Uproszczone modele wolumetryczne jako skuteczna strategia segmentacji sieci aktynowych w tomogramach krioelektronowych

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do umieszczania uproszczonych modeli wolumetrycznych w hałaśliwych, skomplikowanych, tomograficznych objętościach 3D. Pozwala to na szybką segmentację gęstości włókien aktynowych, wykrywanie systematycznego wyginania włókien i przerw we włóknach wiązek włosów, a także wygodne ilościowe określanie właściwości modelu wolumetrycznego, takich jak odległości.

Streszczenie

Efektywne metody ekstrakcji interesujących cech pozostają jednym z największych wyzwań dla interpretacji tomogramów krioelektronowych. Zaproponowano różne zautomatyzowane podejścia, z których wiele sprawdza się w przypadku zestawów danych o wysokim kontraście, w których interesujące cechy można łatwo wykryć i są one wyraźnie oddzielone od siebie. Nasze zestawy danych tomograficznych krioelektronów stereocilia ucha wewnętrznego charakteryzują się gęstym układem sześciokątnie upakowanych włókien aktynowych, które często są ze sobą połączone. Cechy te sprawiają, że automatyczna segmentacja jest bardzo trudna, a dodatkowo pogarsza ją środowisko o wysokim poziomie szumów tomogramów krioelektronowych i wysoka złożoność gęsto upakowanych elementów. Korzystając z wcześniejszej wiedzy na temat organizacji wiązki aktyny, umieściliśmy warstwy wysoce uproszczonego modelu aktyny typu kulka i patyczek, aby najpierw uzyskać globalne dopasowanie do mapy gęstości, a następnie regionalne i lokalne korekty modelu. Pokazujemy, że budowanie modelu wolumetrycznego nie tylko pozwala nam uporać się z dużą złożonością, ale także dostarcza precyzyjnych pomiarów i statystyk dotyczących wiązki aktyny. Modele wolumetryczne służą również jako punkty zaczepienia dla lokalnej segmentacji, tak jak w przypadku łączników krzyżowych aktyna-aktyna. Budowanie modeli wolumetrycznych, szczególnie gdy jest dodatkowo wspomagane przez komputerowe metody automatycznego dopasowania, może być potężną alternatywą, gdy konwencjonalne podejścia do automatycznej segmentacji nie są skuteczne.

Wprowadzenie

Krioelektronowa tomografia pozwala na wizualizację całych organelli lub części komórek i tkanek w rozdzielczościach nanometrowych w ich stanie zbliżonym do natywnego^1,2,3 przy użyciu zamrażania wgłębnego⁴ lub ultraszybkiej witryfikacji zamrażania pod wysokim ciśnieniem⁵. Ponieważ tylko ograniczona dawka elektronów może być tolerowana przez kriokonserwowaną, niebarwioną, uwodnioną próbkę, tomograficzne dane 3D są bardzo zaszumione. Szum ten często można znacznie zredukować za pomocą różnych algorytmów filtrowania szumów^6,7, w tym nieliniowej dyfuzji anizotropowej⁸, filtrowania dwustronnego⁹ i rekurencyjnego filtrowania mediany¹⁰.

Ponadto, ograniczenia nachylenia stolika mikroskopu, skutkujące brakiem klina informacji, oraz fakt, że grubość próbki wzrasta przy dużych kątach nachylenia, prowadzą do rekonstrukcji 3D z rozdzielczością anizotropową. Oznacza to, że gęstość jest rozmazana w trzecim wymiarze ze względu na niższą rozdzielczość w kierunku Z. W rezultacie kształt makrocząsteczek wydaje się zniekształcony (tj. słabiej zdefiniowany i wydłużony w trzecim wymiarze).

Jednym z największych wyzwań w interpretacji danych tomograficznych jest automatyczne wyodrębnianie odpowiednich cech, znane również jako segmentacja¹¹. Dzięki wystarczającej liczbie unikalnych cech kształtu i niskiemu poziomowi szumów, maszyny makromolekularne w złożonych objętościach 3D można zidentyfikować za pomocą dopasowania szablonu^12,13,14; Jednak powodzenie dopasowania szablonu zależy od rozdzielczości tomogramu, odpowiedniego modelu wyszukiwania, a także charakterystyki rozmiaru i kształtu objętości obiektów. Jeśli interesujące nas cechy są wystarczająco oddalone od siebie, a powtarzające się motywy (takie jak duże maszyny makromolekularne) można łatwo zidentyfikować, podobjętości tomogramu można połączyć w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu i uśrednienia zniekształceń kształtu poszczególnych cząstek. Zgłoszono zautomatyzowaną segmentację sieci włókien aktynowych w tomogramach elektronowych cienkiej krawędzi zamrożonych, uwodnionych komórek Dictyostelium discoideum przez dopasowanie szablonu¹⁵.

Jednakże, jeśli interesujące cechy są blisko siebie, anizotropia rozdzielczości danych może prowadzić do rozmazania gęstości mapy w kierunku Z (wzdłuż kierunku wiązki elektronów), co skutkuje pozornym połączeniem się obwiedni gęstości blisko rozmieszczonych maszyn makromolekularnych lub kompleksów supramolekularnych. W takich przypadkach zautomatyzowane podejścia do segmentacji, takie jak watershed¹⁶, boundary segmentation¹⁷ lub różne podejścia klasyfikacyjne oparte na uczeniu maszynowym^18,19, mogą nie być w stanie rozpoznać interesujących cech lub ustalić prawidłowej granicy wokół obiektu zainteresowania. Często kończy się to albo kilkoma bardzo dużymi kawałkami, albo z mocno nadmiernie podzieloną objętością, gdzie potrzeba wiele wysiłku, aby połączyć wiele małych elementów, aż do momentu, gdy interesujący nas element zostanie uznany za kompletny. Takie ręczne selekcjonowanie wyników segmentacji może być bardzo pracochłonne, a nawet może całkowicie się nie powieść, gdy interesująca struktura to szereg blisko rozmieszczonych włókien, które są połączone ze sobą za pomocą krótkich łączników. W tej gigantycznej sieci nitkowatych struktur orientacja może być trudna. Dzieje się tak dlatego, że ze względu na anizotropię rozdzielczości, gęstości wydają się zlewać ze sobą, co stanowi ogromne wyzwanie zarówno dla zautomatyzowanych, jak i interaktywnych podejść do segmentacji ręcznej. W związku z tym można łatwo "przeskakiwać" między włóknami, gdy sprawdza się tylko wizualnie małe obszary.

Na szczęście, w przypadku wiązki aktyny w stereocilia komórek rzęsatych ucha wewnętrznego, mamy wiedzę na temat ogólnej organizacji wiązki aktyny i kierunkowości włókien aktyny^20,21. Wiązka aktyny składa się z setek sześciokątnych, gęsto upakowanych włókien aktynowych o średnicy 6-8 nm, które są oddalone od siebie o około 12-13 nm²².

To pozwoliło nam przyjąć nieco inne podejście do segmentacji, które opiera się na uproszczonych modelach typu kulka i kij do reprezentowania filamentów aktyny. Strategia polegała na jednoczesnym umieszczeniu wyidealizowanego regularnego układu modeli włókien w płytach map gęstości tomografii krioelektronowej w celu zbudowania modelu 3D wiązki aktyny warstwa po warstwie. Upewniliśmy się, że model ma ogólne ogólne dopasowanie do mapy gęstości, zanim dokonaliśmy lokalnych korekt w poszczególnych modelach filamentów lub grupach modeli filamentów, aby ściśle pasowały do mapy gęstości. Dzięki automatycznemu kodowaniu kolorami wartości gęstości mapy w lokalizacji modelu filamentu, byliśmy w stanie łatwo wykryć widoczne luki w wiązce aktyny. Modele wolumetryczne umożliwiają ilościową analizę właściwości wolumetrycznych, takich jak odległości między filamentami aktyny, a także prowadzą do uproszczonego wyświetlania ogólnej organizacji sieci nitkowatej 3D.

Ponadto, modele mogą również służyć jako struktury kotwiczące do segmentacji dodatkowych cech, takich jak łączniki aktyna-aktyna, ponieważ można wybrać (części) poszczególnych modeli filamentów, wokół których można wygenerować odpowiednie strefy gęstości mapy promienia do kontroli i dalszej segmentacji.

Wierzymy, że nasze podejście do segmentacji oparte na modelu wolumetrycznym jest szczególnie przydatne dla dużych sieci o strukturze nitkowatej, które mogą zawierać przerwy i połączenia krzyżowe między włóknami. Algorytmy segmentacji mają tendencję do działania lokalnego, podczas gdy ludzki mózg bierze pod uwagę większe obszary, a zatem jest lepszy od komputerów, jeśli chodzi o rozpoznawanie struktur włókien, nawet w złożonym, wysoce hałaśliwym środowisku.

Protokół

Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etyki badań na ludziach Uniwersytetu Południowo-Wschodniego.

1. Źródło danych tomografii krioelektronowej do budowy modeli wolumetrycznych

UWAGA: Rekonstrukcje tomografii krioelektronowej stereocilia użyte do budowy modelu wolumetrycznego zostały wcześniej opublikowane^22,23, i zostały uzyskane zgodnie z opisem Metlagel et al.²².

Skrypty UCSF Chimera Pythona do modelowania stereocilii są dostępne w Pliku Uzupełniającym 1, Dodatkowym Pliku Kodowania 1, Dodatkowym Pliku Kodowania 2, Dodatkowym Pliku Kodowania 3, Dodatkowym Pliku Kodowania 4 i Uzupełniającym Pliku Kodowania 5.

1. Krótko mówiąc, osusz stereocilia z wierzchołkowej powierzchni nabłonka czuciowego łagiewki myszy na koronkową warstwę nośną z węgla siatki mikroskopu elektronowego (EM). Następnie należy przeprowadzić ultraszybką witryfikację wgłębną i jednoosiowe zbieranie danych krioelektronowo-tomograficznych za pomocą kriogenicznej transmisyjnej mikroskopii elektronowej (cryo-TEM), działającej pod napięciem 300 kV z nominalnym rozogniskowaniem 3,5-4,5 μm, przy użyciu kamery typu CMOS w trybie integracji, o rozmiarze piksela od 0,47 do 0,59 nm (patrz tabela materiałów).
2. Typowa dawka do zbierania danych jednoosiowych wynosi zwykle 80-100 elektronów/^A2. Zrekonstruuj objętości tomogramu 3D za pomocą pakietu oprogramowania IMOD²⁴, albo metodą ważonej projekcji wstecznej, albo metodą SIRT^25,26.
3. Odszumianie tomogramów za pomocą rekurencyjnego filtrowania medianowego lub dwustronnego w Priism²⁷ lub opcji dyfuzji anizotropowej nieliniowej w IMOD.
   UWAGA: Kluczowym pakietem oprogramowania używanym do interaktywnej wizualizacji, budowania modeli wolumetrycznych i analizy ilościowej było oprogramowanie UCSF Chimera^28,29. Wszystkie używane pakiety oprogramowania są wymienione w Tabeli Materiałów.

2. Przygotowanie danych z tomografii krioelektronowej do budowy modeli wolumetrycznych

1. Rotacja tomogramu
   UWAGA: Celem tego kroku jest znalezienie "optymalnych kątów", w których rdzeń aktyny jest wyrównany w dwóch z trzech osi (x i z), tak aby umieszczanie modeli w 3D można było wykonać przy użyciu tylko jednej osi, o którą należy się martwić. Poniższe kroki są wykonywane w pakiecie oprogramowania IMOD.
   1. Otwórz 3dmod (IMOD) i otwórz plik stosu obrazów 3D w formacie .mrc. Upewnij się, że stos 3D jest w trybie 16-bitowej skali szarości i wyświetla prawidłowe wymiary X, Y, Z w nagłówku pliku obrazu. W razie potrzeby wprowadź poprawki za pomocą polecenia alterheader: alterheader -d (x_pixelspacing),(y_pixelspacing),(z_pixelspacing) nazwa_pliku wejściowego.mrc w wierszu polecenia. Jeśli stos 3D jest w formacie pliku TIFF, użyj polecenia tif2mrc inputfilename.tif outputfilename.mrc w wierszu polecenia, aby utworzyć plik .mrc.
   2. Sprawdź wzrokowo tomogram i otwórz "slicer" (naciskając ukośnik odwrotny "\"), aby znaleźć najlepsze kąty obrotu w wymiarach X, Y i Z w celu wyrównania płaszczyzny filamentu aktynowego z płaszczyzną Z. Manipuluj obrotem X, obrotem Y, paskiem obrotu Z, aby znaleźć optymalny kąt, pod którym filamenty aktyny są wyrównane na płaszczyznach X i Z. Zwróć uwagę, że zmiana średniej grubości wyświetlacza tomogramu (Thick : Img) może pomóc w znalezieniu idealnej ilości uśrednienia gęstości w płaszczyźnie Z, a tym samym w zwiększeniu kontrastu. Powiększaj i pomniejszaj tomogram, używając odpowiednio + i - na klawiaturze.
   3. Po zidentyfikowaniu idealnych kątów do obrotu obróć tomogram, wpisując polecenie IMOD rotatevol -a (kąty obrotu Z), (kąty obrotu Y), (kąty obrotu X) -s (x-szerokość), (y-wysokość), (z-głębokość) nazwa_pliku wejściowego.mrc nazwa_pliku wyjściowego.mrc w wierszu polecenia. Upewnij się, że mapa ma wystarczająco dużo miejsca, aby dostosować się do rotacji, aby uniknąć odcinania części mapy podczas obracania.
      UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat korzystania z polecenia rotatevol, skorzystaj z opcji z menu pomocy lub odwiedź następujący adres URL (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/man/rotatevol.html). To polecenie (rotatevol) nie zmienia aktualnie wyświetlanej mapy w oknie IMOD, ale tworzy nowy plik mapy z obracaną mapą gęstości.
   4. Korzystając z okna fragmentatora, zidentyfikuj współrzędne X, Y i Z dwóch przeciwległych rogów mapy, aby zidentyfikować region przycinania zawierający stereocilium za pomocą polecenia trimvol.
   5. Użyj polecenia IMOD Trimvol, aby przyciąć mapę do wcześniej uzyskanych współrzędnych, wpisując trimvol -x (x-coordiante 1),( x-coordiante 2) -y (y-coordiante 1),( y-coordiante 2) -z (z-coordiante 2) inputfilename.mrc outputfilename.mrc w wierszu polecenia. Teraz mapa jest znacznie mniejsza, a co za tym idzie, łatwiejsza i szybsza w obsłudze.
      UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat korzystania z polecenia trimvol, skorzystaj z opcji z menu pomocy lub odwiedź następujący adres URL (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/man/trimvol.html). Wykonanie tych czynności powoduje utworzenie pliku mrc, który został obrócony i przycięty.
2. Filtrowanie tomogramów
   UWAGA: W tym kroku używany jest nieliniowy filtr dyfuzji anizotropowej (NAD) dostarczony przez IMOD do redukcji szumów. Jako wartość początkową użyliśmy wartości zalecanych na stronie pomocy IMOD dla nieliniowego filtrowania dyfuzji anizotropowej, zgodnie z listą w poniższym adresie URL (https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/NADexample.html), i użyliśmy ich jako wartości początkowych.
   1. Wpisz etomo w wierszu polecenia, aby uruchomić graficzny interfejs użytkownika etomo IMOD.
   2. Wybierz opcję Nieliniowa dyfuzja anizotropowa z menu etomo i wybierz plik mapy (Wybierz objętość).
   3. Aby znaleźć wartość K i liczbę iteracji, które zapewniają najlepsze wyniki filtrowania, zgodnie z oceną na podstawie oględzin, zastosuj filtr NAD do mniejszej objętości testowej, aby wyodrębnić określoną objętość testową filtra NAD. Kliknij narzędzie Rubberband Tool na górze interfejsu 3dmod, kliknij lewym przyciskiem myszy, aby wybrać wolumin testowy, a następnie kliknij przyciski Hi i Lo, aby wskazać, że plasterek Z jest granicą objętości testowej (Pobierz zakres objętości testowej z 3dmod). Wyodrębnij wolumin testowy, klikając przycisk Wyodrębnij wolumin testowy.
   4. Przefiltruj wolumin testowy przy użyciu różnych wartości K (Znajdź wartość K dla objętości testowej > Lista wartości K), takich jak 0,1, 1,5, 10, 15, 25, 30, 50 i 75. Wykonaj filtrowanie NAD z każdą z określonych wartości K (Uruchom z różnymi wartościami K > Wyświetl wyniki testu różnych wartości K). Użyj okna fragmentatora, aby ocenić wydajność filtru NAD i wybierz wartość K, która będzie używana do filtrowania całego woluminu.
   5. Użyj wartości K określonej w kroku 2.2.4 i przetestuj różne liczby iteracji, takie jak 2, 5, 8, 11, 15 i 21 (Znajdź numer iteracji dla woluminu testowego > Lista iteracji). Oceń wydajność filtru NAD dla różnych iteracji, klikając pozycję Wyświetl wyniki testu różnych iteracji lub używając narzędzia fragmentatora. Wybierz wartość dla innej liczby iteracji.
   6. Użyj zidentyfikowanej wartości K i liczby iteracji (Filtruj pełną wolumin > wartość K i Iteracje), a następnie przefiltruj cały wolumin (Filtruj pełną głośność). Nowo przefiltrowany wolumin pojawi się w tym samym katalogu, w którym znajduje się załadowany pełny wolumin z rozszerzeniem pliku .nad dołączonym do pliku .mrc.
      UWAGA: Te kroki tworzą plik .mrc, który został przefiltrowany za pomocą filtra NAD i wyświetla niższy szum, a tym samym lepszy stosunek sygnału do szumu.

3. Budowanie modeli wolumetrycznych

1. Przygotowanie do rozmieszczenia modelu 3D
   UWAGA: Celem tego kroku jest przygotowanie i analiza mapy do umieszczania modeli wolumetrycznych 3D na obróconej i odszumionej mapie gęstości za pomocą programu UCSF Chimera.
   1. Korzystając z okna slicera, uzyskaj przekrój poprzeczny (płyta 30 warstw/28,4 nm) w celu zidentyfikowania współrzędnych Z środka płyty gęstości, w której ma zostać umieszczony model filamentu aktynowego. Kliknij na środek gęstości filamentu i zanotuj współrzędne Z w głównym oknie IMOD.
   2. Zanotuj współrzędne określone do przyszłego umieszczenia modelu w UCSF Chimera.
      UWAGA: Współrzędne Z zanotowane w tym kroku są używane w kroku 4, aby łatwo znaleźć i umieścić gotowe modele filamentów aktynowych na odpowiednich wysokościach Z, co przyspiesza umieszczanie modelu.
2. Umieszczanie modelu 3D
   UWAGA: Celem tego kroku jest umieszczenie modelu wolumetrycznego 3D na przygotowanej mapie gęstości za pomocą UCSF Chimera.
   1. W UCSF Chimera otwórz filtrowaną, obróconą mapę (Plik > Otwórz)
   2. Sprawdź, czy parametry mapy są ustawione poprawnie, wybierając opcje Obiekty > płaszczyznach i Współrzędne > elementów w przeglądarce objętości, aby otworzyć interfejs obiektów i współrzędnych. Sprawdź opcję Rozmiar woksela, aby sprawdzić, czy ustawiono prawidłowe odstępy między wokselami za pomocą polecenia nagłówka w wierszu polecenia (w IMOD). Jeśli nie, popraw interfejs Rozmiar woksela na prawidłowe odstępy między wokselami. Wyśrodkowanie mapy w celu ustawienia kamery na środku okna podglądu (Indeks początku > Środek).
   3. Otwórz okno Sterowanie kamerą (Narzędzia > Sterowanie wyświetlaniem > Kamera). Następnie ustaw widok kamery na widok ortogonalny (rzutowanie > prostopadły)
   4. Załaduj gotowy model skryptu Pythona (File > Open > ActinFilamentPlane.py) i otwórz tyle skryptów płaszczyzny filamentu aktyny, ile jest płaszczyzn filamentu aktyny na mapie.
   5. Przenieś załadowane modele, włączając tryb myszy ruchu (Narzędzia > Ruch > Tryb myszy ruchu). Włącz opcję myszy ruchu (Ustaw tryb myszy ruchu > Przesuń zaznaczenie). Użyj Ctrl + Przeciągnij, aby wybrać wiele modeli obecnych w sesji, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy (lub dowolny inny określony w opcji Preferencje > myszy), aby przesunąć modele w żądanym kierunku.
      UWAGA: Modele zostały stworzone za pomocą kulek i patyków o określonej grubości (>promień ActinFilamentPlane.py pisma) i z określonymi odstępami (Lattice_Spacing ActinFilamentPlane.py pisma).
   6. Aby zobrazować tylko ten model, który nas interesuje, otwórz Panel Model (Narzędzia > Formanty ogólne > Panelu Model). Kliknij pola wyboru w obszarze S (Pokaż), aby włączyć lub wyłączyć widoczność danego modelu.
   7. Uaktywnij panel wiersza poleceń (Narzędzia > Elementy sterujące ogólne > Wiersz poleceń).
   8. Po umieszczeniu każdego modelu płaszczyzny filamentu aktyny na właściwej wysokości Z, usuń nadmiar filamentów aktyny w każdym modelu płaszczyzny filamentu aktyny, wybierając nadmiarową część modeli i wpisując del sel (Usuń wybrane) w wierszu poleceń u dołu głównego okna widoku UCSF Chimera.
   9. Wizualizuj tylko jedną płaszczyznę filamentu aktyny na raz, przechodząc do okna Panel modelu i wybierając i ukrywając wszystkie inne modele filamentów aktynowych (Ctrl + Kliknięcie > Ukryj).
   10. Aby zobrazować fragmenty gęstości mapy, które znajdują się w bezpośrednim sąsiedztwie interesującego nas modelu płaszczyzny pojedynczego filamentu aktynowego, wybierz model (Panel Model > wyboru) i otwórz panel sterowania strefą w Podglądzie głośności (Podgląd głośności > Funkcje > Strefa). Ustaw promień strefy na 100 A, a następnie kliknij przycisk Strefa, aby podzielić mapę na strefy w promieniu 100 A (= 10 nm) od wybranego modelu. Zauważ, że wymiar w Chimerze jest ustawiony w Angstrøm (1 Å = 0,1 nm).
   11. W razie potrzeby dostosuj model tak, aby pasował do mapy zagęszczenia, włączając tryb ruchu myszy. Zaznacz wiele modeli, które nie znajdują się w odpowiednim położeniu, aby przesunąć modele w celu prawidłowego umieszczenia ich na mapie zagęszczenia stref.
   12. Aby przezwyciężyć błąd programistyczny w ActinFilamentPlane.py, uruchom skrypt FixingMarkerID.py, który naprawia brakujący MarkerID "atomów" (kulek w modelu kulkowym i kijowym). Wybierz cały model i wpisz runscript FixingMarkerID.py w wierszu polecenia (skrypt powinien być określony przez odpowiedni katalog, taki jak C: \ directory \ Script.py).
   13. Jeśli mapa gęstości wskazuje, że filament aktynowy jest zakrzywiony, upewnij się, że prosty filament aktynowy został podzielony na wiele części, aby dostosować się do krzywizny, wybierając żądane modele i wpisując numer dividelinks.py runscript. Dodatkowe znaczniki (określone liczbą w poleceniu) umieszcza się wewnątrz modelu aktyny w równej odległości od siebie, tworząc "połączenia", w których można wygiąć model.
   14. Dostosuj stawy, aby odzwierciedlić krzywiznę, przesuwając dodatkowe "stawy" znaczników wzdłuż mapy stref za pomocą trybu ruchu myszy. W razie potrzeby dodaj dodatkowe znaczniki do modelu za pomocą skryptu dividelinks.py.
   15. Aby sprawdzić, czy wszystkie filamenty aktyny są prawidłowo umieszczone wewnątrz gęstości aktyny, użyj pasków przycinających, klikając Narzędzia > Sterowanie wyświetlaniem > Kamera w menu rozwijanym UCSF Chimera, aby otworzyć okno Sterowanie kamerą, a następnie wybierz Widok z boku, aby zobaczyć dwa paski przycinania (bliskie i dalekie płaszczyzny przycinania) kamery. Przeciągnij dwa żółte paski do wąskiego otworu, klikając lewym przyciskiem myszy, a następnie przeciągnij część przycinającą za pomocą środkowego przycisku myszy, aby sprawdzić modele po kawałku.
       UWAGA: Model rdzenia aktyny stereocilium jest już gotowy.
3. Segmentacja membrany
   UWAGA: Celem tego kroku jest stworzenie modelu powierzchniowego błony stereocilia.
   1. Segmentacja powierzchni odbywa się za pomocą narzędzia Volume Tracer (Narzędzia > Dane woluminu > Śledzenie woluminu).
   2. W oknie Volume Tracer kliknij Mysz i zaznacz tylko opcje Umieść znaczniki na płaszczyznach danych i Połącz nowy znacznik z zaznaczonym znacznikiem. Pozwala to na precyzyjne umieszczenie znaczników na tej samej płaszczyźnie Z (gdy pokazana jest pojedyncza płaszczyzna Z). Sprawdź także opcję Umieść znaczniki za pomocą środkowego przycisku myszy w oknie śledzenia głośności.
   3. Utwórz nowy zestaw znaczników (Plik > Nowy zestaw znaczników). Zestaw znaczników 1 powinien zostać utworzony i wybrany w oknie Volume Tracer.
   4. Użyj Podglądu woluminów, aby wyświetlić pojedyncze płaszczyzny Z w głównym oknie podglądu (od osi do Z > One).
   5. Za pomocą środkowego przycisku myszy prześledź membranę od jednego końca widocznej membrany do drugiego. Wszystkie znaczniki powinny być połączone linkami z jednego końca na drugi.
   6. Usuń zaznaczenie ostatnio umieszczonego znacznika, naciskając Ctrl + kliknięcie na tle, w którym nie znajduje się ani jeden element do wybrania. Gwarantuje to, że następny znacznik do umieszczenia zostanie połączony z ogniwami w nowej płaszczyźnie, a nie z poprzednim śladem membrany innej płaszczyzny Z.
   7. Powtórzyć obrysowywanie przez membranę dla każdych 10 nm w tym samym kierunku, w jakim przebiega od jednego końca widocznej membrany do drugiej.
   8. Po posegmentowaniu wielu równoległych pasm membran przejdź do okna Śledzenie objętości i kliknij Elementy > Powierzchnie. Spowoduje to włączenie interfejsu powierzchni w oknie śledzenia woluminu. Kliknij przycisk Utwórz obok interfejsu Powierzchnie, aby utworzyć powierzchnie pomiędzy pasmami segmentacji membrany. W ten sposób powstaje cienka klapka modelu powierzchniowego, która wypełnia rozstawione ślady membrany.
      UWAGA: Tworzenie modelu powierzchni błony stereocilium zostało zakończone.
4. Modelowanie sieciujące
   UWAGA: Celem tego kroku jest modelowanie środków sieciujących między filamentami aktyny.
   1. Środki sieciujące można również umieszczać za pomocą narzędzia Volume Tracer.
   2. W oknie Volume Tracer kliknij lewym przyciskiem myszy, aby zaznaczyć tylko opcję Umieść znaczniki na powierzchniach i Połącz nowy znacznik z wybranym znacznikiem. Następnie zaznacz opcję Umieść znaczniki za pomocą środkowego przycisku myszy w oknie Śledzenie głośności.
   3. Wizualizację gęstości wokół interesującego nas modelu płaszczyzny pojedynczego filamentu aktynowego można wizualizować tylko przy użyciu funkcji strefy. Ustaw promień strefy na 100 A, aby wyświetlić mapę w promieniu 100 A od wybranego modelu.
   4. Umieść znaczniki w widocznych gęstościach środków sieciujących, klikając środkowy przycisk myszy. Po umieszczeniu dwóch znaczników (a tym samym modelowaniu jest pojedynczy znacznik sieciujący) należy usunąć zaznaczenie drugiego znacznika, aby zapobiec ciągłemu łączeniu ogniw z następnym modelem sieciującym.
   5. Powtórz powyższe kroki dla każdej płaszczyzny filamentu aktyny i powtórz cały powyższy proces do wszystkich trzech głównych kierunków, w których mogą znajdować się środki sieciujące. Podczas podziału na strefy płaszczyzn filamentu aktynowego w kierunku przekątnej, ręcznie wybierz modele filamentów aktynowych indywidualnie.
      UWAGA: Dla każdego z modeli sieciujących aktyny możemy zarejestrować pozycję na włóknach aktynowych, z którymi łączą się domniemane środki sieciujące. Informacje te można w zasadzie pozyskać do dalszej analizy przy użyciu uśredniania metodą subtomogramu, co wykracza poza zakres niniejszego badania.

4. Analiza ilościowa modelu 3D

1. Analiza luk
   UWAGA: Celem tego kroku jest wykrycie luk we włóknach aktynowych.
   1. Wybrane pozycje mogą być analizowane. Określ ich parametry, takie jak kolor, za pomocą narzędzia Sprawdź zaznaczenie (Operacja > Sprawdź).
   2. Kolor wybranego elementu można określić, zaznaczając dowolny element możliwy do wybrania w UCSF Chimera i zmieniając kolor obok sekcji Kolor w oknie Sprawdź zaznaczenie.
   3. Określ rozmiar znaczników i połączeń, zaznaczając dowolne znaczniki i połączenia w UCSF Chimera oraz zmieniając wartości obok sekcji promienia w oknie Sprawdź zaznaczenie, w którym znajdują się jednostki w Angstrøm.
   4. Przeprowadzaj analizę przerw poprzez automatyczne wykrywanie przerw gęstości, wykorzystując funkcję Wartości w pozycjach atomów (Narzędzia > Dane objętościowe > Wartości w pozycjach atomów).
   5. Wybierz mapę, na której zostaną odczytane wartości, wybierając żądaną mapę obok sekcji Dane objętościowe w oknie Wartości w pozycjach atomów. Wybierz model, w którym wszystkim markerom zostanie przypisany parametr, wybierając żądany model obok sekcji Cząsteczka.
   6. Za pomocą przycisku Histogram znajdującego się w dolnej części okna Wartości w pozycjach atomów tworzony jest histogram w nowym oknie o nazwie Renderuj/Wybierz według atrybutu. Ctrl + kliknięcie na histogramie doda lub usunie punkty odcięcia, dla których można wybrać różne kolory. Usuń zaznaczenie opcji Zachowaj nieprzezroczystość, aby zastosować przezroczysty kolor do sceny. Znaczniki o gęstości poniżej danego progu, który reprezentuje przerwy, mogą być nie tylko kolorowane, ale także wybierane, a tym samym pozwalają nam policzyć znaczniki liczbowe w obszarze przerwy. Aby wybrać, kliknij Wybierz > atrybut > value_mapname.
2. Wyznaczanie odległości interaktyny
   1. Aby zmierzyć odległości między aktynami, umieść znaczniki na pojedynczej płaszczyźnie XZ (określanej w UCSF Chimera jako płaszczyzna Y), korzystając z okna Śledzenie woluminu, klikając Mysz i zaznaczając tylko opcję Umieść znaczniki na płaszczyznach danych i usuwając zaznaczenie opcji Połącz nowy znacznik z wybranym znacznikiem. Pozwala to na precyzyjne umieszczenie znaczników na tej samej płaszczyźnie Y (gdy pokazana jest pojedyncza płaszczyzna Z). Sprawdź również opcję Umieść znaczniki za pomocą środkowego przycisku myszy w oknie śledzenia głośności i umieść znaczniki na docelowej płaszczyźnie Y w celu pomiaru odległości interakcji.
   2. Po pomyślnym oznaczeniu pozycji aktyny pojedynczej płaszczyzny Y, zaznacz wszystkie znaczniki i wpisz polecenie findclash #model-spec test self overlapCutoff -200 hbondAllowance 0 log true Linewidth 10 pbColor black w wierszu poleceń na dole płaszczyzny filamentu aktynowego. Spowoduje to znalezienie wszystkich kolizji między znacznikami w odległości 200 A (overlapCutoff -200) i utworzenie czarnych linii (pbColor black) o grubości 10 A (Szerokość linii 10) między znacznikami.
   3. Ponieważ w danym zakresie 200 A znajdują się nakładające się na siebie znaczniki, należy usunąć zbędne pomiary, które nie są powiązaniami tylko między najbliższymi, sąsiednimi znacznikami. Zrób to za pomocą skryptu RemoveCross.py udostępnionego na stronie UCSF Chimera, który usuwa wszystkie nakładające się linki, które nie są najkrótszym linkiem, wraz z sąsiednimi znacznikami.
   4. Aby zmierzyć odległość pozostałych wiązań, zaznacz wszystkie pseudowiązania (linki, które są tworzone przez findclash) i użyj skryptu Pythona pblengths.py, wpisując pblengths.py runscript. Zobacz zmierzone wartości z dziennika odpowiedzi (Narzędzia > Programy > Dziennik odpowiedzi). Następnie skopiuj uzyskane wartości z Dziennika odpowiedzi i przenieś je do arkusza kalkulacyjnego lub innego odpowiedniego narzędzia, aby utworzyć histogram.

Wyniki

Korzystając z krioelektronowej tomografii niebarwionych, zamrożonych i uwodnionych pojedynczych stereocilii zanurzonych w szklistym lodzie, uzyskaliśmy mapy gęstości wiązki aktyny z jej sześciokątnie ułożonymi włóknami aktyny, połączonymi białkami konektorów krzyżowych²³. Wymiar pojedynczego woksela wynosił 0,947 nm. Oględziny w programie IMOD slicer renderingu objętościowego całego tomogramu (400 plastrów/379 nm) wykazały obecność nitkowatych struktur ustawionych w jednej linii z osią podłużną stereocilii, co można zobaczyć w widokach podłużnych (płaszczyzna XY; Rysunek 1A-C, górne panele), a także w widokach przekrojowych (płaszczyzna XZ; Rysunek 1A-C, dolne panele). Zauważyliśmy, że widok projekcyjny przez sieć filamentów 400 plasterków/379 nm stał się najwyraźniejszy po obróceniu oryginalnej zrekonstruowanej objętości o -6° wokół osi X, -13,5° wokół osi Y i 5° wokół osi Z. Pod tym kątem wszystkie włókna są ustawione jeden na drugim, a zatem kontrast jest maksymalny, co można ocenić na podstawie widoków przekrojowych (Rysunek 1B). Ponieważ pojedyncze przekroje poprzeczne nie mają wystarczającego sygnału, aby jednoznacznie odróżnić włókna aktynowe, zdecydowaliśmy się na masowe renderowanie płyty o długości 30 warstw/28,4 nm, która wyraźnie pokazuje sześciokątny wzór w przekroju poprzecznym. Niebieskie linie w Rysunek 1C (górne panele) wskazują położenie środka odpowiednich płyt o przekroju poprzecznym 30 warstw/28,4 nm w dolnych panelach.

Małe odchylenia od tego optymalnego kąta widzenia, zaledwie o ±2°, znacznie zmniejszyły postrzegany porządek sieci włókien aktynowych (Rysunek 1A,C), co wskazuje, jak łatwo jest zgubić się w objętości 3D tomogramu.

Aby zilustrować wyzwanie związane z użyciem zautomatyzowanych metod segmentacji, takich jak segmentacja zlewni, wybraliśmy mały podobjętość (przedstawioną jako złotą) do segmentacji zlewni, zgodnie z implementacją w pakiecie oprogramowania UCSF Chimera (>Narzędzia > Volume Data > Segger > Segment). Położenie podobjętości w stosunku do całej mapy stereocilii jest oznaczone małą wstawką w Rysunek 1B.

Rysunek 1D-F pokazuje wybraną podobjętość w różnych orientacjach, z Rysunek 1D,E pokazuje kierunek patrzenia wzdłużnego, a Rysunek 1F pokazuje kierunek patrzenia przekroju poprzecznego. Strzałki po lewej stronie Rysunek 1D-F wskazują kierunek włókien aktyny.

Rysunek 1D-F (prawe panele) pokazuje wyniki segmentacji działu wodnego. Podwolumin jest kodowany kolorami według tożsamości obiektu, przy czym kolory są losowo przypisywane do różnych obiektów. Różne kolory wskazują na różną tożsamość obiektu, stąd z Rysunek 1D-F staje się jasne, że gęstości map dla włókien były rozdrobnione wzdłuż osi filamentu, podczas gdy ten sam kolor, a tym samym tożsamość obiektu, nadano gęstościom mapy, które łączyły sąsiednie włókna. Innymi słowy, algorytm segmentacji zlewni nie był w stanie śledzić mapy gęstości włókien aktynowych przez dłuższy czas, a zamiast tego doprowadził do połączenia gęstości z sąsiednich włókien. Chociaż możliwe jest ręczne selekcjonowanie zaznaczenia (np. poprzez usuwanie lub scalanie obiektów), takie podejście jest dość pracochłonne, a tym samym czasochłonne.

Chociaż nie jest to absolutnie konieczne, aby nasza strategia budowania modeli wolumetrycznych działała, pomogła przeorientować (obrócić) mapę 3D tak, aby oś sieci filamentu aktynowego zrównała się z osią Y, a płaszczyzny modelu filamentu aktynowego zrównały się z płaszczyzną X-Y tomogramu. Tę orientację nazywamy standardową orientacją dla wyświetlania tomograficznego stereociliów.

Dlatego zdecydowaliśmy się zbadać inną strategię segmentacji obrazu, wykorzystując fakt, że filamenty aktynowe wykazywały ogólnie regularną organizację (sześciokątne upakowanie), z regularnymi odstępami i zdefiniowaną ogólną orientacją wiązki. Nasza strategia polegała na znalezieniu ogólnego dopasowania modeli wiązki aktyny, jako układu włókien, a następnie regionalnych, a następnie lokalnych korekt pozycji modelu, aby pasowały do eksperymentalnej mapy gęstości. Umieszczając ogólny model na pierwszym miejscu, możemy przezwyciężyć niejasności na mapie lokalnej i wykryć regionalne trendy odchyleń modelu od jego pierwotnej organizacji, takie jak zginanie włókien.

Aby umieścić model, wyświetliliśmy płyty o gęstości (10 warstw/9,47 nm) w standardowej orientacji, która odpowiadała grubości pojedynczej warstwy włókien aktyny, do której dopasowano warstwę regularnie rozmieszczonych, prostych modeli filamentów aktynowych. Jest to oczywiście nadmierne uproszczenie filamentów aktynowych, z których każdy składa się z liniowego układu monomerów aktyny o symetrii helikalnej. Rysunek 2A-C pokazuje trzy reprezentatywne warstwy na różnych wysokościach Z, z czerwonymi prętami reprezentującymi włókna aktyny. Górne panele, przedstawiające przekroje o grubości ~30 warstw / 28,4 nm, pokazują, na której wysokości Z została umieszczona pojedyncza warstwa modelu aktyny składająca się z 19 prętów, podczas gdy dolne panele pokazują orientację podłużną (choć pokazaną w widoku perspektywicznym). Rysunek 2D pokazuje kompletny uproszczony model, zarówno w widoku przekroju poprzecznego (górny panel), jak i podłużnego widoku perspektywicznego (dolny panel). Orientacja przekroju poprzecznego pozwoliła nam na pewne ustawienie włókien. W tym przypadku pomocne okazało się nasze pierwotne posunięcie polegające na zmianie orientacji całej objętości tak, aby pokrywało się z głównymi osiami tomogramów, ponieważ oznaczało to, że orientacja naszego modelu w naszym standardowym kierunku patrzenia była również równoległa do osi głównych. Jednak, ściśle mówiąc, nasze podejście zadziałałoby również bez reorientacji tomogramu, samo umieszczenie modelu w gęstości byłoby większym wyzwaniem.

Po dokładnym przyjrzeniu się poszczególnym płytom mapy gęstości, zauważyliśmy, że idealnie prosty model aktyny nie pasował do obserwowanej mapy gęstości poruszającej się od bliższego końca do dystalnego końca (tj. w kierunku końca) stereocilii (Rysunek 3A-C). W pobliżu końca stereocilii gęstość mapy dla włókien została przesunięta o ponad 13 nm (odstępy aktyna-aktyna), co mogliśmy skompensować, dostosowując model podczas poruszania się od bliższej do dystalnej części mapy gęstości stereocilii, wprowadzając w ten sposób niewielką, ale wyraźną stopniową krzywiznę do naszego modelu aktyny. Rysunek 3D pokazuje pojedynczą płytę gęstości mapy filamentu aktynowego, z modelem wolumetrycznym dopasowanym do mapy gęstości. Porównanie modelu prostego (czerwonego) i zakrzywionego (żółtego) pokazano na rysunku Rysunek 3E. Krzywiznę tę najlepiej uzmysłowić sobie pochylając płytę mapy gęstości z umieszczonym modelem o 80° wokół osi X, co pozwala na uzyskanie widoku perspektywicznego wzdłuż kierunku włókien aktyny (Rysunek 3D,E).

Odchylenie dwóch modeli, z przesunięciem pozycji modelu aktyny w pobliżu końcówki o mniej więcej taką samą odległość, jak odstępy między włóknami aktyny, mogłyby spowodować wiele zamieszania, gdybyśmy nie postępowali tak, jak postępowaliśmy. To "globalne" umiejscowienie warstwy modelu filamentu aktynowego, a następnie "regionalna" regulacja, pozwoliło nam wykryć tę krzywiznę, która jest ledwo zauważalna w widoku podłużnym lub przekrojowym. Jednak nałożenie na siebie tych dwóch modeli, jak pokazano na rysunku Rysunek 3E, ujawnia subtelną różnicę.

Powtórzenie tego podejścia dla wielu warstw pozwala na uzyskanie kompletnego modelu 3D (Rysunek 3F), ograniczonego jedynie przez niepewność danych na samej górze i na dole stereocilia, gdy patrzy się na nią w orientacji przekrojowej (Rysunek 3G). Ten brak gęstości jest spowodowany brakiem klina w (jednoosiowym) gromadzeniu danych tomograficznych i odpowiadającej mu anizotropii rozdzielczości danych, a jego wpływ jest wskazywany przez brak dobrze zdefiniowanej gęstości mapy dla błon stereorzęskowych.

Gdy już mieliśmy model 3D, oznaczyliśmy kolorami każde miejsce modelu wolumetrycznego zgodnie z wartością gęstości mapy w tym miejscu. Obszary modelu z bazową słabą gęstością mapy zostały pokolorowane na czerwono, podczas gdy regiony modelu z silnym sygnałem gęstości mapy zostały pokolorowane na żółto (Rysunek 4A). Interpretujemy takie obszary o czerwonym kolorze, które mogą rozciągać się na dziesiątki nanometrów, jako luki w strukturach włókien aktynowych, które ze względu na swój zakres nie mogą być przypisane zmianom gęstości często spotykanym w środowisku o wysokim poziomie szumów na mapie krio-EM. Szum ma tendencję do wpływania na pojedyncze woksele lub małe grupy wokseli, ale jest mało prawdopodobne, aby był źródłem objętości składającej się z setek wokseli, dla których brakuje gęstości włókien. Zamiast tego takie luki mogą być rzeczywistą cechą siatki aktynowej stereocilia i mogą stanowić miejsca obrotu aktyny. Rysunek 4A ma dwie różne wartości gęstości mapy, pokazane w kolorze jasnoniebieskim i ciemnoniebieskim. Należy wyraźnie zauważyć, że nasze podejście do budowania modelu wolumetrycznego, w połączeniu z automatycznym kodowaniem kolorystycznym naszego modelu w obszarach o słabej gęstości, jest szybkim i wygodnym sposobem wykrywania i wizualizacji rozkładu takich luk w modelu filamentu aktynowego, co w przeciwnym razie byłoby bardzo trudne.

Jak pokazano na Rysunek 4B, części modelu wolumetrycznego w miejscach o porównywalnie niskiej gęstości można łatwo ukryć na podstawie wyników uzyskanych w Rysunek 4A. To z kolei prowadzi do bardziej rozdrobnionego modelu, który może bardziej realistycznie przedstawiać model aktynowy w stereociliach. Alternatywa polegająca na budowaniu małych odcinków włókien aktynowych byłaby bardzo pracochłonna i mogłaby całkowicie zakończyć się niepowodzeniem, ze względu na problemy omówione przy opisie Rysunek 1.

Ponadto, model wolumetryczny pozwala nam łatwo modelować łączniki krzyżowe, po prostu umieszczając połączenie (pokazane na czerwono) między pozycjami punktów modelu filamentu aktynowego po obu stronach połączenia krzyżowego (Rysunek 4C). W naszym uproszczonym podejściu nie musimy przyjmować żadnych założeń co do dokładnej tożsamości każdego białka łączącego krzyżowo, co wymagałoby wyższej rozdzielczości i/lub wyrafinowanych podejść do znakowania. Zamiast tego wszystko, co musimy ustalić, to czy istnieje gęstość, która łączy sąsiednie włókna aktynowe; Jeśli tak, możemy umieścić krótkie połączenie od jednego żarnika do sąsiedniego odpowiednika. W Rysunek 4D, pokazany jest model pięciu filamentów aktynowych wraz z ich łącznikami krzyżowymi, co daje wrażenie rozkładu łączników krzyżowych wzdłuż osi filamentu aktynowego.

Kolejną zaletą budowania wolumetrycznego modelu wiązki aktyny jest to, że można szybko określić odstępy między sąsiednimi włóknami aktyny (Rysunek 4E-H). Rysunek 4E,F pokazuje przekrój poprzeczny mapy gęstości bez i z modelem dopasowanym do sześciokątnej siatki gęstości mapy, odpowiednio. Rysunek 4G pokazuje model z połączeniami między najbliższymi sąsiednimi kulkami. UCSF Chimera umożliwia automatyczne obliczanie odległości najbliższych sąsiednich centrów, czego wynik można następnie wykreślić jako rozkład odległości (Rysunek 4H). Tworzenie modeli dla dwóch dodatkowych zestawów danych przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1 i rysunku uzupełniającym 2.

Rysunek 1: Wyzwania napotykane przez segmentację topografów stereociliowych komórek rzęsatych. (A-C) Rzuty podłużne (400 warstw/379 nm) na tomograficznej mapie 3D w płaszczyźnie XY (górne panele) i przekroje poprzeczne (30 warstw/28,4 nm) w płaszczyźnie XZ (dolne panele). (A) Mapa tomograficzna obrócona o -2° wzdłuż osi Y w stosunku do jej optymalnej orientacji. (B) Mapa tomograficzna w optymalnej orientacji, wyznaczona przez dostosowanie kątów obrotu osi X, Y i Z (X = -6°, Y = -13,5° i Z= 5°) i ujawniająca wysoki stopień uporządkowania na mapie gęstości, sugerujący wysoce uporządkowaną sieć włókien aktynowych. (C) Mapa tomograficzna obrócona o +2° wzdłuż osi Y od jej optymalnej orientacji; obrót o zaledwie 2° wokół osi Y od optymalnego kierunku patrzenia poważnie pogarsza postrzeganą regularność mapy gęstości. Dolne panele ujawniają regularność układu filamentów aktynowych, gdy patrzy się na nie w kierunku przekroju poprzecznego. Niebieska linia w A-C wskazuje położenie płyty przekroju poprzecznego. (D-F) Sześcian o wymiarach 50 nm x 50 nm x 50 nm oglądany z trzech różnych kierunków przed (lewe panele) i po (prawe panele) segmentacji działu wodnego. Należy zauważyć, że segmentacja zlewni nie wykrywa ciągłej gęstości włókien aktynowych, podczas gdy sąsiednie włókna aktynowe i ich połączenie krzyżowe mają tę samą tożsamość obiektu, co sugeruje, że segmentacja zlewni nie jest odpowiednim podejściem do segmentacji tomogramu. W panelach D-F mapa zagęszczenia w Chimerze jest pokazana jako styl mapy "Powierzchnia". (A-C) Podziałka liniowa = 100 nm. (D-F) Podziałka liniowa = 50 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Budowa wolumetrycznego modelu filamentu aktynowego typu kulka i patyczek. (A-C) Góra: przekrój poprzeczny 30 warstw/28,4 nm mapy gęstości z jednowarstwowym uproszczonym modelem filamentu aktynowego umieszczonym na innej wysokości Z. Na dole: pojedyncza płyta mapy gęstości o długości 10 warstw/9,47 nm z jednowarstwowym uproszczonym modelem filamentu aktynowego. (D) Kompletny model prostego filamentu aktynowego w przekroju poprzecznym 30 warstw/28,4 nm (na górze) i w widoku perspektywicznym (na dole); Podziałka liniowa = 100 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Korekta modelu w celu skorygowania wykrytego wygięcia gęstości filamentu aktyny. (A-C) Dokładne oględziny modelu, zarówno w przekroju poprzecznym (górne panele), jak i podłużnym (dolne panele), wykazały dobre dopasowanie modelu do mapy gęstości na bliższym końcu stereocilii. Jednak w miarę zbliżania się do dystalnego końca stereocilii, dopasowanie staje się coraz gorsze dla wszystkich modeli filamentów aktynowych. Można to skorygować, przesuwając kulki modelu kulkowego i patyczka do odpowiedniej pozycji mapy gęstości, co skutkuje lekko zakrzywionym modelem filamentu aktynowego. Model prosty jest pokazany na czerwono, a skorygowany model gięty jest pokazany na żółto. (D) Pojedyncza płyta mapy gęstości z dopasowanym do niej zakrzywionym modelem, odsłaniająca krzywiznę gęstości aktyny w kierunku wierzchołka stereocilii. Model aktynowy został obrócony o 80° wokół osi X, aby lepiej pokazać to subtelne, ale znaczące wygięcie włókien aktynowych. (E) Porównanie prostego, nieskorygowanego modelu aktyny pokazanego na czerwono z zakrzywionym, skorygowanym modelem aktyny pokazanym na żółto. Ze względu na przejrzystość pokazano tylko jedną warstwę modelu filamentu aktynowego. (F-G) Model wiązki aktyny z zakrzywionymi, skorygowanymi włóknami aktyny pokazanymi w orientacji podłużnej (F) i przekroju poprzecznego (G). Membrana segmentowa jest pokazana na niebiesko. W panelu D mapa zagęszczenia w Chimerze jest pokazana jako styl mapy "Siatka". Podziałka liniowa = 100 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wykrywanie luk w pakiecie aktyny za pomocą budowania modelu wolumetrycznego. Kwantyfikacja właściwości wolumetrycznych za pomocą modeli kulowych i patyczkowych. (A-C) Mały obszar podłużnej płyty o grubości ~10 / 9,47 nm mapy gęstości stereocilii jest pokazany na niebiesko, wraz z zakrzywionym, skorygowanym modelem filamentu aktynowego. (A) Mapa zagęszczenia jest pokazana przy niższym progu zagęszczenia (jasnoniebieskim) i wyższym progu zagęszczenia (ciemnoniebieskim). Istnieją obszary modelu filamentu aktynowego, dla których nie ma odpowiadającej im gęstości. W takich miejscach model został oznaczony kolorem czerwonym, aby reprezentować brak gęstości. Interpretujemy te lokalizacje jako luki we włóknach aktynowych. (B) Model włókien aktynowych, który wydaje się rozdrobniony, odzwierciedlający brak gęstości włókien aktynowych w takich miejscach przerwy. (C) Model włókien aktynowych z ogniwami łączącymi krzyżowo (pokazanymi na czerwono) dodanymi w miejscach, w których stwierdzono silną gęstość w celu zmostkowania sąsiednich włókien aktynowych. (D) Trzy wybrane modele filamentów aktynowych są pokazane z łącznikami krzyżowymi do sąsiednich filamentów aktynowych (które nie są pokazane dla jasności). Należy zauważyć, że wiele, ale nie wszystkie, możliwe pozycje włókien interaktynowych są zajmowane przez białka łącznikowe; (E) Płyta o przekroju poprzecznym 30 warstw/28,4 nm o gęstości stereocilii. (F) Model włókien aktynowych dopasowanych do płyty o gęstości stereorzęsek o przekroju poprzecznym 30 warstw/28,4 nm. (G) Model włókien aktynowych bez leżącej pod nimi gęstości mapy. Automatyczne wykrywanie najbliższych odległości sąsiednich filamentów aktynowych, na co wskazują cienkie połączenia między kulkami modelu filamentu aktynowego. (H) Histogram odległości modelu filamentu aktynowego. W panelach A-C mapa zagęszczenia w Chimerze jest pokazana jako styl mapy "Siatka". (A-C) Podziałka liniowa = 50 nm. (D) Podziałka liniowa = 25 nm. (E-G) Podziałka liniowa = 100 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Budowanie modelu dla pierwszego z dwóch dodatkowych zestawów danych stereocilia. (A-C) Mały obszar podłużnej płyty o grubości ~10 / 9,47 nm mapy gęstości stereocilii jest pokazany na niebiesko przy użyciu wyświetlania w trybie siatki. Początkowo umieszczony model jest pokazany na czerwono, a poprawiony model na żółto. (A) Tylko gęstość mapy. (B) Początkowy model umieszczony na mapie zagęszczenia. (C) Poprawiony model umieszczony na mapie zagęszczenia. (D-E) Większy obszar stereocilii bez (D) i z (E) skorygowanym modelem dopasowanym do podłużnej płyty o grubości ~10 warstw/9,47 nm mapy gęstości stereocilii. (F-G) Pokazany jest cały obszar tomogramu stereocilia. (F) Tylko mapa. (G) Mapa z poprawionym modelem. (H) Superpozycja modelu początkowego i poprawionego. Podziałka liniowa = 100 nm Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Budowanie modelu dla drugiego z dwóch dodatkowych zestawów danych stereocilia. (A-C) Mały obszar podłużnej płyty o grubości ~10 warstw/9,47 nm na mapie gęstości stereocilia jest pokazany na niebiesko przy użyciu wyświetlania w trybie siatki. Początkowo umieszczony model jest pokazany na czerwono, a poprawiony model na żółto; (A) Tylko gęstość mapy. (B) Początkowy model umieszczony na mapie zagęszczenia. (C) Poprawiony model umieszczony na mapie zagęszczenia. (D-E) Większy obszar stereocilii bez (D) i z (E) skorygowanym modelem dopasowanym do podłużnej płyty o grubości ~10 warstw/9,47 nm mapy gęstości stereocilii. (F-G) Pokazany jest cały obszar tomogramu stereocilia. (F) Tylko mapa. (G) Mapa z poprawionym modelem. (H) Superpozycja modelu początkowego i poprawionego. Podziałka liniowa = 100 nm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: UCSF Chimera python skrypty do modelowania stereocilia. Dodatkowy plik kodowania 1: pblengths.py. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 2: RemoveCross.py. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 3: ActinFilamentPlane.py. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 4: dividelinks.py. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 5: FixingMarkerID.py. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Wykazaliśmy, że zautomatyzowane podejścia do segmentacji, takie jak segmentacja działu wodnego, mogą zawieść w środowisku o wysokim poziomie szumów i złożoności tomogramów krioelektronowych stereocilia komórek rzęsatych. Rozróżnienie, która część tej nitkowatej sieci reprezentuje włókna aktynowe, a co stanowi usieciowanie krzyżowe na poziomie środowiska lokalnego, wydaje się w najlepszym razie trudne, gdy bada się tylko małe podobjętości tomograficzne. Podejście do budowania modelu zastosowane w tym badaniu korzysta z wcześniejszej wiedzy na temat wielkoskalowego porządku wiązki aktyny, co pomaga w opracowaniu oczekiwań dotyczących orientacji włókien aktynowych i gęstości sieciowania. Być może jeszcze bardziej znaczące jest to, że ludzki mózg może łatwo znaleźć wzorce, biorąc pod uwagę szerszy kontekst poza lokalnym rozkładem gęstości, podczas gdy algorytm komputerowy działa tylko dla stosunkowo małego obszaru, który jest brany pod uwagę przez algorytm; W związku z tym nie można łatwo wziąć pod uwagę tendencji na większą skalę. Dopasowując model globalnie do warstwy gęstości, uniknęliśmy zamieszania, które może wystąpić podczas próby stworzenia modelu dla małych porcji pojedynczych filamentów aktynowych na raz. Oczywiście takie globalne dopasowanie zakłada porządek, który rozciąga się na duże odległości. Ponieważ jednak mieliśmy nieoczekiwane niewielkie, ale znaczące stopniowe wyginanie włókien aktynowych, globalne dopasowanie było tylko wstępnym przybliżeniem i wymagało lokalnych korekt modelu, aby pasowały do mapy gęstości. Ponieważ początkowy model był dobrym punktem wyjścia, korekty można było wprowadzać z dużą pewnością. Jedną z dużych zalet naszego podejścia było to, że mogliśmy wybrać wyświetlanie tylko zdefiniowanej strefy zagęszczenia, co pomogło zmniejszyć złożoność scenerii. Co więcej, oglądanie płyty gęstości mapy wzdłuż osi modelu filamentu pomogło zidentyfikować nieoczekiwaną krzywiznę, którą najprawdopodobniej przegapilibyśmy przy prostym wyświetlaniu mniejszych podobjętości. Umieszczenie początkowego modelu ułatwiło również szybkie powiększanie i pomniejszanie, aby przełączać się między ogólnym widokiem odpowiedniej warstwy filamentów aktynowych a szczegółowymi widokami w celu dokonania korekt modelu.

Kluczowe kroki w ramach protokołu obejmowały obracanie mapy po oględzinach, tworzenie i umieszczanie modelu na mapie gęstości, a także podział modelu filamentu na mniejsze segmenty. Położenie atomów segmentów można następnie dostosować przestrzennie, aby pasowało do mapy gęstości i/lub oznaczyć kolorami w celu wykrycia przerw.

To podejście do budowania modelu aktynowego można również zmodyfikować poprzez umieszczenie zestawu "atomów" (tj. kulek modelu kuli i patyczka) w gęstościach włókien za pomocą przekroju poprzecznego uśrednionej płyty o gęstości 10-30 warstw / 9,47-28,4 nm, które następnie można połączyć wiązaniami (tj. pałeczkami modelu kuli i patyczka). Zastosowaliśmy to podejście, które jest modyfikacją protokołu opisanego tutaj szczegółowo, do budowy modelu wolumetrycznego w obszarze stożkowym stereocilia komórek rzęsiastych²³. Ponadto, jak opisaliśmy tutaj, nasze podejście do budowania modeli wolumetrycznych doskonale nadaje się również do segmentacji i budowy modeli membran.

Podczas gdy budowanie modelu wolumetrycznego można zastosować do dowolnej mapy gęstości, która pokazuje cechy nitkowate, technika, którą tutaj opisaliśmy, jest najbardziej wydajna, gdy mamy tablicę regularnie rozmieszczonych włókien, dla których można uzyskać globalne dopasowanie modelu wolumetrycznego. Zależy to również od cech nitkowatych, aby stopniowo zmieniać ich kierunkowość. Jeśli w strukturach nitkowatych występują nagłe załamania i ostre zakręty, nasze podejście może nie być szczególnie pomocne w segmentacji.

W międzyczasie nasi współpracownicy opracowali zautomatyzowane podejście do automatycznego śledzenia filamentów, które jest zgodne z podobną koncepcją zastosowaną w przypadku ręcznej segmentacji^30,31. Idąc dalej, najlepszym podejściem może być hybryda polegająca na ręcznej identyfikacji i umieszczeniu początkowego rzadkiego modelu (nawet tylko kilku kulek) w gęstości jako punktu wyjścia, a następnie pozwoleniu, aby algorytm wyszukiwania i dopasowania zakończył śledzenie włókien.

Uproszczone modele wolumetryczne zmniejszają złożoność systemu i pozwalają lepiej docenić pewne wzorce, takie jak wyginanie się filamentu aktynowego w pobliżu końcówki. Ponadto model wolumetryczny może być używany jako "kotwica" do wyświetlania strefy gęstości wokół wybranego modelu kuli i kija kotwiącego, co umożliwia wykrywanie i wizualizację gęstości sieciowania między sąsiednimi włóknami aktyny. Możliwość wyboru poszczególnych włókien i ustawienia odpowiednich promieni jako strefy, w której ponownie wyświetlana jest gęstość, pozwala na zredukowanie przytłaczającej złożoności scenerii do możliwego do opanowania poziomu.

Jedną z zalet tego podejścia do budowania modelu wolumetrycznego polegającego na globalnym dopasowaniu, po którym nastąpiły lokalne korekty, było to, że byliśmy w stanie zidentyfikować obszary, w których filamenty aktynowe wydawały się być przerwane, a znaczne luki we włóknach aktynowych były wskazywane przez brak gęstości mapy. Ponieważ umieściliśmy wolumetryczny model kuli i patyka, mogliśmy skorzystać z procedury w pakiecie oprogramowania UCSF Chimera, która koduje kolorami każdą pozycję piłki modelu zgodnie z wartością gęstości mapy w tym miejscu. Podejście to pozwoliło na szybkie wykrycie i wizualizację przerw w filamentach aktynowych w wiązce aktyny, co jest biologicznie istotną cechą, którą znaleźliśmy w naszym tomogramach krioelektronowym, a która byłaby bardzo trudna do wykrycia i wizualizacji przy użyciu tradycyjnych podejść do segmentacji. Kolejną zaletą naszego modelu wolumetrycznego jest to, że można łatwo uzyskać właściwości wolumetryczne, w tym długości i odległości, co pozwala na przeprowadzenie rzeczywistych liczb, a tym samym analizy statystycznej.

Podsumowując, interaktywne ręczne umieszczanie punktów w modelu, być może dodatkowo wzbogacone o późniejsze zautomatyzowane możliwości lokalnego dopasowania i śledzenia włókien, jest dość obiecującym podejściem do wizualizacji i analizy ilościowej objętości subkomórkowych tomografii elektronowej. Dzieje się tak, ponieważ wykorzystuje moc ludzkiego mózgu do rozpoznawania wzorców i moc informatyki do optymalizacji modeli.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chimera	RBVI		Wersja 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html
Chimera	RBVI		Wersja 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/cgi-bin/secure/chimera-get.py?file=win64/chimera-1.16-win64.exe
Chimera	RBVI		Wersja 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/cgi-bin/secure/chimera-get.py?file=mac64/chimera-1.16-mac64.dmg
Chimera	RBVI		Wersja 1.16 https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/cgi-bin/secure/chimera-get.py?file=linux_x86_64/chimera-1.16-linux_x86_64.bin
Excel			Microsoft Wersja 2211 https://www.office.com/?auth=1
Falcon II	Thermofisher		https://www.thermofisher.com/de/de/home/electron-microscopy/products/accessories-em/falcon-detector.html
IMOD	University of Colorado		Wersja 4.11.1 https://bio3d.colorado.edu/imod/download.html
PC Komputer stacjonarny	Intel		Windows 10, wersja 22H2
PC Laptop	Gigabyte		Windows 10, wersja 22H2
Powerpoint	Wersja Microsoft		2211 https://www.office.com/?auth=1
Mikroskop elektronowy Titan Krios	Thermofisher		https://www.thermofisher.com/de/de/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html
Word	Microsoft		2211 https://www.office.com/?auth=1