze Tris-octan EDTA (TAE).
    2. Prowadzić elektroforezę pod napięciem 120 V przez około 20 min, aż prążki buforu do ładowania dotrą do dna żelu.
    3. Ustalić, czy sekwencja docelowa została pomyślnie namnożona z próbki, porównując wielkość prążków próbki z prążkami markera.
NazwaSekwencja
Starter RPA FATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
Starter RPA RGGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG

Tabela 2: Startery RPA użyte w tej metodzie.

KomponentStężenie początkoweDodawanie
PEG 20 000-114 mg
ATP100 mM125 μL
dNTP25 mM48 μL
Tris-HCl1 M125 μL
DTT1 M125 μL
Fosfokreatyna1 M250 μL
Kinaza kreatynowa10 μg/μL50 μL
ddH2O2O-277 μL
Objętość całkowita-1 mL

Tabela 3: Skład 5-krotnego buforu do reakcji RPA (pH 7,5).

KomponentStężenie początkoweDodawanie
bufor reakcyjny do RPA 5x-10 μL
białko UvsX5 mg/ml2.6 μL
białko UvsY5 mg/ml0.9 μL
białko GP325 mg/ml2.54 μL
białko Bsu5 mg/ml0.88 μL
starter bezpośredni100 μM0.25 μL
primer wsteczny100 μM0.25 μL
ddH2O2O-24.58 μL
Cel-1 μL
*MgCl22100 mM7 μL
Objętość całkowita50 μL
*MgCl22 należy dodać na samym końcu, aby zainicjować reakcję RPA.

Tabela 4: Skład mieszaniny reakcyjnej RPA.

3. Detekcja CRISPR/Cas12a bez użycia SPM

  1. Należy zastosować crRNA (Tabela Materiałów) dla sekwencji docelowej oraz sondę reporterową ssDNA łączącą fluorofor i wygaszacz dla CRISPR/Cas12a. W tym przypadku jako fluorofor na końcach 5' sond reporterowych ssDNA zastosowano karboksy-tetrametylorodaminę (TAMRA), a jako wygaszacz na końcach 3' Black Hole Quencher-2 (BHQ2). Szczegółowa sekwencja crRNA i reportera ssDNA opisana jest w Tabeli 5.
  2. Należy przygotować białko Cas12a z bakterii Lachnospiraceae bacterium (LbCas12a) z 10x buforem reakcyjnym CRISPR/Cas12a.
  3. 1 µL produktu reakcji RPA z sekcji 2 należy rozpuścić w 1x buforze reakcyjnym CRISPR/Cas12a z kompleksami LbCas12a-crRNA oraz 500 nM sondą reporterową ssDNA w całkowitej objętości reakcji 100 µL.
  4. Po zmieszaniu LbCas12a i crRNA należy odstawić mieszaninę na co najmniej 5 min w celu utworzenia funkcjonalnego kompleksu. Po inkubacji do mieszaniny reakcyjnej należy dodać pozostałe składniki i przeprowadzić całą reakcję w temperaturze 37 °C. Końcowa objętość każdej reakcji CRISPR/Cas12a wynosi 100 µL. Szczegółowe stężenia poszczególnych składników w każdej reakcji CRISPR/Cas12a opisano w Tabeli 6.
  5. Reakcję detekcji CRISPR/Cas12a o objętości 100 µL należy przeprowadzić w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  6. Sygnały fluorescencji należy monitorować w sposób ciągły za pomocą czytnika mikropłytek przy długości fali wzbudzenia 535 nm i długości fali emisji 595 nm z wzmocnieniem (gain) wynoszącym 60.
    UWAGA: Detekcja przy różnych długościach fal wzbudzenia i emisji światła zależy od wyboru fluoroforu i wygaszacza w wcześniej zaprojektowanych sondach reporterowych ssDNA.
  7. W odniesieniu do zebranych danych należy podzielić wartość kontrolną przez pomiar z próbek pozytywnych, aby znormalizować wszystkie dane, a następnie zintegrować je do analizy testem t dla dwóch prób.
NazwaSekwencja
crRNA LbCas12a dla FV3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT
reporter ssDNA/5TAMRA/TTATT/3BHQ2

Tabela 5: Sekwencje crRNA CRISPR/Cas12a oraz raportera ssDNA użyte w tej metodzie.

KomponentStężenie początkoweDodawanie
NEBuffer r2.1 -10 μL
Lba Cas12a (Cpf1)10 μM0.5 μL
crRNA10 μM0.625 μL
Odczekać co najmniej 5 min, aby kompleks LbCas12a/crRNA uległ połączeniu.
reporter DNA100 μM0.5 μL
ddH2O2O-87.375 μL
Cel-1 μL
Objętość całkowita-100 μL

Tabela 6: Skład mieszaniny reakcyjnej CRISPR/Cas12a.

4. Konfiguracja SPM

  1. W torze wzbudzania ustaw wiązkę lasera tak, aby przechodziła przez filtry neutralnej gęstości (ND) w celu osłabienia intensywności lasera.
  2. Wygeneruj wiązkę kolimowaną za pomocą soczewki asferycznej (zwanej dalej L1) i odbij ją za pomocą lustra dichroicznego (DM).
  3. Skieruj światło przez obiektyw (20x) na szkiełko przedmiotowe, na którym umieszczona jest próbka, aby oświetlić ją i wzbudzić fluorescencję próbki. Stolik mikroskopowy umożliwia precyzyjną regulację płaszczyzny ogniskowej, kierując wiązkę do tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu. Powyższe kroki tworzą tor wzbudzania instrumentu SPM.
  4. W torze emisji umieść soczewkę zewnętrzną (zwaną dalej L2), aby utworzyć obraz pośredni po drugiej stronie obiektywu. Obiektyw jednocześnie oświetla próbkę i zbiera sygnał emisji.
  5. Rejestruj sygnał fluorescencji z próbki za pomocą smartfona umieszczonego na końcu toru emisji. Użyj stabilnego uchwytu, aby uniknąć drgań.
  6. Umieść filtr pasmowy między L1 a kamerą smartfona, aby odfiltrować światło wzbudzenia i dopuścić do kamery jedynie światło emitowane z próbki, co pozwoli zoptymalizować detekcję.
  7. Zamocuj układ SPM na płycie optycznej w celu umożliwienia przenośnego zastosowania.
    UWAGA: Schemat i wygląd fizyczny urządzenia SPM do detekcji fluorescencji opartej na reakcji RPA-CRISPR/Cas12a przedstawiono na Rysunku 2. Detekcja CRISPR/Cas12a odbywa się na wstępnie przygotowanym szkiełku przedmiotowym opisanym w następnym kroku.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Schemat i wygląd fizyczny urządzenia SPM użytego do detekcji fluorescencji. (A) Wygląd fizyczny urządzenia SPM do zbierania obrazów fluorescencyjnych po reakcji RPA-CRISPR/Cas12a. (B) Schemat urządzenia SPM do detekcji fluorescencji opartej na reakcji RPA-CRISPR/Cas12a. Rysunek zmodyfikowany (skorygowano położenie obrazu i kolor) za zgodą Lei et al.35. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Przygotowanie szkiełka przedmiotowego do detekcji za pomocą SPM

  1. Przygotować polidimetylosiloksan (PDMS), mieszając bazę z utwardzaczem w stosunku 10:1, a następnie wyprać na płycie grzejnej w temperaturze 80 °C przez 2 h.
  2. Obydwa elementy, PDMS oraz szkiełko przedmiotowe (długość: 75 mm; wysokość: 50 mm), poddać działaniu plazmy tlenowej przez 120 s, a następnie docisnąć je do siebie.
  3. Wyprać strukturę szkło/PDMS w temperaturze 95 °C przez 2 h; zostaje ona trwale zamknięta poprzez wiązanie Si-O-Si. PDMS charakteryzuje się wysoką przezroczystością i brakiem autofluorescencji, co sprzyja detekcji metodą SPM. Obróbkę szkiełka przedmiotowego i PDMS przeprowadzono zgodnie z metodą He i wsp.32

6. Wykrywanie CRISPR/Cas12a za pomocą SPM

  1. Należy użyć crRNA (Tabela materiałów) dla sekwencji docelowej oraz sondy reporterowej ssDNA łączącej fluorofor i wygaszacz dla CRISPR/Cas12a. W tej metodzie karboksy-tetrametylorodamina (TAMRA) jest połączona jako fluorofor na końcach 5' sond reporterowych ssDNA, a Black Hole Quencher-2 (BHQ2) jako wygaszacz na końcach 3'. Szczegółowe sekwencje crRNA i reportera ssDNA opisano w Tabeli 5.
  2. Należy przygotować białko Cas12a z bakterii Lachnospiraceae bacterium (LbCas12a) z 10x buforem do reakcji CRISPR/Cas12a.
  3. 1 µL produktu reakcji RPA z sekcji 2 należy rozpuścić w 1x buforze do reakcji CRISPR/Cas12a z kompleksami LbCas12a-crRNA oraz 500 nM sondy reporterowej ssDNA w końcowej objętości reakcji 100 µL.
  4. Po zmieszaniu LbCas12a i crRNA należy odstawić mieszaninę na co najmniej 5 min w celu utworzenia funkcjonalnego kompleksu. Po inkubacji do mieszaniny reakcyjnej należy dodać pozostałe składniki i przeprowadzić reakcję w temperaturze 37 °C. Końcowa objętość każdej reakcji CRISPR/Cas12a wynosi 100 µL. Szczegółowe stężenia każdego składnika w każdej reakcji CRISPR/Cas12a opisano w Tabeli 6.
  5. Reakcję detekcji CRISPR/Cas12a o objętości 100 µL należy przeprowadzić na wstępnie przygotowanym szkiełku przedmiotowym i przykryć ją szkiełkiem nakrywnym. Szkiełko z reakcją należy inkubować w temperaturze RT przez 10 min.
  6. Sygnały fluorescencji należy zmierzyć za pomocą SPM. Szkiełko z reakcją detekcji należy umieścić na stoliku SPM, zachować odpowiednią odległość, dostosować ogniskową i ostrość, a następnie odnaleźć pole widzenia reakcji i ustawić ostrość w celu wykonania zdjęcia.
    ​UWAGA: W pierwszej kolejności należy wyznaczyć krzywą wzorcową, aby dane z próbek można było przeskalować do przybliżonego zakresu stężeń. Należy użyć różnych stężeń oczyszczonych celów, w tym 10 nM, 1 nM, 100 pM i 10 pM, a jako kontrolę negatywną (przed RPA) innego wirusa.

7. Zbiór danych i augmentacja danych

  1. Obrazy fluorescencyjne z analizy detekcyjnej opisanej w sekcji 6 należy zebrać jako zestawy danych. W celu zapewnienia paralelizmu danych należy powtórzyć detekcję co najmniej trzykrotnie dla każdej próbki.
    1. Dopuszczalne jest zastosowanie odpowiednich metod w celu uzyskania wyższego stopnia paralelizmu. Na przykład podczas pozyskiwania obrazów fluorescencyjnych z każdej próbki, należy ręcznie ustawić ostrość i wyszukać względnie jaśniejsze pole do wykonania zdjęć. Jednocześnie należy sfotografować każdą próbkę, aby uzyskać sygnał fluorescencyjny w więcej niż pięciu różnych miejscach.
  2. Za pomocą programu ImageJ należy zmierzyć średnią wartość szarości każdego obrazu oraz odchylenie standardowe średniej wartości szarości w obrębie grupy stężeń.
  3. W celu oczyszczania danych należy ustawić zakres intensywności [mediana - odchylenie standardowe, mediana + odchylenie standardowe].
    ​UWAGA: W obrazach uzyskanych w poprzednich krokach mogą wystąpić zdjęcia o dużych różnicach, dlatego konieczna jest ich selekcja. Jeśli intensywność obrazów wykracza poza ustalony próg, należy uznać je za wartości odstające i wykluczyć.
  4. Obrazy oczyszczonego celu o rosnących stężeniach należy oznaczyć liczbami od 0 do 6 w kolejności rosnącej.
  5. Aby zwiększyć odporność systemu i zapobiec przeuczeniu (over-fitting), należy zastosować techniki augmentacji obrazu, takie jak poziome i pionowe odbicie lustrzane oraz szum losowy, wykorzystując funkcje transformacji w języku Python. Pozwala to na wprowadzenie zróżnicowania do zestawu danych.

8. Transfer learning

  1. W charakterze sieci bazowej (backbone) zastosowano model głębokiego uczenia AlexNet33 do celów klasyfikacji.
  2. Aby spełnić wymogi modelu wstępnie wytrenowanego opisane w sekcji 7, obraz wejściowy przekształcono za pomocą funkcji transformujących w języku Python do wymiarów 224 pixels x 224 pixels x 3 channels (wysokość i szerokość 224 pixels oraz głębokość 3 channels odpowiadająca kanałom kolorów czerwonego, zielonego i niebieskiego).
    UWAGA: Krok ten jest powszechną metodą wstępnego przetwarzania heterogenicznych danych w uczeniu transferowym, obejmującą transformację.
  3. Wykorzystano sieć bazową wstępnie wytrenowaną na zbiorze danych ImageNet w celu ekstrakcji cech, wykorzystując przy tym wyuczone wagi pośrednich warstw ukrytych.
  4. W kontekście zadania klasyfikacji fluorescencji końcową w pełni połączoną warstwę sieci neuronowej, która pierwotnie zawierała 1000 neuronów dla zadania ImageNet, zastąpiono warstwą w pełni połączoną zawierającą 2 lub 7 neuronów.
  5. Wydajność wytrenowanego modelu oceniono za pomocą zestawu metryk, w tym macierzy pomyłek, dokładności (accuracy), precyzji (precision), czułości (recall) oraz wskaźnika F1-score, zgodnie z metodologią Lawton i Viriri34.

Wyniki

Ta metoda koncentruje się na szybkim, łatwym w implementacji, wysoce czułym systemie detekcji w punkcie opieki (POC) dla wirusów DNA. Projektowanie par starterów do reakcji RPA oraz projektowanie crRNA do reakcji CRISPR/Cas12a to dwa kluczowe elementy, ponieważ wpływają one na wydajność reakcji RPA-CRISPR/Cas12a oraz determinują późniejszą detekcję i klasyfikację.

W tej metodzie FV3 służy jako przykład detekcji wirusa DNA. Zaprojektowano kilka par starterów RPA dla FV3, a następnie wybrano najskuteczniejszą z nich, upewniając się, że wykazuje ona wysoką wydajność amplifikacji, co potwierdzono poprzez analizę jasności i wielkości prążków w elektroforezie żelowej produktów RPA, zgodnie z opisem w kroku 2.8. Jednocześnie zaprojektowano crRNA dla CRISPR/Cas12a i wybrano najskuteczniejszą sekwencję na podstawie silniejszego sygnału fluorescencji wywołanego w reakcji CRISPR/Cas12a bez udziału RPA. Sekwencje trzech starterów przednich i trzech tylnych do RPA oraz trzech crRNA dla Cas12a przedstawiono w Tabeli 7. Na podstawie wyników elektroforezy w żelu agarozowym przedstawionych na Rysunku 3, 6ta para starterów (F2 i R1) wykazuje lepszą wydajność amplifikacji i została wybrana do tej metody. Jak pokazano na Rysunku 4, crRNA-3 jest najskuteczniejsza w procesie cięcia pobocznego (collateral cleavage) i została wybrana do zastosowania w metodzie.

Starter RPA F1ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAG
Starter RPA F2ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
Starter RPA F3TCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAGTGGT
starter RPA R1GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG
Starter RPA R2GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAA
Starter RPA R3CGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAACG
LbCas12a crRNA-1uaauuucuacuaaguguagauATCGACTTGGCCACTTATGACAA
LbCas12a crRNA-2uaauuucuacuaaguguagauTCAAGGAGCACTACCCCGTGGGG
LbCas12a crRNA-3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT

Tabela 7: Sekwencje starterów RPA i crRNA do optymalizacji reakcji.

figure-results-1
Rysunek 3: Wyniki elektroforezy w żelu agarozy służącej do oceny wydajności RPA. Reakcje RPA przeprowadzono z użyciem różnych kombinacji starterów w tych samych warunkach z wykorzystaniem 1 nM oczyszczonego celu. Numer 1 oznaczał kombinację RPA-F3 i RPA-R3, 2 – RPA-F3 i RPA-R2, 3 – RPA-F3 i RPA-R1, 4 – RPA-F2 i RPA-R3, 5 – RPA-F2 i RPA-R2, 6 reprezentował RPA-F2 i RPA-R1, 7 – RPA-F1 i RPA-R3, 8 – RPA-F1 i RPA-R2 oraz 9 – RPA-F1 i RPA-R2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 4: Detekcja fragmentów docelowych FV3 za pomocą trzech różnych crRNA przez system CRISPR/Cas12a. Stężenia oczyszczonych fragmentów zastosowane w detekcji wynosiły od 10 nM do 100 pM DNA docelowego w stosunku do 10 nM DNA kontrolnego przy 30 min inkubacji. Rycina została powtórzona za zgodą Lei i wsp.35. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aby uzyskać dane przedstawione na Rysunku 5, zastosowano zoptymalizowane primery RPA, crRNA oraz układ SPM. W celu dokładniejszego określenia stężenia w próbkach, za pomocą zestawu do amplifikacji PCR przeprowadzono amplifikację 240 bp fragmentów DNA wysoce konserwatywnego genu głównego białka kapsydu (MCP) z FV3 oraz wirusa infekcyjnej nekrozy śledziony i nerek (ISKNV, Iridoviridae) jako celu i kontroli, zgodnie z procedurami przedstawionymi w Tabeli 8. Wielkość amplifikowanego DNA potwierdzono za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie z żelu wyekstrahowano oczyszczony docelowy dsDNA oraz kontrolę. Ilość oczyszczonych fragmentów DNA określono przy użyciu spektrofotometru NanoDrop 2000.

figure-results-3
Rysunek 5: Obrazy fluorescencyjne oczyszczonego docelowego DNA oraz DNA kontrolnego. (A) Kontrola negatywna. (B) Oczyszczone docelowe DNA (100 pM). Rysunek powtórzony za zgodą Lei i wsp.35. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

EtapTemperatura (°C)CzasCykl(e)
Gorący start955 min1
Denaturacja9530 s35
Wyżarzanie6045 s
Rozszerzenie7230 s
Rozszerzenie725 min1
Przechowywanie4--

Tabela 8: Procedura amplifikacji PCR.

Wyłącznie do celów referencyjnych, po oczyszczeniu danych uzyskano zbiór danych obejmujący 162 obrazy fluorescencyjne. Liczba obrazów fluorescencyjnych do dalszej analizy wymagała zwiększenia, dlatego zbiór danych rozszerzono, wykorzystując 337 obrazów fluorescencyjnych do klasyfikacji binarnej oraz 398 do klasyfikacji wieloklasowej.

Detekcję osiągnięto w czasie około 40 min, w tym 30 min na amplifikację RPA oraz 10 min na detekcję LbCas12a po RPA. Przy zastosowaniu opracowanego systemu detekcji z wybranymi starterami RPA i crRNA, intensywność sygnału dla 10 aM FV3 oraz kontroli wykazuje znaczące różnice, co przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1.

Rycina uzupełniająca 1: Statystyki intensywności sygnału dla obrazów fluorescencyjnych zebranych w reakcjach RPA-LbCas12a z różnymi stężeniami oczyszczonych fragmentów. *: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001; ****: p < 0.0001; F: FV3, I: ISKNV; a.u.: jednostka absorbancji. Rycina została powtórzona za zgodą Lei et al.35. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W tej metodzie opracowujemy szybki, łatwy do wdrożenia, wysoce czuły, specyficzny dla sekwencji i POC system wykrywania wirusów DNA z pomocą sztucznej inteligencji. Po uzyskaniu próbek stosuje się RPA w celu amplifikacji sekwencji docelowej, a następnie CRISPR/Cas12a może rozpoznać docelowe DNA i uwolnić fluorescencję, co zwiększa sygnał detekcji. Przenośna mikroskopia smartfonowa jest przystosowana do wykonywania obrazów fluorescencyjnych, a modele głębokiego uczenia z uczeniem transferowym służą do binarnej klasyfikacji obrazów próbek dodatnich i ujemnych. FV3 jest pobierany jako próbka dodatnia w tej metodzie, a następnie badany z wielu perspektyw w celu poprawy specyficzności i czułości proponowanego systemu.

Pierwszą strategią jest zaprojektowanie konkretnych starterów RPA i odsianie najbardziej wydajnych starterów. Na wydajność amplifikacji reakcji RPA mają wpływ różne startery36. Specyficzność starterów używanych do amplifikacji docelowego genu szczepów wirusa DNA może być potwierdzona przez przetarcie ze standardową bazą danych sekwencjonowania nukleotydów. Ponieważ nie ma przewodnika dotyczącego projektowania wydajnych par starterów RPA, wymagana jest walidacja eksperymentalna37.

Innym podejściem jest zaprojektowanie crRNA docelowego wirusa dla reakcji CRISPR/Cas12a, ponieważ skuteczność rozszczepienia pobocznego znacząco przyczynia się do czułości wykrywania38,39. Przy wyborze lepszego crRNA należy wziąć pod uwagę siłę wyzwalanego sygnału fluorescencji w reakcji CRISPR/Cas12a bez RPA. Poza tym aktywność uboczna białka LbCas12a jest stale aktywowana przez 24 godziny32, co może korzystnie wpłynąć na wykrywanie.

W celu identyfikacji wirusów i wizualizacji cząstek wirusowych zastosowano mikroskopię fluorescencyjną40,41. Jednak konwencjonalna mikroskopia jest kłopotliwa i kosztowna w przypadku szybkiej diagnozy POC. W związku z tym w proponowanym systemie zbudowano przenośny SPM o niższych kosztach, aby uzyskać sygnał fluorescencyjny poprzez przechwytywanie obrazów w celu wykrycia POC. Taki przenośny SPM kosztuje znacznie mniej niż komercyjny czytnik płytek lub maszyna do PCR w czasie rzeczywistym, która jest przyjazna dla konfiguracji systemu wykrywania.

Proponowana platforma wymaga również dalszego ulepszenia w niektórych aspektach. Stosując tę platformę detekcji do wykrywania innych wirusów DNA, należy przeprojektować zarówno starter RPA, jak i sekwencję Cas12a-crRNA. Ponieważ nie ma przewodnika dotyczącego ich projektowania, należy przeprowadzić eksperymenty, aby ocenić ich skuteczność. Chociaż proponowany system może spełniać zalety przenośności, rozmiar całego systemu nadal musi zostać jeszcze bardziej zmniejszony, aby uzyskać lżejszy. Ponieważ sam aparat w telefonie komórkowym nie jest łatwy do ustawienia ostrości w przypadku fotografowania z bliskiej odległości, potrzeba czasu, aby dostosować się podczas procesu uzyskiwania obrazów fluorescencyjnych, w tym pola widzenia, w celu uzyskania obrazów o lepszej jakości.

Dzięki postępowi w powiązanych technologiach i ich nowym zastosowaniom, skuteczność wykrywania poc będzie się nadal poprawiać. Przedstawiona tutaj metoda jest jednym z przykładów ulepszenia, które może pomóc w wykrywaniu POC w oparciu o system CRISPR/Cas12a i platformę SPM, z nowatorską pomocą sztucznej inteligencji. Dodatkowo, zintegrowany system może być wykorzystany do identyfikacji dowolnego celu DNA ze względu na możliwość przeprogramowania crRNA. System RPA-CRISPR/Cas12a-AI będzie miał znaczącą pozycję w identyfikacji patogenów DNA pod względem czułości wykrywania, swoistości, czasu i wiarygodności.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin 31970752, Naukę, Technologię, Komisję ds. Innowacji Gminy Shenzhen JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; Otwarte finansowanie Laboratorium Zatoki Shenzhen, SZBL2020090501004; Chińska Fundacja Nauk Podoktoranckich 2020M680023; i Generalnej Administracji Celnej Chińskiej Republiki Ludowej 2021HK007.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20-krotne wzmocnienieOLYMPUSOPLN20X
532 nm zielony laserThorlabsPL201o mocy wyjściowej 0,9 mW
535 nm długość fali odcięciachromAT535
6x bufor ładowania DNAThermo scientificR0611
96-dołkowa mikropłytkaCorning Incorporated3603z płaskim przezroczystym dnem
Soczewka asferycznaLubangN/A
Filtr pasmowoprzepustowySEMROCKFF01-542/27-25
Bsu DNA PolimerazaATG BiotechnologyM103Duży fragment
crRNASangon BiotechN/A
Fragmenty DNASangon BiotechN/A
Uchwyty dichroiczneRuicageN/A
Lustro dichroiczneSEMROCKFF555-Di03-25x36o długości fali granicznej 535 nm
Zestaw do ekstrakcji żelu E.Z.N.AOmega BiotekD2500-02
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)New England Biolabs (Beijing) LTDM0653T
Uchwyty filtrówRuicageN/A
Sondy reporterskie Fluorophore-ssDNA-QuencherSangon BiotechN/ATAMRA (karboksyltetrametylorodamina) jako fluorofor na 5 końcach; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) jako wygaszacz na 3 końcach
GP32ATG BiotechnologyM104
ImageJOpen-sourceWersja 1.53t 24Pobrane z https://imagej.nih.gov/ij/ 
Czytnik mikropłytekSPARK, TECANN/A
Multi-Block thermal Cycler Przyrząd do PCRLongGeneN/A
NanoDrop 2000/2000c SpektrofotometryThermo ScientificND-2000
NEBuffer r2.1New England Biolabs (Beijing) LTDB6002S10x CRISPR/Cas12a Bufor reakcyjny
Obróbka plazmą tlenową Elektrotechnika  Produktyekstrakcji kwasów
nukleinowych, bufor bezpośrednio do PCR z proteinazą K (PINDBK)EbioPINDBK -25 ml
par starterów PCR SangonBiotechN/A
PDMSDow CorningSylgard 184
RPA Pary starterówSangon BiotechN/A
SmartphoneHuaweiMate10
Etapy translacjiRuicageN/A
Filtry o neutralnej gęstościThorlabsND40A
Potrójne soczewki achromatyczneThorlabsTRH127-020-A
UvsXATG BiotechnologyM105
UvsYATG BiotechnologyM106
N/A Pathogen Inactivate, bez

Bibliografia

  1. Gire, S. K., et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Science. 345 (6202), 1369-1372 (2014).
  2. The Ebola Outbreak Epidemiology Team. Outbreak of Ebola virus disease in the Democratic Republic of the Congo, April-May 2018: an epidemiological study. Lancet. 392 (10143), 213-221 (2018).
  3. Zumla, A., Hui, D. S., Perlman, S. Middle East respiratory syndrome. Lancet. 386 (9997), 995-1007 (2015).
  4. Plourde, A. R., Bloch, E. M. A literature review of Zika virus. Emerg Infect Dis. 22 (7), 1185-1192 (2016).
  5. Yuan, X., et al. Current and perspective diagnostic techniques for COVID-19. ACS Infect Dis. 6 (8), 1998-2016 (2020).
  6. Minhaj, F. S., et al. Monkeypox outbreak - nine states, May 2022. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 71 (23), 764-769 (2022).
  7. Bao, M., et al. Challenges and opportunities for clustered regularly interspaced short palindromic repeats based molecular biosensing. ACS Sens. 6 (7), 2497-2522 (2021).
  8. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  9. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  10. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  11. Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).
  12. Mukama, O., et al. An ultrasensitive and specific point-of-care CRISPR/Cas12 based lateral flow biosensor for the rapid detection of nucleic acids. Biosens Bioelectron. 159, 112143(2020).
  13. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  14. Yin, L., Man, S., Ye, S., Liu, G., Ma, L. CRISPR-Cas based virus detection: Recent advances and perspectives. Biosens Bioelectron. 193, 113541(2021).
  15. Dronina, J., Bubniene, U. S., Ramanavicius, A. The application of DNA polymerases and Cas9 as representative of DNA-modifying enzymes group in DNA sensor design (review). Biosens Bioelectron. 175, 112867(2021).
  16. Fozouni, P., et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell. 184 (2), 323-333.e9 (2021).
  17. Kumar, M., et al. FnCas9-based CRISPR diagnostic for rapid and accurate detection of major SARS-CoV-2 variants on a paper strip. eLife. 10, e67130(2021).
  18. Lee, R. A., et al. Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).
  19. Ganguli, A., et al. Hands-free smartphone-based diagnostics for simultaneous detection of Zika, Chikungunya, and Dengue at point-of-care. Biomed Microdevices. 19 (4), 73(2017).
  20. Yeo, S. J., et al. Smartphone-based fluorescent diagnostic system for highly pathogenic H5N1 viruses. Theranostics. 6 (2), 231-242 (2016).
  21. von Chamier, L., et al. Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic. Nat Commun. 12 (1), 2276(2021).
  22. Shiaelis, N., et al. Virus detection and identification in minutes using single-particle imaging and deep learning. ACS Nano. 17 (1), 697-710 (2020).
  23. Liu, Y., et al. Mixed-UNet: Refined class activation mapping for weakly-supervised semantic segmentation with multi-scale inference. Front. Comput. Sci. 4, 1036934(2022).
  24. Lawrimore, J., Doshi, A., Walker, B., Bloom, K. AI-assisted forward modeling of biological structures. Front Cell Dev Biol. 7, 279(2019).
  25. Yang, Y., Hu, Y., Zhang, X., Wang, S. Two-stage selective ensemble of CNN via deep tree training for medical image classification. IEEE Trans Cybern. 52 (9), 9194-9207 (2022).
  26. Zhang, R., et al. RCMNet: A deep learning model assists CAR-T therapy for leukemia. Comput Biol Med. 150, 106084(2022).
  27. Xie, Y., et al. Stroke prediction from electrocardiograms by deep neural network. Multimed Tools Appl. 80, 17291-17297 (2021).
  28. Wang, J., Zhu, H., Wang, S., Zhang, Y. -D. A review of deep learning on medical image analysis. Mobile Netw Appl. 26, 351-380 (2021).
  29. Artoni, P., et al. Deep learning of spontaneous arousal fluctuations detects early cholinergic defects across neurodevelopmental mouse models and patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23298-23303 (2020).
  30. Li, J., et al. DeepLearnMOR: a deep-learning framework for fluorescence image-based classification of organelle morphology. Plant Physiol. 186 (4), 1786-1799 (2021).
  31. Yosinski, J., Clune, J., Bengio, Y., Lipson, H. How transferable are features in deep neural networks. Proceedings of the 27th International Conference on Neural Information Processing Systems. 2, 3320-3328 (2014).
  32. He, Q., et al. High-throughput and all-solution phase African Swine Fever Virus (ASFV) detection using CRISPR-Cas12a and fluorescence based point-of-care system. Biosens Bioelectron. 154, 112068(2020).
  33. Krizhevsky, A., Sutskever, I., Hinton, G. E. ImageNet classification with deep convolutional neural networks. Commun. ACM. 60 (6), 84-90 (2017).
  34. Lawton, S., Viriri, S. Detection of COVID-19 from CT lung scans using transfer learning. Comput Intell Neurosci. 2021, 5527923(2021).
  35. Lei, Z., et al. Detection of frog virus 3 by integrating RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with deep learning. ACS Omega. 8 (36), 32555-32564 (2023).
  36. Chen, Z., Huang, J., Zhang, F., Zhou, Y., Huang, H. Detection of shrimp hemocyte iridescent virus by recombinase polymerase amplification assay. Mol Cell Probes. 49, 101475(2020).
  37. Fu, X., Sun, J., Ye, Y., Zhang, Y., Sun, X. A rapid and ultrasensitive dual detection platform based on Cas12a for simultaneous detection of virulence and resistance genes of drug-resistant Salmonella. Biosens Bioelectron. 195, 113682(2022).
  38. Habimana, J. D., et al. Mechanistic insights of CRISPR/Cas nucleases for programmable targeting and early-stage diagnosis: A review. Biosens Bioelectron. 203, 114033(2022).
  39. Liang, Y., Lin, H., Zou, L., Deng, X., Tang, S. Rapid detection and tracking of Omicron variant of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas12a-based assay. Biosens Bioelectron. 205, 114098(2022).
  40. Sivaraman, D., Biswas, P., Cella, L. N., Yates, M. V., Chen, W. Detecting RNA viruses in living mammalian cells by fluorescence microscopy. Trends Biotechnol. 29 (7), 307-313 (2011).
  41. Wang, I. H., Burckhardt, C. J., Yakimovich, A., Greber, U. F. Imaging, tracking and computational analyses of virus entry and egress with the cytoskeleton. Viruses. 10 (4), 166(2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

diagnostyka w miejscu opieki (Point Of Care)mikroskopia smartfonowamodel głębokiego uczeniawirus żab 3 (Frog Virus 3)detekcja sygnału fluorescencyjnegocięcie kolateralneklasyfikacja obrazówocena ładunku wirusowego
System detekcji wirusów DNA oparty na RPA-CRISPR/Cas12a-SPM i głębokim uczeniu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.