Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64840

⸱

23 czerwca 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Różnicowanie komórek macierzystych w komórki wysp trzustkowych stanowi alternatywne rozwiązanie dla konwencjonalnego leczenia cukrzycy i modelowania chorób. Opisujemy szczegółowy protokół hodowli komórek macierzystych, który łączy komercyjny zestaw różnicujący z wcześniej zwalidowaną metodą, aby pomóc w wytwarzaniu wysp trzustkowych wydzielających insulinę pochodzących z komórek macierzystych w naczyniu.

Streszczenie

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki beta wydzielające insulinę dostarcza materiału do badania funkcji komórek beta i leczenia cukrzycy. Pozostają jednak wyzwania związane z uzyskaniem komórek beta pochodzących z komórek macierzystych, które odpowiednio naśladują natywne ludzkie komórki beta. Opierając się na wcześniejszych badaniach, wygenerowano komórki wysp trzustkowych pochodzących z hPSC, aby stworzyć protokół o lepszych wynikach różnicowania i spójności. Opisany tutaj protokół wykorzystuje zestaw progenitorowy trzustki podczas etapów 1-4, a następnie protokół zmodyfikowany na podstawie artykułu opublikowanego wcześniej w 2014 r. (zwanego dalej "protokołem R") podczas etapów 5-7. Uwzględniono szczegółowe procedury korzystania z zestawu progenitorów trzustki i płytek mikrodołkowych o średnicy 400 μm do generowania klastrów progenitorowych trzustki, protokół R do różnicowania endokrynologicznego w 96-dołkowym formacie zawiesiny statycznej oraz charakterystykę in vitro i ocenę funkcjonalną wysp trzustkowych pochodzących z hPSC. Pełny protokół zajmuje 1 tydzień na początkową ekspansję hPSC, a następnie ~5 tygodni na uzyskanie wysp trzustkowych hPSC wytwarzających insulinę. Personel posiadający podstawowe techniki hodowli komórek macierzystych i przeszkolony w zakresie testów biologicznych może odtworzyć ten protokół.

Wprowadzenie

Komórki beta trzustki wydzielają insulinę w odpowiedzi na wzrost poziomu glukozy we krwi. Pacjenci bez wystarczającej produkcji insuliny z powodu autoimmunologicznego zniszczenia komórek beta w cukrzycy typu 1 (T1D)1 lub z powodu dysfunkcji komórek beta w cukrzycy typu 2 (T2D)2, są zazwyczaj leczeni podawaniem insuliny egzogennej. Pomimo tej ratującej życie terapii, nie jest ona w stanie dokładnie dorównać znakomitej kontroli stężenia glukozy we krwi, jaką osiąga się dzięki dynamicznemu wydzielaniu insuliny z komórek beta w dobrej wierze. W związku z tym pacjenci często cierpią z powodu zagrażających życiu epizodów hipoglikemii i innych powikłań wynikających z przewlekłych skoków hiperglikemii. Przeszczepienie ludzkich martwych wysp trzustkowych z powodzeniem przywraca ścisłą kontrolę glikemii u pacjentów z cukrzycą typu 1, ale jest ograniczone przez dostępność dawców wysp trzustkowych i trudności w oczyszczaniu zdrowych wysp trzustkowych do przeszczepu3,4. Wyzwanie to można zasadniczo rozwiązać, wykorzystując hPSC jako alternatywny materiał wyjściowy.

Obecne strategie generowania wysp trzustkowych wydzielających insulinę z hPSC in vitro często mają na celu naśladowanie procesu rozwoju embrionalnej trzustki in vivo5,6. Wymaga to wiedzy na temat odpowiedzialnych szlaków sygnałowych i czasowego dodawania odpowiednich rozpuszczalnych czynników, aby naśladować krytyczne etapy rozwoju zarodkowej trzustki. Program trzustkowy rozpoczyna się od zaangażowania w ostateczną endodermę, która jest oznaczona przez czynniki transkrypcyjne widelec box A2 (FOXA2) i region determinujący płeć Y-box 17 (SOX17)7. Kolejne różnicowanie ostatecznej endodermy polega na tworzeniu prymitywnej rurki jelitowej, przekształcającej się w tylne jelito przednie, które wyraża homeobox 1 trzustki i dwunastnicy (PDX1)7,8,9, oraz ekspansję nabłonka do komórek progenitorowych trzustki, które wykazują współekspresję PDX1 i NK6 homeobox 1 (NKX6.1)10,11.

Dalsze zaangażowanie w komórki wysp wydzielniczych towarzyszy przejściowa ekspresja pro-endokrynologicznego regulatora głównego neurogeniny-3 (NGN3)12 oraz stabilna indukcja kluczowych czynników transkrypcyjnych różnicowania neuronów 1 (NEUROD1) i NK2 homeobox 2 (NKX2.2)13. Główne komórki wyrażające hormony, takie jak komórki beta produkujące insulinę, komórki alfa produkujące glukagon, komórki delta wytwarzające somatostatynę i komórki PPY trzustkowe wytwarzające polipeptydy, są następnie programowane. Dzięki tej wiedzy, a także odkryciom z obszernych, wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, ostatnie postępy umożliwiły wygenerowanie wysp trzustkowych hPSC z komórkami przypominającymi komórki beta zdolne do wydzielania insuliny14,15,16,17,18,19.

Zgłoszono protokoły krokowe do generowania komórek beta reagujących na glukozę6,14,18,19. Zbudowany na podstawie tych badań, obecny protokół obejmuje użycie zestawu progenitorów trzustki do generowania komórek progenitorowych trzustki PDX1 + / NKX6.1 + w hodowli płaskiej, a następnie agregacji płytek mikrodołkowych w klastry o jednolitej wielkości i dalszego różnicowania w kierunku wysp trzustkowych hPSC wydzielających insulinę z protokołem R w statycznej hodowli zawiesinowej 3D. Analizy kontroli jakości, w tym cytometria przepływowa, barwienie immunologiczne i ocena funkcjonalna, są wykonywane w celu rygorystycznej charakterystyki różnicujących się komórek. Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy opis każdego etapu ukierunkowanego różnicowania i nakreśla podejścia do charakterystyki in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół opiera się na pracy z liniami hPSC, w tym H1, HUES4 PDXeG i Mel1 INSGFP/W, w warunkach wolnych od zasilania. W tej sekcji szczegółowo opisano procedurę krok po kroku, a w sekcji reprezentatywnych wyników przedstawiono dane pomocnicze dotyczące różnicowania Mel1 INSGFP/W. Zalecamy, aby dalsza optymalizacja była konieczna podczas pracy z innymi liniami hPSC, które nie zostały tutaj wymienione. Szczegółowe informacje na temat wszystkich odczynników i roztworów stosowanych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie pożywek i roztworów różnicujących

UWAGA: Zobacz Tabelę 1 dla wszystkich rozwiązań, które mają być przygotowane, i Tabelę 2 dla mediów różnicujących.

  1. Przygotuj wszystkie pożywki i odczynniki do hodowli komórkowej w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przed użyciem krótko podgrzać roztwory związane z hodowlami komórkowymi i podłoża podstawowe do temperatury 37 °C w kąpieli.
    UWAGA: Jak opisano poniżej, codziennie przyrządzaj nowe podłoża różnicujące, dodając suplementy i używaj ich tego samego dnia. Alternatywnie, zestaw progenitora trzustki daje możliwość wcześniejszego przygotowania większej objętości, którą można stosować przez kilka dni zgodnie z protokołem producenta. Obie metody przygotowania pożywek sprawdzają się dobrze. Należy pamiętać, że nie zaleca się pozostawiania pożywek przez dłuższy czas w łaźni wodnej. Przygotowując codziennie świeże podłoża, zaleca się podawanie porcji suplementów, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.

2. Różnicowanie hPSC w komórki progenitorowe trzustki

  1. Utrzymuj niezróżnicowane hPSC na naczyniach pokrytych Matrigelem w kompletnym podłożu mTeSR1 i codziennie wykonuj zmiany pożywki. Podczas hodowli podtrzymującej hPSC pasażują co 3-4 dni, gdy komórki osiągną ~70% konfluencji, używając odczynnika dysocjacji komórek zgodnie z protokołem producenta. Aby zainicjować różnicowanie, należy zdysocjować komórki na pojedyncze komórki i umieścić je na 6-dołkowych lub 12-dołkowych płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych (z objętością pożywki odpowiednio 2 ml lub 1 ml na dołek).
    UWAGA: Patrz Tabela 1 w celu uzyskania instrukcji dotyczących przechowywania podłoża podstawowego endodermy i jego podwielokrotności.
  2. Wstępnie pokryć hodowlę studzienkami Matrigelem z kwalifikacją hESC (rozcieńczonym w lodowatym DMEM/F12 zgodnie z zaleceniami w protokole producenta) i umieścić płytkę w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 30 minut.
  3. Przenieś płytkę pokrytą Matrigelem do temperatury pokojowej (zużyć w ciągu 3 godzin).
  4. Odessać zużytą pożywkę z kultury hPSC i spłukać raz DPBS. Dysocjować hodowlę hPSC na pojedyncze komórki za pomocą enzymu dysocjacji komórek w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut. Spłucz komórki, dodając ciepłą pożywkę DMEM/F12, przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml i wiruj w temperaturze 300 × g przez 5 minut.
  5. Zawiesić osad komórkowy za pomocą kompletnego podłoża z komórkami macierzystymi plus 10 μM Y-27632 i przeprowadzić liczenie żywych komórek (trypan niebieski ujemny) za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Odessać rozcieńczony Matrigel i natychmiast wysiać żywe komórki o gęstości 1,60-1,80 × 105/cm2 na studzienkach pokrytych Matrigelem i inkubować w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny. Przejdź do etapu 1.
    UWAGA: Spowoduje to ~95% początkowej konfluencji w celu zainicjowania różnicowania. Zgodnie z protokołem producenta zalecana jest gęstość wysiewu 2,6 × 105/cm2. Zaleca się badanie różnych gęstości wysiewu w celu określenia optymalnej wartości dla linii komórkowej i sprawdzenia żywotności komórek. Jeśli rentowność jest niższa niż 80%, nie przystępuj do różnicowania. Niska żywotność komórek może być wynikiem nadmiernego trawienia lub nadmiernego rozdmuchiwania podczas zbioru lub pozostawiania komórek na dłuższy czas w pożywce DMEM/F12 przed siewem.
  6. W Etapie 1 dnia 1 krótko podgrzać endodermę podłoże podstawowe do 37 °C w kąpieli i rozmrozić Suplement MR i CJ. Przygotować pożywkę etapu 1A, dodając suplement MR i CJ do podłoża podstawowego endodermy. Dobrze wymieszaj i natychmiast zużyj.
  7. Odessać zużyte podłoże ze studzienek, dodać pożywkę etapu 1A i inkubować w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny
    UWAGA: Etapy prania nie są konieczne. Usuń wszelkie nieprzyłączone komórki z hodowli, delikatnie potrząsając płytką hodowlaną przed wymianą pożywki. Unikaj przerywania monowarstwy poprzez niedotykanie końcówki pipety do dna studzienki podczas usuwania pożywki i poprzez delikatne dodawanie pożywki.
  8. W Etapie 1 dnia 2 krótko podgrzej podłoże podstawowe endodermy w kąpieli o temperaturze 37 °C i rozmroź Suplement CJ. Przygotuj pożywkę etapu 1B, dodając suplement CJ do podłoża podstawowego endodermy. Dobrze wymieszaj i natychmiast zużyj.
  9. Odessać zużytą pożywkę ze studzienek, dodać pożywkę etapu 1B i inkubować w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
  10. Na etapie 1 dnia 3 powtórz kroki 2.8-2.9. Przejdź do etapu 2.
  11. W Etapie 2 dnia 1 ogrzej trzustkę Stage 2-4 Podłoże podstawowe w kąpieli w temperaturze 37 °C i rozmroź Suplement 2A i 2B. Przygotuj pożywkę etapu 2A, dodając suplement 2A i 2B do trzustki Podłoże podstawowe etapu 2-4. Dobrze wymieszaj i natychmiast zużyj.
  12. Odessać zużytą pożywkę ze studzienek, dodać pożywkę etapu 2A i inkubować w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
  13. W Etapie 2 dnia 2 ogrzej trzustkę Etap 2-4 Pożywka podstawowa w kąpieli w temperaturze 37 °C i rozmroź Suplement 2B. Przygotuj pożywkę Etapu 2B, dodając Suplement 2B do trzustki Podłoże podstawowe Etap 2-4. Dobrze wymieszaj i natychmiast zużyj.
  14. Odessać zużytą pożywkę ze studzienek, dodać pożywkę etapu 2B i inkubować w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
  15. Na etapie 2 dnia 3 powtórz kroki 2.13-2.14. Przejdź do etapu 3.
  16. Na etapie 3 dnia 1 ogrzej trzustkę Etap 2-4 Podłoże podstawowe w kąpieli o temperaturze 37 °C i rozmroź Suplement 3. Przygotuj pożywkę etapu 3, dodając suplement 3 do podłoża podstawowego etapu 2-4 trzustki. Dobrze wymieszaj i natychmiast zużyj.
  17. Odessać zużytą pożywkę ze studzienek, dodać pożywkę etapu 3 i inkubować w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
  18. Na etapie 3 dnia 2 i dnia 3 powtórz kroki 2.16-2.17. Przejdź do etapu 4.
  19. Na etapie 4 dnia 1 ogrzej trzustkę Etap 2-4 Podłoże podstawowe w kąpieli o temperaturze 37 °C i rozmroź Suplement 4. Przygotuj pożywkę etapu 4, dodając suplement 4 do podłoża podstawowego etapu 2-4 trzustki. Dobrze wymieszaj i natychmiast zużyj.
  20. Odessać zużytą pożywkę ze studzienek, dodać pożywkę etapu 4 i inkubować w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
  21. Na etapie 4 od dnia 2 do dnia 4 powtórz kroki 2.19-2.20. Przejdź do kroków agregacji.

3. Agregacja w klastry progenitorowe trzustki przy użyciu płytek mikrodołkowych o średnicy 400 μm

  1. Na etapie 4 dnia 5 należy wstępnie potraktować mikrostudzienki (np. płytkę 24-dołkową) 500 μl roztworu do płukania zapobiegającego przywieraniu na dołek.
  2. Przygotować płytkę równoważącą i odwirować płytkę mikrodołkową o masie 1 300 × g przez 5 min.
    UWAGA: Sprawdź płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że w mikrodołkach nie pozostały żadne pęcherzyki. Wirować ponownie przez kolejne 5 minut, jeśli pęcherzyki pozostają uwięzione w mikrostudzienkach.
  3. Odessać płyn do płukania zapobiegającego przywieraniu ze studzienek i spłukać raz 1 ml DPBS. Odessać DPBS z dołków i dodać 1 ml pożywki agregacyjnej do każdej studzienki.
  4. Usunąć zużytą pożywkę z kultur progenitorowych trzustki i przemyć raz DPBS. Dysocjować kultury na pojedyncze komórki za pomocą odczynnika dysocjacyjnego w temperaturze 37 °C przez 10-12 minut. Spłucz komórki ciepłym DMEM/F12, przenieś je do probówki i wiruj z prędkością 300 × g przez 5 minut.
  5. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce agregacyjnej i przeprowadzić liczenie żywych komórek. Zasiaj 2,4-3,6 miliona komórek na studzienkę (tj. 2,000-3,000 komórek na mikrostudzienkę) i dodaj pożywkę agregacyjną do każdej studzienki, aby uzyskać końcową objętość 2 ml na studzienkę.
  6. Delikatnie odpipetuj komórki w górę i w dół kilka razy za pomocą końcówki pipety P1000, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek w całym dołku. Nie wprowadzaj pęcherzyków do mikrostudzienek. Odwirować płytkę mikrodołkową o masie 300 × g przez 5 minut w celu wychwycenia komórek w mikrostudzienkach. Inkubować płytkę mikrodołkową w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez agregację przez 24 godziny i przejść do etapów 5-7 różnicowania.
    UWAGA: Uważaj, aby nie naruszyć płyty w czasie agregacji. Do optymalnego formowania agregatu może być potrzebne do 48 godzin inkubacji.

4. Różnicowanie wywodzących się z zestawu skupisk progenitorowych trzustki na wyspy trzustkowe hPSC

  1. W dniu 1. etapu 5 należy ogrzać podłoże podstawowe etapu 5-7 w kąpieli o temperaturze 37 °C i rozmrozić suplementy (patrz tabela 1 i tabela 2). Przygotować pożywkę etapu 5, dodając suplementy (do końcowych stężeń roboczych) do podłoża podstawowego etapu 5-7. Dobrze wymieszaj i natychmiast zużyj.
  2. Po uformowaniu agregatu delikatnie odpipetuj agregaty w górę i w dół kilka razy za pomocą końcówki do pipety P1000, aby unosić wszelkie niezagregowane komórki. Pozwól, aby agregaty osiadły grawitacyjnie (odczekaj ~1 min). Delikatnie usunąć zużyte podłoże (zawierające pływające niezagregowane komórki) z dołka w jak największym stopniu, unikając zasysania agregatów.
  3. Energicznie dozować świeże podłoże etapu 5 na powierzchnię płytki mikrodołkowej, aby usunąć kruszywa z mikrostudzienek. Przenieś agregaty do 6-dołkowych z ultraniskim mocowaniem (ULA). Przepłukać raz pożywką Stage 5, aby całkowicie odzyskać kruszywa z mikrostudzienek.
  4. Zbierz wszystkie agregaty w dołkach ULA 6, ponownie zawieś kruszywa w podłożu etapu 5 i dostosuj gęstość do 20 klastrów na 100 μl (np. oczekuje się, że z każdego dołka zostanie pobranych ~1,200 klastrów. Zawiesić 1,200 klastrów w 6 ml pożywki Stage 5). Za pomocą pipety wielokanałowej dozuj 50 μl pożywki Stage 5 do każdego dołka 96-dołkowej płytki ULA z płaskim dnem. Napełnij studzienki narożne i krawędziowe 200 μl DPBS.
    UWAGA: Unikaj używania studzienek krawędziowych do hodowli kruszyw, ponieważ są one podatne na większe parowanie; W przeciwnym razie należy użyć płytki 96-dołkowej, która została zaprojektowana tak, aby zminimalizować parowanie wzdłuż krawędzi (np. płytki 96-dołkowe z wbudowanymi fosami) lub umieścić płytkę hodowlaną w inkubatorze do hodowli komórkowych w mikroklimacie o wysokiej wilgotności.
  5. Dodać 100 μl zawiesiny klastra do każdego dołka 96-dołkowej płytki ULA z płaskim dnem, co daje w sumie 150 μl pożywki hodowlanej zawierającej średnio 20 klastrów na studzienkę.
    UWAGA: Delikatnie wymieszać zawiesinę aparatu udojowego za każdym razem przed dozowaniem do 96 dołków.
  6. Umieść płytki hodowlane na równej powierzchni w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
  7. W Etapie 5 dnia 2 przygotuj pożywkę Etapu 5 zgodnie z krokiem 4.1.
  8. Użyj pipety wielokanałowej, aby usunąć ~90 μl zużytego podłoża z każdej studzienki i odświeżyć 100 μl pożywki etapu 5.
  9. Na etapie 5 dnia 3 powtórz kroki 4.7-4.8. Przejdź do etapu 6.
  10. W dniu 1. etapu 6 należy ogrzać podłoże podstawowe etapu 5-7 w kąpieli o temperaturze 37 °C i rozmrozić (patrz tabela 1 i tabela 2). Przygotować pożywkę etapu 6, dodając suplementy (do końcowych stężeń roboczych) do podłoża podstawowego etapu 5-7. Dobrze wymieszaj i natychmiast zużyj.
  11. Użyj pipety wielokanałowej, aby usunąć ~90 μl zużytego podłoża i odświeżyć 100 μl pożywki etapu 6 na studzienkę.
  12. Na etapie 6 od dnia 2 do dnia 8 powtórz kroki 4.10-4.11. Przejdź do etapu 7.
  13. W dniu 1. etapu 7 należy ogrzać podłoże podstawowe etapu 5-7 w kąpieli o temperaturze 37 °C i rozmrozić (patrz tabela 1 i tabela 2). Przygotować pożywkę etapu 7, dodając suplementy (do końcowych stężeń roboczych) do podłoża podstawowego etapu 5-7. Dobrze wymieszaj i natychmiast zużyj.
  14. Użyj pipety wielokanałowej, aby usunąć ~90 μl zużytego podłoża i odświeżyć 100 μl pożywki Stage 7 na studzienkę.
  15. Na etapie 7 od dnia 2 do dnia 12 powtórz kroki 4.13-4.14. Przejdź do charakterystyki in vitro.

5. Analiza cytometryczna przepływowa

  1. Usuń pożywkę hodowlaną i umyj raz DPBS. Dysocjować kultury (płaskie komórki progenitorowe lub różnicujące się klastry) na pojedyncze komórki za pomocą odczynnika dysocjacyjnego przez inkubację w temperaturze 37 °C przez 10-12 minut. Płukać buforem FACS i wirować z prędkością 300 × g przez 5 minut.
  2. Ponownie zawieś osad komórek w buforze FACS i wykonaj zliczanie komórek. Wiruj komórki z prędkością 300 × g przez 5 minut. Zawiesić pojedyncze komórki w 500 μl buforu Fix/Perm na 10 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Przed użyciem doprowadź bufor Fix/Perm do temperatury pokojowej. Bufor Fix/Perm zawiera paraformaldehyd (PFA). Ostrożnie obchodzić się z PFA w dygestorium i utylizować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  3. Wirować w temperaturze 500 × g przez 3 minuty, przemyć dwukrotnie 500 μl 1x buforu do trwałej ondulacji/prania i ponownie zamieszać w 300 μl 1x buforu do trwałej ondulacji. Przenieść 100 μl zawiesiny pojedynczej komórki (każda zawierająca 2,5-3 × 105 komórek) do trzech probówek do mikrofuge w celu niebarwionej kontroli, kontroli izotypu i barwienia przeciwciał (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania próbki przeciwciał i informacji o rozcieńczeniu). Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej i przykryć folią.
  4. Wirować z prędkością 500 × g przez 3 minuty. Przemyć dwukrotnie 500 μl 1x bufor do trwałej ondulacji. Zawiesić próbki w 100 μl buforu FACS i przeanalizować wybarwione komórki (patrz Tabela materiałów do wewnątrzkomórkowego barwienia markerów na określonych etapach) za pomocą cytometru przepływowego i oprogramowania (np. FlowJo).
    UWAGA: Jeśli próbki nie zostaną natychmiast oznaczone, należy je przechowywać w temperaturze 4°C, chronić przed światłem. W przypadku strategii bramkowania dane dotyczące przepływu są najpierw bramkowane przez właściwości rozproszenia (FSC-A i SSC-A) w celu usunięcia małych zanieczyszczeń komórkowych, a następnie właściwości FSC-A i szerokości FSC w celu identyfikacji singletów. Bramkowanie dodatnie i ujemne określa się za pomocą kontroli komórek macierzystych i/lub niebarwionych kontroli izotypowych.

6. Barwienie immunologiczne całego wierzchowca

  1. Zbierz klastry w probówce z mikrofugą. Osadzaj klastry grawitacyjnie. Odessać zużytą pożywkę i spłukać raz 1 ml PBS (z wapniem i magnezem). Utrwalić klastry za pomocą 1 ml 4% PFA w temperaturze 4°C przez noc.
  2. Spłukać raz PBST i przepuścić 20-30 klastrów z 500 μl 0,3% TritonX-100 w probówce do mikrofuge w temperaturze otoczenia przez co najmniej 6 godzin na wytrząsarce przechylnej.
    UWAGA: W przypadku dużych skupisk potrzebny jest dłuższy czas przenikania (do 24 godzin).
  3. Inkubować klastry w 100 μl buforu blokującego w temperaturze otoczenia przez 1 godzinę na wytrząsarce przechylnej. Usunąć bufor blokujący i inkubować klastry ze 100 μl przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w buforze do rozcieńczania przeciwciał w temperaturze otoczenia przez noc na wytrząsarce przechylnej.
    UWAGA: Jeśli tło jest silne podczas obrazowania, należy inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi w temperaturze 4 °C.
  4. Umyć dokładnie 3 x 30 min 500 μl PBST na wytrząsarce uchylnej (kąt nachylenia ustawiony na 8, prędkość ustawiona na 20).
  5. Inkubować klastry ze 100 μl przeciwciał drugorzędowych w buforze rozcieńczającym przeciwciała w temperaturze otoczenia przez noc na wytrząsarce przechylnej. Przykryj probówki folią.
    UWAGA: Jeśli tło jest silne podczas obrazowania, inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze 4 °C.
  6. Spłukać raz 500 μl PBST. Dodać 100 μl roztworu 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) (10 μg/ml w PBST) i barwić w temperaturze otoczenia przez 10-15 min. Przykryj folią i chroń przed światłem.
  7. Umyć dokładnie 3 x 30 min z 500 μl PBST na wytrząsarce uchylnej. Przykryj rurki folią na etapie prania.
  8. Przymocuj klastry do szkiełek do komór obrazowania (patrz tabela materiałów) wstępnie pokrytych klejem tkankowym zgodnie z protokołem producenta i opublikowanymi protokołami20,21.
  9. Zamocować za pomocą pożywki do oczyszczania tkanek (80% glicerolu w roztworze PBS) i przykryć szkiełkami nakrywkowymi. Chronić przed światłem do czasu obrazowania konfokalnego.
    UWAGA: Jeśli próbki nie zostaną natychmiast zobrazowane, należy je przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.

7. Statyczny test GSIS

  1. Ciepły bufor wodorowęglanu Ringera Kreba o niskiej zawartości glukozy (3,3 G KRB), bufor KRB o wysokiej zawartości glukozy (16,7 G) i bufor KRB o wysokiej zawartości glukozy w kąpieli o temperaturze 37 °C.
  2. Ręcznie wybierz dopasowane do rozmiaru klastry i spłucz 2 ml ciepłego buforu KRB 3,3 G. Przenieść klastry na 6-dołkową płytkę poddaną działaniu kultur nietkankowych i zrównoważyć w 2 ml ciepłego buforu KRB 3,3 G przez 1 godzinę w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Po zrównoważeniu napełnić komorę testową (patrz tabela materiałów) 100 μl ciepłego buforu KRB 3,3G. Ręcznie wybierz pięć klastrów i przenieś je na środek komory testowej. Inkubować przez 30 minut w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    UWAGA: Użyj końcówek do pipet o pojemności 10 μl do przenoszenia klastrów o minimalnej objętości podłoża.
  4. Ostrożnie zebrać ~100 μl supernatantu i przechowywać go w temperaturze -30 °C do czasu pomiaru podstawowego wydzielania insuliny (patrz krok 7.9). Na tym etapie nie susz ani nie guść żadnych skupisk. Natychmiast dodać 100 μl ciepłego buforu KRB 16,7 G do komory testowej i inkubować te same klastry przez 30 minut w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  5. Ostrożnie zebrać ~100 μl supernatantu i przechowywać go w temperaturze -30 °C do czasu pomiaru wydzielania insuliny stymulowanego glukozą (patrz krok 7.9). Natychmiast dodać 100 μl ciepłego 30 mM buforu KCl KRB do komory testowej i inkubować te same klastry przez 30 minut w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  6. Ostrożnie zebrać ~100 μl supernatantu i przechowywać w temperaturze -30 °C do czasu pomiaru wydzielania insuliny stymulowanego przez KCl (patrz krok 7.9). Natychmiast dodać 100 μl buforu do lizy RIPA do komory testowej i przenieść bufor do lizy zawierający wszystkie pięć klastrów do probówki do mikrofuge.
  7. Opcjonalnie) Rozbij klastry ręcznie przez energiczne rozcieranie za pomocą końcówki do pipety P200. Wirować przez 30 s i inkubować na lodzie przez 30 minut, a następnie przez kolejne 30 s wirowania.
    UWAGA: Zapewnić całkowitą lizę poprzez wirowanie i wystarczający czas inkubacji na lodzie.
  8. Wirować z prędkością 8 000 × g przez 1 minutę. Zebrać supernatant i przechowywać w temperaturze -30 °C do czasu zmierzenia całkowitej zawartości insuliny (patrz krok 7.9).
  9. Zmierz insulinę ludzką w próbkach supernatantu za pomocą zestawu ELISA insuliny ludzkiej zgodnie z protokołem producenta i opublikowanymi protokołami20,22.
    UWAGA: Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania próbek sklarowanych nad osadem. Próbki, które mają więcej niż trzy cykle zamrażania i rozmrażania, nie powinny być oznaczane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opracowaliśmy hybrydową strategię różnicowania komórek macierzystych w wydzielające insulinę wyspy hPSC-islets w siedmiu krokach, która wykorzystuje zestaw do hodowli progenitorów trzustki w pierwszych czterech etapach w kulturze planarnej, a następnie zmodyfikowany protokół oparty na wcześniej opisanej metodzie6 w statycznej kulturze zawiesinowej w trzech ostatnich etapach (Rysunek 1). W tym protokole zapewnienie kultury o niemal pełnej konfluencji (90%-100%) 24 h po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano siedmioetapowy protokół hybrydowy, który pozwala na wytwarzanie wysp trzustkowych hPSC zdolnych do wydzielania insuliny po prowokacji glukozą w ciągu 40 dni hodowli in vitro. Uważa się, że spośród tych wielu etapów, skuteczna indukcja ostatecznej endodermy stanowi ważny punkt wyjścia dla ostatecznych wyników różnicowania 18,27,28. W protokole producenta zaleca się gęstość wysiewu na poziomie 2,6 × 10<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Timothy J. Kieffer był pracownikiem ViaCyte podczas przygotowywania tego manuskryptu. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie od STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF i Canadian Institutes of Health Research. Jia Zhao i Shenghui Liang są laureatami nagrody Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam jest stypendystą programu Mitacs Accelerate Fellowship. Diepiriye G. Iworima jest laureatką stypendium Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship oraz nagrody upamiętniającej Ecole Polytechnique w 1989 roku. Serdecznie dziękujemy dr Edouardowi G. Stanleyowi z MCRI i Monash University za udostępnienie linii Mel1 INS GFP/W oraz Alberta Diabetes Institute Islet Core za izolację i dystrybucję ludzkich wysp trzustkowych. Dziękujemy również za wsparcie ze strony Instytutu Nauk Przyrodniczych ds. Obrazowania i Cytometrii Przepływowej Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3,3',5-Triiodo-L-tyronina (T3)SigmaT6397Hormon tarczycy
4% roztwór PFASanta Cruz BiotechnologySC-281692Należy obchodzić się z dygestoriami
96-Well, Ultralow Attachment, płaskie dnoCorning Costar (VWR)CLS3474Płaskie dno; do statycznej hodowli zawiesiny w ostatnich trzech etapach
Technologie AccutaseSTEMCELL07920Odczynnik dysocjacyjny do komórek Stage 4
Płytki Aggrewell400STEMCELL Technologies34415400 µ Płytki mikrodołkowe o średnicy m Płytki
Aggrewell800STEMCELL Technologies34815800 µ Płytki mikrodołkowe o średnicy m
Alexa Fluor 488 Koza anty-ludzka FOXA2 (koza IgG)R& Systemy DIC2400G1:100 w cytometrii przepływowej; używany do oznaczania komórek etapu 1
Alexa Fluor 488 Kozia IgG Kontrola izotypuR& D SystemsIC108G1:100 w cytometrii przepływowej
Alexa Fluor 488 Mysz anty-ludzka SST (mysia IgG2B)BD Sciences5660321:250 w cytometrii przepływowej; używany do oznaczania komórek etapu 7
Alexa Fluor 488 Mysz IgG2B Kontrola izotypuR& D SystemsIC0041G1:500 w cytometrii przepływowej
Alexa Fluor 647 Mysi anty-ludzki peptyd C (mysi IgG1κ)BD Pharmingen5658311:2,000 w cytometrii przepływowej; używany do oznaczania komórek etapu 7
Alexa Fluor 647 Mysz anty-ludzka INS (mysia IgG1κ)BD Sciences5656891:2,000 w cytometrii przepływowej
Alexa Fluor 647 Mysz anty-ludzka NKX6.1 (mysz IgG1κ)BD Sciences5633381:33 w cytometrii przepływowej; używany do oznaczania komórek etapu 4
Alexa Fluor 647 Mysz anty-ludzka SOX17 (mysia IgG1κ)BD Sciences5625941:50 w cytometrii przepływowej; używany do oznaczania komórek etapu 1
Alexa Fluor 647 Mysz IgG1κ Kontrola izotypuBD Sciences5577141:50 w cytometrii przepływowej
ALK5i IICayman Chemicals14794Inhibitor sygnalizacji TGF-beta
Roztwór do płukania zapobiegający przywieraniu STEMCELL Technologies7010Komora testowa roztworu do płukania mikrostudzienki
CellvisD35-10-1-NDo celów statycznego GSIS i obrazowania konfokalnego
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Thermo Fisher ScientificBP1600-100Do procedury barwienia immunologicznego
Przeciwciało CK19DAKOM08881:50 w całej górze immunofluorescencja
D-glukozaSigmaG8769Średni suplement
DAPISigmaD9542Do jądrowego barwienia przeciwbarwiącego
DMEM/F12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032Roztwór rozcieńczający Matrix
Osioł anty-kozioł Alexa Fluor 555Technologie życiaA214321:500 w całej górze immunofluorescencja
Osioł anty-koza Alexa Fluor 647Technologie życiaA214471:500 w całej górze immunofluorescencja
osła anty-mysz Alexa Fluor 555Life technologiesA315701:500 w całej górze immunofluorescencja
Osioł anty-mysz Alexa Fluor 647Life technologiesA315711:500 w całej górze immunofluorescencja
Osioł anty-królik Alexa Fluor 555Life technologiesA315721:500 w całej immunofluorescencji mount
Osioł anty-królik Alexa Fluor 647Technologie życiaA315731:500 w całej immunofluorescencji
osła anty-owce Alexa Fluor 647Technologie życiaA214481:500 w całej immunofluorescencji
DPBSSigmaD8537Bez Ca2+ i Mg2+
ELISA, insulina, ludzkaAlpco80-INSHU-E01.1Do pomiaru insuliny ludzkiej
Wolny od kwasów tłuszczowych BSAProliant68700Średni suplement
Zestaw roztworów do utrwalania i przepuszczalnościBD Sciences554714Fix/Perm i 10x roztwory do trwałej ondulacji/prania
Delikatny odczynnik do dysocjacji komórekSTEMCELL Technologies7174Do pasażowania grudek hPSC podczas hodowli podtrzymującej
Przeciwciało glukagonuSigmaG26541:400 w całym organizmie immunofluorescencji
GLUT1Thermo Fisher ScientificPA1-377821:200 w całej górze immunofluorescencja
GlutaMAX-I (100x)Gibco35050061Suplement L-glutaminy
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-4Do oczyszczania i montażu tkanek
GSi XXSigma Millipore565789Inhibitor Notch
HeparynaSigmaH3149Średni suplement
ITS-X (100x)Thermo Fisher Scientific51500056Insulina-Transferyna-Selen-Etanoloamina; Średni suplement
LDN193189 STEMCELL Technologies72147Antagonista BMP
Przeciwciało MAFAAbcamab264051:200 w całej górze immunofluorescencyjna
Matrigel, z kwalifikacją hESCThermo Fisher Scientific08-774-552Macierz zewnątrzkomórkowa do powlekania powierzchni naczyń krwionośnych
MCDB131 mediumTechnologie życia10372019Pożywka bazowa
Kompletny zestaw mTeSR1STEMCELL Technologie85850pożywka z komórkami macierzystymi i 5-krotny suplement w zestawie
N-Cys (N-acetylocysteina)SigmaA9165Przeciwutleniacz
NaHCO3SigmaS6297Średni suplement
NEUROD1 przeciwciałoR& D SystemsAF27461:20 w całej górze immunofluorescencja
NKX6.1 przeciwciałoDSHBF55A12-c1:50 w całej górze immunofluorescencja
Przeciwciało polipeptydowe trzustkiR& D SystemsAF62971:200 w immunofluorescencji całej monty
PBSSigmaD8662z przeciwciałem Ca2+ i Mg2+
PDX1Abcamab472671:200 w całej górze immunofluorescencja
PE Mysz anty-ludzka GCG (mysz IgG1κ)BD Sciences5658601:2,000 w cytometrii przepływowej; używany do oznaczania komórek etapu 7
PE Mysz anty-ludzka NKX6.1 (mysia IgG1k)BD Sciences5630231:250 w cytometrii przepływowej
PE Mysz anty-ludzka PDX1 (mysia IgG1k)BD Sciences5621611:200 w cytometrii przepływowej; używany do oznaczania komórek etapu 4
PE Mysz IgG1κ Kontrola izotypuBD Sciences5546801:2,000 w cytometrii przepływowej
PE Mysz-ludzka chromogranina A (CHGA, mysia IgG1k)BD Sciences5645631:200 w cytometrii przepływowej
R428 Cayman Chemicals21523Inhibitor kinazy tyrozynowej AXL
Kwas retinoidowy, all-transSigmaR2625Światłoczuły
bufor do lizy RIPA, 10xSigma20-188Do ekstrakcji hormonów
SANT-1SigmaS4572Inhibitor SHH
SLC18A1 przeciwciałoSigmaHPA0637971:200 w całej ilości immunofluorescencji
Przeciwciało somatostatynySigmaHPA0194721:100 w całej górze immunofluorescencja
STEMdiff Zestaw progenitorów trzustkiSTEMCELL Technologies05120Zawarte podłoża podstawowe i suplementy
Przeciwciało synaptofizynyNovusNB120-166591:25 w całej górze immunofluorescencja
Triton X-100SigmaX100Do przepuszczalności
Trolox Sigma Millipore648471Analog witaminy E
TrypLE Enzyme Express Lifetechnologie12604-021odczynnik enzymatyczny do dysocjacji komórek do pasażowania pojedynczych komórek hPSC
Przeciwciało trypsyny1/2/3R& D SystemsAF35861:25 w całości immunofluorescencja
Y-27632STEMCELL Technologies72304Inhibitor ROCK
SiarczanSigmaZ0251Średni suplement

Bibliografia

  1. Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. Type 1 diabetes. Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).
  2. Petersen, M. C., Shulman, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  3. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  4. Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
  5. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  6. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  7. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  8. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  9. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  10. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  11. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  12. Rukstalis, J. M., Habener, J. F. Neurogenin3: a master regulator of pancreatic islet differentiation and regeneration. Islets. 1 (3), 177-184 (2009).
  13. Mastracci, T. L., Anderson, K. R., Papizan, J. B., Sussel, L. Regulation of Neurod1 contributes to the lineage potential of Neurogenin3+ endocrine precursor cells in the pancreas. PLoS Genetics. 9 (2), e1003278(2013).
  14. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nature Biotechnology. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  15. Du, Y., et al. Human pluripotent stem-cell-derived islets ameliorate diabetes in non-human primates. Nature Medicine. 28 (2), 272-282 (2022).
  16. Hogrebe, N. J., Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Targeting the cytoskeleton to direct pancreatic differentiation of human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 38 (4), 460-470 (2020).
  17. Yoshihara, E., et al. Immune-evasive human islet-like organoids ameliorate diabetes. Nature. 586 (7830), 606-611 (2020).
  18. Mahaddalkar, P. U., et al. Generation of pancreatic beta cells from CD177(+) anterior definitive endoderm. Nature Biotechnology. 38 (9), 1061-1072 (2020).
  19. Liang, S., et al. Differentiation of stem cell-derived pancreatic progenitors into insulin-secreting islet clusters in a multiwell-based static 3D culture system. Cell Reports Methods. 3, 10046(2023).
  20. Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. Elife. 8, e41540(2019).
  21. Zhao, J., et al. In vivo imaging of calcium activities from pancreatic beta-cells in zebrafish embryos using spinning-disc confocal and two-photon light-sheet microscopy. Bio-protocol. 11 (23), e4245(2021).
  22. Liang, S., et al. Carbon monoxide enhances calcium transients and glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta-cells by activating phospholipase C signal pathway in diabetic mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 582, 1-7 (2021).
  23. Bruin, J. E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
  24. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  25. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  26. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro beta-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  27. D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
  28. Jiang, Y., et al. Generation of pancreatic progenitors from human pluripotent stem cells by small molecules. Stem Cell Reports. 16 (9), 2395-2409 (2021).
  29. Tran, R., Moraes, C., Hoesli, C. A. Controlled clustering enhances PDX1 and NKX6.1 expression in pancreatic endoderm cells derived from pluripotent stem cells. Scientific Reports. 10 (1), 1190(2020).
  30. Mamidi, A., et al. Mechanosignalling via integrins directs fate decisions of pancreatic progenitors. Nature. 564 (7734), 114-118 (2018).
  31. Rezania, A., et al. Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo. Stem Cells. 31 (11), 2432-2442 (2013).
  32. Sander, M., et al. Homeobox gene Nkx6.1 lies downstream of Nkx2.2 in the major pathway of beta-cell formation in the pancreas. Development. 127 (24), 5533-5540 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

R nicowanie kom rek betaklastry progenitor w trzustkistatyczna hodowla w zawiesinier nicowanie endokrynnestymulowana glukoz sekrecja insulinytypy kom rek wysepekekspresja PDX1ekspresja NKX6 1
Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.