Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Immunologiczne wykrywanie dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64843

⸱

17 marca 2023

 , 
1Department of Molecular and Cellular Sports Medicine, German Sport University Cologne, 2Biorheology Research Laboratory, Menzies Health Institute, Griffith University Gold Coast

W tym artykule

Podsumowanie

Uchwycenie dynamicznych zmian w aktywacji białek wyłuszczonych czerwonych krwinek stanowi wyzwanie metodologiczne, takie jak zachowanie dynamicznych zmian w ostrych bodźcach do późniejszej oceny. Prezentowany protokół opisuje techniki przygotowania i barwienia próbek, które umożliwiają zachowanie i analizę istotnych zmian białkowych, a następnie ich wykrycie.

Streszczenie

Oznaczanie przeciwciałami białek krwinek czerwonych (RBC) jest powszechnie stosowaną, półilościową metodą wykrywania zmian w ogólnej zawartości białka lub ostrych zmian w stanach aktywacji białek. Ułatwia ocenę leczenia erytrocytami, charakterystykę różnic w niektórych stanach chorobowych oraz opis koherencji komórkowych. Wykrycie gwałtownie zmienionej aktywacji białka (np. poprzez mechanotransdukcję) wymaga odpowiedniego przygotowania próbki, aby zachować tymczasowe modyfikacje białek. Podstawowa zasada obejmuje unieruchomienie docelowych miejsc wiązania pożądanych białek RBC, aby umożliwić początkowe wiązanie określonych przeciwciał pierwotnych. Próbka jest dalej przetwarzana w celu zagwarantowania optymalnych warunków wiązania przeciwciała drugorzędowego z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym. Wybór niefluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych wymaga dodatkowego traktowania, w tym sprzężenia biotyny-awidyny i zastosowania tetrachlorowodorku 3,3-diaminobenzydyny (DAB) w celu uzyskania barwienia, które należy kontrolować w czasie rzeczywistym pod mikroskopem, aby zatrzymać utlenianie, a tym samym intensywność barwienia, na czas. W celu wykrycia intensywności barwienia obrazy są wykonywane za pomocą standardowego mikroskopu świetlnego. W modyfikacji tego protokołu można zamiast tego zastosować przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoresceiną, co ma tę zaletę, że nie jest konieczny żaden dalszy etap rozwoju. Procedura ta wymaga jednak obiektywu fluorescencyjnego przymocowanego do mikroskopu w celu wykrywania barwienia. Biorąc pod uwagę półilościowy charakter tych metod, konieczne jest zapewnienie kilku barwień kontrolnych w celu uwzględnienia nieswoistych reakcji przeciwciał i sygnałów tła. Przedstawiamy tutaj zarówno protokoły barwienia, jak i odpowiadające im procesy analityczne, aby porównać i omówić odpowiednie wyniki i zalety różnych technik barwienia.

Wprowadzenie

Czerwone krwinki (RBC) przechodzą przez układ sercowo-naczyniowy przez 70 do 140 dni, przy średnim wieku RBC wynoszącym około 115 dni1,2. Starcze lub uszkodzone erytrocyty są usuwane z krążenia przez erytrofagocytozę, skuteczny proces oczyszczania napędzany przez makrofagi3. Z góry określona długość życia tych komórek jest jedną z konsekwencji rezygnacji z organelli komórkowych, w tym jądra, mitochondriów i rybosomów, podczas różnicowania i dojrzewania4. W związku z tym krążące erytrocyty są pozbawione maszynerii translacyjnej, co wyklucza syntezę nowych białek3. Wynika z tego, że dynamiczne, potranslacyjne modyfikacje istniejących białek stanowią jedyny realny mechanizm ostrej, biochemicznej regulacji w odpowiedzi na zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe stresory działające na RBC5.

Siły mechaniczne wydają się być głównymi sygnałami zewnątrzkomórkowymi, które powodują aktywację lub modulację szlaków biochemicznych w krwinkach czerwonych. Odkrycie mechanowrażliwego białka, Piezo1, w błonach RBC6 zainspirowało kilka linii badań nad mechanicznie aktywowaną sygnalizacją w tych komórkach7. Na przykład ostatnie postępy wykazały, że właściwości fizyczne erytrocytów są aktywnie regulowane przez ostre i dynamiczne zmiany białek8, co obejmuje fosforylację potranslacyjną i ubikwitynację9. Ponieważ te normalne modyfikacje różnią się w zależności od niektórych chorób9,10,11, wydaje się, że określenie stanu aktywacji białek RBC, szczególnie w odniesieniu do procesów mechanobiologicznych, wydaje się być interesujące naukowo i klinicznie.

Określenie ostrych zmian w stanach aktywacji białka RBC stanowi pewne wyzwanie metodologiczne. Na przykład przechowywanie próbek RBC do późniejszej analizy wymaga zachowania zmodyfikowanych białek RBC, ponieważ modyfikacje potranslacyjne są nietrwałe. Co więcej, klasyczne metody wykrywania białek (np. western blotting) są notorycznie trudne do standaryzacji w krwinkach czerwonych ze względu na niską obfitość białek w stosunku do hemoglobiny, która stanowi ~98% zawartości białka w tych komórkach12. W związku z tym barwienie chemicznie konserwowanych erytrocytów na podstawie przeciwciał było metodą z wyboru podczas badania ostrych modyfikacji ważnych białek RBC, takich jak specyficzna dla RBC izoforma syntazy tlenku azotu (RBC-NOS)13,14. Wykazano, że RBC-NOS enzymatycznie wytwarza tlenek azotu (NO), który wydaje się niezbędny dla podstawowych właściwości RBC, w tym odkształcalności RBC15,16,17. Potranslacyjne modyfikacje RBC-NOS regulują aktywność enzymów katalitycznych, przy czym fosforylacja reszty seryny 1177 jest opisana w celu zwiększenia aktywności enzymu, podczas gdy fosforylacja reszt seryny 114 lub treoniny 495 została powiązana ze zmniejszoną aktywnością RBC-NOS18,19.

Łącznie, tymczasowe modyfikacje białek RBC przyczyniają się do ważnych funkcji komórkowych, a standaryzowane protokoły, które umożliwiają wykrywanie tych zmodyfikowanych białek, mają wysoką wartość. W tym miejscu przedstawiamy dwa odrębne protokoły, które wykorzystują specyficzne przeciwciała w celu ułatwienia wykrywania aktywacji białka RBC-NOS oraz omawiamy zalecenia dotyczące analizy i interpretacji danych.

Wydajność opisanych protokołów została oceniona poprzez pomiar dobrze opisanego wzrostu fosforylacji RBC-NOS przy reszcie seryny 1177 w odpowiedzi na siły mechaniczne odzwierciedlające te występujące w ludzkim układzie naczyniowym (5 Pa).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisane tutaj protokoły są zgodne z Deklaracją Helsińską i zostały zatwierdzone przez komisje etyczne Niemieckiego Uniwersytetu Sportowego w Kolonii (16.09.2013) oraz Griffith University (2019/808). Ochotnicy zostali poddani badaniu przesiewnemu w celu wykluczenia istotnych patologii i wyrazili pisemną świadomą zgodę.

1. Barwienie białek RBC z wykorzystaniem protokołów immunohistochemicznych

UWAGA: Szczegółowa lista wymaganych odczynników i materiałów znajduje się w Tabeli materiałów. Poniższe sekcje opisują przygotowanie niezbędnych roztworów, a następnie zawierają szczegółowy opis protokołu immunohistochemii (Rysunek 1).

Schemat procesu immunostainingu; fiksacja białek, znakowanie przeciwciałami i analiza mikroskopowa.
Rysunek 1: Schemat poszczególnych etapów wymaganych do barwienia immunohistochemicznego i immunofluorescencyjnego RBC-NOS w miejscu fosforylacji 1177. Przedstawiono typowy przebieg opisanych protokołów, obejmujący etapy od przygotowania roztworów i pobrania krwi po detekcję z użyciem przeciwciał i wizualizację. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Pobieranie próbek krwi
    1. Pobrać próbki krwi (10 mL krwi pełnej) od siedmiu zdrowych mężczyzn. Ochotnicy byli zdrowymi osobami, u których nie stwierdzono chorób sercowo-naczyniowych, hematologicznych, neurologicznych, endokrynologicznych ani metabolicznych. Ochotnicy byli również niepalącymi.
    2. Krew pobrać za pomocą sterylnej igły i strzykawki z wyraźnie widocznej żyły w zgięciu łokciowym przedramienia i niezwłocznie przenieść do probówek powlekanych jednym z następujących przeciwkrzepliwości: heparyną sodową (do immunohistochemii) lub kwasem etylenodiaminotetracyklooctowym (EDTA; do znakowania fluorescencyjnego).
    3. Próbki krwi z przeciwkrzepliwcem poddać precyzyjnie kontrolowanym siłom mechanicznym przy użyciu systemu ścinania typu Couette, jak opisano wcześniej7,20.
      1. Aparat do ścinania składa się z obracającego się kubka i stacjonarnego rdzenia, oddzielonych szczeliną o szerokości 300 µm. Przenieść próbkę krwi do szczeliny, co spowoduje, że precyzyjnie sterowana prędkość obrotowa kubka wywrze dobrze kontrolowane siły mechaniczne na próbkę. Reprezentatywne dane przedstawione w niniejszej pracy uzyskano poprzez zastosowanie sił mechanicznych odzwierciedlających te występujące w naczyniach krwionośnych człowieka (5 Pa) przez dłuższy czas (300 s).
  2. Przygotowanie roztworów niezbędnych do immunobarwienia
    1. Przygotować roztwory zgodnie z Tabelą 1. Roztwory można przygotować przed przeprowadzeniem procedury immunobarwienia i przechowywać w określonej temperaturze do momentu użycia.
      UWAGA: Czas przechowywania może się różnić w zależności od odczynnika. Należy sprawdzić kartę charakterystyki substancji.
  3. Przygotowanie próbek
    1. Krew pełną przetwarzać niezwłocznie po pobraniu lub zabiegu eksperymentalnym (jeśli dotyczy; np. stymulacja mechaniczna w naszych próbkach; patrz krok 1.1.3), aby móc wykryć krótkotrwałe efekty, na przykład po zastosowaniu naprężenia ścinającego, wysiłku fizycznym, krótkotrwałej ekspozycji na hipoksję itp.
    2. Przeprowadzić fiksację białek erytrocytów za pomocą formaldehydu w następujący sposób: rozcieńczyć krew pełną w stosunku 1:2 w 4% roztworze paraformaldehydu przez 20 min w temperaturze pokojowej (RT). Odwirować próbkę przy 132 x g przez 3 min w RT i ostrożnie usunąć nadsącz za pomocą pipety.
    3. Ponownie zawiesić osad erytrocytów w dwóch objętościach 0,1 mol/L soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) (rozcieńczenie 1:3) i inkubować przez 5 min w RT. Powtórzyć wirowanie zgodnie z powyższym opisem i usunąć nadsącz, który powinien być klarowny, za pomocą pipety. Ponownie zawiesić osad erytrocytów w jednej objętości 0,1 mol/L PBS (rozcieńczenie 1:2).
    4. Przygotować rozmazy krwi w następujący sposób: opisać szkiełko mikroskopowe, podając identyfikator próbki, zastosowane przeciwciało itp., używając pisaka odpornego na alkohol (np. ołówka). Następnie nanieść 10 µL przygotowanego roztworu erytrocytów bezpośrednio nad pole opisu.
    5. Położyć drugie szkiełko na próbce pod kątem około 45° i równomiernie rozprowadzić próbkę wzdłuż szkiełka. Utrwalić próbkę termicznie nad palnikiem Bunsena, przesuwając szkiełko nad płomieniem w stałym ruchu przez 5-7 s.
      UWAGA: Zaleca się wysuszenie próbek na powietrzu przed utrwalaniem termicznym. Próbki można przechowywać w RT do momentu barwienia (Rysunek 2).
  4. Barwienie immunohistochemiczne
    1. Wyznaczyć dwa obszary na każdym szkiełku: obszar badawczy, w którym erytrocyty inkubuje się z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym i drugorzędowym, oraz obszar kontrolny, w którym przeciwciało pierwszorzędowe zastępuje się roztworem kontrolnym. Obszar ten służy jako kontrola wewnątrztestowa do określenia sygnału tła erytrocytów.
    2. Przygotować roztwory przed lub w trakcie procedury, zgodnie z Tabelą 2. Na każdy obszar badawczy wymagana jest objętość 300 µL, a na obszar kontrolny 200 µL.
      ​UWAGA: Należy zauważyć, że te procedury barwienia oparte na przeciwciałach dostarczają danych półilościowych, a nie ilościowych. Dlatego, aby zapewnić możliwość wyciągnięcia znaczących wniosków z uzyskanych danych, absolutnie wymagane są odpowiednie próbki kontrolne (tj. w celu zapewnienia punktu odniesienia dla ocenianych względnych zmian w aktywacji białek).
    3. W celu trawienia trypsyną odmrozić 0,1% trypsynę i doprowadzić do temperatury RT. Wyznaczyć dwa obszary na każdym szkiełku za pomocą kredki tłustej: obszar badawczy (2/3 szkiełka) i obszar kontrolny (1/3 szkiełka). Ostrożnie nanieść bufor TBS (tris-buffered saline) za pomocą pipet transferowych, aby przemyć obszary z próbkami. Pozostawić TBS na 30 s, a następnie go odlać. Powtórzyć etap przemywania.
      UWAGA: Nanieść następujące roztwory zarówno do obszaru kontrolnego, jak i badawczego, chyba że opisano inaczej. Obszary muszą być wystarczająco pokryte odpowiednim roztworem. Nanosić roztwory za pomocą jednorazowych pipet transferowych i zmieniać pipety po każdym roztworze.
    4. Dodać 0,1% trypsyny, przykryć szkiełka za pomocą specjalnej komory inkubacyjnej z pokrywką lub folią aluminiową i inkubować przez 30 min w 37 °C w inkubatorze. Po inkubacji zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając wodę z kranu. Odlać roztwór. Przemyć oba obszary 3x TBS, jak opisano powyżej.
    5. W celu zablokowania aktywacji peroksydazy dodać roztwór metanolu i inkubować przez 30 min w RT. Przykryć szkiełka w tym czasie. Odlać roztwór.
      UWAGA: W przypadku detekcji immunofluorescencyjnej (sekcja 2) ten etap można pominąć, ponieważ blokowanie endogennych peroksydaz służy zapobieganiu sygnałom artefaktowym wywołanym przez detekcję z użyciem peroksydazy chrzanowej (HRP) i jabłczanu 3,3′-diaminobenzydyny (DAB).
    6. Przemyć oba obszary 3x TBS, jak opisano w kroku 1.4.3. Dodać 3% roztwór mleka odtłuszczonego i inkubować przez 30 min w RT w celu blokowania. Odlać roztwór. Nie przemywać po tym kroku.
    7. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe (AB) tylko do obszaru badawczego. Do obszaru kontrolnego dodać roztwór kontrolny AB (patrz Tabela 2). Inkubować próbki w 4 °C przez noc. Przykryć szkiełka w tym czasie, aby zapobiec wysychaniu.
      UWAGA: Unikać przenoszenia roztworów z obszaru badawczego do kontrolnego, ponieważ wpłynie to na wartości kontrolne.
    8. Odlać roztwór przeciwciał. Przemyć oba obszary 3x TBS, jak opisano w kroku 1.4.3.
    9. Przeprowadzić etap blokowania, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu. Dodać 3% normalne surowicę kozią i inkubować przez 30 min w RT. Odlać roztwór.
    10. Dodać roztwór przeciwciała drugorzędowego i inkubować przez 30 min w RT. Odlać roztwór przeciwciał. Przemyć obszary 3x TBS, jak opisano w kroku 1.4.3.
  5. Wywoływanie barwienia i zamykanie preparatu
    1. Przeprowadzić reakcję HRP sprzężoną z awidyną (patrz rozcieńczenie w Tabeli 2), dodając rozcieńczony roztwór awidyna-peroksydazy i inkubując przez 30 min w RT. Odlać roztwór.
    2. Przygotować mieszaninę DAB do wywołania immunobarwienia przed użyciem, zgodnie z Tabelą 3.
      OSTROŻNIE: DAB jest substancją niebezpieczną. Należy wziąć pod uwagę zwroty wskazujące na rodzaj zagrożenia H341 (podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne) i H350 (może powodować raka). Należy przestrzegać następujących zwrotów ostrzegawczych: P201, P202, P280, P308+P313, P405 oraz P501.
    3. Przeprowadzić kontrolne barwienie DAB w następujący sposób: zebrać roztwór HRP z kroku 1.5.1 z jednego szkiełka i zmieszać z niewielką objętością (np. 1 mL) przygotowanego roztworu DAB w oddzielnej probówce do wirowania przed barwieniem. Mieszanina powinna przybrać kolor brązowo-szary.
    4. Umieścić szkiełka pod mikroskopem (powiększenie co najmniej 200x) i dodać roztwór DAB do obu obszarów. Ciągle monitorować barwienie erytrocytów i przerwać proces, usuwając roztwór DAB jednorazową pipetą, zanim tło zacznie zmieniać kolor. Dla barwienia RBC-NOS seryna 1177 czas inkubacji z DAB wynosi około 17 min.
    5. Przeprowadzić odwodnienie próbki. Umieścić szkiełka w statywie szklanym i zanurzać każde z nich na 5 s w roztworach etanolu o różnych stężeniach, zaczynając od 70%, następnie 96%, potem 100%, a na koniec w ksylolu. Wyjąć szkiełka ze statywu i położyć na chłonnym papierze erytrocytami do góry, aby odsączyć nadmiar cieczy.
    6. Nanieść dwie lub trzy krople medium montażowego na całe szkiełko. Przykryć szkiełko szkiełkiem nakrywkowym. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza, ponieważ utrudniają one ocenę mikroskopową. Suszyć próbki przez co najmniej jedną noc w dygestorium.
  6. Przeprowadzanie oceny mikroskopowej
    1. Do wizualizacji i obrazowania umieścić szkiełka w mikroskopie świetlnym z powiększeniem co najmniej 200x. Upewnić się, że mikroskop jest połączony z kamerą w celu wykonania zdjęć zabarwionych erytrocytów.
    2. Włączyć źródło światła mikroskopu. Włączyć kamerę podłączoną do mikroskopu i uruchomić oprogramowanie sterujące mikroskopem. Użyć mikroskopii w polu jasnym, aby ustawić odpowiednią ostrość, obracając pokrętłami regulacji ostrości wstępnej i precyzyjnej, aż do znalezienia poziomu ostrości, w którym widoczne są erytrocyty.
    3. Ustawić wartości tła na zdjęciach na 220 ± 5 wartości szarości, zmierzone w trzech obszarach szkiełka wolnych od komórek. Aby to zrobić, otworzyć pierwsze zdjęcie za pomocą bezpłatnego oprogramowania ImageJ. Wybrać opcję Mean gray values w panelu Set measurements. Użyć ikony owalu, aby zmierzyć wartość szarości za pomocą komendy Measure. Jeśli zmierzone wartości wykraczają poza zakres, odpowiednio dostosować oświetlenie tła w mikroskopie. Powtarzać te kroki, aż wartości tła będą poprawne.
      UWAGA: Wartości tła powinny mieścić się w podanym zakresie dla wszystkich wykonanych zdjęć. W przeciwnym razie dane nie są porównywalne.
    4. Do analizy wartości szarości erytrocytów zaznaczyć krawędź każdego erytrocytu za pomocą narzędzia wyboru owalnego w oprogramowaniu ImageJ. Wyznaczyć wartości szarości poszczególnych erytrocytów za pomocą komendy Measure. Zmierzyć wartości szarości minimum 50 erytrocytów z obszaru badawczego i minimum 10 erytrocytów z obszaru kontrolnego.
      UWAGA: Całkowitą liczbę analizowanych erytrocytów można dostosować indywidualnie. Im więcej erytrocytów zostanie przeanalizowanych, tym bardziej znaczący będzie wynik. Jednak całkowita liczba analizowanych erytrocytów powinna być porównywalna dla każdego stanu, badanego itp. w ramach danego eksperymentu.
      1. Unikać analizy erytrocytów w pobliżu linii narysowanych kredką tłustą, ponieważ barwienie w tym obszarze może być niepełne. Unikać analizy nakładających się erytrocytów, ponieważ wpływa to na intensywność barwienia. Używać tylko erytrocytów oddzielonych od innych. Przeanalizować co najmniej pięć zdjęć z obszaru badawczego i co najmniej dwa zdjęcia z obszaru kontrolnego do oceny 50/10 erytrocytów. W końcowej analizie uwzględnić erytrocyty z każdego zdjęcia.
    5. Aby obliczyć intensywność barwienia, wyznaczyć sygnały końcowe według wzoru:
      (pojedynczy erytrocyt z obszaru badawczego - średnie tło obszaru badawczego) - (pojedynczy erytrocyt z obszaru kontrolnego - średnie tło obszaru kontrolnego)

Schemat procesu utrwalania krwi pełnej, wirowanie i utrwalanie termiczne w celu przygotowania do analizy komórkowej.
Rysunek 2Przedstawienie procesu utrwalania i przygotowywania rozmazu krwi. (Schemat stworzony za pomocą BioRender.com.) Rozcieńczone próbki krwi utrwalono chemicznie w paraformaldehydzie, a następnie poddano wirowaniu i przemyto roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo. Na koniec resuspendowaną krew naniesiono w formie rozmazu na szkiełko przedmiotowe i utrwalono termicznie. poprzez podtrzymywanie nad płomieniem palnika Bunsena. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Warunki przygotowania i przechowywania roztworów niezbędnych do barwienia immunohistochemicznego. Roztwór można przygotować przed rozpoczęciem procedury. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Opis roztworów przeciwciał do bezpośredniego użycia. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Składniki i protokół przygotowania roztworu DAB do bezpośredniego użycia. Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.

2. Fluorescencyjne znakowanie białek RBC

UWAGA: Poniższa sekcja opisuje adaptację protokołu immunohistochemicznego, opracowaną w celu umożliwienia zastosowania przeciwciał z koniugatami fluorescencyjnymi (Rysunek 1).

Przygotowanie próbek krwi do protokołu immunofluorescencji jest identyczne z opisanym w sekcji 1, dlatego poniższa sekcja rozpoczyna się od etapu barwienia próbek.

  1. Barwienie immunofluorescencyjne
    1. Inkubować z wtórnym przeciwciałem koniugowanym z fluoresceincją (objętość podano w kroku 1.4.2) przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem, używając dedykowanej komory inkubacyjnej lub folii aluminiowej.
    2. Odlać roztwór przeciwciał wtórnych i przemyć próbki 3x buforem TBS. Pozostawić ostatnią porcję buforu na próbkach, aby zapobiec ich wyschnięciu.
    3. Odlać TBS i wyjmować próbki ze statywu po jednej, aby uniknąć przedłużonej ekspozycji na światło. W celu odwodnienia próbek, poddać preparaty działaniu kolejnych roztworów etanolu przez ok. 5 s każdy, zaczynając od 70%, następnie 90% i na końcu 100%. Poddać preparaty działaniu roztworu ksylolu przez 5 s.
    4. Przygotować szkiełko cover-slip z dwiema lub trzema kroplami medium montażowego, a następnie przykryć preparat szkiełkiem. Zapewnić równomierne rozprowadzenie medium montażowego, wywierając lekki nacisk pęsetą lub podobnym sterylnym instrumentem metalowym. Usunąć pęcherzyki powietrza, które mogłyby zakłócać obrazowanie, tym samym instrumentem. Pozostawić próbki do wyschnięcia przez noc w ciemnym i suchym miejscu.
  2. Ocena mikroskopowa
    1. Do wizualizacji i obrazowania umieścić preparat na stoliku mikroskopu przy całkowitym powiększeniu co najmniej 400x. Włączyć źródło światła mikroskopu oraz źródło światła fluorescencyjnego, upewniając się, że intensywność światła fluorescencyjnego jest ustawiona na maksimum.
    2. Włączyć kamerę podłączoną do mikroskopu i uruchomić oprogramowanie sterujące mikroskopem. Użyć mikroskopii w polu jasnym, aby ustawić odpowiedni ostrość za pomocą pokręteł regulacji ostrości grubej i precyzyjnej, odnajdując poziom ostrości, na którym widoczne są erytrocyty (RBC).
      UWAGA: Nadmierna ekspozycja na światło może spowodować fotoblaknięcie koniugatów fluorescencyjnych. W tym celu można użyć preparatu z poprzedniego eksperymentu, aby zminimalizować ekspozycję na światło preparatów, które dopiero mają zostać przeanalizowane.
    3. Ustalić optymalną intensywność lasera, badając erytrocyty w obszarze kontrolnym. Upewnić się, że intensywność jest wystarczająco wysoka, aby erytrocyty były widoczne, ale nie powoduje silnego sygnału tła. Utrzymać stałą intensywność i czas ekspozycji między obszarami i próbkami, aby zapewnić porównywalność.
    4. Przechwycić obrazy w polu jasnym oraz fluorescencyjne w co najmniej trzech różnych, wybranych losowo obszarach testowych preparatu. Aby wybrać obszar, przesunąć stolik mikroskopu z dala od krawędzi preparatu zaznaczonych pisakiem lipidowym. Wybrać obszar wykazujący równomierny rozkład pojedynczej warstwy erytrocytów.
    5. Ustawić czas ekspozycji na 1 s dla obrazów fluorescencyjnych i wykonać zdjęcie za pomocą sterowników oprogramowania mikroskopu. Przełączyć na tryb pola jasnego, ustawić czas ekspozycji na „Auto” i przechwycić odpowiadający obraz w polu jasnym.
    6. Przechwycić obrazy w polu jasnym oraz fluorescencyjne w co najmniej dwóch różnych, losowo wybranych obszarach kontrolnych preparatu, powtarzając krok 2.2.3.
    7. Zapisać obrazy w formacie .tif, aby zachować oryginalne wartości szarości pikseli, zapobiec kompresji i zachować metadane akwizycji.
    8. Zmierzyć wartości szarości przechwyconych erytrocytów. Otworzyć ImageJ (lub FIJI21; patrz Supplementary File 1). Wyznaczyć wartości szarości poszczególnych erytrocytów. W tym celu zaznaczyć każdą pojedynczą komórkę za pomocą narzędzia Oval i przeanalizować za pomocą komendy Measure.
      UWAGA: Nie należy analizować erytrocytów, które nakładają się na inne komórki, ponieważ może to zwiększyć wypadkowy sygnał.
    9. Zaznaczyć od trzech do pięciu obszarów wolnych od erytrocytów i wyznaczyć wartości szarości, aby uzyskać miarę sygnału tła. Przeanalizować co najmniej 150 erytrocytów z co najmniej trzech różnych obrazów dla każdego obszaru testowego oraz co najmniej 50 erytrocytów z co najmniej dwóch różnych obrazów dla każdego obszaru kontrolnego.
      UWAGA: W celu zminimalizowania zmienności zaleca się analizę większej liczby komórek/obszarów. Biorąc pod uwagę, że populacja erytrocytów jest z natury heterogenna, zmienność sygnału między komórkami może być znacząca, w zależności od badanego białka.
    10. Przeprowadzić alternatywną analizę danych przechwyconych obrazów za pomocą komendy makro. Stworzyć/zainstalować komendę makro w wersji FIJI programu ImageJ do automatycznego zaznaczania, korekcji tła i analizy wartości szarości danego obrazu.
      UWAGA: Ta rutyna wykorzystuje automatyczne progowanie do wykrywania komórek obecnych na danym obrazie przy użyciu kopii obrazu oryginalnego, tworząc nakładkę na obraz oryginalny w celu wyekstrahowania wartości szarości fluorescencyjnych erytrocytów. Makro jest dostarczone jako plik .ijm, w Supplementary Coding File 1.
    11. Otworzyć plik obrazu w formacie .tif przeznaczony do analizy w programie FIJI. Otworzyć makro RBC fluorescence.ijm (Supplementary Coding File 1) i kliknąć Run.
      UWAGA: Makro jest skonfigurowane dla obrazów uzyskanych przy powiększeniu 600x i wysokim stosunku sygnału do szumu. Automatyczny wybór komórek powinien zostać zweryfikowany przez badacza.
  3. Obliczyć końcowe sygnały jako:
    (erytrocyty obszaru testowego - tło obszaru testowego) - (erytrocyty obszaru kontrolnego - tło obszaru kontrolnego) dla analizy ręcznej;
    (obszar testowy - obszar kontrolny) dla analizy automatycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiony protokół, opisujący metody ułatwiające wykrywanie ostrych zmian w białkach erytrocytów (RBC), został przetestowany na dobrze znanej mechanicznie wrażliwej modyfikacji białka: fosforylacji RBC-NOS w reszcie seryny 1177. Krew pełną pobrano od zdrowych ochotników, a następnie podzielono na dwie oddzielne alikwoty. Wybraną próbkę krwi poddano mechanicznemu naprężeniu ścinającemu o wartości fizjologicznej (5 Pa) przez 300 s, co w badaniach wcześniej wykazano jako czynnik indukujący fosforylację RBC-NOS w serynie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najnowsza literatura wysoce sugeruje, że białko RBC-NOS ma kluczowe znaczenie dla regulacji odkształcalności RBC 15,22,23, co z kolei ułatwia ich przejście przez wąskie naczynia włosowate 24. Aktywność białek w dużym stopniu zależy od potranslacyjnych modyfikacji białek, w szczególności od fosforylacji niektórych reszt18. W centrum zainteresowania znajduje się miejsce fosforylacji ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy ujawnili, że nie ma konfliktu interesów.

Podziękowania

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3,3′-diaminobenzydyna-tetrachlorowodorek hydratSigma/MerckD5637DAB
Chlorek amonu Wirówka Merck /Millipore101145NH4Cl
5427 R Eppendorf5409000010
Szkiełka nakrywkoweVWR631-0147 
Wodorofosforan di-sodowy dwuwodny Merck /Millipore106580Na2HPO4. 2 H2O
Jednorazowe pipety transferoweVWR612-6803
EntellanMerck /Millipore107961medium do szybkiego montażu do mikroskopii
Etanol denaturowany przy użyciu 1 % ketonu metylowo-etylowego (MEK)Hofmann642
Oksydaza glukozowaSigma/MerckG2133
Ołówek do smarowania DakoS 2002
Peroksydaza chrzanu/ExtrAvidin− PeroksydazaSigma/MerckE-2886HRP
Kwas solny Merck /Millipore109057HCl
Nadtlenek wodoru, 30%Merck /Millipore107203H2O2
ImageJDarmowe
Laserowy analizator optycznych komórek rotacyjnych (LORCA)RR MechatronikEktacytometr używany do ścinania
metanoluMerck /Millipore
Szkiełka mikroskopoweVWR630-1985
Siarczan niklu(II) sześciowodny Sigma/MerckN4882NiSO4.6H2O
Normalna surowica koziaAgilent/DAKOX0907NGS
ParaformaldehydMerck /Pipety Millipore818715PFA
Eppendorf Reference 2VWR613-5836/ 613-5839
Królicze przeciwciało anty-fosfo eNOS (Ser1177)Merck/Millipore07-428-Iprzeciwciał pierwotnych
, 2mlEppendorf30120094
Przeciwciało wtórne koza anty królikAgilent/DAKOE0432Przeciwciało drugorzędowe
Odtłuszczone mleko w proszkuBio-Rad170-6404
Chlorek sodu Merck /Millipore 106404NaCl
Monohydrat diwodorofosforanu soduMerck /Millipore106346NaH2PO4. H2O
Wodorotlenek sodu, 1 MMerck /Milipore150706NaOH
Tris(hydroksymetylo)-aminometanMerck /Millipore108382Tris
TrypsinSigma/MerckT7409
Tween20 Merck /Millipore822184
Whatman Glas, jakość GF/FMerck /MilliporeWHA1825047
XylolVWR Chemicals2,89,73,465
ß-D-Glukoza monohydratMerck /Millipore14431-43-7
oprogramowanie106009 Probówki reakcyjne Filtr z mikrofibry

Bibliografia

  1. Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
  2. Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
  3. Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die? Frontiers in Physiology. 12, 655393(2021).
  4. Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076(2017).
  5. Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945(2019).
  6. Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370(2015).
  7. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
  8. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
  9. Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218(2020).
  10. Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
  11. Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
  12. Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103(2022).
  13. Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982(2012).
  14. Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36(2019).
  15. Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759(2013).
  16. Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
  17. Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
  18. Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
  19. Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
  20. Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biology. 10 (1), 47(2021).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
  23. Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
  24. McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417(2019).
  25. Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206(2015).
  26. Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
  27. Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
  28. Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
  29. Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
  30. Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
  31. Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
  32. Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36(2021).
  33. Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
  34. Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813(2019).
  35. Methods in Nitric Oxide Research. Feelisch, M. , Wiley. Chichester. (1998).
  36. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Detekcja immunobarwieniastany aktywacji białekznakowanie przeciwciałamibarwienie immunohistochemicznebarwienie immunofluorescencyjnemechanotransdukcjamodyfikacje białekmikroskopia świetlnaanaliza w programie ImageJ
Immunologiczne wykrywanie dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.