Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Indukcja zapalenia przyzębia poprzez połączenie ligatury i wstrzyknięcia lipopolisacharydu w modelu szczurzym

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64842

⸱

17 lutego 2023

 ,  ,  ,  , 
1Group of Cell Therapy and Tissue Engineering, Research Institute on Health Sciences (IUNICS), University of the Balearic Islands (UIB), 2Balearic Islands Health Research Institute (IdISBa), 3Preclinical Research Department, Labo'Life España, 4Departament de Biologia Fonamental i Ciències de la Salut, UIB, 5ADEMA School of Dentistry, UIB

W tym artykule

Podsumowanie

W tym badaniu, szczurzy model indukcji zapalenia przyzębia jest prezentowany poprzez kombinację ligatury retencyjnej i powtarzających się iniekcji lipopolisacharydu pochodzącego z Porphyromonas gingivalis, przez 14 dni wokół pierwszych zębów trzonowych szczęki. Techniki podwiązania i iniekcji LPS były skuteczne w wywoływaniu zapalenia ozębnej, co skutkowało utratą kości wyrostka zębodołowego i stanem zapalnym.

Streszczenie

Zapalenie przyzębia (PD) jest bardzo powszechną, przewlekłą chorobą immunologiczno-zapalną przyzębia, która powoduje utratę tkanek miękkich dziąseł, więzadeł przyzębia, cementu i kości wyrostka zębodołowego. W pracy opisano prostą metodę indukcji PD u szczurów. Udostępniamy szczegółowe instrukcje dotyczące umieszczania modelu ligatury wokół pierwszych zębów trzonowych szczęki (M1) oraz kombinacji iniekcji lipopolisacharydu (LPS), pochodzącego z Porphyromonas gingivalis po stronie mezjo-podniebiennej M1. Indukcja zapalenia przyzębia utrzymywała się przez 14 dni, sprzyjając gromadzeniu się biofilmu bakteryjnego i stanowi zapalnemu. Aby zweryfikować model zwierzęcy, IL-1β, kluczowy mediator stanu zapalnego, oznaczono za pomocą testu immunologicznego w płynie dziąsłowym (GCF), a ubytek kości wyrostka zębodołowego obliczono za pomocą tomografii komputerowej wiązki stożkowej (CBCT). Technika ta była skuteczna w promowaniu recesji dziąseł, utraty kości wyrostka zębodołowego i wzrostu poziomu IL-1β w GCF pod koniec procedury eksperymentalnej po 14 dniach. Metoda ta okazała się skuteczna w indukowaniu choroby Parkinsona, dzięki czemu mogła być wykorzystana w badaniach nad mechanizmami progresji choroby i przyszłymi możliwymi metodami leczenia.

Wprowadzenie

Zapalenie przyzębia (PD) jest szóstym najbardziej rozpowszechnionym schorzeniem zdrowia publicznego na świecie, dotykającym około 11% całej populacji, będąc zaawansowaną, nieodwracalną i destrukcyjną formą choroby przyzębia1,2. PD to proces zapalny, który wpływa na tkanki dziąseł i przyzębia, co skutkuje recesją dziąseł, migracją wierzchołkową nabłonka połączeniowego z rozwojem kieszonek oraz utratą kości wyrostka zębodołowego3. Ponadto choroba Parkinsona jest związana z kilkoma chorobami ogólnoustrojowymi, w tym chorobami układu krążenia, otyłością, cukrzycą i reumatoidalnym zapaleniem stawów, w przypadku których czynniki środowiskowe i specyficzne dla gospodarza odgrywają znaczącą rolę4,5.

Stąd, PD jest chorobą wieloczynnikową inicjowaną głównie przez nagromadzenie płytki bakteryjnej - wynikającej z dysbiozy społeczności drobnoustrojów - oraz przez nadmierną odpowiedź immunologiczną gospodarza na patogeny przyzębia, co prowadzi do rozpadu tkanki przyzębia4,6. Wśród kilku bakterii przyzębia, Gram-ujemna bakteria beztlenowa Porphyromonas gingivalis jest jednym z kluczowych patogenów w PD4. P. gingivalis zawiera w swoich ściankach złożony lipopolisacharyd (LPS), cząsteczkę znaną z indukowania nacieku leukocytów wielojądrzastych i poszerzenia naczyń w tkankach przyzębia objętych stanem zapalnym7. Powoduje to produkcję mediatorów stanu zapalnego, takich jak interleukina 1 (IL-1), IL-6 i IL-8, czynnik martwicy nowotworu (TNF) lub prostaglandyny, z późniejszą aktywacją osteoklastów i resorpcją kości, co prowadzi do zniszczenia tkanek i ostatecznej utraty zębów3.

Wśród różnych zalet modeli zwierzęcych znajduje się zdolność do naśladowania złożoności komórkowej, jak u ludzi, lub do większej dokładności niż badania in vitro, które są przeprowadzane na powierzchniach plastikowych z ograniczonymi typami komórek8. Do eksperymentalnego modelowania PD in vivo wykorzystano różne gatunki zwierząt, takie jak naczelne, psy, świnie, fretki, króliki, myszy i szczury9. Jednak szczury są najszerzej badanym modelem zwierzęcym pod kątem patogenezy PD, ponieważ są niedrogie i łatwe w obsłudze10. Ich tkanka dziąsłowa ma podobne cechy strukturalne do ludzkiej tkanki dziąsłowej, z płytką bruzdą dziąsłową i nabłonkiem połączeniowym przyczepionym do powierzchni zęba. Ponadto, podobnie jak u ludzi, nabłonek łączący ułatwia przechodzenie bakterii, ciał obcych i wysięków z komórek zapalnych 9.

Jednym z najczęściej opisywanych eksperymentalnych modeli indukcji PD u szczurów jest umieszczanie ligatur wokół zębów, co jest technicznie trudne, ale niezawodne10. Umieszczenie ligatury ułatwia gromadzenie się płytki nazębnej i bakterii, powodując dysbiozę w bruzdach dziąsłowych, która powoduje zapalenie i zniszczenie tkanek przyzębia11. Utrata przyczepu przyzębia i resorpcja kości wyrostka zębodołowego może wystąpić w ciągu 7 dni w tym modelu szczura8.

Inny zwierzęcy model PD polega na wstrzyknięciu LPS do tkanki dziąsła. W rezultacie stymulowana jest osteoklastogeneza i utrata masy kostnej. Cechy histopatologiczne tego modelu są podobne do PD ustalonego przez człowieka, charakteryzującego się wyższymi poziomami cytokin prozapalnych, degradacją kolagenu i resorpcją kości wyrostka zębodołowego6,8.

Tak więc, celem tego badania było opisanie prostego szczurzego modelu eksperymentalnego PD opartego na technikach iniekcji P. gingivalis-LPS (Pg-LPS), w połączeniu z umieszczeniem ligatury wokół pierwszych zębów trzonowych szczęki (M1). Jest to model o podobnych cechach do tych obserwowanych w chorobie Parkinsona u ludzi, który może być wykorzystany w badaniu mechanizmów progresji choroby i przyszłych możliwych metod leczenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Eksperymentalny protokół badania został zatwierdzony przez Komitet Etyczny Eksperymentów na Zwierzętach Instytutu Badań nad Zdrowiem Balearów (CEEA-UIB; numer referencyjny 163/03/21).

1. Znieczulenie zwierząt i przygotowanie do zabiegu

  1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne (aluminiowe kneble, odkrywca dentystyczny, lanca diamentowa, nożyczki chirurgiczne, szczypce mikrochirurgiczne, uchwyt na mikroigły, rzeźbiarkę hollenback, windę mikrochirurgiczną okostną i nożyczki mikrochirurgiczne) (5 min w 135 °C) przed zabiegiem.
  2. Przygotuj wszystkie roztwory potrzebne do zabiegu w sterylnych warunkach, zgodnie z opisem:
    1. Przygotuj mieszaninę ketaminy (60 mg/ml) i ksylazyny (8 mg/ml), mieszając 1,6 ml ketaminy z 1 ml ksylazyny rozcieńczonej w roztworze buforu fosforanowego (PBS)/soli fizjologicznej. Przechowywać wywar w temperaturze 4 °C.
    2. Rozcieńczyć atipamezol do końcowego stężenia 0,25 mg/ml w PBS/sól fizjologiczna. Przechowywać wywar w temperaturze 4 °C.
    3. Rozcieńczyć buprenorfinę do końcowego stężenia 0,03 mg/ml w PBS/sól fizjologiczna. Przechowywać wywar w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotować 1 ml Pg-LPS (1 mg/ml) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Przechowywać wywar w temperaturze -20 °C.
  3. Do eksperymentu wykorzystano samice i samce szczurów rasy Wistar w wieku 12 tygodni i ważące 210-350 g w momencie operacji. Trzymać zwierzęta trzymane w grupach w odpowiednim środowisku i stałych warunkach (20–24 °C, 12 godzin dziennie w cyklach jasnych i ciemnych), z jedzeniem i standardową wodą, podawaną ad libitum.
  4. Aby wywołać znieczulenie, zważyć szczura i podać mieszaninę ketaminy/ksylazyny w stężeniu 80/10 mg/kg dootrzewnowo (IP), używając sterylnej igły podskórnej o sile 25 G i strzykawki o pojemności 1 ml.
  5. Po znieczuleniu szczura połóż zwierzę na grzbiecie na podgrzewanej platformie chirurgicznej; podczas zabiegu przykryj ciało zwierzęcia, aby zapobiec utracie ciepła.
    UWAGA: Głębokość znieczulenia ocenia się na podstawie utraty odruchu pedałowania podczas zabiegu oraz monitorowania parametrów życiowych. W razie potrzeby użyj małego stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie 2% izofluranem w 100% tlenie. Po indukcji znieczulenia nałóż sterylną maść okulistyczną na oba oczy, aby chronić rogówkę i zapobiec wysuszeniu.
  6. Podczas zabiegów podawaj 100% tlenu za pomocą małego stożka nosowego oraz monitoruj tętno i saturację tlenem za pomocą pulsoksymetrii.
    UWAGA: Jeśli nasycenie tlenem i częstość tętna spadną odpowiednio poniżej 95% i 190 uderzeń na minutę, przerwij procedurę i umieść zwierzę w bocznej pozycji odleżynowej, aż do osiągnięcia normalnych wartości.
  7. Otwórz pysk szczura za pomocą aluminiowego knebla ustnego wokół siekaczy (górnego i dolnego), chowając nim język i stabilizując szczękę i żuchwę w otwartej, wygodnej pozycji roboczej, umożliwiając dostęp do zębów trzonowych żuchwy.
    UWAGA: Jeśli zwierzę musi zostać umieszczone w bocznym odleżynie, usuń knebel z ust przed zmianą jego pozycji, aby ułatwić powrót do zdrowia. Po znieczuleniu zwierzęcia należy pobrać płyn dziąsłowy (GCF) przed zabiegiem (próbka w warunkach podstawowych) (dzień 0).
  8. Zbierz GCF zgodnie z opisem w następujących krokach:
    1. Połóż zwierzę na plecach na platformie operacyjnej i ustabilizuj szczękę i żuchwę w pozycji otwartej za pomocą aluminiowych knebli ustnych.
    2. Zebrać GCF za pomocą łącznie czterech (po dwa na każdy M1) chłonnego papierowego punktu nr 30 (0,03 cm średnicy x 3 cm długości), wkładając go do szczeliny dziąsła (przestrzeń między nabłonkiem dziąsła a sąsiednim szkliwem) wokół mezjo-podniebienia M1 do uzyskania lekkiego oporu. Trzymaj papier w tej samej pozycji przez łącznie 30 s przed natychmiastowym usunięciem.
    3. Po pobraniu należy natychmiast przenieść papierowy punkt do plastikowej fiolki i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu wykonania testu.

2. Technika podwiązania retencyjnego i dodziąsłowe wstrzyknięcie Pg -LPS

UWAGA: Model ligatury został stworzony (dzień 0) poprzez umieszczenie sterylnej plecionej jedwabnej ligatury (5/0) wokół M1 obustronnie w obrębie bruzdy dziąsłowej za pomocą narzędzi mikrochirurgicznych i zabezpieczenie jej węzłami chirurga na powierzchni podniebienia. Używanymi narzędziami mikrochirurgicznymi były szczypce mikrochirurgiczne, uchwyt na mikroigły, rzeźbiarka hollenback, winda mikrochirurgiczna okostna i nożyczki mikrochirurgiczne. Zastosowano również lupy chirurgiczne ze źródłem światła LED (powiększenie 3,6x).

  1. Umieść dystalny ogon szwu po stronie podniebienia uzębienia i włóż bliższy segment między kontaktem M1 a drugimi zębami trzonowymi szczęki (M2).
  2. Użyj windy mikrochirurgicznej okostnej, aby wprowadzić szew do bruzdy. Owiń ligaturę wokół policzkowej powierzchni M1 bardzo ostrożnie, ponieważ tkanki na tym poziomie prezentują wąską strefę przyczepionego dziąsła. Jeśli chodzi o aspekt podniebienny, upewnij się, że szew jest zaciśnięty na obu końcach, aby upewnić się, że jest wbity w bruzdę dziąsłową.
    UWAGA: Jeśli podczas zakładania szwu między M1 a M2 zaobserwuje się opór, kontakt można lekko otworzyć za pomocą eksploratora dentystycznego i wiertła w kształcie lancy diamentowej.
  3. Zawiąż końce szwu węzłem chirurgicznym i przytnij ogony tak krótko, jak to możliwe. Włóż węzeł do bruzdy.
    UWAGA: Końcówki narzędzi chirurgicznych mogą powodować uraz jamy ustnej i krwawienie. Przygotuj małe kawałki gazy lub bawełniany wacik, aby usunąć krew z jamy ustnej i uciskać, aby zatrzymać krwotok. Staranne zarządzanie tkankami miękkimi z podejściem mikrochirurgicznym minimalizuje powikłania chirurgiczne i prowadzi do mniejszej liczby urazów tkanek.
  4. Po ułożeniu podwiązki wstrzyknąć 40 μl Pg-LPS w sterylnym roztworze soli fizjologicznej za pomocą sterylnej igły podskórnej 25 G i strzykawki o pojemności 1 ml do tkanki poddziąsłowej (między korzeniem lub szyjką zęba a brzegiem dziąsła) obustronnie po stronie mezjo-podniebiennej M1 (dzień 0).

3. Zakończenie procedury

  1. Po ustawieniu podwiązania i zastosowaniu Pg-LPS uwolnij szczura ze stanu chirurgicznego i umieść go w czystej indywidualnej klatce pod lampą grzewczą.
  2. Antagonistę Atipamezol (0,5 mg/kg mc. podskórnie (SC)) należy wstrzyknąć za pomocą sterylnej igły podskórnej o strzykawce 25 g i strzykawki o pojemności 1 ml.
  3. W celu złagodzenia bólu należy wstrzyknąć 0,03 mg/kg buprenorfiny, SC.
  4. Monitoruj powrót zwierzęcia do zdrowia, aż do całkowitego odwrócenia skutków operacji. Indywidualnie trzymaj każdego szczura w odpowiednim środowisku w stałych warunkach (20-24 °C, 12 godzin dziennie cykle jasno-ciemne). Oferuj jedzenie i wodę dejonizowaną ad libitum.
  5. Przez pierwsze 2 dni po zabiegu należy zważyć zwierzęta i wstrzyknąć Buprenorfinę SC dwa razy dziennie w celu złagodzenia bólu.
    UWAGA: Buprenorfina może być podawana przed rozpoczęciem zabiegu w celu wyeliminowania efektu nakręcania.
  6. W czasie trwania eksperymentu monitoruj zwierzęta pod względem masy ciała i ogólnej oceny zachowania raz lub dwa razy w tygodniu.

4. Postępowanie następcze po zabiegu

UWAGA: Indukcja PD była utrzymywana przez 14 dni, aby sprzyjać gromadzeniu się biofilmu bakteryjnego i wynikającemu z tego zapaleniu. Ligatury muszą zostać zbadane i wyregulowane, a Pg-LPS jest wstrzykiwany trzy razy w tygodniu (dzień 2, dzień 4, dzień 6, dzień 8, dzień 10 i dzień 12).

  1. Zbadaj i wyreguluj ligaturę (dzień 2, dzień 4, dzień 6, dzień 8, dzień 10 i dzień 12) w następujący sposób:
    1. Znieczulenie 2% izofluranem w 100% tlenie za pomocą komory indukcyjnej znieczulenia.
    2. Po znieczuleniu szczura należy ułożyć zwierzę na grzbiecie i podczas zabiegu używać małego stożka nosowego z 1% izofluranem w 100% tlenu w celu utrzymania znieczulenia zwierzęcia.
    3. Otwórz pysk szczura za pomocą aluminiowego knebla ustnego wokół siekaczy (górnego i dolnego), cofając nim język i stabilizując szczękę i żuchwę w otwartej, wygodnej pozycji roboczej, umożliwiając dostęp do ligatur.
    4. Dokręć ligatury do dziąsła za pomocą mikrochirurgicznej windy okostnej i upewnij się, że szew ligatur jest wprowadzony, tworząc stan zapalny wokół dziąsła.
      UWAGA: Możliwe jest, że 7-10 dni po zabiegu dojdzie do utraty ligatur. Jeśli tak się stanie, postępuj zgodnie z protokołem opisanym dla wstrzyknięcia Pg-LPS (krok 2.4).
  2. Po dopasowaniu ligatury wstrzyknąć obustronnie 40 μl Pg-LPS za pomocą sterylnej igły podskórnej 25 G i strzykawki o pojemności 1 ml do tkanki poddziąsłowej po stronie mezjo-podniebiennej M1 (dzień 2, dzień 4, dzień 6, dzień 8, dzień 10 i dzień 12).
  3. Usuń stożek nosowy do znieczulenia i umieść szczura w klatce. Monitoruj powrót zwierzęcia do zdrowia, aż efekty znieczulenia zostaną całkowicie odwrócone.

5. Składanie ofiar ze zwierząt i analiza

UWAGA: Istnieją różne opcje oceny postępu PD. W tym przypadku opisana analiza składa się z oceny cytokin prozapalnych w płynie dziąsłowym (GCF) oraz oceny utraty kości wyrostka zębodołowego.

  1. W 14 dniu badania (14 dzień) należy złożyć zwierzęta w ofierze z CO2 w komorze na dwutlenek węgla. Dla gryzoni zaleca się przemieszczenie od 30% do 70% objętości komory/min.
    UWAGA: Brak reakcji zwierzęcia na odruch pedałowania i brak parametrów życiowych musi zostać zweryfikowany, aby potwierdzić eutanazję.
  2. Zbierz GCF zgodnie z opisem w następujących krokach:
    UWAGA: GCF pobiera się przed indukcją PD (przed operacją) (dzień 0) i po indukcji PD (po uśmierceniu) (dzień 14).
    1. Ułóż zwierzę na plecach na platformie operacyjnej i ustabilizuj szczękę i żuchwę w pozycji otwartej za pomocą aluminiowych knebli ustnych.
    2. Zebrać GCF za pomocą papieru adsorpcyjnego nr 30 (0,03 cm średnicy x 3 cm długości), wkładając go do szczeliny dziąsłowej wokół mezjo-podniebienia M1 do uzyskania lekkiego oporu. Trzymaj papier w tej samej pozycji przez łącznie 30 s przed natychmiastowym usunięciem.
    3. Po pobraniu należy natychmiast przenieść papierowy punkt do plastikowej fiolki i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu wykonania testu.
  3. Aby ocenić białka w GCF, należy przygotować następujące roztwory i postępować zgodnie z opisanymi etapami metody elucji:
    UWAGA: IL-1β ocenia się w GCF (dzień 14) za pomocą testu immunologicznego, zgodnie z protokołem producenta.
    1. Przygotuj świeży bufor elucji i utrzymuj go na lodzie przez cały proces ekstrakcji, aby zahamować aktywność proteazy.
    2. Przygotować wszystkie roztwory potrzebne do buforu elucyjnego zgodnie z opisem:
      1. Przygotuj 1 ml aprotyniny (1 mg/ml) w ultraczystej wodzie.
      2. Przygotować 10 ml fluorku fenylometylosulfonylofluorku (PMSF) (200 mM) w metanolu.
      3. Dodać 125 μl PMSF i 250 μl aprotyniny do 24,5 ml roztworu PBS (pH = 7,4) w celu przygotowania buforu elucyjnego.
    3. Rozpuścić jedną dostępną w handlu tabletkę inhibitora fosfatazy w 10 ml świeżo przygotowanego buforu elucyjnego przez 10 minut pod mieszaniem w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Czas trwania elucji GCF jest ograniczony; Spożyć natychmiast do odwirowania po dodaniu tabletki z inhibitorem fosfatazy w ciągu pierwszych 30 minut.
    4. Po dodaniu inhibitora fosfatazy dodać 11 μl pełnego buforu elucyjnego bezpośrednio na probówkę z punktami bibułowymi.
    5. Odwirować probówkę o sile 452 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Przenieść eluowaną zawartość do nowej plastikowej fiolki. Powtórz ten proces jeszcze cztery razy, aby uzyskać całkowitą objętość 50 μl.
    7. Po ostatnim odwirowaniu dodać całkowitą objętość 60 μl bezpośrednio na papierowy punkt i odwirować po raz ostatni w temperaturze 452 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Użyj wymaganej objętości eluowanej do oceny białka.
  4. Po eutanazji i pobraniu GCF, za pomocą nożyczek chirurgicznych, wyciąć górną szczękę szczurów. Spróbuj zdjąć maskę szczura i pozostawić jak najmniej tkanki miękkiej.
  5. Ustaw szczękę w stoliku mikroskopu w celu wizualizacji i zrób zdjęcie w żądanym powiększeniu.
  6. Umieść szczękę bezpośrednio w 4% paraformaldehydzie (PFA) rozcieńczonym w PBS. Odświeżaj dwa razy w tygodniu za pomocą nowego PFA przez 12 dni, aby uzyskać pełną fiksację.
    UWAGA: Czynności związane z PFA należy wykonywać w dygestoriach zgodnie z zaleceniami zawartymi w karcie charakterystyki.
  7. Po całkowitym ustabilizowaniu szczęki oceń utratę masy kostnej za pomocą skanera tomografii komputerowej wiązki stożkowej (CBCT) w następujący sposób:
    1. Otwórz komputer.
    2. Otwórz program do analizy CBCT.
    3. Wybierz Protokół skanowania > tryb skanowania protez zębowych.
    4. Wybierz pole widzenia (FOV) > (11x8) HIRes (90 kV napięcia i 3 mA prądu).
    5. Umieść stałą górną szczękę szczurów w suwnicy.
    6. Kliknij Dalej.
    7. Kliknij przycisk wyzwalania promieniowania rentgenowskiego (naciśnij pilot rentgenowski, aby dokonać emisji i przytrzymaj go przez cały czas trwania skanowania).
    8. W razie potrzeby przenieś górną szczękę na środek płaszczyzny czołowej, naciskając przycisk sterujący, a następnie kliknij przycisk wyzwalania promieniowania rentgenowskiego (naciśnij pilot rentgenowski, aby dokonać emisji i trzymaj go wciśnięty przez cały czas trwania skanowania).
    9. Kliknij Dalej.
    10. Kliknij przycisk wyzwalania promieniowania rentgenowskiego (naciśnij pilot rentgenowski, aby dokonać emisji i przytrzymaj go przez cały czas trwania skanowania).
    11. W razie potrzeby przenieś protezę na środek płaszczyzny strzałkowej, naciskając przycisk sterujący, a następnie kliknij przycisk wyzwalania promieniowania rentgenowskiego (naciśnij pilot rentgenowski, aby dokonać emisji i przytrzymaj go wciśnięty przez cały czas trwania skanowania).
    12. Kliknij Dalej.
    13. Kliknij przycisk Start (naciśnij pilot rentgenowski, aby wykonać emisję i przytrzymaj go przez cały czas trwania badania). Poczekaj na otrzymanie komunikatu przetwarzania, a następnie postępuj zgodnie z wyświetlanymi instrukcjami.
    14. Pojawi się widok z okna. Dostosuj szarość na poziomie 65% i kliknij przycisk Zastosuj.
    15. Aby zapisać skan, kliknij Plik i zapisz go w formacie DICOM. Następnie kliknij Wszystkie obrazy i w oknie wyboru eksportu DICOM wybierz wszystkie pokazane parametry (obraz początkowy, oryginalny osiowy, sformatowany osiowy, wielopłaszczyznowy) i wybierz typ predefiniowany.
  8. Przetwarzaj dwuwymiarowe i strzałkowe obrazy reprezentatywne zębów trzonowych szczęki za pomocą programu analitycznego w następujący sposób:
    1. Otwórz oprogramowanie.
    2. Kliknij pozycję Plik i otwórz, a następnie wybierz folder z obrazami w formacie DICOM i kliknij przycisk Otwórz.
    3. Poczekaj, aż pojawi się okno "Konwertuj na 8 bitów", wybierz zakres od 0 do 6 000 i kliknij OK.
    4. Kliknij opcję Obrazy RAW.
    5. Zdefiniuj górną i dolną krawędź zaznaczenia, aby ograniczyć obszar zainteresowania. Wyszukaj pierwszy i ostatni obraz, na którym pojawia się kość wyrostka zębodołowego, i zaznacz go za pomocą poleceń u góry i u dołu zaznaczenia.
      UWAGA: Reprezentatywne dwuwymiarowe obrazy kości wyrostka zębodołowego zębów trzonowych można wyeksportować, jak w Rysunek 3A,B.
    6. Aby uzyskać strzałkowe obrazy reprezentatywne, kliknij Przełącz pasek profilu.
    7. Narysuj linię strzałkową na środku podniebienia i kliknij przycisk Reslice model (Model przeciąć). Określ parametry wyznaczania obszaru zainteresowania (odstępy między plasterkami: 1; liczba plasterków: 100) i kliknij przycisk OK. Poczekaj, aż zakończy się model ponownego krojenia. Na koniec kliknij zapisz ponownie pokrojone obrazy.
      UWAGA: Reprezentatywne strzałkowe wyobrażenia kości wyrostka zębodołowego zębów trzonowych można wyeksportować, jak w Rysunek 3C,D.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Harmonogram kroków eksperymentalnych przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2A przedstawia obraz żuchwy po interwencji chirurgicznej, z umieszczeniem ligatury wokół bruzdy M1 w czasie 0 eksperymentu. Rysunek 2B pokazuje, jak po 14 dniach od zabiegu ligatura wokół M1 wnika do bruzdy dziąsłowej, wywołując stan zapalny dziąseł i akumulację nacieków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda ta opisuje indukcję PD u szczurów po zastosowaniu połączonej techniki wstrzykiwań Pg-LPS i umieszczania ligatur wokół M1, ujawniając, że znaczące zmiany w tkankach przyzębia i kości wyrostka zębodołowego mogą zostać wywołane w ciągu 14 dni po tej metodzie.

Podczas tej procedury należy zwrócić uwagę na różne krytyczne kroki. Podczas znieczulenia zwierząt i przygotowania do zabiegu, ocena prawidłowego znieczulenia podczas procesu chirurgicznego ma kluczowe znaczenie dla jego powo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fundació Universitat-Empresa de les Illes Balears (Proof of concept call 2020), przez Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competividad, współfinansowane przez EFS, Europejski Fundusz Społeczny i EFRR Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (umowa z M.M.B; FI18/00104) oraz przez Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (umowa z M.M.F.C; FPI/040/2020). Autorzy dziękują dr Annie Tomás i Marii Tortosie za ich pomoc w eksperymentalnej chirurgii i platformie IdISBa. Na koniec podziękowania dla ADEMA School of Dentistry za dostęp do skanera CBCT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Punkt adsorbentu papieru nº 30 Proclinc8187
AprotininSigma-AldrichA1153
AtipamezoleDechra573751.5Revanzol 5 mg/ml
Pleciona jedwabna ligatura (5/0) Laboratorio Arago Sl613112
Buprenorfina Richter pharma578816.6Bupaq 0,3 mg/ml
Skaner tomografii komputerowej wiązki stożkowej (CBCT) MyRayhyperion X9Model Hyperion X9
CTAnoprogramowanieSkyScanWersja 1.13.4.0
Eksplorator dentystyczny Proclinc99743
Wiertło diamentowe w kształcie lancy DentaltixIT21517
Dieta podtrzymująca żywnośćBadania nad bólemROD14 
Podgrzewana platforma chirurgicznaPetSavers
Hollenback rzeźbiarzHu-FRIEDY 
Igła podskórna   BD 30060025G X 5/8" - 0,5 X 16 MM
Izofluran KarizooIsoflutek 1000mg/g
Ketamina   Dechra581140.6Anesketin 100 mg/ml
Lipopolisacharyd  pochodzący z P.Gingivalis InvivoGenTLRL-PGLPS
MetanolFisher ScientificM/4000/PB08
Holter mikroigłowyNarzędzia chirurgiczne FehlingKOT-6
Szczypce mikrochirurgiczneKLS Martin12-384-06-07
nożyczki mikrochirurgiczne S& T instrumenty mikrochirurgiczneSDC-15 RV
Monitor iMEC 8 VetMindray 
Multipleksowy test immunologiczny kulkowyProcartaplex, Thermo fisher ScientificPPX-05
Paraformaldehyd (PFA) Sigma-Aldrich8187151000
Winda mikrochirurgiczna okostnej DentaltixCU19112468
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) Roche10837091001
Bufor Fosforanowy (PBS)Capricorn ScientificPBS-1A
PhosSTOP Roche4906845001Komercyjna tabletka z inhibitorem fosfatazy 
Plastikowa fiolkaSPL Lifesciencies600151,5 ml
soli fizjologicznejCinfa204024.3
Mikroskop stereoskopowy Lupy chirurgiczne ZeissModel SteREO Discovery.V12
Światło ledNożyczki chirurgiczne Zeiss
 Zepf Surgical08-1701-17
Strzykawka BD plastipak3031721mL
Weterynaryjny mikrosilnik dentystycznyEickemeyer174028
KsylazynaCalier20102-003Xilagesic 20 mg/ml
HF45234

Bibliografia

  1. Carvalho, J. D. S., et al. Impact of citrus flavonoid supplementation on inflammation in lipopolysaccharide-induced periodontal disease in mice. Food and Function. 12 (11), 5007-5017 (2021).
  2. Nazir, M. A. Prevalence of periodontal disease, its association with systemic diseases and prevention. International Journal of Health Sciences. 1 (2), 72-80 (2017).
  3. Dumitrescu, A. L., El-Aleem, S. A., Morales-Aza, B., Donaldson, L. F. A model of periodontitis in the rat: Effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation. Journal of Clinical Periodontology. 31 (8), 596-603 (2004).
  4. Wang, H. Y., et al. Preventive effects of the novel antimicrobial peptide Nal-P-113 in a rat Periodontitis model by limiting the growth of Porphyromonas gingivalis and modulating IL-1β and TNF-α production. BMC Complementary and Alternative Medicine. 17 (1), 1-10 (2017).
  5. Guan, J., Zhang, D., Wang, C. Identifying periodontitis risk factors through a retrospective analysis of 80 cases. Pakistan Journal of Medical Sciences. 38 (1), 293-296 (2021).
  6. Khajuria, D. K., Patil, O. N., Karasik, D., Razdan, R. Development and evaluation of novel biodegradable chitosan based metformin intrapocket dental film for the management of periodontitis and alveolar bone loss in a rat model. Archives of Oral Biology. 85, 120-129 (2018).
  7. Nishida, E., et al. Bone resorption and local interleukin-1alpha and interleukin-1beta synthesis induced by Actinobacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Periodontal Research. 36 (1), 1-8 (2001).
  8. Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Bone. 23 (1), 1-7 (2008).
  9. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental animal models in periodontology: a review. The Open Dentistry Journal. 4 (1), 37-47 (2010).
  10. Mustafa, H., et al. Induction of periodontal disease via retentive ligature, lipopolysaccharide injection, and their combination in a rat model. Polish Journal of Veterinary Sciences. 24 (3), 365-373 (2021).
  11. Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. Journal of Visualized Experiments. 2020 (155), 6-13 (2019).
  12. Cheng, R., Wu, Z., Li, M., Shao, M., Hu, T. Interleukin-1β is a potential therapeutic target for periodontitis: a narrative review. International Journal of Oral Science. 12 (1), 1-9 (2020).
  13. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  14. Jeong-Hyon, K., Bon-Hyuk, G., Sang-Soo, N., Yeon-Cheol, P. A review of rat models of periodontitis treated with natural extracts. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences. 7 (2), 95-103 (2020).
  15. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nature Protocols. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  16. Lin, P., et al. Application of ligature-induced periodontitis in mice to explore the molecular mechanism of periodontal disease. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8900(2021).
  17. Irie, M. S., et al. Use of micro-computed tomography for bone evaluation in dentistry. Brazilian Dental Journal. 29 (3), 227-238 (2018).
  18. Haas, L. F., Zimmermann, G. S., De Luca Canto, G., Flores-Mir, C., Corrêa, M. Precision of cone beam CT to assess periodontal bone defects: a systematic review and meta-analysis. Dentomaxillofacial Radiology. 47 (2), 20170084(2018).
  19. Kamburoğlu, K., Ereş, G., Akgün, C. Qualitative and quantitative assessment of alveolar bone destruction in adult rats using CBCT. Journal of Veterinary Dentistry. 36 (4), 245-250 (2019).
  20. Sousa Melo, S. L., Rovaris, K., Javaheri, A. M., de Rezen de Barbosa, G. L. Cone-beam computed tomography (CBCT) imaging for the assessment of periodontal disease. Current Oral Health Reports. 7 (4), 376-380 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Indukcja zapalenia przyzębiazałożenie ligaturyubytek kości jamistejrecesja dziąsłapłyn przydziąsłowycytokiny prozapalnetomografia komputerowa w wiązce stożkowejmodel choroby przyzębia
Indukcja zapalenia przyzębia poprzez połączenie ligatury i wstrzyknięcia lipopolisacharydu w modelu szczurzym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.