Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przeszczep dootrzewnowy w celu wywołania ostrej białaczki szpikowej u myszy

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64834

⸱

6 stycznia 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Center for Molecular Immunology and Infectious Disease and Center for Molecular Toxicology and Carcinogenesis, Penn State Cancer Institute, The Pennsylvania State University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj dootrzewnowe wstrzykiwanie komórek białaczkowych jest wykorzystywane do wykrywania i rozprzestrzeniania ostrej białaczki szpikowej (AML) u myszy. Ta nowa metoda jest skuteczna w seryjnym przeszczepianiu komórek AML i może służyć jako alternatywa dla osób, które mogą doświadczać trudności i niespójności podczas wstrzykiwania dożylnego myszom.

Streszczenie

Istnieje niezaspokojona potrzeba nowych terapii w leczeniu ostrej białaczki szpikowej (AML) i związanego z nią nawrotu, który dotyczy komórek macierzystych przetrwałej białaczki (LSC). Eksperymentalny model gryzoni z ostrą białaczką szpikową (AML) do testowania terapii opartych na skutecznym przeszczepianiu tych komórek za pomocą zastrzyków zaoczodołowych u myszy biorców jest najeżony wyzwaniami. Celem tego badania było opracowanie łatwej, niezawodnej i spójnej metody generowania solidnego mysiego modelu AML przy użyciu drogi dootrzewnowej. W niniejszym protokole komórki szpiku kostnego były transdukowane retrowirusem eksprymującym ludzką onkoproteinę fuzyjną MLL-AF9. Zbadano skuteczność populacji lineage ujemnych (Lin-) i Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) jako LSC dawców w rozwoju pierwotnej AML, a wstrzyknięcie dootrzewnowe przyjęto jako nową metodę generowania AML. Porównanie między iniekcjami dootrzewnowymi i zaoczodołowymi przeprowadzono w przeszczepach seryjnych w celu porównania i skontrastowania obu metod. Zarówno komórki Lin, jak i LSK transdukowane ludzkim wirusem MLL-AF9 dobrze wszczepiają się w szpik kostny i śledzionę biorców, prowadząc do pełnoobjawowej AML. Dootrzewnowe wstrzyknięcie komórek dawcy spowodowało AML u biorców po seryjnym przeszczepie, a naciekanie komórek AML wykryto we krwi, szpiku kostnym, śledzionie i wątrobie biorców za pomocą cytometrii przepływowej, qPCR i analiz histologicznych. Tak więc wstrzyknięcie dootrzewnowe jest skuteczną metodą indukcji AML wykorzystującą seryjne przeszczepianie komórek białaczkowych dawcy.

Wprowadzenie

Ostra białaczka szpikowa (AML) to rodzaj nowotworu hematologicznego o zróżnicowanej etiologii ze złym rokowaniem1. Generowanie modeli zwierzęcych AML stanowi podstawę do zrozumienia jego złożonych odmian i patobiologii w celu odkrycia nowych terapii2. Leukemogeneza u myszy polega na przeszczepieniu komórek dawcy wykazujących ekspresję onkoprotein fuzyjnych, w tym fuzji z udziałem genu białaczki mieszanej (MLL) w celu silnego wywołania AML, w celu naśladowania choroby u ludzi3. Różne pochodzenie komórkowe komórek dawcy zostało zgłoszone w transplantacji AML4, przy czym bardzo niewiele wiadomo o komórkach odpowiedzialnych za pochodzenie choroby.

Opracowano wiele dróg do przeszczepu u myszy; zamiast iniekcji doudowej, która bezpośrednio wprowadza zmutowane komórki dawcy do szpiku kostnego5, dożylne wstrzyknięcie, które wykorzystuje splot zatoki żylnej, żyłę ogonową i żyłę szyjną, było szeroko stosowane do generowania mysich modeli AML6,7,8,9. W przypadku iniekcji retro-orbitalnej (r.o.) różne nieodłączne wady, takie jak ograniczenie objętości, wysokie wymagania techniczne, małe szanse na powtórzenie prób lub błędów oraz potencjalne urazy oka, były głównymi przeszkodami z ograniczonymi lub żadnymi realnymi alternatywami7. Iniekcja żyły ogonowej może mieć podobne problemy poza miejscowymi urazami; Aby ułatwić procedurę, myszy często muszą być rozgrzane, aby rozszerzyły swoje żyły ogonowe10. Trudno jest również zlokalizować żyłę ogonową bez dodatkowego źródła światła, szczególnie u myszy szczepu C57BL/6. W przypadku iniekcji do żyły szyjnej personel badawczy wymaga odpowiedniego przeszkolenia, aby zlokalizować żyłę i ograniczyć możliwe powikłania. Ponadto zarówno iniekcje do zatok żylnych, jak i żył szyjnych muszą być wykonywane w znieczuleniu, co dodaje kolejny poziom złożoności. W związku z tym kuszące jest zbadanie nowych dróg transplantacji, aby ułatwić ustanowienie mysich modeli AML.

Wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.) jest powszechnie stosowane do podawania leków, barwników i środków znieczulających11,12,13,14,15; był również używany do wprowadzania komórek krwiotwórczych do hematopoezy ektopowej16 oraz do przeszczepiania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego u różnych myszy models17,18,19,20,21. Jednak rzadko stosuje się go do ustalania nowotworów układu krwiotwórczego u myszy, szczególnie w celu zbadania progresji choroby AML.

Niniejsze badanie opisuje wykonalność iniekcji i.p. w generowaniu modeli myszy AML, dodatkowo porównując skuteczność przeszczepu populacji lineage ujemnych (Lin-) i Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) jako komórek dawcy. Odkrycia te zapewniają prosty i skuteczny sposób generowania eksperymentalnych modeli AML i pokrewnych białaczek szpikowych. Taka metoda ma potencjał, aby pogłębić nasze zrozumienie mechanizmów choroby, a także zapewnić stosunkowo łatwy model do testowania eksperymentalnych terapii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały wcześniej zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) na Pennsylvania State University.

1. Przygotowanie buforów i odczynników

  1. Przygotować płytki agarowe LB z dodatkiem ampicyliny (AP) (sterylne płytki 10 cm). W tym celu rozpuścić 10 g pożywki LB z agarem w 400 mL wody destylowanej, wymieszać i doprowadzić objętość do 500 mL. Sterylizować roztwór w autoklawie, a następnie pozwolić mu ostygnąć, dodać do roztworu 0,5 mL ampicyliny (stężenie zapasowe: 150 mg/mL) i wymieszać przez wstrząsanie. Natychmiast wlać 18 mL roztworu na sterylną płytkę 10 cm w pobliżu lampy alkoholowej, pozwolić zastygnąć w temperaturze pokojowej i przechowywać płytki odwrócone dnem do góry w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
  2. Przygotować pożywkę LB, rozpuszczając 10 g LB bez agaru w 500 mL wody destylowanej. Sterylizować roztwór w autoklawie, pozwolić mu ostygnąć, dodać 0,5 mL ampicyliny (stężenie zapasowe: 150 mg/mL) i wymieszać przez wstrząsanie.
  3. Przygotować bufor przepływowy, dodając 5 mL penicyliny/streptomycyny i 10 mL inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (hiFBS) do 485 mL 1x buforu fosforanowego Dulbecco (DPBS).
    UWAGA: Aby inaktywować FBS termicznie, umieścić rozmrożone butelki z FBS w kąpieli wodnej o temperaturze 56 °C. Należy upewnić się, że butelki nie przewrócą się ani nie zostaną całkowicie zanurzone w kąpieli wodnej. Temperatura jest krytyczna dla pełnej degradacji; aby to zapewnić, należy poczekać, aż temperatura ustabilizuje się na poziomie 56 ˚C po umieszczeniu butelek w kąpieli. Delikatnie obrócić butelki co 10 min, powtarzając czynność trzy razy. Nie inkubować surowicy dłużej niż 30 min.
  4. Przygotować pożywkę do utrzymania, dodając 50 mL hiFBS, 5 mL L-glutaminy i 5 mL penicyliny/streptomycyny do 440 mL pożywki DMEM (Dulbecco's modified eagle medium). Przygotować pożywkę do transfekcji, dodając 50 mL hiFBS i 5 mL L-glutaminy do 445 mL pożywki DMEM.
  5. Przygotować bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC), dodając 4,145 g NH4Cl, 0,504 g NaHCO3 oraz 16,81 mg kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do 500 mL wody destylowanej. Przygotować niepełną pożywkę IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium), dodając 75 mL hiFBS, 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 mL insuliny o stężeniu 10 mg/mL, 2,5 mL holotransferyny o stężeniu 4 mg/mL, 3,5 µL β-merkaptoetanolu, 5 mL L-glutaminy i 0,5 mL cyprofloksacyny do 416,5 mL pożywki IMDM.
  6. Przygotować 10 mL pożywki 2x IMDM, w której stężenie cytokin jest dwukrotnie wyższe niż w pożywce 1x IMDM, dodając 10 µL mr-SCF (50 ng/µL), 20 µL mr-Flt3L (25 ng/µL), 20 µL mr-IL-6 (10 ng/µL), 20 µL mr-IL-3 (10 ng/µL), 10 µL insuliny (10 mg/mL) oraz 50 µL holotransferyny (4 mg/mL) do 9,87 mL niepełnej pożywki IMDM.
    UWAGA: Należy upewnić się, że bufor przepływowy, bufor do lizy RBC, pożywka do utrzymania, pożywka do transfekcji oraz niepełna pożywka IMDM zostały wysterylizowane przez filtrowanie przed użyciem.

2. Transformacja plazmidowa

  1. Rozmrozić 20 µL kompetentnych komórek α-Select na lodzie. Do rozmrożonych komórek dodać 1 µL (~2 ng) plazmidu MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC322 i delikatnie wymieszać, opukując probówkę. Inkubować reakcję na lodzie przez 30 min.
  2. Przeprowadzić szok termiczny mieszaniny poprzez inkubację przez 40 s w bloku grzejnym o temperaturze 42 °C. Natychmiast przenieść probówkę na lód na 2 min.
  3. Do probówki dodać 1 mL pożywki LB (bez ampicyliny) i inkubować w wytrząsarce przy 37 °C i 200 rpm przez 1 h.
  4. Wirować probówkę w temperaturze pokojowej przy 500 x g przez 4 min i odpiąć 0,9 mL supernatantu. Resuspender osad w pozostałych 0,1 mL pożywki LB.
  5. Wysiać przekształcone komórki kompetentne na uprzednio ogrzane (37 °C) agarowe płytki AP LB. Inkubować płytkę w pozycji odwróconej przy 37 °C przez 12-16 h.
  6. Wybrać pojedynczą kolonię i namnożyć przekształcone komórki w 10 mL pożywki AP LB przez noc przy 37 ˚C i 200 rpm.
  7. Dodać 5 mL namnożonych przekształconych komórek kompetentnych do 500 mL pożywki AP LB w kolbie i inkubować kolbę przez noc przy 37 °C i 200 rpm.
  8. Wyekstrahować plazmid przy użyciu zestawu do ekstrakcji plazmidów zgodnie z instrukcją producenta i resuspender w 0,5 mL autoklawowanej wody ultraczystej. Ilościowo oznaczyć plazmid za pomocą spektrofotometru.

3. Transfekcja komórek Phoenix Ecotropic (pECO)

  1. Hodowla 2 x 106 komórki pECO/płytkę w pożywce utrzymującej w płytkach 10 cm w humidyfikatorze z 5% CO22 inkubator w temperaturze 37 °CNależy upewnić się, że komórki pECO znajdują się w fazie wzrostu wykładniczego i aktywnie się dzielą przed pasażowaniem.
  2. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, dwukrotnie przemyć płytki 5 ml DPBS, dodać do płytki 1 ml trypsyny i inkubować w humidyfikatorze przy 5% CO22 inkubator w temperaturze 37 ˚C przez 2 min. Zebrać komórki za pomocą 5 ml pożywki utrzymującej do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i odwirować w wirowarce przy 4 °C oraz 400x g przez 3 min. Resuspendować osad komórkowy w 5 ml pożywki utrzymującej.
  3. Wymieszać 10 µL zawiesiny komórkowej i 10 µL trypan blue i załadować 10 µL na komorę Bürchera-Neubauera w celu policzenia komórek.
    Całkowita liczba komórek/ml = (Całkowita liczba policzonych komórek x Współczynnik rozcieńczenia x 104 komórek/ml) / Liczba przeliczonych pól)
    Wysiać 2 x 106 komórek/szalki do szalek 6 cm, używając 5 ml pożywki utrzymującej do transfekcji, i hodować komórki w wilgotnym inkubatorze z 5% CO22 inkubator w temperaturze 37 °C.
  4. Po 18 h hodowli, gdy komórki osiągną 50-60% konfluencji, należy zastąpić pożywkę utrzymującą 5 ml pożywki do transfekcji.
  5. Przed transfekcją należy pozostawić odczyn do transfekcji w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 min.
  6. Dodaj 5.5 µg plazmidu MSCV-MLL-AF9-EF1α-luc2-P2A-EGFP-LC322 dodać 0,5 ml zwykłej pożywki DMEM do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Delikatnie wymieszać, stukując probówką, i pozostawić na 10 min.
  7. Dodaj 14.6 µL (3x ilości plazmidu; v/w) odczynnika do transfekcji do probówki i delikatnie opukiwać probówkę trzy razy co 10 min.
  8. Równomiernie dodawaj mieszaninę kroplami do wszystkich obszarów płytek z komórkami pECO w pożywce do transfekcji. Delikatnie poruszaj płytkami w przód i w tył 10 razy oraz na boki 10 razy. Inkubuj płytki w wilgotnym atmosferze z 5% CO22 inkubator w temperaturze 37 °C przez 48 h.
  9. Pomiar wydajności transfekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej dla zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), zgodnie z opisem w22Najpierw przeprowadza się bramkowanie komórek na podstawie parametrów FSC-A/FSC-H oraz FSC-A i SSC-A w celu wyselekcjonowania singletów. GFP+ populację wyznacza się poprzez bramkowanie na wykresie FL1 poprzez porównanie jej z komórkami nietransfekowanymi.
  10. Zebrać i przefiltrować nadsączniki przez 0.45 µm przez filtr strzykawkowy do sterylnej probówki o pojemności 50 mL. Nadfiltrów należy użyć natychmiast do transdukcji lub zamrozić metodą snap-freeze w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Komórki pECO muszą zostać odpowiednio wymieszane i równomiernie wysiane w naczyniach. Aby umożliwić rozprzestrzenienie się komórek, podczas wysiewania należy przesuwać naczynia 10 razy w przód i w tył oraz 10 razy na boki. Liczba wysiewanych komórek może się różnić w zależności od rozbieżności w liczeniu. W celu ustalenia optymalnej liczby wysiewanych komórek, która pozwoli osiągnąć 50%–60% konfluencji po 18 h hodowli, pomocne jest wysiewanie komórek z wykorzystaniem rozcieńczeń seryjnych.

4. Transdukcja lentiwirusem

  1. Eutanazuj 8-10-tygodniowe samice myszy C57BL6/J CD45.1 (od dwóch do trzech myszy dawców na jedną mysz biorczą) w komorze z CO2.
  2. Zdezynfekuj całe ciało myszy 70% etanolem. Umieść myszy na sterylnej podkładce chirurgicznej na styropianowej płytce i przypnij kończyny przez poduszki łap.
  3. Nacinaj skórę nad jamą brzuszną w linii środkowej i poszerz przestrzeń podskórną w kierunku tylnych kończyn za pomocą sterylnych nożyczek z ostrymi końcami.
  4. Przedłuż nacięcie od linii środkowej brzucha w dół do kostek. Poszerz przestrzeń podskórną pod tylnymi kończynami ostrzami sterylnych nożyczek z ostrymi końcami.
  5. Przetnij ścięgno Achillesa sterylnymi nożyczkami z ostrymi końcami. Przytrzymaj ścięgno pęsetą z ząbkami i przetnij drugi koniec przyczepiony do kości udowej, aby usunąć mięsień brzuchaty łydki.
  6. Przetnij ścięgno mięśnia czworogłowego przyczepione do kolana sterylnymi nożyczkami z ostrymi końcami. Przytrzymaj ścięgno pęsetą z ząbkami i przetnij brzuszki mięśnia przyczepione do kości udowej, aby usunąć mięsień brzuchaty łydki.
  7. Przetnij pozostałe mięśnie otaczające kość udową w miejscu przyczepu do kości piszczelowej sterylnymi nożyczkami z ostrymi końcami.
  8. Przetnij staw skokowy sterylnymi nożyczkami z ostrymi końcami, upewniając się, że kość piszczelowa pozostała nienaruszona. Przytrzymaj dystalny koniec kości udowej pęsetą z ząbkami i przetnij staw biodrowy sterylnymi nożyczkami z ostrymi końcami, upewniając się, że głowa kości udowej pozostała nienaruszona.
  9. Przenieś kości piszczelowe i udowe do buforu przepływowego w sterylną probówkę 15 mL.
  10. Oddziel kość piszczelową od udowej, przełamując kolano ręcznie. Ręcznie usuń rzepkę, chrząstkę i kłykcie kości udowej, aby odsłonić plateau piszczelowe i dystalną część kości udowej. Usuń mięśnie za pomocą sterylnej gazy, a następnie namocz kości w buforze przepływowym.
  11. Przetnij szyjkę kości udowej i wypłucz komórki szpiku kostnego buforem przepływowym z obu końców kości udowej, używając strzykawki 10 mL z igłą 23 G.
  12. Przetnij kostkę piszczelową i wypłucz komórki szpiku kostnego buforem przepływowym z obu końców kości piszczelowej, używając strzykawki 10 mL z igłą 23 G.
  13. Rozdysperguj komórki poprzez pipetowanie w górę i w dół za pomocą strzykawki 10 mL z igłą 18 G. Odwiruj zawiesinę pojedynczych komórek przy 4 °C i 400 x g przez 3 min.
  14. Odlej supernatant i resuspenduj komórki w 5 mL buforu do lizy erytrocytów, aby przeprowadzić lizę RBC przez 3 min.
  15. Dodaj 5 mL buforu przepływowego, aby zatrzymać lizę, i odwiruj zawiesinę komórkową przy 4 °C i 400 x g przez 3 min.
  16. Umieść sitko komórkowe 70 µm na sterylnej probówce 50 mL. Resuspenduj pellet 5 mL buforu przepływowego, wymieszaj i przepuść przez sitko komórkowe, aby zebrać komórki.
  17. Dostosuj stężenie komórek buforem przepływowym do 1 x 108/mL w polipropylenowych probówkach z okrągłym dnem.
  18. Wyselekcjonuj komórki Lin- przy użyciu zestawu do izolacji hematopoetycznych komórek myszy zgodnie z instrukcją producenta.
  19. Odstaw trzy probówki zawierające 1 x 104 komórek w 100 µL buforu dla jednej kontroli niebarwionej i dwóch kontroli barwionych pojedynczymi przeciwciałami dla przeciwciała anty-mysie CD117 (c-Kit) koniugowanego z APC oraz przeciwciała anty-mysie Ly-6A/E (Sca-1) koniugowanego z PE-Cy7. Użyj 1 µL przeciwciała (z roztworu stokowego 0,2 mg/mL) dla każdej z kontroli barwionych pojedynczymi przeciwciałami.
  20. Pozostałe komórki w probówce zabarw obydwoma przeciwciałami (po 4 µL każdego z roztworów stokowych 0,2 mg/mL) w 400 µL. Inkubuj probówki na lodzie w ciemności przez 0,5-1 h.
  21. Po barwieniu przemyj komórki, dodając 1 mL buforu przepływowego, i odwiruj przy 4 °C i 400 x g przez 3 min.
  22. Resuspenduj komórki dla kontroli niebarwionej i kontroli barwionych pojedynczymi przeciwciałami w 100 µL buforu przepływowego. Resuspenduj komórki barwione dwoma przeciwciałami w 1 mL buforu przepływowego do sortowania.
  23. Posortuj hematopoetyczne komórki macierzyste (HSCs) jako populację LSK za pomocą sortera komórkowego zgodnie z opisem w23,24.
  24. Podczas barwienia pokryj sterylną płytkę 6 cm retronektyną w następujący sposób: Przygotuj roztwór stokowy retronektyny 100 µg/mL w PBS i dodaj 0,9 mL PBS oraz 0,1 mL retronektyny do płytki 6 cm. Pokrywaj płytkę w sterylnej komorze z laminarem w temperaturze pokojowej przez 2 h. Następnie usuń retronektynę i zablokuj płytkę 0,5 mL filtrowanego 2% BSA (w PBS) przez 30 min. Przemyj płytkę dwukrotnie 5 mL PBS; płytka jest gotowa do transdukcji.
  25. Odwiruj posortowane HSCs lub niesortowane komórki Lin- przy 4 °C i 400 x g przez 3 min, a następnie resuspenduj w 3 mL pożywki IMDM 2x (z cytokinami) i 3 mL supernatantu wirusowego (otrzymanego w kroku 3.10) na płytce pokrytej retronektyną. Inkubuj płytkę w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 6 lub 24 h.
    UWAGA: W niniejszym badaniu komórki Lin- były sortowane lub niesortowane w zależności od planu eksperymentalnego.

5. Transplantacja seryjna (Rysunek 1)

UWAGA: Myszy biorcy były samcami szczepu C57BL6/J (CD45.2) w wieku 8-10 tygodni. Od 3 dni przed transplantacją do 7 dni po transplantacji miały zapewniony dostęp ad libitum do wody zawierającej antybiotyki w celu zapobiegania oportunistycznym infekcjom układu pokarmowego. Myszy biorcy zostały poddane subletalnemu napromieniowaniu (4.75 Gy) na 3 h przed transplantacją25. Isofluranu nie stosowano u myszy poddawanych iniekcjom doszpikowym.

  1. Po transdukcji trwającej 6 lub 24 h, zebrać komórki poprzez wirowanie w temperaturze pokojowej przy 400 x g przez 3 min. W razie potrzeby użyć trypsyny, aby zebrać komórki przytwierdzone do dna naczynia. Odrzucić nadosad i resuspendować komórki w podgrzanym PBS. Objętość PBS dobrać w zależności od liczby biorców (tj. 0,1 mL/mysz i 0,5 mL/mysz dla biorców poddawanych iniekcjom retro-orbitalnym i dos trunksznymi, odpowiednio).
  2. Umieścić poddane subletalnemu napromieniowaniu myszy biorcze w komorze z izofluranem (przepływ tlenu ustawiony na 1,0 L/min, a parownik izofluranu na 5%). Nałożyć wilgotną maść na oczy, aby zapobiec wysychaniu podczas znieczulenia. Myszy są gotowe do dalszych procedur, gdy tętno spadnie do 60 uderzeń na minutę.
  3. Wstrzyknąć komórki pierwotnym myszom biorczym drogą retro-orbitalną (0,1 mL/mysz)7 lub dos trunkszną (0,5 mL/mysz)26 za pomocą igły 27 G1/2. Obserwować myszy nieprzerwanie, aż odzyskają wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję brzuszną. Monitorować codziennie stan dobrostanu myszy po transplantacji.
  4. Po 1 miesiącu pobierać krew co tydzień drogą krwawienia retro-orbitalnego, aby monitorować leukocytozę poprzez ocenę pełnej morfologii krwi (CBC) na analizatorze Hemavet, zgodnie z poniższym opisem.
    1. Umieścić mysz bocznie po znieczuleniu izofluranem (przepływ tlenu ustawiony na 1,0 L/min, a parownik izofluranu na 5%). Myszy są gotowe do dalszych procedur, gdy tętno spadnie do 60 uderzeń na minutę.
    2. Wypchnąć gałkę oczną kciukiem i palcem wskazującym. Przebić splot żylny za pomocą sterylnej kapilary do hematokrytu przez kącik wewnętrzny oka.
    3. Zebrać 20-25 µL krwi do probówki z EDTA i zamknąć powieki, aby zatamować krwawienie. Nałożyć jedną kroplę okulistycznego roztworu siarczanu gentamycyny do oka.
  5. W punkcie końcowym, gdy liczba białych krwinek (WBCs) osiągnie 4 x 104 komórek/µL, eutanazować mysz w komorze z CO2 i wyizolować komórki szpiku kostnego poprzez przepłukanie kości udowych i piszczeli buforem przepływowym, a następnie przeprowadzić lizę RBC, jak wspomniano w kroku 4.
  6. W punkcie końcowym zebrać splenocyty zgodnie z poniższym opisem.
    1. Eutanazować mysz w komorze z CO2. Umieścić myszy na sterylnej podkładce chirurgicznej na styropianowej płytce i przypiąć nogi przez poduszeczki łap. Zdezynfekować całe ciało myszy 70% etanolem.
    2. Przeciąć skórę i mięśnie w linii środkowej, aby odsłonić jamę brzuszną za pomocą ostrych sterylnych nożyczek. Wyizolować śledzionę ostrymi sterylnymi nożyczkami i umieścić ją w buforze przepływowym w sterylnej probówce 15 mL.
    3. Przetrzeć śledzionę przez sterylny gęstość 70 µm sitko w naczyniu 6 cm z 3 mL buforu przepływowego. Przenieść komórki z naczynia do sterylnej probówki 15 mL i wirować zawiesinę pojedynczych komórek w temperaturze 4 °C przy 400 x g przez 3 min.
    4. Odrzucić nadosad i resuspendować komórki w 5 mL buforu do lizy RBC, aby lizać RBC przez 3 min. Dodać 5 mL buforu przepływowego, aby zatrzymać lizę i wirować zawiesinę komórkową w temperaturze 4 °C przy 400 x g przez 3 min.
    5. Umieścić sitko komórkowe 70 µm na sterylnej probówce 50 mL. Resuspendować osad w 5 mL buforu przepływowego, wymieszać i przepuścić przez sitko komórkowe w celu zebrania komórek.
  7. Zidentyfikować pierwotne (1˚) komórki AML poprzez barwienie splenocytów i komórek szpiku kostnego przeciwciałem anty-mysie CD45.1 sprzężonym z FITC i detekcję na cytometrze przepływowym. Komórki są najpierw bramkowane na FSC-A/FSC-H oraz FSC-A i SSC-A w celu wyłonienia singletów. Populacja CD45.1+ jest bramkowana na wykresie FL1 poprzez porównanie jej z komórkami niebarwionymi.
  8. Do transplantacji wtórnej (2˚) resuspendować komórki śledzionowe AML CD45.1 z pierwotnych biorców r.o. w PBS (0,1 mL/mysz) i wstrzyknąć je drogą retro-orbitalną samcom myszy C57BL6/J CD45.2. Równolegle resuspendować komórki śledzionowe AML z pierwotnych biorców i.p. w PBS (0,5 mL/mysz) i wstrzyknąć je dos trunksznie samcom myszy Ai14TdTomato w wieku 8-12 tygodni, wykazującym ekspresję czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP)27.
  9. Do transplantacji trzeciorzędowej (3˚) resuspendować komórki AML wyizolowane ze szpiku kostnego lub jamy otrzewnej wtórnych biorców i.p. i wstrzyknąć je odpowiednio dos trunksznie myszom Ai14TdTomato (RFP+) lub CD45.2. Resuspendować komórki AML wyizolowane z jamy otrzewnej wtórnych biorców r.o. i transplantować je drogą iniekcji r.o. do myszy Ai14TdTomato (RFP+).
    UWAGA: W przypadku transplantacji 2˚ identyfikowaliśmy progresję choroby u biorców 2˚ poprzez monitorowanie CBC we krwi obwodowej. Aby dodatkowo potwierdzić rozwój AML, pobraliśmy pełną krew obwodową poprzez punkcję serca, a także szpik kostny, śledzionę i wątrobę. Ponadto wykonaliśmy płukanie i.p. w celu zebrania komórek z jamy otrzewnej. Zawiesiny pojedynczych komórek uzyskano ze szpiku kostnego, śledziony i płukania i.p. zgodnie z powyższym opisem. Komórki z tych miejsc analizowano na cytometrze przepływowym po lizie RBC. Komórki AML rozpoznano jako komórki RFP-ujemne (RFP-). W przypadku transplantacji 3˚ w punkcie końcowym pobrano próbki krwi, szpiku kostnego, śledziony, wątroby i komórek i.p.; komórki RFP- lub CD45.1+ zidentyfikowano jako komórki AML i zbadano za pomocą cytometrii przepływowej. Myszy biorcze 2˚ i 3˚ nie otrzymały napromieniowania ani wody z antybiotykiem.

Schemat testu transplantacyjnego z markerami CD45 i barwieniem; monitorowanie komórek białaczki u myszy.
Rysunek 1: Schemat transdukcji wirusowej MLL-AF9 w HSC szpiku kostnego oraz transplantacji seryjnej (1˚, 2˚ i 3˚). Sortowanie populacji podwójnie dodatniej dla Sca-1 i c-Kit przy użyciu sortera komórkowego, pokazane w przerywanym obszarze zacienionym, jest opcjonalne, jeżeli pozwalają na to zasoby. Rysunek został stworzony przy użyciu BioRender (https://biorender.com/). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

6. Płukanie jamotrzewne

  1. Wstrzyknąć 5 mL niepełnej pożywki IMDM do jamy otrzewnowej dwukrotnie, aby zebrać komórki do sterylnej probówki o pojemności 15 mL. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze pokojowej przy 400 x g przez 3 min. Przeszczepić komórki AML (4 x 105 komórek/mysz) z jamy otrzewnowej biorców drugiego stopnia (via) poprzez wstrzyknięcie d.o. do myszy biorców trzeciego stopnia CD45.2 (n = 3).

7. Analiza histologiczna 28

  1. Po eutanazji myszy wyizolować śledziony, wątroby i kości udowe. Utrwalić je w 5 mL 10% (v/v) buforowanej formaliny. W celu porównania pobrać próbki śledzion i wątrób od zdrowych osobników kontrolnych.
  2. Utrwalone tkanki zatopić w parafinie i wykonać ich przekroje. Przekroje zabarwić hematoksyliną i eozyną (H&E).
  3. Wykonać zdjęcia pod mikroskopem przy powiększeniu 20x, korzystając z zainstalowanego zgodnego oprogramowania do analizy histologicznej.

8. Przeprowadzenie półilościowej reakcji PCR (qPCR)

  1. Przygotuj RNA w odczynniku do RNA zgodnie z instrukcją producenta.
  2. Wykorzystaj 0,5-1,0 µg RNA do syntezy cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji cDNA zgodnie z instrukcją producenta.
  3. Użyj cDNA do przeprowadzenia qPCR z wykorzystaniem zestawu do qPCR i analizy próbek w systemie qPCR. Wykorzystaj następujące uprzednio zwalidowane sondy TaqMan: KMT2A (MLL; Ref Seq: NM_001197104(2), IDT)29 oraz rybosomalne RNA 18S (Hs99999901_s1).
  4. Nałóż amplikony KMT2A i 18S na 2% żel agarozowy w celu wizualizacji ekspresji. Wykonaj zdjęcia za pomocą analizatora obrazu z zainstalowanym kompatybilnym oprogramowaniem.

9. Przetwarzanie danych

  1. Przeanalizuj wyniki przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej i przedstaw je jako średnią ± SEM. Przygotuj rysunki za pomocą komercyjnego programu do ilustrowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Porównanie wydajności transplantacji mysich komórek AML z wykorzystaniem dróg r.o. i i.p.
Wcześniej opisano indukcję 1˚ AML u myszy biorców poddanych transplantacji zaocznej (r.o.) komórkami LSK transdukowanymi MLL-AF9, a zdolność do transplantacji komórek 1˚ AML została wykazana poprzez transplantację seryjną30. Niniejsze badanie jest pierwszą próbą oceny możliwości wykorzystania komórek Lin- szpiku kostnego do przeprowadzenia transplantacji. Obecność aberracyjne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Te wyżej opisane badania dostarczają dowodów na to, że przeszczepienie komórek Lin jest porównywalne z komórkami LSK w pokoleniu 1° mysiej AML. Ponadto aktualne dane pokazują również, że wstrzyknięcie i.p. jest skuteczną i wygodną metodą ustalenia mysiej AML w porównaniu z wstrzyknięciem dożylnym (lub r.o.).

Oprócz komórek LSK, inne populacje, takie jak progenitor granulocytów-monocytów (GMP), wspólny progenitor limfoidalny (CLP) i wspólny przodek szpiku (CMP), zostały podmienione j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Centralnemu Ośrodku Cytometrii Przepływowej Instytutu Huck oraz Ośrodkowi Histopatologii Laboratorium Diagnostyki Zwierząt, Wydziału Nauk Weterynaryjnych i Biomedycznych, Uniwersytetu Stanowego Pensylwanii, za terminowe wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez granty z American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, numer dostępu 00000005 do K.S.P. i R.F.P.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
a-Wybierz kompetentne komórki BiolineBIO-85027
Chlorek amonu (NH4Cl)Sigma AldrichCat# A-9434
AmpicillinSigma AldrichCat# A0797
Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V— BioproduktyGeminiCat# 700-102P
HCl cyprofloksacynyGoldBio.comCat# C-861-100
DMEM, wysoka glukoza, bez glutaminyGibcoCat# 11960-044
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)CorningCat# 21-031-CV
EDTA, sól disodowa (EDTA-2Na), dwuwodzian, klasa biologii molekularnejCalbiochemCat# 324503
Płodowa surowica bydlęca - Premium SelectAtlanta BiologicalsCat# S11550
Holo-transferyna, bydlęcaSigma AldrichCat# T1283
Roztwór insuliny ludzkiSigmaKat# I-9278
Zmodyfikowany Ilbecco's Medium Iscove (IMDM)GibcoCat# 12440-053
L-glutamina 200 mM (100&razy;) roztwórHyClone, GelifesciencesCat# SH30034.01
LB bulion, LennoxNEOGENCat #: 7290A
LB Rosół z agarem (Miller)Sigma AldrichCat# L-3147
Mysz anty-mysz CD45.1 (FITC)Miltenyi BiotecCat# 130-124-211
Mysia interleukina-3 (IL-3)Produkty biologiczne GeminiKot# 300-324P
Mysia interleukina-6 (IL-6)Produkty biologiczne GeminiKot# 300-327P
Czynnik komórek macierzystych myszy (SCF)Produkty biologiczne GeminiCat# 300-348P
Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100xCorningCat# 30-002-CI
Ogniwa Phenix-Eco (pECO)ATCCCRL-3214
Wodorowęglan potasu (KHCO3), granulowanyJT. Baker Cat# 2940-01
Szczurzy anty-mysz CD117 (c-kit) (APC)BioLegend Kat # 105812
Szczur anty-mysz Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7)BD PharmingenCat# 558162
Rekombinowany mysi Flt3-LigandPepro Tech, INC.Cat# 250-31L
Rekombinowany ludzki fragment fibronektyny retronektynyTaKaRaCat# T100A
TransIT-293 OdczynnikMirusBioCat# MIR 2705
TRISigmaAldrich Cat# T9424
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%GibcoCat # 15250061
Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibcoCat# 25200-056
β-Mercaptoethanol (BME)Sigma AldrichCat# M3148
Testy komercyjne 
EasySep Zestaw do izolacji krwiotwórczych komórek progenitorowych myszy Technologie StemCellCat# 19856Zestaw
cDNA o dużej pojemności Thermo Fisher Cat# 4368813
PerfeCTa qPCR SuperMixQuanta BioCat# 95051-500
Plasmid Maxi Kit (25)QiagenCat#:12163
Animals
>Ai14TdTomato miceLaboratoryStrain # 007914
Myszy CD45.1 C57BL6/J& nbsp;Myszy Jackson LaboratoryStrain # 002014
CD45.2 C57BL6/J Szczep laboratoryjny Jackson# 000664
Instrumenty i oprogramowanie
Adobe illustrator Wersja 25.2.3
Cytometr przepływowy BD accuri C6BD Biosciences
FlowJo 10.8.0BD
GeneSys oprogramowanie Wersja 1.5.7.0
GraphPad Prism wersja 6 GraphPad
Hemavet 950FS Drew Scientific
7300 System PCR w czasie rzeczywistymBiosystemy
Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescencyjne obrazowanie fluorescencyjneG:Box Chemi
o niskiej zawartości endotoksyn do odwrotnej transkrypcji Jackson stosowane

Bibliografia

  1. Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
  2. Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
  3. Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
  4. Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152(2019).
  5. Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
  6. Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
  7. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
  8. Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. The Laboratory Mouse. , CRC Press Inc. (2001).
  9. Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
  10. Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
  11. Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
  12. Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
  13. Leong, S. -K., Ling, E. -A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
  14. Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
  15. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  16. Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, Suppl_4 106-117 (2011).
  17. Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048(2012).
  18. Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
  19. Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
  20. Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360(2012).
  21. Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27(2016).
  22. Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361(2016).
  23. Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
  24. Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
  25. Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572(2020).
  26. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
  27. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  28. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  29. Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
  30. Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328(2022).
  31. Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
  32. Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
  33. Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

mysi model AMLkomórki macierzyste białaczkiiniekcja zaoczodołowatransdukcja szpiku kostnegofuzja MLL-AF9komórki lineage-negativecytometria przepływowatransplantacja seryjna
Przeszczep dootrzewnowy w celu wywołania ostrej białaczki szpikowej u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.