Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przeszczep dootrzewnowy w celu wywołania ostrej białaczki szpikowej u myszy

2.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64834

⸱

6 stycznia 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Center for Molecular Immunology and Infectious Disease and Center for Molecular Toxicology and Carcinogenesis, Penn State Cancer Institute, The Pennsylvania State University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj dootrzewnowe wstrzykiwanie komórek białaczkowych jest wykorzystywane do wykrywania i rozprzestrzeniania ostrej białaczki szpikowej (AML) u myszy. Ta nowa metoda jest skuteczna w seryjnym przeszczepianiu komórek AML i może służyć jako alternatywa dla osób, które mogą doświadczać trudności i niespójności podczas wstrzykiwania dożylnego myszom.

Streszczenie

Istnieje niezaspokojona potrzeba nowych terapii w leczeniu ostrej białaczki szpikowej (AML) i związanego z nią nawrotu, który dotyczy komórek macierzystych przetrwałej białaczki (LSC). Eksperymentalny model gryzoni z ostrą białaczką szpikową (AML) do testowania terapii opartych na skutecznym przeszczepianiu tych komórek za pomocą zastrzyków zaoczodołowych u myszy biorców jest najeżony wyzwaniami. Celem tego badania było opracowanie łatwej, niezawodnej i spójnej metody generowania solidnego mysiego modelu AML przy użyciu drogi dootrzewnowej. W niniejszym protokole komórki szpiku kostnego były transdukowane retrowirusem eksprymującym ludzką onkoproteinę fuzyjną MLL-AF9. Zbadano skuteczność populacji lineage ujemnych (Lin-) i Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) jako LSC dawców w rozwoju pierwotnej AML, a wstrzyknięcie dootrzewnowe przyjęto jako nową metodę generowania AML. Porównanie między iniekcjami dootrzewnowymi i zaoczodołowymi przeprowadzono w przeszczepach seryjnych w celu porównania i skontrastowania obu metod. Zarówno komórki Lin, jak i LSK transdukowane ludzkim wirusem MLL-AF9 dobrze wszczepiają się w szpik kostny i śledzionę biorców, prowadząc do pełnoobjawowej AML. Dootrzewnowe wstrzyknięcie komórek dawcy spowodowało AML u biorców po seryjnym przeszczepie, a naciekanie komórek AML wykryto we krwi, szpiku kostnym, śledzionie i wątrobie biorców za pomocą cytometrii przepływowej, qPCR i analiz histologicznych. Tak więc wstrzyknięcie dootrzewnowe jest skuteczną metodą indukcji AML wykorzystującą seryjne przeszczepianie komórek białaczkowych dawcy.

Wprowadzenie

Ostra białaczka szpikowa (AML) to rodzaj nowotworu hematologicznego o zróżnicowanej etiologii ze złym rokowaniem1. Generowanie modeli zwierzęcych AML stanowi podstawę do zrozumienia jego złożonych odmian i patobiologii w celu odkrycia nowych terapii2. Leukemogeneza u myszy polega na przeszczepieniu komórek dawcy wykazujących ekspresję onkoprotein fuzyjnych, w tym fuzji z udziałem genu białaczki mieszanej (MLL) w celu silnego wywołania AML, w celu naśladowania choroby u ludzi3. Różne pochodzenie komórkowe komórek dawcy zostało zgłoszone w transplantacji AML4, przy czym bardzo niewiele wiadomo o komórkach odpowiedzialnych za pochodzenie choroby.

Opracowano wiele dróg do przeszczepu u myszy; zamiast iniekcji doudowej, która bezpośrednio wprowadza zmutowane komórki dawcy do szpiku kostnego5, dożylne wstrzyknięcie, które wykorzystuje splot zatoki żylnej, żyłę ogonową i żyłę szyjną, było szeroko stosowane do generowania mysich modeli AML6,7,8,9. W przypadku iniekcji retro-orbitalnej (r.o.) różne nieodłączne wady, takie jak ograniczenie objętości, wysokie wymagania techniczne, małe szanse na powtórzenie prób lub błędów oraz potencjalne urazy oka, były głównymi przeszkodami z ograniczonymi lub żadnymi realnymi alternatywami7. Iniekcja żyły ogonowej może mieć podobne problemy poza miejscowymi urazami; Aby ułatwić procedurę, myszy często muszą być rozgrzane, aby rozszerzyły swoje żyły ogonowe10. Trudno jest również zlokalizować żyłę ogonową bez dodatkowego źródła światła, szczególnie u myszy szczepu C57BL/6. W przypadku iniekcji do żyły szyjnej personel badawczy wymaga odpowiedniego przeszkolenia, aby zlokalizować żyłę i ograniczyć możliwe powikłania. Ponadto zarówno iniekcje do zatok żylnych, jak i żył szyjnych muszą być wykonywane w znieczuleniu, co dodaje kolejny poziom złożoności. W związku z tym kuszące jest zbadanie nowych dróg transplantacji, aby ułatwić ustanowienie mysich modeli AML.

Wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) jest powszechnie stosowane do podawania leków, barwników i środków znieczulających11,12,13,14,15; był również używany do wprowadzania komórek krwiotwórczych do hematopoezy ektopowej16 oraz do przeszczepiania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego u różnych myszy models17,18,19,20,21. Jednak rzadko stosuje się go do ustalania nowotworów układu krwiotwórczego u myszy, szczególnie w celu zbadania progresji choroby AML.

Niniejsze badanie opisuje wykonalność iniekcji i.p. w generowaniu modeli myszy AML, dodatkowo porównując skuteczność przeszczepu populacji lineage ujemnych (Lin-) i Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) jako komórek dawcy. Odkrycia te zapewniają prosty i skuteczny sposób generowania eksperymentalnych modeli AML i pokrewnych białaczek szpikowych. Taka metoda ma potencjał, aby pogłębić nasze zrozumienie mechanizmów choroby, a także zapewnić stosunkowo łatwy model do testowania eksperymentalnych terapii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały wstępnie zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Stanowym Pensylwanii.

1. Przygotowanie i odczynników

  1. Przygotować płytki agarowe LB z dodatkiem ampicyliny (AP) (sterylne płytki 10 cm). Aby to zrobić, rozpuść 10 g bulionu LB z agarem w 400 ml wody destylowanej, wymieszaj i zwiększ objętość do 500 ml. Wysterylizuj roztwór przez autoklawowanie, następnie pozwól roztworowi ostygnąć, dodaj 0,5 ml ampicyliny (zapas: 150 mg/ml) do roztworu i wstrząśnij do wymieszania. Natychmiast dodać 18 ml roztworu do sterylnej płytki o długości 10 cm w pobliżu lampy alkoholowej, pozostawić do zestalenia w temperaturze pokojowej i przechowywać płytki do góry nogami w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  2. Przygotować pożywkę LB, rozpuszczając 10 g LB bez agaru w 500 ml wody destylowanej. Wysterylizuj roztwór w autoklawie, poczekaj, aż roztwór ostygnie, dodaj 0,5 ml ampicyliny (zapas: 150 mg/ml) do roztworu i wstrząśnij, aby wymieszać.
  3. Przygotować bufor przepływowy, dodając 5 ml penicyliny/streptomycyny i 10 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (hiFBS) do 485 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS).
    UWAGA: Aby dezaktywować FBS przez ogrzewanie, umieść rozmrożone butelki FBS w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C. Upewnij się, że butelki nie przewracają się ani w inny sposób nie zanurzają się w łaźni wodnej. Temperatura ma kluczowe znaczenie dla całkowitej degradacji; Aby to zapewnić, poczekaj, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 56 °C po włożeniu butelek do łaźni wodnej. Delikatnie obracaj butelki co 10 minut trzy razy. Nie dopuścić do inkubacji surowicy dłużej niż 30 minut.
  4. Przygotuj pożywkę konserwacyjną, dodając 50 ml hiFBS, 5 ml L-glutaminy i 5 ml penicyliny/streptomycyny do 440 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle Medium (DMEM). Przygotuj pożywkę do transfekcji, dodając 50 ml hiFBS i 5 ml L-glutaminy do 445 ml pożywki DMEM.
  5. Przygotować bufor do lizy krwinek czerwonych (RBC), dodając 4,145 g NH4Cl, 0,504 g NaHCO3 i 16,81 mg kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do 500 ml wody destylowanej. Przygotuj niekompletną pożywkę zmodyfikowaną Dulbecco (IMDM) firmy Iscove, dodając 75 ml hiFBS, 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 ml insuliny 10 mg/mL, 2,5 ml 4 mg/ml holotransferyny, 3,5 μl β-merkaptoetanolu, 5 ml L-glutaminy i 0,5 ml cyprofloksacyny do 416,5 ml pożywki IMDM.
  6. Przygotować 10 ml 2x pożywki IMDM, w której stężenie cytokin jest dwukrotnie większe niż ilość w 1x pożywce IMDM, dodając 10 μL 50 ng/μL mr-SCF, 20 μL 25 ng/μL mr-Flt3L, 20 μL 10 ng/μL mr-IL-6, 20 μL 10 ng/μL mr-IL-3, 10 μl insuliny 10 mg/ml i 50 μl 4 mg/ml holotransferyny do 9,87 ml niekompletnego podłoża IMDM.
    UWAGA: Upewnij się, że bufor przepływowy, bufor do lizy RBC, media konserwacyjne, media transfekcyjne i niekompletne media IMDM są sterylizowane filtrem przed użyciem.

2. Transformacja plazmidu

  1. Rozmrozić 20 μl kompetentnych komórek α-Select na lodzie. Dodaj 1 μl (~2 ng) plazmidu MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 plasmid22 do rozmrożonych kompetentnych komórek i delikatnie wymieszaj, stukając w probówkę. Inkubować reakcję na lodzie przez 30 minut.
  2. Wstrząs cieplny mieszaniny przez inkubację przez 40 s w bloku grzewczym o temperaturze 42 °C. Natychmiast przenieś rurkę na lód na 2 minuty.
  3. Dodać 1 ml pożywki LB (bez ampicyliny) do probówki i wstrząsać w temperaturze 37 °C i 200 obr./min przez 1 godzinę.
  4. Odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przy 500 x g przez 4 minuty i wyrzucić 0,9 ml supernatantu. Zawiesić osad w pozostałych 0,1 ml pożywki LB.
  5. Rozprowadzić przekształcone kompetentne komórki na wstępnie ogrzanych (37 °C) płytkach agarowych AP LB. Inkubować płytkę do góry nogami w temperaturze 37 °C przez 12-16 godzin.
  6. Wybierz pojedynczą kolonię i zużywaj przekształcone komórki w 10 ml pożywki AP LB przez noc w temperaturze 37 °C i 200 obr./min.
  7. Dodać 5 ml zużytych, przekształconych komórek kompetentnych do 500 ml pożywki AP LB w kolbie i inkubować kolbę przez noc w temperaturze 37 °C i 200 obr./min.
  8. Ekstrahować plazmid za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta i ponownie zawiesić w 0,5 ml autoklawowanej ultraczystej wody. Określić ilościowo plazmid za pomocą spektrofotometru.

3. Transfekcja komórek ekotropowych Phoenix (pECO)

  1. Hodowla 2 x 106 komórek pECO na płytce podtrzymującej na 10 cm płytkach w nawilżonym inkubatorze z 5% stężeniemCO2 w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że komórki pECO są utrzymywane w fazie wzrostu wykładniczego i aktywnie dzielą się przed pasażem.
  2. Gdy komórki zlewają się w 80%, umyj płytki dwukrotnie 5 ml DPBS, dodaj 1 ml trypsyny do płytki i inkubuj w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 2 min. Zebrać komórki z 5 ml pożywki konserwacyjnej w sterylnej probówce o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 4 °C i 400 x g przez 3 min. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml media konserwacyjne.
  3. Wymieszaj 10 μl zawiesiny komórek i 10 μl błękitu trypanowego i załaduj 10 μl na hemocytometr, aby policzyć komórki.
    Całkowita liczba komórek/ml = (Całkowita liczba komórek x Współczynnik rozcieńczenia x 104 komórki/ml)/ Liczba policzonych kwadratów)
    Wysiewać 2 x 106 komórek/naczynie do 6 cm szalek przy użyciu 5 ml pożywki konserwacyjnej do transfekcji i hodowli komórek w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
  4. Zastąp pożywkę konserwacyjną 5 ml pożywki do transfekcji, gdy komórki zlewają się w 50%-60% po 18 godzinach hodowli.
  5. Odczynnik do transfekcji należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut przed transfekcją.
  6. Dodaj 5,5 μg plazmidu MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC3 plasmid22 do 0,5 ml zwykłej pożywki DMEM w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml. Wymieszaj delikatnie, stukając w tubkę i pozostaw na 10 minut.
  7. Dodać 14,6 μl (3x ilość plazmidu; v/w) odczynnika do transfekcji do probówki i delikatnie postukać w probówkę co 10 minut trzy razy.
  8. Równomiernie dodawać mieszaninę kroplami do wszystkich obszarów naczyń z komórkami pECO w pożywce transfekcyjnej. Delikatnie przesuń naczynia do przodu i do tyłu 10 razy i 10 razy na boki. Inkubować naczynia w nawilżonym inkubatorze z 5% stężeniemCO2 w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
  9. Zmierz wydajność transfekcji za pomocą mikroskopii florescencyjnej i cytometrii przepływowej dla białka zielonej fluorescencji (GFP) zgodnie z opisem w22. Komórki są najpierw bramkowane na FSC-A/FSC-H i FSC-A i SSC-A w celu uzyskania singletów. Populacja GFP+ jest bramkowana na powierzchni FL1 poprzez porównanie jej z komórkami nietransfekowanymi.
  10. Zebrać i przefiltrować supernatanty przez filtr strzykawkowy 0,45 μm do sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Supernatanty należy natychmiast zużyć do transdukcji lub zamrozić je błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: komórki pECO muszą być odpowiednio wymieszane i równomiernie wysiane w szalkach. Pozwól komórkom się rozprzestrzenić, przesuwając naczynia do przodu i do tyłu 10 razy i na boki 10 razy podczas wysiewu. Liczba komórek, które mają zostać zasiane, może się różnić w zależności od różnic w liczeniu. Aby znaleźć optymalną liczbę komórek wysiewu, które mogą osiągnąć 50%-60% konfluencji po 18 godzinach hodowli, pomocne jest wysiewanie komórek z seryjnymi rozcieńczeniami.

4. Transdukcja lentiwirusowa

  1. Eutanazja 8-10-tygodniowych samic myszy C57BL6/J CD45.1 (od dwóch do trzech myszy dawców na mysz biorcy) w komorze CO2
    2. .
  2. Wysterylizuj całe ciało myszy 70% etanolem. Umieść myszy na sterylnej podkładce chirurgicznej na styropianowej płycie i przypnij nogi przez poduszki łap myszy.
  3. Przetnij skórę powyżej jamy brzusznej na linii środkowej i poszerz przestrzeń podskórną w kierunku tylnych nóg sterylnymi nożyczkami o ostrym końcu.
  4. Przedłuż nacięcie od linii środkowej brzucha w dół do kostek. Poszerz przestrzeń podskórną poniżej tylnych nóg za pomocą ostrzy sterylnych nożyczek o ostrym końcu.
  5. Przetnij ścięgno Achillesa sterylnymi nożyczkami o ostrym końcu. Przytrzymaj ścięgno za pomocą kleszczy z zębami i odetnij drugi koniec przymocowany do kości udowej, aby usunąć mięsień brzuchaty łydki.
  6. Przetnij ścięgno mięśnia czworogłowego przyczepionego do kolana sterylnymi nożyczkami o ostrym końcu. Przytrzymaj ścięgno za pomocą kleszczy z zębami i odetnij głowy mięśni przyczepione do kości udowej, aby usunąć mięsień brzuchaty łydki.
  7. Przetnij pozostałe mięśnie otaczające kość udową na końcu przyczepionym do kości piszczelowej sterylnymi nożyczkami o ostrym końcu.
  8. Przetnij kostkę sterylnymi nożyczkami z ostrym końcem, upewniając się, że kość piszczelowa pozostaje nienaruszona. Przytrzymaj dystalny koniec kości udowej za pomocą kleszczy z zębami i przetnij staw biodrowy sterylnymi nożyczkami o ostrym końcu, upewniając się, że głowa kości udowej pozostaje nienaruszona.
  9. Przenieś piszczele i kości udowe do buforu przepływowego w sterylnej probówce o pojemności 15 ml.
  10. Oddziel kość piszczelową i udową, łamiąc kolano ręką. Usuń ręcznie rzepkę, chrząstkę i kłykcie kości udowej, aby odsłonić płaskowyż piszczelowy i dystalną część kości udowej. Usuń mięśnie za pomocą sterylnej gazy, a następnie zanurz kości w buforze przepływowym.
  11. Przeciąć szyjkę kości udowej i przepłukać komórki szpiku kostnego buforem przepływowym z obu końców kości udowej za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 23 G.
  12. Przeciąć kostkę piszczelową i przepłukać komórki szpiku kostnego buforem przepływowym z obu końców kości piszczelowej za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 23 G.
  13. Rozproszyć komórki, pipetując w górę i w dół za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą 18 G. Odwirować zawiesinę jednokomórkową w temperaturze 4 °C i 400 x g przez 3 minuty.
  14. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml buforu do lizy RBC w celu lizy RBC przez 3 minuty.
  15. Dodać 5 ml buforu przepływowego, aby zatrzymać lizę i odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 4 °C i 400 x g przez 3 minuty.
  16. Umieść sitko o pojemności 70 μm na sterylnej probówce o pojemności 50 ml. Zawiesić osad z 5 ml buforu przepływowego, wymieszać i przepuścić przez sitko komórkowe w celu zebrania komórek.
  17. Dostosuj stężenie komórek z buforem przepływowym do 1 x 108/ml w okrągłodennych probówkach polipropylenowych.
  18. Komórki krwiotwórcze należy wybrać za pomocą mysiego zestawu do izolacji komórek krwiotwórczych zgodnie z instrukcją producenta.
  19. Odłożyć na bok trzy probówki po 1 x 104 komórek w 100 μl buforu dla jednej niebarwionej kontroli i dwóch pojedynczych kontrolek barwionych przeciwciałami dla anty-mysiego CD117 (c-Kit) i anty-mysiego anty-6A / E sprzężonego z PE-Cy7 (Sca-1). Użyć 1 μl przeciwciała (z 0,2 mg/ml zapasu) dla każdej z pojedynczych kontrolek wybarwionych przeciwciałami.
  20. Wybarwić resztę komórek w probówce z obydwoma przeciwciałami (po 4 μl każdego z zapasów 0,2 mg/ml) w 400 μl. Inkubować probówki na lodzie w ciemności przez 0,5-1 godzinę.
  21. Po zabarwieniu przemyć komórki, dodając 1 ml buforu przepływowego i odwirować w temperaturze 4 °C i 400 x g przez 3 minuty.
  22. Ponownie zawiesić komórki do niebarwionej kontroli i pojedynczej kontroli barwionej przeciwciałami w 100 μl buforu przepływowego. Ponownie zawiesić podwójnie wybarwione przeciwciałami komórki w 1 ml buforu przepływowego w celu sortowania.
  23. Sortuj krwiotwórcze komórki macierzyste (HSC) jako populację LSK za pomocą sortera komórek, jak opisano w23,24.
  24. Podczas barwienia pokryj sterylne 6 cm naczynie retronektyną w następujący sposób: Przygotuj 100 μg/ml retronektyny w PBS i dodaj 0,9 ml PBS i 0,1 ml retronektyny do 6-centymetrowego naczynia. Posmaruj naczynie sterylnym kapturem w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie usuń retronektynę i zablokuj naczynie 0,5 ml przefiltrowanego 2% BSA (w PBS) na 30 minut. Umyj naczynie dwukrotnie 5 ml PBS i naczynie jest gotowe do transdukcji.
  25. Odwirować posortowane HSC lub niesortowane limonki w temperaturze 4 °C i 400 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić w 3 ml 2x (cytokin) pożywki IMDM i 3 ml supernatantu wirusowego (otrzymanego z kroku 3.10) w naczyniu pokrytym retronektyną. Inkubować naczynie w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C przez 6 lub 24 godziny
    UWAGA: W niniejszym badaniu komórki Lin-cell były sortowane lub niesortowane w zależności od projektu eksperymentalnego.

5. Seryjne przeszczepienie (Rysunek 1)

UWAGA: Głównymi myszami biorcami były 8-10-tygodniowe samce myszy C57BL6/J (CD45.2). Podano im wodę ad libitum zawierającą antybiotyki w celu zapobiegania oportunistycznym infekcjom przewodu pokarmowego, od 3 dni przed przeszczepem do 7 dni po przeszczepie. Myszy pierwotnego biorcy zostały podletalnie napromieniowane (4,75 Gy) na 3 godziny przed przeszczepem25. Izofluranu nie stosowano u myszy po wstrzyknięciu dootrzewnowym.

  1. Po transdukcji przez 6 lub 24 godziny zbierz komórki przez odwirowanie w temperaturze pokojowej i 400 x g przez 3 minuty. W razie potrzeby użyj trypsyny, aby zebrać komórki przymocowane do dna naczynia. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki we wstępnie podgrzanym PBS. Określ objętość PBS w zależności od liczby biorców (tj. 0,1 ml/mysz i 0,5 ml/mysz dla biorców z zastrzykami zaoczodołowymi i dootrzewnowymi).
  2. Umieść napromieniowane subletalnie myszy biorcze w komorze izofluranu (szybkość przepływu tlenu jest ustawiona na 1,0 l/min, a parownik izofluranu na 5%). Nałóż mokrą maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Myszy są gotowe do dalszych zabiegów, gdy bicie serca spadnie do 60 uderzeń na minutę.
  3. Wstrzyknij komórki myszom pierwotnym biorcom retro-orbitalnie (0,1 ml / mysz) 7 lub dootrzewnowo (0,5 ml / mysz) 26 za pomocą igły 27 G1/2. Obserwuj myszy w sposób ciągły, aż uzyskają wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Codziennie monitoruj myszy pod kątem ich samopoczucia po przeszczepie.
  4. Po 1 miesiącu należy co tydzień pobierać krew przez krwawienie zaoczodołowe w celu monitorowania leukocytozy poprzez ocenę pełnej morfologii krwi (CBC) na hemavet, jak opisano poniżej.
    1. Umieść mysz bokiem po znieczuleniu izofluranem (natężenie przepływu tlenu jest ustawione na 1.0 l/min, a parownik izoflurancji jest ustawione na 5%). Myszy są gotowe do dalszych zabiegów, gdy bicie serca spadnie do 60 uderzeń na minutę.
    2. Podeprzeć oko kciukiem i palcem wskazującym. Przeniknąć do splotu zatokowego żylnego za pomocą sterylnej rurki kapilarnej hemakrytu przez wewnętrzny kant.
    3. Zbierz 20-25 μl krwi do probówki do pobrania krwi EDTA i zamknij powieki, aby zatrzymać krwawienie. Nałóż jedną kroplę roztworu okulistycznego siarczanu gentamycyny na oko.
  5. W punkcie końcowym, gdy białe krwinki (WBC) osiągną 4 x 104 komórki/μl, należy poddać mysz eutanazji w komorze CO2 i wyizolować komórki szpiku kostnego poprzez przepłukanie kości udowych i piszczelowych buforem przepływowym, a następnie lizę RBC, jak wspomniano w kroku 4.
  6. Na końcu zbierz splenocyty, jak wspomniano poniżej.
    1. Poddaj mysz eutanazji w komorze CO2 . Umieść myszy na sterylnej podkładce chirurgicznej na styropianowej płycie i przypnij nogi przez poduszki łap myszy. Wysterylizuj całe ciało myszy 70% etanolem.
    2. Przetnij skórę i mięśnie w linii środkowej, aby odsłonić jamę brzuszną sterylnymi nożyczkami o ostrym końcu. Odizoluj śledzionę sterylnymi nożyczkami z ostrym końcem i umieść ją w buforze przepływowym w sterylnej probówce o pojemności 15 ml.
    3. Przetrzyj śledzionę przez sterylne sitko o długości 70 μm w 6-centymetrowym naczyniu z 3 ml buforu przepływowego. Przenieść komórki z naczynia do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę jednokomórkową w temperaturze 4 °C i 400 x g przez 3 minuty.
    4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml buforu do lizy RBC w celu lizy RBC przez 3 min. Dodać 5 ml buforu przepływowego w celu zatrzymania lizy i odwirować zawiesinę komórek w temperaturze 4 °C i 400 x g przez 3 min.
    5. Umieść sitko o pojemności 70 μm na sterylnej probówce o pojemności 50 ml. Zawiesić osad z 5 ml buforu przepływowego, wymieszać i przepuścić przez sitko komórkowe w celu zebrania komórek.
  7. Zidentyfikuj pierwotne (1°) komórki AML, barwiąc splenocyty i komórki szpiku kostnego sprzężonym z FITC przeciwciałem anty-mysim CD45.1 i wykrywając za pomocą cytometru przepływowego. Komórki są najpierw bramkowane na FSC-A/FSC-H i FSC-A i SSC-A w celu uzyskania singletów. Populacja CD45.1 + jest bramkowana na wykresie FL1 poprzez porównanie jej z niebarwionymi komórkami.
  8. W przypadku przeszczepu wtórnego (2°) należy ponownie zawiesić komórki śledziony CD45.1 AML od biorców 1° r.o. w PBS (0,1 ml / mysz) i wstrzyknąć je po orbicie samcom myszy C57BL6 / J CD45.2. Równolegle ponownie zawiesić komórki śledziony AML od biorców 1 ° i.p. w PBS (0,5 ml / mysz) i wstrzyknąć je dootrzewnowo do 8-12-tygodniowych samców myszy TdTomato z ekspresją białka czerwonej fluorescencji (RFP) 27.
  9. W przypadku przeszczepu trzeciego stopnia (3°) należy ponownie zawiesić komórki AML wyizolowane ze szpiku kostnego lub jamy otrzewnej biorców 2° i.p. i wstrzyknąć je dootrzewnowo odpowiednio myszom Ai14TdTomato (RFP+) lub CD45.2. Ponownie zawiesić komórki AML wyizolowane z jamy otrzewnej biorców 2° r.o. i przeszczepić je przez wstrzyknięcie r.o. myszom Ai14TdTomato (RFP+).
    UWAGA: W przypadku przeszczepu pod kątem 2° zidentyfikowaliśmy postęp choroby u biorców pod kątem 2°, monitorując morfologię krwi we krwi obwodowej. Aby dodatkowo potwierdzić powstanie AML, pobraliśmy całą krew obwodową przez nakłucie serca, a także szpik kostny, śledzionę i wątrobę. Ponadto przeprowadziliśmy płukanie i.p. w celu pobrania komórek i.p. Zawiesiny jednokomórkowe uzyskano ze szpiku kostnego, śledziony i płukania i.p., jak opisano powyżej. Komórki z tych miejsc analizowano na cytometrze przepływowym po lizie RBC. Komórki AML zostały rozpoznane jako komórki RFP ujemne (RFP-). W przypadku przeszczepu 3° pobraliśmy próbki krwi, szpiku kostnego, śledziony, wątroby i komórek i.p. w punkcie końcowym; Komórki RFP lub CD45.1 + zidentyfikowano jako komórki AML i zbadano za pomocą cytometrii przepływowej. Myszom biorcom w temperaturze 2° i 3° nie podawano napromieniania ani wody z antybiotykiem.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat transdukcji wirusa MLL-AF9 w HSC szpiku kostnego i seryjnej transplantacji (1°, 2° i 3°). Sortowanie podwójnie dodatniej populacji Sca-1 i c-Kit przy użyciu sortera komórek pokazanego w kropkowanym polu cieniowania jest uważane za opcjonalne, jeśli pozwalają na to zasoby. Figura została stworzona przy użyciu BioRender (https://biorender.com/). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Płukanie dootrzewnowe

  1. Wstrzyknąć 5 ml niekompletnego podłoża IMDM do jamy otrzewnej dwukrotnie, aby zebrać komórki w sterylnej probówce o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej i 400 x g przez 3 min. Przeszczep komórki AML (4 x 105 komórek / mysz) z jamy otrzewnej biorców 2 ° przez wstrzyknięcie i.p. do myszy biorców 3 ° CD45.2 (n = 3).

7. Analiza histologiczna 28

  1. Odizoluj śledzionę, wątrobę i kości udowe od myszy po eutanazji. Umieść je w 5 ml 10% (v/v) buforowanej formaliny. Pobranie próbek śledziony i wątroby od zdrowych odpowiedników w celu porównania.
  2. Utrwalone tkanki zanurzyć w parafinie i pokroić je na sekcje. Wybarwić skrawki barwnikami hematoksyliną i eozyną (H&E).
  3. Uzyskaj obrazy pod mikroskopem przy 20-krotnym powiększeniu zainstalowanym z kompatybilnym oprogramowaniem do analizy histologicznej.

8. Przeprowadzanie półilościowego PCR (qPCR)

  1. Przygotować RNA w odczynniku RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Użyj 0,5-1,0 μg RNA do syntezy cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Użyj cDNA do wykonania qPCR za pomocą zestawu qPCR i uruchom próbki w systemie qPCR. Należy używać następujących wstępnie zatwierdzonych sond TaqMan: KMT2A (MLL; Ref Seq: NM_001197104(2), IDT)29 i 18S rybosomalny RNA (Hs99999901_s1).
  4. Załaduj amplikony KMT2A i 18S na 2% żel agarozowy, aby uwidocznić ekspresję. Pobieranie obrazów w imagerze zainstalowanym za pomocą kompatybilnego oprogramowania.

9. Przetwarzanie danych

  1. Analizuj wyniki za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej i przedstaw wyniki jako średnią ± SEM. Generuj rysunki za pomocą komercyjnego narzędzia do ilustracji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Porównanie wydajności transplantacji mysich komórek AML z wykorzystaniem dróg r.o. i i.p.
Wcześniej opisano indukcję 1˚ AML u myszy biorców poddanych transplantacji zaocznej (r.o.) komórkami LSK transdukowanymi MLL-AF9, a zdolność do transplantacji komórek 1˚ AML została wykazana poprzez transplantację seryjną30. Niniejsze badanie jest pierwszą próbą oceny możliwości wykorzystania komórek Lin- szpiku kostnego do przeprowadzenia transplantacji. Obecność aberracyjne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Te wyżej opisane badania dostarczają dowodów na to, że przeszczepienie komórek Lin jest porównywalne z komórkami LSK w pokoleniu 1° mysiej AML. Ponadto aktualne dane pokazują również, że wstrzyknięcie i.p. jest skuteczną i wygodną metodą ustalenia mysiej AML w porównaniu z wstrzyknięciem dożylnym (lub r.o.).

Oprócz komórek LSK, inne populacje, takie jak progenitor granulocytów-monocytów (GMP), wspólny progenitor limfoidalny (CLP) i wspólny przodek szpiku (CMP), zostały podmienione j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Centralnemu Ośrodku Cytometrii Przepływowej Instytutu Huck oraz Ośrodkowi Histopatologii Laboratorium Diagnostyki Zwierząt, Wydziału Nauk Weterynaryjnych i Biomedycznych, Uniwersytetu Stanowego Pensylwanii, za terminowe wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez granty z American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, numer dostępu 00000005 do K.S.P. i R.F.P.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
a-Wybierz kompetentne komórki BiolineBIO-85027
Chlorek amonu (NH4Cl)Sigma AldrichCat# A-9434
AmpicillinSigma AldrichCat# A0797
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V— BioproduktyGeminiCat# 700-102P
HCl cyprofloksacynyGoldBio.comCat# C-861-100
DMEM, wysoka glukoza, bez glutaminyGibcoCat# 11960-044
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)CorningCat# 21-031-CV
EDTA, sól disodowa (EDTA-2Na), dwuwodzian, klasa biologii molekularnejCalbiochemCat# 324503
Płodowa surowica bydlęca - Premium SelectAtlanta BiologicalsCat# S11550
Holo-transferyna, bydlęcaSigma AldrichCat# T1283
Roztwór insuliny ludzkiSigmaKat# I-9278
Zmodyfikowany Ilbecco's Medium Iscove (IMDM)GibcoCat# 12440-053
L-glutamina 200 mM (100&razy;) roztwórHyClone, GelifesciencesCat# SH30034.01
LB bulion, LennoxNEOGENCat #: 7290A
LB Rosół z agarem (Miller)Sigma AldrichCat# L-3147
Mysz anty-mysz CD45.1 (FITC)Miltenyi BiotecCat# 130-124-211
Mysia interleukina-3 (IL-3)Produkty biologiczne GeminiKot# 300-324P
Mysia interleukina-6 (IL-6)Produkty biologiczne GeminiKot# 300-327P
Czynnik komórek macierzystych myszy (SCF)Produkty biologiczne GeminiCat# 300-348P
Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100xCorningCat# 30-002-CI
Ogniwa Phenix-Eco (pECO)ATCCCRL-3214
Wodorowęglan potasu (KHCO3), granulowanyJT. Baker Cat# 2940-01
Szczurzy anty-mysz CD117 (c-kit) (APC)BioLegend Kat # 105812
Szczur anty-mysz Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)BD PharmingenCat# 558162
Rekombinowany mysi Flt3-LigandPepro Tech, INC.Cat# 250-31L
Rekombinowany ludzki fragment fibronektyny retronektynyTaKaRaCat# T100A
TransIT-293 OdczynnikMirusBioCat# MIR 2705
TRISigmaAldrich Cat# T9424
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%GibcoCat # 15250061
Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibcoCat# 25200-056
β-Mercaptoethanol (BME)Sigma AldrichCat# M3148
Testy komercyjne 
EasySep Zestaw do izolacji krwiotwórczych komórek progenitorowych myszy Technologie StemCellCat# 19856Zestaw
cDNA o dużej pojemności Thermo Fisher Cat# 4368813
PerfeCTa qPCR SuperMixQuanta BioCat# 95051-500
Plasmid Maxi Kit (25)QiagenCat#:12163
Animals
>Ai14TdTomato miceLaboratoryStrain # 007914
Myszy CD45.1 C57BL6/J& nbsp;Myszy Jackson LaboratoryStrain # 002014
CD45.2 C57BL6/J Szczep laboratoryjny Jackson# 000664
Instrumenty i oprogramowanie
Adobe illustrator Wersja 25.2.3
Cytometr przepływowy BD accuri C6BD Biosciences
FlowJo 10.8.0BD
GeneSys oprogramowanie Wersja 1.5.7.0
GraphPad Prism wersja 6 GraphPad
Hemavet 950FS Drew Scientific
7300 System PCR w czasie rzeczywistymBiosystemy
Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescencyjne obrazowanie fluorescencyjneG:Box Chemi
o niskiej zawartości endotoksyn do odwrotnej transkrypcji Jackson stosowane

Bibliografia

  1. Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
  2. Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
  3. Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
  4. Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152(2019).
  5. Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
  6. Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
  7. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
  8. Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. The Laboratory Mouse. , CRC Press Inc. (2001).
  9. Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
  10. Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
  11. Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
  12. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
  13. Leong, S. -K., Ling, E. -A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
  14. Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
  15. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  16. Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).
  17. Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048(2012).
  18. Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
  19. Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
  20. Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360(2012).
  21. Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27(2016).
  22. Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361(2016).
  23. Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
  24. Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
  25. Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572(2020).
  26. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
  27. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  28. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  29. Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
  30. Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328(2022).
  31. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  32. Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
  33. Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mysi model AMLkom rki macierzyste bia aczkiiniekcja zaoczodo owatransdukcja szpiku kostnegofuzja MLL AF9kom rki lineage negativecytometria przep ywowatransplantacja seryjna
Przeszczep dootrzewnowy w celu wywołania ostrej białaczki szpikowej u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.