Tutaj dootrzewnowe wstrzykiwanie komórek białaczkowych jest wykorzystywane do wykrywania i rozprzestrzeniania ostrej białaczki szpikowej (AML) u myszy. Ta nowa metoda jest skuteczna w seryjnym przeszczepianiu komórek AML i może służyć jako alternatywa dla osób, które mogą doświadczać trudności i niespójności podczas wstrzykiwania dożylnego myszom.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przeszczep dootrzewnowy w celu wywołania ostrej białaczki szpikowej u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Istnieje niezaspokojona potrzeba nowych terapii w leczeniu ostrej białaczki szpikowej (AML) i związanego z nią nawrotu, który dotyczy komórek macierzystych przetrwałej białaczki (LSC). Eksperymentalny model gryzoni z ostrą białaczką szpikową (AML) do testowania terapii opartych na skutecznym przeszczepianiu tych komórek za pomocą zastrzyków zaoczodołowych u myszy biorców jest najeżony wyzwaniami. Celem tego badania było opracowanie łatwej, niezawodnej i spójnej metody generowania solidnego mysiego modelu AML przy użyciu drogi dootrzewnowej. W niniejszym protokole komórki szpiku kostnego były transdukowane retrowirusem eksprymującym ludzką onkoproteinę fuzyjną MLL-AF9. Zbadano skuteczność populacji lineage ujemnych (Lin-) i Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) jako LSC dawców w rozwoju pierwotnej AML, a wstrzyknięcie dootrzewnowe przyjęto jako nową metodę generowania AML. Porównanie między iniekcjami dootrzewnowymi i zaoczodołowymi przeprowadzono w przeszczepach seryjnych w celu porównania i skontrastowania obu metod. Zarówno komórki Lin, jak i LSK transdukowane ludzkim wirusem MLL-AF9 dobrze wszczepiają się w szpik kostny i śledzionę biorców, prowadząc do pełnoobjawowej AML. Dootrzewnowe wstrzyknięcie komórek dawcy spowodowało AML u biorców po seryjnym przeszczepie, a naciekanie komórek AML wykryto we krwi, szpiku kostnym, śledzionie i wątrobie biorców za pomocą cytometrii przepływowej, qPCR i analiz histologicznych. Tak więc wstrzyknięcie dootrzewnowe jest skuteczną metodą indukcji AML wykorzystującą seryjne przeszczepianie komórek białaczkowych dawcy.
Wprowadzenie
Ostra białaczka szpikowa (AML) to rodzaj nowotworu hematologicznego o zróżnicowanej etiologii ze złym rokowaniem1. Generowanie modeli zwierzęcych AML stanowi podstawę do zrozumienia jego złożonych odmian i patobiologii w celu odkrycia nowych terapii2. Leukemogeneza u myszy polega na przeszczepieniu komórek dawcy wykazujących ekspresję onkoprotein fuzyjnych, w tym fuzji z udziałem genu białaczki mieszanej (MLL) w celu silnego wywołania AML, w celu naśladowania choroby u ludzi3. Różne pochodzenie komórkowe komórek dawcy zostało zgłoszone w transplantacji AML4....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały wstępnie zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Stanowym Pensylwanii.
1. Przygotowanie i odczynników
- Przygotować płytki agarowe LB z dodatkiem ampicyliny (AP) (sterylne płytki 10 cm). Aby to zrobić, rozpuść 10 g bulionu LB z agarem w 400 ml wody destylowanej, wymieszaj i zwiększ objętość do 500 ml. Wysterylizuj roztwór przez autoklawowanie, następnie pozwól roztworowi ostygnąć, dodaj 0,5 ml ampicyliny (zapas: 150 mg/ml) do roztworu i wstrząśnij do wymieszania. Natychmiast dodać 18 ml roztworu do sterylnej płytki o długości 10 c....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Porównanie wydajności transplantacji mysich komórek AML z wykorzystaniem dróg r.o. i i.p.
Wcześniej opisano indukcję 1˚ AML u myszy biorców poddanych transplantacji zaocznej (r.o.) komórkami LSK transdukowanymi MLL-AF9, a zdolność do transplantacji komórek 1˚ AML została wykazana poprzez transplantację seryjną30. Niniejsze badanie jest pierwszą próbą oceny możliwości wykorzystania komórek Lin- szpiku kostnego do przeprowadzenia transplantacji. Obecność aberracyjne.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Te wyżej opisane badania dostarczają dowodów na to, że przeszczepienie komórek Lin jest porównywalne z komórkami LSK w pokoleniu 1° mysiej AML. Ponadto aktualne dane pokazują również, że wstrzyknięcie i.p. jest skuteczną i wygodną metodą ustalenia mysiej AML w porównaniu z wstrzyknięciem dożylnym (lub r.o.).
Oprócz komórek LSK, inne populacje, takie jak progenitor granulocytów-monocytów (GMP), wspólny progenitor limfoidalny (CLP) i wspólny przodek szpiku (CMP), zostały podmienione j.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Centralnemu Ośrodku Cytometrii Przepływowej Instytutu Huck oraz Ośrodkowi Histopatologii Laboratorium Diagnostyki Zwierząt, Wydziału Nauk Weterynaryjnych i Biomedycznych, Uniwersytetu Stanowego Pensylwanii, za terminowe wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez granty z American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, numer dostępu 00000005 do K.S.P. i R.F.P.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| a-Wybierz kompetentne komórki | Bioline | BIO-85027 | |
| Chlorek amonu (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA), frakcja V— Bioprodukty | Gemini | Cat# 700-102P | |
| HCl cyprofloksacyny | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, wysoka glukoza, bez glutaminy | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, sól disodowa (EDTA-2Na), dwuwodzian, klasa biologii molekularnej | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Płodowa surowica bydlęca - Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferyna, bydlęca | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Roztwór insuliny ludzki | Sigma | Kat# I-9278 | |
| Zmodyfikowany Ilbecco's Medium Iscove (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamina 200 mM (100&razy;) roztwór | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB bulion, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Rosół z agarem (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mysz anty-mysz CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mysia interleukina-3 (IL-3) | Produkty biologiczne Gemini | Kot# 300-324P | |
| Mysia interleukina-6 (IL-6) | Produkty biologiczne Gemini | Kot# 300-327P | |
| Czynnik komórek macierzystych myszy (SCF) | Produkty biologiczne Gemini | Cat# 300-348P | |
| Roztwór penicyliny-streptomycyny, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Ogniwa Phenix-Eco (pECO) | ATCC | CRL-3214 | |
| Wodorowęglan potasu (KHCO3), granulowany | JT. Baker Cat | # 2940-01 | |
| Szczurzy anty-mysz CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Kat # 105812 | |
| Szczur anty-mysz Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Rekombinowany mysi Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| Rekombinowany ludzki fragment fibronektyny retronektyny | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Odczynnik | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI | Sigma | Aldrich Cat# T9424 | |
| Roztwór błękitu trypanowego, 0,4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Testy komercyjne | |||
| EasySep Zestaw do izolacji krwiotwórczych komórek progenitorowych myszy | Technologie StemCell | Cat# 19856Zestaw | |
| cDNA o dużej pojemności | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| >Ai14TdTomato mice | Laboratory | Strain # 007914 | |
| Myszy CD45.1 C57BL6/J& nbsp; | Myszy Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J | Szczep laboratoryjny Jackson | # 000664 | |
| Instrumenty i oprogramowanie | |||
| Adobe illustrator | Wersja 25.2.3 | ||
| Cytometr przepływowy BD accuri C6 | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys oprogramowanie | Wersja 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism wersja 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 System PCR w czasie rzeczywistym | Biosystemy | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescencyjne obrazowanie fluorescencyjne | G:Box Chemi |
Bibliografia
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Erns....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
