Immunologiczne wykrywanie dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych

Summary

Uchwycenie dynamicznych zmian w aktywacji białek wyłuszczonych czerwonych krwinek stanowi wyzwanie metodologiczne, takie jak zachowanie dynamicznych zmian w ostrych bodźcach do późniejszej oceny. Prezentowany protokół opisuje techniki przygotowania i barwienia próbek, które umożliwiają zachowanie i analizę istotnych zmian białkowych, a następnie ich wykrycie.

Abstract

Oznaczanie przeciwciałami białek krwinek czerwonych (RBC) jest powszechnie stosowaną, półilościową metodą wykrywania zmian w ogólnej zawartości białka lub ostrych zmian w stanach aktywacji białek. Ułatwia ocenę leczenia erytrocytami, charakterystykę różnic w niektórych stanach chorobowych oraz opis koherencji komórkowych. Wykrycie gwałtownie zmienionej aktywacji białka (np. poprzez mechanotransdukcję) wymaga odpowiedniego przygotowania próbki, aby zachować tymczasowe modyfikacje białek. Podstawowa zasada obejmuje unieruchomienie docelowych miejsc wiązania pożądanych białek RBC, aby umożliwić początkowe wiązanie określonych przeciwciał pierwotnych. Próbka jest dalej przetwarzana w celu zagwarantowania optymalnych warunków wiązania przeciwciała drugorzędowego z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym. Wybór niefluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych wymaga dodatkowego traktowania, w tym sprzężenia biotyny-awidyny i zastosowania tetrachlorowodorku 3,3-diaminobenzydyny (DAB) w celu uzyskania barwienia, które należy kontrolować w czasie rzeczywistym pod mikroskopem, aby zatrzymać utlenianie, a tym samym intensywność barwienia, na czas. W celu wykrycia intensywności barwienia obrazy są wykonywane za pomocą standardowego mikroskopu świetlnego. W modyfikacji tego protokołu można zamiast tego zastosować przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluoresceiną, co ma tę zaletę, że nie jest konieczny żaden dalszy etap rozwoju. Procedura ta wymaga jednak obiektywu fluorescencyjnego przymocowanego do mikroskopu w celu wykrywania barwienia. Biorąc pod uwagę półilościowy charakter tych metod, konieczne jest zapewnienie kilku barwień kontrolnych w celu uwzględnienia nieswoistych reakcji przeciwciał i sygnałów tła. Przedstawiamy tutaj zarówno protokoły barwienia, jak i odpowiadające im procesy analityczne, aby porównać i omówić odpowiednie wyniki i zalety różnych technik barwienia.

Introduction

Czerwone krwinki (RBC) przechodzą przez układ sercowo-naczyniowy przez 70 do 140 dni, przy średnim wieku RBC wynoszącym około 115 dni^1,2. Starcze lub uszkodzone erytrocyty są usuwane z krążenia przez erytrofagocytozę, skuteczny proces oczyszczania napędzany przez makrofagi³. Z góry określona długość życia tych komórek jest jedną z konsekwencji rezygnacji z organelli komórkowych, w tym jądra, mitochondriów i rybosomów, podczas różnicowania i dojrzewania⁴. W związku z tym krążące erytrocyty są pozbawione maszynerii translacyjnej, co wyklucza syntezę nowych białek³. Wynika z tego, że dynamiczne, potranslacyjne modyfikacje istniejących białek stanowią jedyny realny mechanizm ostrej, biochemicznej regulacji w odpowiedzi na zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe stresory działające na RBC⁵.

Siły mechaniczne wydają się być głównymi sygnałami zewnątrzkomórkowymi, które powodują aktywację lub modulację szlaków biochemicznych w krwinkach czerwonych. Odkrycie mechanowrażliwego białka, Piezo1, w błonach RBC⁶ zainspirowało kilka linii badań nad mechanicznie aktywowaną sygnalizacją w tych komórkach⁷. Na przykład ostatnie postępy wykazały, że właściwości fizyczne erytrocytów są aktywnie regulowane przez ostre i dynamiczne zmiany białek⁸, co obejmuje fosforylację potranslacyjną i ubikwitynację⁹. Ponieważ te normalne modyfikacje różnią się w zależności od niektórych chorób^9,10,11, wydaje się, że określenie stanu aktywacji białek RBC, szczególnie w odniesieniu do procesów mechanobiologicznych, wydaje się być interesujące naukowo i klinicznie.

Określenie ostrych zmian w stanach aktywacji białka RBC stanowi pewne wyzwanie metodologiczne. Na przykład przechowywanie próbek RBC do późniejszej analizy wymaga zachowania zmodyfikowanych białek RBC, ponieważ modyfikacje potranslacyjne są nietrwałe. Co więcej, klasyczne metody wykrywania białek (np. western blotting) są notorycznie trudne do standaryzacji w krwinkach czerwonych ze względu na niską obfitość białek w stosunku do hemoglobiny, która stanowi ~98% zawartości białka w tych komórkach¹². W związku z tym barwienie chemicznie konserwowanych erytrocytów na podstawie przeciwciał było metodą z wyboru podczas badania ostrych modyfikacji ważnych białek RBC, takich jak specyficzna dla RBC izoforma syntazy tlenku azotu (RBC-NOS)^13,14. Wykazano, że RBC-NOS enzymatycznie wytwarza tlenek azotu (NO), który wydaje się niezbędny dla podstawowych właściwości RBC, w tym odkształcalności RBC^15,16,17. Potranslacyjne modyfikacje RBC-NOS regulują aktywność enzymów katalitycznych, przy czym fosforylacja reszty seryny 1177 jest opisana w celu zwiększenia aktywności enzymu, podczas gdy fosforylacja reszt seryny 114 lub treoniny 495 została powiązana ze zmniejszoną aktywnością RBC-NOS^18,19.

Łącznie, tymczasowe modyfikacje białek RBC przyczyniają się do ważnych funkcji komórkowych, a standaryzowane protokoły, które umożliwiają wykrywanie tych zmodyfikowanych białek, mają wysoką wartość. W tym miejscu przedstawiamy dwa odrębne protokoły, które wykorzystują specyficzne przeciwciała w celu ułatwienia wykrywania aktywacji białka RBC-NOS oraz omawiamy zalecenia dotyczące analizy i interpretacji danych.

Wydajność opisanych protokołów została oceniona poprzez pomiar dobrze opisanego wzrostu fosforylacji RBC-NOS przy reszcie seryny 1177 w odpowiedzi na siły mechaniczne odzwierciedlające te występujące w ludzkim układzie naczyniowym (5 Pa).

Protocol

Opisane tutaj protokoły są zgodne z Deklaracją Helsińską i zostały zatwierdzone przez Komisje Etyki Niemieckiego Uniwersytetu Sportowego w Kolonii (16.09.2013) i Uniwersytetu Griffith (2019/808). Ochotnicy zostali poddani badaniom przesiewowym, aby upewnić się, że nie ma odpowiednich patologii i wyrazili pisemną świadomą zgodę.

1. Barwienie białek RBC za pomocą protokołów immunohistochemicznych

UWAGA: Szczegółowa lista wymaganych chemikaliów i materiałów znajduje się w Tabeli Materiałów. Poniższe sekcje opisują przygotowanie wymaganych roztworów, po których następuje szczegółowy opis protokołu immunohistochemicznego (Rysunek 1).

Rysunek 1: Schemat poszczególnych etapów wymaganych do immunohistochemicznego i immunofluorescencyjnego barwienia RBC-NOS w miejscu fosforylacji 1177. Przedstawiono typowy przebieg prezentowanych protokołów, począwszy od przygotowania roztworu i pobrania krwi, a skończywszy na wykrywaniu i wizualizacji na podstawie przeciwciał. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Pobranie próbki krwi
   1. Pobrać próbki krwi (10 ml krwi pełnej) od siedmiu zdrowych mężczyzn. Ochotnicy byli zdrowymi osobami, podobno wolnymi od chorób sercowo-naczyniowych, hematologicznych, neurologicznych, endokrynologicznych lub metabolicznych. Ochotnikami były również osoby niepalące.
   2. Za pomocą sterylnej igły i strzykawki należy pobrać krew z wystającej żyły w okolicy przedłokciowej przedramienia i natychmiast przenieść do probówek pokrytych jednym z następujących antykoagulantów: heparyny sodowej (do immunohistochemii) lub kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA; do znakowania fluorescencyjnego).
   3. Wystaw próbki krwi z antykoagulacją na działanie precyzyjnie kontrolowanych sił mechanicznych za pomocą systemu ścinania typu Couette, jak opisano wcześniej^7,20.
      1. Aparat do strzyżenia składa się z obrotowego miseczki i nieruchomego boczka, oddzielonych szczeliną 300 μm. Przenieś próbkę krwi do szczeliny, co powoduje, że precyzyjnie kontrolowana prędkość obrotowa kubka wywiera dobrze kontrolowane siły mechaniczne na próbkę. Przedstawione tu reprezentatywne dane uzyskano poprzez zastosowanie sił mechanicznych odzwierciedlających siły występujące w układzie naczyniowym człowieka (5 Pa) przez dłuższy czas (300 s).
2. Przygotowanie roztworów niezbędnych do barwienia immunologicznego
   1. Przygotować roztwory jak w Tabeli 1. Roztwory można przygotować przed wykonaniem procedury barwienia immunologicznego i przechowywać w określonej temperaturze do czasu, gdy będą potrzebne.
      UWAGA: Czas przechowywania może się różnić w zależności od chemikaliów. Sprawdź kartę charakterystyki substancji niebezpiecznej.
3. Przygotowanie próbki
   1. Przetwarzaj krew pełną natychmiast po odstawieniu lub eksperymentalnym leczeniu (w stosownych przypadkach; np. bodziec mechaniczny w naszych próbkach; patrz krok 1.1.3), aby móc wykryć krótkotrwałe efekty, na przykład po zastosowaniu naprężeń ścinających, wysiłku fizycznym, krótkotrwałej ekspozycji na hipoksję itp.
   2. Wykonać wiązanie białka RBC za pomocą formaldehydu w następujący sposób: rozcieńczyć krew pełną w stosunku 1:2 w 4% roztworze paraformaldehydu przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT). Odwirować próbkę o masie 132 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipetowania.
   3. Ponownie zawiesić osad RBC w dwóch objętościach soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o stężeniu 0,1 mol/l (rozcieńczenie 1:3) i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórzyć wirowanie zgodnie z powyższym opisem i usunąć supernatant, który powinien być klarowny, pipetując. Ponownie zawiesić osad RBC w jednej objętości 0,1 mol/l PBS (rozcieńczenie 1:2).
   4. Przygotuj rozmazy krwi w następujący sposób: oznacz szkiełko mikroskopowe identyfikatorem próbki, zastosowanym przeciwciałem itp. za pomocą długopisu odpornego na alkohol (np. ołówka). Następnie dodaj 10 μl przygotowanego roztworu RBC tuż nad polem etykiety.
   5. Umieścić drugie szkiełko na próbce pod kątem około 45° i równomiernie rozprowadzić próbkę wzdłuż szkiełka. Utrwalić szkiełko na gorąco nad palnikiem Bunsena, unosząc próbkę nad palnikiem ciągłym ruchem przez 5-7 s.
      UWAGA: Zaleca się wysuszenie próbek na powietrzu przed utrwaleniem na gorąco. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej do czasu barwienia (Rysunek 2).
4. Barwienie immunohistochemiczne
   1. Na każdym szkiełku należy zaznaczyć dwa obszary: obszar testowy, w którym erytrocyty są inkubowane z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym i drugorzędowym, oraz obszar kontrolny, w którym przeciwciało pierwszorzędowe zastępuje się roztworem kontrolnym. Obszar ten służy jako kontrola w teście w celu określenia sygnału tła RBC.
   2. Przygotować roztwory przed zabiegiem lub w jego trakcie, zgodnie z tabelą 2. Potrzebna jest objętość 300 μl na obszar testowy i 200 μl na obszar kontrolny.
      UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, że te procedury barwienia oparte na przeciwciałach dają dane półilościowe, a nie ilościowe. W związku z tym, aby zapewnić możliwość wyciągnięcia miarodajnych wniosków z uzyskanych danych, bezwzględnie wymagane są odpowiednie próbki kontrolne (tj. zapewniające punkt odniesienia dla ocenianych względnych zmian w aktywacji białek).
   3. W celu wytrawienia trypsyny rozmrozić 0,1% trypsyny i zrównoważyć do RT. Zaznacz dwa obszary na każdym szkiełku za pomocą ołówka do smarowania: obszar testowy (2/3 szkiełka) i obszar kontrolny (1/3 szkiełka). Ostrożnie nanieść trójbuforową sól fizjologiczną (TBS) za pomocą pipet transferowych w celu umycia obszarów próbki. Pozostaw TBS na 30 sekund, a następnie odlej go. Powtórz krok prania.
      UWAGA: Dodaj następujące roztwory zarówno do obszaru kontrolnego, jak i testowego, chyba że opisano inaczej. Obszary te muszą być w wystarczającym stopniu pokryte odpowiednim rozwiązaniem. Roztwory należy nakładać za pomocą jednorazowych pipet transferowych i zmieniać pipety po każdym roztworze.
   4. Dodać 0,1% trypsyny, przykryć szkiełka za pomocą specjalnie skonstruowanej komory inkubacyjnej z pokrywką lub folią aluminiową i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Po inkubacji zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając wodę z kranu. Odlej roztwór. Umyj oba obszary 3x TBS, jak opisano powyżej.
   5. W celu zablokowania aktywacji peroksydazy należy dodać roztwór metanolu i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. W tym czasie przykryć szkiełka. Odlej roztwór.
      UWAGA: W przypadku wykrywania immunofluorescencji (sekcja 2) etap ten można pominąć, biorąc pod uwagę, że blokowanie endogennych peroksydaz służy zapobieganiu artefaktom spowodowanym wykryciem za pomocą peroksydazy chrzanowej (HRP) i hydratu 3,3′-diaminobenzydyny (DAB).
   6. Umyj oba obszary 3x za pomocą TBS, jak opisano w kroku 1.4.3. Dodaj 3% roztwór odtłuszczonego mleka i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej do zablokowania. Odlej roztwór. Nie myć później.
   7. Dodaj przeciwciało pierwszorzędowe (AB) tylko do obszaru testowego. Dodać roztwór kontrolny AB (patrz tabela 2) do obszaru kontrolnego. Próbki należy inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. W tym czasie przykryj szkiełka, aby zapobiec wysuszeniu.
      UWAGA: Unikaj przenoszenia roztworów z badania do obszaru kontrolnego, ponieważ wpłynie to na wartości kontrolne.
   8. Odlej roztwór przeciwciała. Umyj oba obszary 3x za pomocą TBS, jak opisano w kroku 1.4.3.
   9. Wykonaj krok blokowania, aby zapobiec niespecyficznemu powiązaniu. Dodać 3% normalnej surowicy koziej i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odlewać roztwór.
   10. Dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odlewać roztwór przeciwciała. Umyj obszary 3x za pomocą TBS, zgodnie z opisem w kroku 1.4.3.
5. Rozwój barwienia i pokrycia
   1. Przeprowadzić reakcję HRP sprzężoną z awidyną (patrz rozcieńczenie w tabeli 2), dodając rozcieńczony roztwór peroksydazy awidyny i inkubując przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Odlać roztwór.
   2. Przygotować mieszaninę DAB w celu wytworzenia barwienia immunologicznego przed użyciem, zgodnie z tabelą 3.
      UWAGA: DAB jest niebezpieczny. Należy wziąć pod uwagę zwroty wskazujące rodzaj zagrożenia H341 (podejrzewany o powodowanie wad genetycznych) i H350 (może powodować raka). Rozważ następujące zwroty wskazujące środki ostrożności: P201, P202, P280, P308+P313, P405 i P501.
   3. Barwienie kontrolne DAB należy przeprowadzić w następujący sposób: pobrać roztwór HRP z kroku 1.5.1 ze szkiełka i wymieszać z niewielką objętością (np. 1 ml) przygotowanego roztworu DAB w oddzielnej probówce wirówkowej przed barwieniem. Mieszanina powinna nabrać brązowo-szarego koloru.
   4. Umieść szkiełka pod mikroskopem (powiększenie co najmniej 200x) i dodaj roztwór DAB do obu obszarów. Monitoruj barwienie krwinek czerwonych w sposób ciągły i zatrzymaj barwienie, usuwając roztwór DAB jednorazową pipetą, zanim tło zacznie się kolorować. W przypadku barwienia seryną RBC-NOS 1177 czas inkubacji DAB wynosi około 17 minut.
   5. Wykonaj odwodnienie próbki. Umieść szkiełka w szklanym stojaku i zanurz na 5 s każde w roztworach etanolu o różnych rozcieńczeniach, zaczynając od 70%, następnie 96%, a następnie 100%, a na końcu w ksylolu. Wyjmij szkiełka ze stojaka i umieść na chusteczce, z erytrocytami u góry, aby wchłonąć nadmiar płynu.
   6. Dodaj dwie lub trzy krople podłoża montażowego na całym szkiełku. Przykryj szkiełko za pomocą szkiełka nakrywkowego. Należy unikać włączania pęcherzyków powietrza, ponieważ utrudnia to ocenę mikroskopową. Próbki należy suszyć co najmniej przez noc w dygestorium.
6. Przeprowadzanie oceny mikroskopowej
   1. W celu wizualizacji i obrazowania umieść szkiełka w mikroskopie światła przechodzącego o powiększeniu co najmniej 200x. Upewnij się, że mikroskop jest połączony z kamerą, aby zrobić zdjęcia barwionych erytrocytów.
   2. Włącz źródło światła mikroskopu. Włącz kamerę dołączoną do mikroskopu i uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem. Użyj mikroskopii jasnego pola, aby określić odpowiednią ostrość, obracając pokrętła regulacji ostrości zgrubnej i precyzyjnej i znajdując poziom ostrości, na którym widoczne są erytrocyty.
   3. Ustaw wartości tła obrazów na 220 ± 5 wartości szarości, mierzone w trzech obszarach slajdu wolnych od komórek. Aby to zrobić, otwórz pierwsze zdjęcie za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ. Wybierz opcję Średnie wartości szarości za pomocą panelu Ustaw miary. Użyj ikony owalu, aby zmierzyć wartość szarości za pomocą polecenia Zmierz. Jeśli zmierzone wartości są poza zakresem, odpowiednio wyreguluj światło tła pod mikroskopem. Powtarzaj te kroki, aż wartości tła będą poprawne.
      UWAGA: Te wartości tła powinny mieścić się w podanym zakresie dla wszystkich wykonanych zdjęć. W przeciwnym razie dane nie są porównywalne.
   4. Aby przeprowadzić analizę wartości szarości RBC, zaznacz krawędź każdego RBC za pomocą narzędzia Zaznaczanie owalu w oprogramowaniu ImageJ. Określ wartości szarości poszczególnych RBC za pomocą polecenia Zmierz. Zmierzyć wartości szarości dla co najmniej 50 erytrocytów z badania i co najmniej 10 erytrocytów z obszaru kontrolnego.
      UWAGA: Całkowita liczba analizowanych erytrocytów może być dostosowana indywidualnie. Im więcej analizowanych erytrocytów, tym bardziej znaczący jest wynik. Jednak całkowita liczba analizowanych erytrocytów powinna być porównywalna dla każdego stanu, badanego itp. w danym eksperymencie.
      1. Unikaj analizy krwinek czerwonych w pobliżu ołówka do smarowania, ponieważ barwienie może być niepełne w tym obszarze. Unikaj analizy nakładających się na siebie erytrocytów, ponieważ wpływa to na intensywność barwienia. Używaj tylko erytrocytów, które są oddzielone od innych erytrocytów. Przeanalizuj co najmniej pięć obrazów z testu i co najmniej dwa obrazy z obszaru kontrolnego w celu oceny 50/10 erytrocytów. Uwzględnij erytrocyty z każdego zdjęcia w końcowej analizie.
   5. Aby obliczyć intensywność barwienia, oblicz końcowe sygnały jako:
      (indywidualny obszar badawczy RBC - tło średniego obszaru badania) - (indywidualny obszar kontrolny RBC - tło średniego obszaru kontrolnego)

Rysunek 2: Przedstawienie procesu utrwalania i generowania rozmazu krwi. (Schemat utworzony za pomocą BioRender.com.) Rozcieńczone próbki krwi są chemicznie utrwalane w paraformaldehydzie, a następnie odwirowywane i przemywane solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Na koniec zawieszona krew jest rozmazywana na szklanym szkiełku i utrwalana termicznie poprzez unoszenie się nad płomieniem palnika Bunsena. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Warunki przygotowania i przechowywania roztworów niezbędnych do barwienia immunohistochemicznego. Roztwór można przygotować przed protokołem. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Opis roztworów przeciwciał do natychmiastowego użycia. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Komponenty i protokół do przygotowania roztworu DAB do natychmiastowego użycia. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

2. Fluorescencyjne znakowanie białek RBC

UWAGA: Poniższa sekcja przedstawia adaptację protokołu immunohistochemicznego, opracowanego w celu umożliwienia stosowania przeciwciał z koniugatami fluorescencyjnymi (Rysunek 1).

Przygotowanie próbki krwi do protokołu immunofluorescencji jest identyczne do opisanego w sekcji 1, więc następna sekcja zaczyna się od barwienia próbek.

1. Barwienie immunofluorescencyjne
   1. Inkubować z drugorzędowym, fluorescencyjnym sprzężonym przeciwciałem (objętość, patrz krok 1.4.2) przez 30 minut w temperaturze słonecznej, chronionym przed światłem, używając specjalnie skonstruowanej komory inkubacyjnej lub folii aluminiowej.
   2. Odlewać roztwór przeciwciał wtórnych i przemywać próbki 3x TBS. Pozostawić końcowe płukanie na próbkach, aby zapobiec ich wyschnięciu.
   3. Wylej TBS i wyjmij próbki ze stojaka na próbki pojedynczo, aby zapobiec długotrwałej ekspozycji na światło. W celu odwodnienia próbek należy wystawić szkiełka na działanie różnych roztworów etanolu przez ~5 s każda, zaczynając od 70%, następnie 90%, a na końcu 100%. Wystaw szkiełka na działanie roztworu ksylolu/ksylenu na 5 sekund.
   4. Przygotuj szkiełko nakrywkowe z dwiema lub trzema kroplami podłoża montażowego, a następnie zamontuj szkiełko nakrywkowe. Zapewnij równomierne rozprowadzenie medium mocującego, lekko uciskając pęsetą lub podobnym, sterylnym metalowym narzędziem. Wyeliminuj pęcherzyki powietrza, które w przeciwnym razie mogłyby zakłócać obrazowanie, za pomocą tego samego instrumentu. Pozostawić próbki do wyschnięcia na noc w ciemnym i suchym miejscu.
2. Ocena mikroskopowa
   1. W celu wizualizacji i obrazowania umieść szkiełko na stoliku mikroskopu o całkowitym powiększeniu co najmniej 400x. Włącz źródło światła mikroskopu i źródło światła fluorescencyjnego, upewniając się, że źródło światła fluorescencyjnego jest ustawione na maksymalną intensywność.
   2. Włącz kamerę dołączoną do mikroskopu i uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem. Użyj mikroskopii jasnego pola, aby określić odpowiednią ostrość, obracając pokrętła regulacji ostrości zgrubnej i precyzyjnej oraz znajdując poziom ostrości, na którym widoczne są RBC.
      UWAGA: Nadmierna ekspozycja na światło może spowodować fotowybielanie koniugatów fluorescencyjnych. Można w tym celu użyć szkiełka z poprzedniego eksperymentu, aby zminimalizować ekspozycję na światło szkiełek, które nie zostały jeszcze przeanalizowane.
   3. Określ optymalną intensywność lasera, sprawdzając erytrocyty w obszarze kontrolnym. Upewnij się, że intensywność jest wystarczająco wysoka, aby erytrocyty były widoczne, a jednocześnie nie wytwarzały dużego sygnału tła. Utrzymuj jednolitą intensywność i czas ekspozycji między obszarami i próbkami, aby zapewnić porównywalność.
   4. Uchwyć obrazy w jasnym polu i obrazy fluorescencyjne w co najmniej trzech odrębnych obszarach obszaru testowego szkiełka, wybranych losowo. Aby zaznaczyć obszar, przesuń z dala od krawędzi szkiełka, które są oznaczone pisakiem lipidowym, używając elementów sterujących stolika mikroskopu. Zaznacz obszar, który wykazuje równomierny rozkład pojedynczej warstwy RBC.
   5. Ustaw czas naświetlania na 1 s dla obrazów fluorescencyjnych i uchwyć obraz za pomocą elementów sterujących oprogramowania sterującego mikroskopu. Przełącz się w tryb jasnego pola, ustaw czas ekspozycji na "Auto" i uchwyć odpowiedni obraz w jasnym polu.
   6. Uchwyć obrazy w jasnym polu i obrazy fluorescencyjne w co najmniej dwóch odrębnych, losowo wybranych obszarach obszaru kontrolnego szkiełka, powtarzając krok 2.2.3.
   7. Zapisz obrazy w .tif formacie, aby zachować oryginalne wartości szarości pikseli, zapobiec kompresji i przenieść metadane akwizycji.
   8. Zmierz wartości szarości przechwyconych RBC. Otwórz ImageJ (lub FIJI²¹; patrz Plik uzupełniający 1). Określ wartości szarości poszczególnych RBC. W tym celu należy oznaczyć każdą pojedynczą komórkę za pomocą narzędzia Zaznaczanie owalu i przeanalizować ją za pomocą polecenia Zmierz.
      UWAGA: Erytrocyty nie powinny być analizowane, jeśli nakładają się na inne komórki, ponieważ może to zwiększyć wynikowy sygnał.
   9. Podświetl od trzech do pięciu obszarów wolnych od erytrocytów i określ wartości szarości, aby zapewnić miarę sygnału tła. Przeanalizuj co najmniej 150 erytrocytów z co najmniej trzech odrębnych obrazów dla każdego obszaru testowego i co najmniej 50 erytrocytów z co najmniej dwóch odrębnych obrazów dla każdego obszaru kontrolnego.
      UWAGA: Można zalecić analizę większej liczby komórek/obszarów w celu zminimalizowania zmienności. Biorąc pod uwagę, że populacja RBC jest z natury niejednorodna, zmienność sygnału między komórkami może być znacząca, w zależności od białka będącego przedmiotem zainteresowania.
   10. Wykonaj alternatywną analizę danych przechwyconych obrazów za pomocą makropolecenia. Utwórz/zainstaluj makro polecenie za pomocą wersji FIJI ImageJ w celu automatycznego wyboru, korekcji tła i analizy wartości szarości danego obrazu.
       UWAGA: Ta procedura wykorzystuje automatyczne progowanie do wykrywania komórek obecnych na danym obrazie przy użyciu kopii oryginalnego obrazu, tworząc nakładkę, która jest nakładana na oryginalny obraz w celu wyodrębnienia szarych wartości fluorescencyjnych krwinek czerwonych. Makro jest deponowane jako plik .ijm, jako Uzupełniający plik kodowania 1.
   11. Otwórz plik obrazu w formacie .tif gotowym do analizy na FIDŻI. Otwórz makro RBC fluorescence.ijm (Supplementary Coding File 1) i kliknij Uruchom.
       UWAGA: Makro jest skonfigurowane dla obrazów uzyskanych z 600-krotnym powiększeniem i dużym stosunkiem sygnału do szumu. Automatyczny wybór komórek powinien być sprawdzony przez badacza.
3. Oblicz końcowe sygnały jako:
   (obszar testowy RBC - tło obszaru testowego) - (obszar kontrolny RBC - tło obszaru kontrolnego) do analizy ręcznej;
   (Obszar testowy - obszar kontrolny) do automatycznej analizy.

Results

Prezentowany protokół, opisujący metody ułatwiające wykrywanie ostrych zmian w białkach RBC, został przetestowany na dobrze znanej mechanicznie wrażliwej zmianie białka: fosforylacji RBC-NOS na reszcie seryny 1177. Krew pełną pobrano od zdrowych ochotników, a następnie podzielono na dwie oddzielne porcje. Dana próbka krwi była wystawiona na mechaniczne naprężenie ścinające o wielkości fizjologicznej (5 Pa) przez 300 s, co wcześniej wykazano w celu wywołania fosforylacji RBC-NOS przy serynie 1177¹⁴...

Discussion

Najnowsza literatura wysoce sugeruje, że białko RBC-NOS ma kluczowe znaczenie dla regulacji odkształcalności RBC 15,22,23, co z kolei ułatwia ich przejście przez wąskie naczynia włosowate ²⁴. Aktywność białek w dużym stopniu zależy od potranslacyjnych modyfikacji białek, w szczególności od fosforylacji niektórych reszt¹⁸. W centrum zainteresowania znajduje się miejsce fosforylacji ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3′-diaminobenzydyna-tetrachlorowodorek hydrat	Sigma/Merck	D5637	DAB
Chlorek amonu	Wirówka Merck /Millipore	101145	NH4Cl
5427 R	Eppendorf	5409000010
Szkiełka nakrywkowe	VWR	631-0147
Wodorofosforan di-sodowy dwuwodny	Merck /Millipore	106580	Na2HPO4. 2 H2O
Jednorazowe pipety transferowe	VWR	612-6803
Entellan	Merck /Millipore	107961	medium do szybkiego montażu do mikroskopii
Etanol denaturowany przy użyciu 1 % ketonu metylowo-etylowego (MEK)	Hofmann	642
Oksydaza glukozowa	Sigma/Merck	G2133
Ołówek do smarowania	Dako	S 2002
Peroksydaza chrzanu/ExtrAvidin− Peroksydaza	Sigma/Merck	E-2886	HRP
Kwas solny	Merck /Millipore	109057	HCl
Nadtlenek wodoru, 30%	Merck /Millipore	107203	H2O2
ImageJ	Darmowe
Laserowy analizator optycznych komórek rotacyjnych (LORCA)	RR Mechatronik		Ektacytometr używany do ścinania
metanolu	Merck /Millipore
Szkiełka mikroskopowe	VWR	630-1985
Siarczan niklu(II) sześciowodny	Sigma/Merck	N4882	NiSO4.6H2O
Normalna surowica kozia	Agilent/DAKO	X0907	NGS
Paraformaldehyd	Merck /Pipety Millipore	818715	PFA
Eppendorf Reference 2	VWR	613-5836/ 613-5839
Królicze przeciwciało anty-fosfo eNOS (Ser1177)	Merck/Millipore	07-428-I	przeciwciał pierwotnych
, 2ml	Eppendorf	30120094
Przeciwciało wtórne koza anty królik	Agilent/DAKO	E0432	Przeciwciało drugorzędowe
Odtłuszczone mleko w proszku	Bio-Rad	170-6404
Chlorek sodu	Merck /Millipore 106404		NaCl
Monohydrat diwodorofosforanu sodu	Merck /Millipore	106346	NaH2PO4. H2O
Wodorotlenek sodu, 1 M	Merck /Milipore	150706	NaOH
Tris(hydroksymetylo)-aminometan	Merck /Millipore	108382	Tris
Trypsin	Sigma/Merck	T7409
Tween20	Merck /Millipore	822184
Whatman Glas, jakość GF/F	Merck /Millipore	WHA1825047
Xylol	VWR Chemicals	2,89,73,465
ß-D-Glukoza monohydrat	Merck /Millipore	14431-43-7