Monitorowanie docelowych reakcji sygnalizacyjnych u larw danio pręgowanego - Z-REX demaskuje precyzyjne mechanizmy działania leków elektrofilowych i metabolitów

Podsumowanie

Danio pręgowany celujący w reaktywne elektrofile i utleniacze (Z-REX) to oparta na biologii chemicznej metoda badania reaktywnej sygnalizacji małocząsteczkowej. Technikę tę można zastosować do żywych ryb na różnych etapach rozwoju. Tutaj łączymy standardowe testy u danio pręgowanego z Z-REX do analizy szlaku sygnałowego.

Streszczenie

Reaktywne metabolity i związane z nimi leki elektrofilowe należą do najtrudniejszych małych cząsteczek do zbadania. Konwencjonalne podejścia do dekonstrukcji sposobu działania (MOA) takich cząsteczek wykorzystują masowe traktowanie próbek eksperymentalnych nadmiarem określonych reaktywnych gatunków. W tym podejściu wysoka reaktywność elektrofilów sprawia, że znakowanie proteomu jest niedyskryminacyjne w sposób zależny od czasu i kontekstu; Białka i procesy wrażliwe na redoks mogą być również pośrednio i często nieodwracalnie dotknięte. Na takim tle niezliczonych potencjalnych celów i pośrednich efektów ubocznych, powiązanie fenotypu z konkretnym zaangażowaniem celu pozostaje złożonym zadaniem. Danio pręgowany ukierunkowany na reaktywne elektrofile i utleniacze (Z-REX) - platforma dostarczania reaktywno-elektrofilowej na żądanie, dostosowana do stosowania u larw danio pręgowanego - została zaprojektowana do dostarczania elektrofilów do określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) w niezakłóconych żywych zarodkach ryb. Kluczowe cechy tej techniki obejmują niski poziom inwazyjności, a także precyzyjne dostarczanie elektrofilu kontrolowane dawkowaniem, chemotypem i czasowo-przestrzennie. Tak więc, w połączeniu z unikalnym zestawem kontroli, technika ta pozwala uniknąć efektów niedocelowych i toksyczności ogólnoustrojowej, które w przeciwnym razie obserwuje się po niekontrolowanym masowym narażeniu zwierząt na reaktywne elektrofile i plejotropowe leki elektrofilowe. Wykorzystując Z-REX, naukowcy mogą ustanowić punkt zaczepienia w zrozumieniu, w jaki sposób indywidualne reakcje na stres i wyjścia sygnałowe są zmieniane w wyniku specyficznego reaktywnego zaangażowania ligandów w określone POI, w warunkach zbliżonych do fizjologicznych u nienaruszonych żywych zwierząt.

Wprowadzenie

Niezliczone zdarzenia sygnalizacji komórkowej obejmują reakcje między małymi cząsteczkami reaktywnymi (endogennie wytwarzanymi w komórce lub ksenobiotykami/ksenometabolitami, takimi jak leki) a ich celem białkowym. W wielu przypadkach substechiometryczny poziom takich zdarzeń wiązania kowalencyjnego może wywołać odpowiedzi komórkowe, prowadząc do zmian, na przykład, w rozwoju, metabolizmie, apoptozie i/lub odpowiedzi immunologicznej¹. Jednak dekonstrukcja sposobu działania (MOA) poprzez powiązanie konkretnych zdarzeń wiązania z ich fenotypowymi konsekwencjami okazała się wyzwaniem. Tradycyjne metody dawkowania w bolusie, które polegają na wprowadzeniu wysokich stężeń reaktywnych gatunków, często skutkują modyfikacją wielu białek, a także nadmierną toksycznością dla organizmu modelowego². Takie warunki są dalekie od ideału. Opracowano metodę rozwiązywania tych problemów w hodowli komórkowej przy użyciu precyzyjnego miejscowego dostarczania elektrofilu w natywnym kontekście komórkowym, o nazwie T-REX (targetable reactive electrophiles and oxidants)³. W kolejnych latach skupiono się na eksperymentach na całych organizmach, co daje możliwość badania białek w określonych kontekstach komórkowych w komórkach nieprzekształconych. W związku z tym rozszerzyliśmy technikę, aby była kompatybilna z kilkoma modelami, w tym z modelami zarodków Danio rerio. W niniejszym artykule przedstawiamy Z-REX (danio pręgowany celujący w reaktywne elektrofile i utleniacze) (Rysunek 1).

Aby zrozumieć Z-REX, ten artykuł najpierw przedstawia technologie REX i ich podstawowe koncepcje. Zasadniczo techniki te modelują endogenną fizjologiczną reaktywną sygnalizację form elektrofilowych (RES), naśladując sposób, w jaki naturalne elektrofile są wytwarzane lokalnie in vivo z precyzją czasoprzestrzenną. Białko będące przedmiotem zainteresowania (POI) jest wyrażane jako konstrukt fuzyjny do Halo; ten ostatni zakotwicza przepuszczalną tkankowo i obojętną sondę zawierającą fotoklatowany RES w stechiometrii 1:1. Jednym z takich endogennych RES jest 4-hydroksynonenal (HNE), który jest fotoklatowany w sondzie Ht-PreHNE. W wielu przypadkach używamy funkcjonalizowanej alkinami wersji HNE [tj. HNE(alkin)], która ma zasadniczo identyczne właściwości biologiczne jak HNE, ale może być oznaczona za pomocą chemii kliknięć. Sonda, która jest również funkcjonalizowana chloroalkanem w celu reaktywności z Halo, jest określana jako Ht-PreHNE (alkin). Kompleks fuzji Halo-POI i powstała w ten sposób sonda umożliwiają proksymalne dostarczanie OZE do stopionego punktu POI po naświetlaniu światłem UV. Jeśli POI reaguje szybko z uwolnionym RES, wynikowe kowalencyjne oznakowanie POI za pomocą OZE pozwala nam zidentyfikować kinetycznie uprzywilejowane cysteiny.

Z-REX wykorzystuje wyżej wymienione zalety technologii REX i stosuje je szeroko do badania specyficznych ścieżek sygnałowych u żywych ryb. Protokół ten został zoptymalizowany dla danio pręgowanego (D. rerio), ponieważ są to genetycznie podatne na kręgowce organizmy, które są przezroczyste podczas rozwoju, a zatem idealne dla technik optochemicznych/genetycznych, takich jak technologie REX. Niemniej jednak podobna strategia prawdopodobnie sprawdzi się również w przypadku innych genetycznie podatnych gatunków ryb, ponieważ szerokie zastosowanie metody wynika z pseudowewnątrzcząsteczkowego mechanizmu dostarczania elektrofilu pochodzenia lipidowego (LDE). Rzeczywiście, procedura jest wysoce biokompatybilna, ponieważ ryby mogą być leczone elektrofilem fotoklatkowym Z-REX [np. Ht-PreHNE (alkinem)] przez co najmniej 48 godzin bez zauważalnego wpływu na rozwój. Podobny protokół funkcjonuje w C. elegans^4,5.

Protokół najpierw opisuje użycie iniekcji mRNA do wytworzenia przejściowej ekspresji nienatywnego konstruktu fuzji Halo-POI w embrionalnych modelach danio pręgowanego, 1-1,5 dnia po zapłodnieniu (dpf). Powoduje to ekspresję białka ektopowego w większości komórek ryb (zwanego dalej "wszechobecnym"), a nie w określonych tkankach lub lokalizacjach; Jednak dane pokazują, że w niektórych przypadkach można zaobserwować efekty specyficzne dla komórek. Po wstrzyknięciu zarodki są inkubowane z niskim stężeniem [0,3-5 μM Ht-PreHNE(alkin)] sondy do 30,5 godziny po zapłodnieniu (hpf). Następnie, w czasie określonym przez użytkownika, dostarczanie RES do punktu POI w rybach odbywa się poprzez fotoklatkę przez 2-5 minut. Po fotoklatowaniu RES, w ciągu najbliższych 2-10 godzin można przeprowadzić różne dalsze testy fenotypowe: 1) obrazowanie na żywo linii reporterowych (Rysunek 2A); 2) ocena oznaczania celów za pomocą analizy western blot (Rysunek 3); 3) analiza transkryptomiczna (Rysunek 4); lub 4) immunofluorescencja całej góry (Rysunek 5).

Jako przykład obrazowania na żywo linii reporterowych, Z-REX jest demonstrowany w połączeniu z obrazowaniem na żywo linii ryb, Tg(lyz:TagRFP) i Tg(mpeg1:eGFP), aby zmierzyć, jak modyfikacja RES konkretnego punktu POI czujnika elektrofilowego (mianowicie Keap1) obniża poziomy odpowiednio neutrofili i makrofagów, bez zauważalnego wpływu na inne komórki ryby. Jednak wykazaliśmy wcześniej, że znakowanie POI i wynikający z niego szlak sygnalizacji z badań T-REX można odtworzyć za pomocą Z-REX dla kilku białek: Akt3⁶, Keap1⁷ i Ube2v2⁶. Ogólnie rzecz biorąc, dzięki Z-REX naukowcy mogą badać konsekwencje kowalencyjnej modyfikacji punktów POI przez OZE w kontekście kilku złożonych szlaków redoks. Technika ta ma na celu wskazanie celów i ich funkcjonalnych pozostałości w celu zaprojektowania leku kowalencyjnego i nowych mechanizmów działania leku w bardziej kontekstowym modelu całego zwierzęcia.

Protokół

Procedury hodowli i obchodzenia się z danio pręgowanym na Uniwersytecie Cornell (Stany Zjednoczone) zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Procedury hodowli i obchodzenia się z danio pręgowanym w jednostce Szwajcarskiego Federalnego Instytutu Technologii w Lozannie (EPFL, Szwajcaria) przeprowadzono zgodnie z ustawą o dobrostanie zwierząt SR 455 i rozporządzeniem w sprawie dobrostanu zwierząt SR 455.1, z kantonalnym zezwoleniem weterynaryjnym VD-H23.

UWAGA: W tym protokole, linie ryb Tg(lyz:TagRFP) i Tg(mpeg1:EGFP) wyrażające Halo-TeV-Keap1 są używane do demonstracji Z-REX. Metodę można rozszerzyć na inne interesujące białka, transgeniczne linie ryb reporterowych i dalsze testy biologiczne. Patrz Tabela Uzupełniająca 1, aby zapoznać się z zastosowanymi w tym badaniu. Wszystkie odczynniki, instrumenty, sprzęt, przeciwciała, plazmidy, szczepy danio pręgowanego i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie mRNA

1. Przygotuj mRNA Halo-TeV-Keap1-2xHA i Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro mMessage mMachine SP6.
   UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta i wykonaj reakcje w skali 40 μl dla każdego mRNA. Ponownie rozpuść osad mRNA w 10 μl wody wolnej od nukleaz.
2. Oceń jakość mRNA i zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i elektroforezy w żelu agarozowym. MRNA dobrej jakości powinno mieć stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ około lub powyżej 2,0.
3. Rozcieńczyć mRNA do 1-1,5 mg/ml wodą wolną od nukleaz.
4. Podwielokrotność roztworu mRNA (1-2 μl na probówkę) i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.

2. Produkcja zarodków ryb

1. Opcja 1: Produkcja zarodków ryb typu dzikiego (WT).
   1. Ustaw 10 par krzyżujących ryby w 10 oddzielnych zbiornikach, z których każdy zawiera przegrodę między samcem i samicą ryby rodzicielskiej.
      UWAGA: Łącznie 10 par krzyżowych zazwyczaj zapewnia wystarczającą liczbę zarodków do testów. Liczba krzyżujących się par może być dostosowana do projektu/potrzeby eksperymentu i płodności ryb rodzicielskich.
   2. Następnego dnia rano, po ustawieniu wtryskiwacza, usuń przegrody w pięciu zbiornikach. Poczekaj 30 minut, aż ryba połączy się w pary.
   3. Przenieś rybę rodzicielską do innego zbiornika, zbierz zarodki, przepuszczając wodę ze zbiornika przez sitko, a następnie wypłucz zarodki z sitka na 10-centymetrową szalkę Petriego. Zarodki te zostaną wykorzystane do pierwszej rundy wstrzyknięć.
      UWAGA: Jeśli jakość jaj z określonej partii jest niska (np. jaja są nieprzezroczyste z powodu agregacji białek), nie należy łączyć ich z innymi zarodkami.
   4. (Opcjonalnie) Wykonaj podobne procedury, jak opisano w krokach 2.1.2-2.1.3 na pozostałych pięciu zbiornikach do następnej rundy wstrzykiwania.
      UWAGA: Najlepiej jest wykonać tylko jedną serię wstrzyknięć, aby zminimalizować różnicę wieku między zarodkami. Jeśli jednak wymagana jest większa liczba zarodków, niż można wstrzyknąć w jednej partii, zaleca się wykonanie dwóch serii wstrzyknięć, aby zapewnić, że zarodki pozostaną w stadium 1-4 komórek podczas wstrzykiwania mRNA. Liczba rund wtryskowych może być dostosowana do umiejętności wtryskiwania operatora i projektu eksperymentu. Sugeruje się jednak, aby cały zabieg (od usunięcia pierwszego dzielnika do wstrzyknięcia ostatniego zarodka) wykonać w ciągu 2 godzin. Duża różnica wieku między zarodkami może pogorszyć wiarygodność i odtwarzalność wyników eksperymentu.
2. Opcja 2: Produkcja heterozygotycznych transgenicznych zarodków ryb reporterowych neutrofili/makrofagów.
   1. Ustaw 10 par krzyżujących się ryb w 10 oddzielnych zbiornikach, z których każdy jest wyposażony w przegrodę między samcem i samicą ryby rodzicielskiej: ryba WT kontra Tg(lyz:TagRFP) lub ryba WT kontra Tg(mpeg1:eGFP).
      UWAGA: Unikaj krzyżówek między heterozygotycznymi rybami transgenicznymi, które mogą wpływać na dalsze odczyty fluorescencyjne, ponieważ homozygotyczne ryby reporterowe wykazują wyższy sygnał fluorescencyjny w porównaniu z rybami heterozygotycznymi. Transgeniczne linie reporterowe i zarodki WT można łatwo odróżnić podczas obrazowania. Posiadanie mieszanki zarodków WT i heterozygotycznych w tej samej puli nie stanowi problemu. lyz:TagRFP informuje o neutrofilach, a mpeg:eGFP o makrofagach. Protokół ten może być również stosowany do innych linii reporterowych.
   2. Wykonaj kroki 2.1.2-2.1.4.

3. Konfiguracja mikrowtryskiwacza

1. Włącz źródło powietrza, ustaw ciśnienie wsteczne na 0,2-0,5 psi i ustaw ciśnienie wtrysku na 25-30 psi. Zazwyczaj zalecany jest konkretny zakres ciśnienia.
   UWAGA: Niezbędne jest stabilne ciśnienie wsteczne, aby zapobiec cofaniu się pożywki rybnej do igły. Podczas kalibracji objętości wtrysku w kroku 3.8 należy zmienić tylko czas wstrzykiwania. Nie zmieniaj ciśnienia wtrysku w następujących krokach; Niskie ciśnienie iniekcji może prowadzić do niepowodzenia iniekcji z powodu napięcia powierzchniowego i międzyfazowego, podczas gdy wysokie ciśnienie iniekcji może uszkodzić zarodki.
2. Oczyść sprzęt i platformę iniekcyjną roztworem do odkażania RNazy.
   UWAGA: RNaza, która degraduje mRNA, może pochodzić od operatora lub sprzętu. Konieczne jest wykonanie sprzątania przed eksperymentem i założenie rękawiczek.
3. (Opcjonalnie) W przypadku jednoczesnego wstrzykiwania mRNA i morfolino, należy je wstępnie wymieszać w probówce o pojemności 0,2 ml.
   UWAGA: Z-REX działa dobrze przy użyciu roztworu mRNA Halo-TeV-Keap1-2xHA o stężeniu 250-1500 ng/μL. U danio pręgowanego zastosowano również kilka morfolin, a optymalne stężenia zostały zgłoszone⁷. W przypadku stosowania morfolino z niepublikowaną sekwencją, operator powinien najpierw ocenić toksyczność i skuteczność knockdownu genu morpholino przed użyciem go w Z-REX.
4. Przenieś 1-2 μl mRNA (i/lub morfolinu, jeśli dotyczy⁷) do igły iniekcyjnej za pomocą końcówki do pipety z mikroładowarką.
   UWAGA: W przypadku przygotowywania igieł za pomocą ściągacza do mikropipet Flaming/Brown konfiguracja jest następująca. Ciepło: 520 jednostek; siła ciągnięcia: 60 jednostek; prędkość: 70 jednostek; opóźnienie: 155 jednostek; ciśnienie: 550 jednostek; rampa: 530 jednostek.
5. Zamontować igłę na manipulatorze do mikroiniekcji.
   UWAGA: Przeciwciśnienie ze źródła powietrza powinno wypchnąć roztwór mRNA (/ morpholino) do końcówki igły.
6. Za pomocą ostrych kleszczyków lub żyletki złamać końcówkę igły, tworząc odpowiedni otwór do wstrzyknięcia.
7. Zanurz końcówkę igły w oleju mineralnym na mikrometrze stolika.
8. Zastosuj dwa lub trzy impulsy iniekcyjne, aby usunąć pęcherzyki powietrza z końcówki.
9. Skalibruj wielkość kropli do 2 nL, zmieniając czas wstrzykiwania.
   UWAGA: Najlepiej wykonać to poprzez wstrzyknięcie do oleju mineralnego (który naśladuje lepkość woreczka żółtkowego) umieszczonego na hemocytometrze. Używając mikroskopu, użyj linii siatki hemocytometru, aby oszacować wielkość kropli powstałej podczas wstrzyknięcia i odpowiednio dostosować czas wstrzyknięcia. Chociaż czasami stosuje się barwnik czerwieni fenolowej, nie zaobserwowano potrzeby jego stosowania w opisanej tutaj procedurze wstrzykiwania mRNA.

4. Mikroiniekcja

1. Napełnij płytkę iniekcyjną świeżą 10% pożywką ze zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS) i wyrównaj zarodki w rowkach płytki za pomocą kleszczyków.
   UWAGA: Płytkę iniekcyjną przygotowuje się z 2% agarozy w 10% pożywce HBSS; Rowki są formowane za pomocą plastikowej formy.
2. Zanurzyć końcówkę igły w 10% podłożu HBSS w płytce iniekcyjnej.
3. Zastosuj dwa lub trzy impulsy iniekcyjne, aby usunąć pęcherzyki powietrza z końcówki.
4. Przy każdym wstrzyknięciu należy jednym ruchem wniknąć w kosmówkę i woreczek żółtkowy i zastosować impuls iniekcji. Ten wstrzyknięty płyn można zobaczyć zaraz po wstrzyknięciu jako małą sferoidę w woreczku żółtkowym. Ta mała sferoida rozprasza się stosunkowo szybko. Czynność tę należy powtarzać w odniesieniu do pozostałych zarodków, aż do uzyskania wystarczającej liczby wstrzykniętych zarodków.
   UWAGA: Wskaźnik przeżywalności zarodków (zarówno wstrzykniętych, jak i niewstrzykniętych) zwykle waha się od 50% do 90%. Dążyć do wstrzyknięcia podwójnej liczby zarodków potrzebnej dla każdej grupy kontrolnej/eksperymentalnej. W teście ściągania biotyny dla każdego stanu potrzeba 100-140 zdolnych do życia zarodków. W teście qRT-PCR dla każdego schorzenia zaleca się pięć zdolnych do życia zarodków. Wielkość próbki do obrazowania żywych ryb i testu barwienia immunofluorescencyjnego w całości jest zdefiniowana przez użytkownika; Zaleca się posiadanie co najmniej 20 zdolnych do życia zarodków na jeden warunek, aby uzyskać dobrą moc statystyczną w analizie.
5. Wypłukać wstrzyknięte zarodki na nową, 10 cm szalkę Petriego zawierającą świeżą pożywkę 10% HBSS.
   UWAGA: Zarodki można łatwo wypłukać z rowków za pomocą butelki ze spryskiwaczem.
6. Zebrać niewstrzyknięte zarodki na innej płytce.
   UWAGA: Zarodki, którym nie wstrzyknięto zarodków, mogą służyć do kontroli jakości zdrowia ryb, wyjściowej ekspresji białka, poziomu fluorescencji tła itp., w zależności od potrzeb. Jeśli procedura iniekcji zadziałała prawidłowo, a wstrzyknięte mRNA/morfolino nie jest śmiertelne dla zarodków, zarodki wstrzyknięte i niewstrzyknięte powinny mieć podobną żywotność.

5. Z-REX

1. Rozmieść wstrzyknięte zarodki na 10-centymetrowe szalki, zgodnie z konfiguracją eksperymentu (tj. liczbą grup kontrolnych/eksperymentalnych).
2. W ciemnym pomieszczeniu z oświetleniem światłem czerwonym zastąp pożywkę 30 ml 10% HBSS z 1 μM Ht-PreHNE(alkinem) lub bez niego.
   UWAGA: Ht-PreHNE (alkin) jest związkiem lekko labilnym. Zarodki należy przechowywać w ciemności w następujących krokach.
3. Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C w ciemności.
4. Przy 30,5 hpf, w ciemnym pomieszczeniu, zastąp podłoże świeżym 30 ml 10% HBSS.
   UWAGA: Podczas wymiany nośnika należy usunąć jak najwięcej starego nośnika. Ma to kluczowe znaczenie dla usunięcia niezwiązanej/nadmiernej ilości Ht-PreHNE (alkinu) z zarodków.
5. Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C w ciemności przez 30 minut.
6. Powtórz kroki 5.4-5.5 jeszcze dwa razy.
7. Włącz lampę UV (365 nm, 3 mW/cm²) na 5 minut, aby wstępnie ogrzać lampę.
   UWAGA: Lamp etap wstępnego podgrzewania należy wykonać przed krokiem 5.8. Moc lampy jest niższa/niestabilna w ciągu pierwszych kilku minut po włączeniu. Moc lampy powinna być regularnie mierzona za pomocą miernika UV.
8. Przy 32 hpf wystaw zarodki na działanie światła UV.
   1. Opcja 1: W przypadku dalszych odczytów, takich jak obrazowanie żywych ryb, barwienie immunofluorescencyjne w całości, analiza fluorescencji w żelu (sprzężenie na klik z azydkiem Cy5), sekwencja RNA lub qRT-PCR, należy wystawić zarodki na działanie światła UV przez 3 minuty, obracając płytki co 30 sekund.
   2. Opcja 2: W przypadku dalszych odczytów, takich jak test pobierania biotyny, należy wystawić zarodki na działanie światła UV przez maksymalnie 5 minut (i minimum 3 minuty), obracając płytki co 30 s, i schładzać płytki na lodzie przez 1 minutę
      UWAGA: W przypadku korzystania z różnych sond czas ekspozycji na światło musi być zoptymalizowany, w zależności od t_1/2 fotoklatki dla danej fotoklatowanej sondy elektrofilowej i zastosowanego źródła światła. T_1/2^{Photounclaging} można określić za pomocą znanych procedur8. Dla Ht-PreHNE(alkinu) t_1/2 wynosi < 1 min³; W związku z tym wskazany powyżej czas jest wystarczający.

6. Dalsze testy

1. Opcja 1: Test fenotypowy. Obrazowanie na żywo transgenicznych neutrofili/makrofagów reporter
   linie rybne, Tg(lyz:TagRFP) i Tg(mpeg1:eGFP) (Rysunek 2)
   1. Znieczulać zarodki przez inkubację w temperaturze 4 °C przez 10 min.
      UWAGA: Zaleca się posiadanie co najmniej 20 zdolnych do życia zarodków na jeden stan.
   2. Usunąć niezapłodnione/martwe zarodki z płytki.
      UWAGA: Niezapłodnione/martwe zarodki są mętne/nieprzezroczyste i można je zidentyfikować wizualnie. Jeśli obserwuje się wysoką śmiertelność, wróć do procedury wstrzykiwania lub spróbuj zmniejszyć stężenie mRNA lub morfolino.
   3. Odkorówkować zarodki ostrymi kleszczami. Przytrzymaj kosmówkę jedną parą kleszczy, nie dotykając larwy ryby, a drugą parą kleszczy użyj do oderwania kosmówki. Zarodek jest delikatny. Dotykaj kosmówki tylko podczas wykonywania dechorionacji.
      UWAGA: Często zdarza się, zwłaszcza u początkujących, że niektóre zarodki uszkadzają się podczas dechorionacji. Dlatego zawsze miej więcej zarodków niż potrzebne minimum.
   4. Umieść zarodki na 2% agarozowej płytce (przygotowanej z 10% pożywką HBSS) i zobrazuj zarodki za pomocą stereomikroskopu (jasne pole i odpowiednie kanały fluorescencyjne) (Rysunek 2A, C, G).
      UWAGA: Po Z-REX [połączenie wstrzyknięcia mRNA Halo-TeV-Keap1-2xHA i leczenia Ht-PreHNE(alkinem)] stwierdzono, że zubożenie neutrofili (lyz:TagRFP) jest najbardziej znaczące przy 36 hpf (4 h po Z-REX), podczas gdy redukcja makrofagów (mpeg1:eGFP) była najbardziej znacząca przy 34 hpf (2 h po Z-REX) (Figura 2E,F). Inne punkty czasowe mogą być używane w przypadku korzystania z różnych linii reporterowych, mRNA/morpholino lub sond. Czas naświetlania i/lub wzmocnienie muszą być zoptymalizowane pod kątem wizualizacji pojedynczych komórek lub określonych (ultra)struktur pożądanych.
   5. Policz liczbę neutrofili/makrofagów każdej ryby za pomocą ImageJ (NIH) (Rysunek 2B, D-F, H). Użyj narzędzia Zaznaczanie odręczne w ImageJ, aby zakreślić całą rybę, i użyj opcji Znajdź maksima, aby policzyć komórki fluorescencyjne.
2. Opcja 2: Ocena etykietowania celów. Połączenie azydek-klik biotyny i test ściągania biotyny (Rysunek 3)
   1. Znieczulić zarodki przez inkubację w temperaturze 4 °C. Zwykle trwa to 10 min.
      UWAGA: Aby uzyskać wystarczającą ilość lizatu ryb, dla każdego stanu potrzeba 100-140 zdolnych do życia zarodków.
   2. Usuń niezapłodnione/martwe zarodki z płytki.
   3. Wykonaj dechorionację i deyolking. Wykonaj dwie manipulacje, przytrzymując kosmówkę parą ostrych kleszczy, używając drugiej pary kleszczy do penetracji woreczka żółtkowego, a następnie oddzielając woreczek żółtkowy, usuwając kosmówkę, aby umożliwić wydostanie się białek żółtka.
      UWAGA: Na tym etapie bardzo ważne jest usunięcie białek żółtka. Obfite białka żółtka w próbce zakłócają późniejszą analizę.
   4. Przenieść pozbawione żółtka zarodki do probówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Zakręć płytką, aby wyśrodkować otoczkowe zarodki, co ułatwia zbieranie. Lżejsze odłamki kosmówki odsiewają się podczas tego procesu.
   5. Po tym, jak zarodki osiądą na dnie probówki, usuń supernatant i dodaj 1 ml schłodzonego roztworu soli fizjologicznej buforowanej przez HEPS (pH 7,6).
   6. Powtórz krok 6.2.5 jeszcze dwa razy.
   7. (Opcjonalnie) Jeśli nie zamierzasz natychmiast przejść do następnego etapu, usuń bufor, błyskawicznie zamroź próbki w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Granulki rybne z żółtkiem mogą być zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C. Próbki mrożone w temperaturze -80 °C można przechowywać do 2 tygodni.
   8. Zawiesić granulki rybne w buforze do lizy.
      UWAGA: Bufor do lizy (pH 7,6) składa się z 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,3 mM TCEP, 2x Roche cOmplete Mini inhibitory proteazy wolne od EDTA i 0,1 mg / ml inhibitora trypsyny z soi. Jeden zarodek daje około 2 μg lizatu. Na każde 120 zarodków należy użyć 100 μl buforu do lizy. Dwa inhibitory proteazy Roche cOmplete Mini wolne od EDTA i inhibitory trypsyny z soi należy dodać do buforu do lizy tuż przed użyciem.
   9. Dodaj 20% v/v kulek cyrkonu do tuby.
   10. Wirować przez 20 s, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
   11. Powtórz krok 6.2.10 jeszcze dwa razy.
   12. Odwirować roztwór o sile 21 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
   13. Przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml.
   14. Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda.
   15. Rozcieńczyć lizat do 1 mg/ml.
   16. Dla każdego warunku przenieś 170 μg lizatu do probówki o pojemności 2 ml.
   17. Zmieszać lizat z kroku 6.2.16 z proteazą TeV (S219V) o stężeniu 0,2 mg/ml i inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez 30 min.
       UWAGA: W przypadku grup nietraktowanych proteazą TeV, po prostu wymieszaj lizat z równą objętością buforu do lizy do roztworu proteazy TeV stosowanego w innych grupach.
   18. Przygotuj 10x mieszankę główną do reakcji klikania biotyny-azydku: 10% w/v SDS, 10 mM CuSO₄, 1 mM Cu(TBTA), 1 mM biotynowo-azydkowe i 20 mM TCEP.
       UWAGA: Dodaj TCEP do mieszanki tuż przed krokiem 6.2.19.
   19. Dodać 8,5 μl t-BuOH i 17 μl 10-krotnej mieszanki wzorcowej reakcji kliknięcia do lizatu (trawionego proteazą TeV) z kroku 6.2.17. Odwirować, odwirować i inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
   20. Dodać kolejny 1 mM TCEP do roztworu, a następnie wirować, odwirować i inkubować roztwór w temperaturze 37 °C przez kolejne 15 minut. Czas inkubacji dla etapów 6.2.19-6.2.20 wynosi łącznie 30 minut.
       UWAGA: Ten suplement TCEP, odczynnika redukującego do wytwarzania Cu(I), poprawia wydajność reakcji kliknięcia.
   21. Dodać 600 μl etanolu o temperaturze -20 °C do każdej probówki, zwirować roztwór i inkubować go w temperaturze -80 °C przez noc.
       UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez 1 tydzień; Jeśli nie, natychmiast przejdź do następnego kroku.
   22. Odwirować roztwór przy 21 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 h.
       UWAGA: Po odwirowaniu na dnie probówki powinien powstać granulek, który jest pożądaną frakcją.
   23. Usunąć supernatant, dodać 1 ml etanolu o temperaturze -20 °C, odwirować i odwirować roztwór o sile 21 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
   24. Powtórz krok 6.2.23.
   25. Usunąć sklarowany osad, dodać 1 ml acetonu o temperaturze -20 °C, odwirować i odwirować roztwór o temperaturze 21 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
   26. Usunąć supernatant. Pozwól, aby nadmiar pozostałego acetonu odparował, ale nie całkowicie do wyschnięcia.
   27. Zawiesić osad w 100 μl buforu do respensji (8% w/v dodecylosiarcanu litu [LDS], 1 mM EDTA w 50 mM soli fizjologicznej HEPES, pH 7,6), wirować przez 15 s i sonikować, aż osad się rozpuści.
   28. Odwirować roztwór o stężeniu 21 000 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
   29. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 2 ml i dodać 1,5 ml 50 ml soli fizjologicznej HEPES o pH 7,6,
       UWAGA: Końcowe stężenie LDS na tym etapie wynosi 0,5%. Wyższe stężenia LSR mogą osłabić skuteczność ściągania. Tak więc, chociaż zwiększenie stężenia LDS może pomóc w redukcji niespecyficznego wiązania, może również zmniejszyć skuteczność ściągania. W związku z tym zaleca się, aby na tym etapie nie zmieniać stężenia LDS.
   30. Zbierz próbkę "wejściową" (Rysunek 3): przenieś 30 μl lizatu 1 mg / ml do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 10 μl 4x buforu próbki Laemmli zawierającego 6% β-merkaptoetanolu (BME). Błyskawicznie zamrozić roztwór i przechowywać go w temperaturze -80 °C.
   31. Przenieś 100 μl żywicy streptawidyny o dużej pojemności do nowej probówki o pojemności 2 ml. Dodać 1 ml 0,5% LDS w 50 mM soli fizjologicznej HEPES (pH 7,6), odwirować przy 1,500 x g przy RT przez 2 minuty i usunąć supernatant. Powtórz pranie z kolejnym 1 ml 0,5% LDS w 50 mM soli fizjologicznej HEPES (pH 7,6).
   32. Przenieść roztwór z kroku 6.2.29 do probówki zawierającej wstępnie umytą żywicę o dużej pojemności streptawidyny z kroku 6.2.31 i inkubować roztwór na mieszalniku typu end-over-end w temperaturze pokojowej przez 4-6 godzin.
   33. Odwirować mieszaninę przy 1 500 x g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty, pobrać 30 μl supernatantu i zmieszać go z 10 μl 4 x Laemmli buforu do próbek zawierających 6% BME dla próbki "przepływowej". Następnie usuń pozostały supernatant.
       UWAGA: Próbki "przepływowe" mogą być analizowane za pomocą western blot w celu sprawdzenia skuteczności ściągania streptawidyny. Konieczne jest usunięcie jak największej ilości supernatantu, aby wypłukać niezwiązane białka. Najpierw usuń większość supernatantu za pomocą pipety P-1000, a następnie usuń pozostały supernatant za pomocą pipety P-20 z końcówką ładującą żel.
   34. Dodaj 1 ml 0,5% LDS w 50 mM soli fizjologicznej HEPES (pH 7,6) do żywicy i inkubuj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej z rotacją od końca do końca.
   35. Odwirować mieszaninę przy 1 500 x g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty i usunąć supernatant.
       UWAGA: Zazwyczaj 0,5% LDS wystarcza do usunięcia większości niespecyficznych białek wiążących. Jeśli w późniejszej analizie nadal widoczne są niespecyficzne sygnały wiązania, stężenie LDS w buforze płuczącym może zostać zwiększone.
   36. Powtórz kroki 6.2.34-6.2.35 jeszcze dwa razy.
   37. Do żywicy dodać 40 μl 2x buforu do próbek Laemmli zawierającego 6% BME.
   38. Eluować związane białka przez inkubację mieszaniny w temperaturze 98 °C przez 5 minut.
   39. Odwirować mieszaninę przy 21 000 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut i przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. To jest próbka "elucji".
       UWAGA: Bezpośrednie ładowanie roztworu zawierającego żywicę z kroku 6.2.38 do żelu może mieć wpływ na analizę SDS-PAGE.
   40. Załaduj 20 μl do każdej studzienki 10-pasmowego 10% żelu poliakryloamidowego i uruchom elektroforezę żelową.
       UWAGA: Uruchom żel przy niższym napięciu (120 V), aż czoło barwnika dotrze do żelu rozdzielczego i zmień napięcie na 170 V. Zatrzymaj program po wyjściu czoła barwnika.
   41. Wykonaj western blotting z przeciwciałami anty-HA, anty-Halo lub innymi przeciwciałami wykrywającymi białka porządkowe (Ryc. 3).
3. Opcja 3: Analiza transkryptomiczna. Sekwencja RNA i qRT-PCR (Rysunek 4)
   UWAGA: Zdecydowanie zaleca się użycie do tego testu zarodków złożonych w odstępie 15 minut. Różnica wieku zarodków ma istotny wpływ na wyniki testów.
   1. Znieczulić zarodki, inkubując je w temperaturze 4 °C przez 10 minut, 2 godziny po Z-REX.
   2. Wykonaj dechorionację za pomocą ostrych kleszczy (krok 6.1.3).
   3. (Opcjonalnie) Wykonaj segmentację za pomocą kleszczyków (np. oddziel głowę od ogona), jeśli różne segmenty mają być analizowane osobno.
   4. W przypadku ekstrakcji RNA z całego zarodka przenieś od trzech do pięciu zarodków do probówki o pojemności 1,5 ml. W przypadku ekstrakcji RNA z głowy lub ogona przenieś 10-12 wypreparowanych segmentów do probówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie eksperymentu z trzema do pięciu powtórzeń biologicznych.
   5. Dodaj 1 ml odczynnika TRIzol i szklane kulki do probówki.
      UWAGA: Stwierdzono, że kulki szklane działają lepiej niż kulki cyrkonu do ekstrakcji RNA.
   6. Mieszaj mieszaninę przez 30 s.
      UWAGA: Jeśli natychmiast nie przejdziesz do następnego kroku, roztwór można przechowywać w temperaturze -80 °C przez 1-3 tygodnie.
   7. Wyodrębnij RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
   8. Ocenić jakość i stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i elektroforezy w żelu agarozowym.
      UWAGA: RNA dobrej jakości powinno mieć stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ około lub powyżej 2,0.
   9. Albo prześlij RNA do sekwencjonowania, albo potraktuj 1 μg RNA DNazą I klasy amplifikacji i dokonaj odwrotnej transkrypcji przy użyciu odwrotnej transkryptazy III w indeksie górnym i oligo-(dT)₂₀. Wykonaj ten krok zgodnie z instrukcjami producenta.
   10. Wykonaj qRT-PCR i przeanalizuj dane metodą ΔΔCT ⁹ (Rysunek 4B-D).
4. Opcja 4: Analiza ekspresji POI i kolokalizacji. Test barwienia immunofluorescencyjnego w całości (Rysunek 5)
   UWAGA: Zarodki utrwalone formaldehydem są delikatne. Unikaj energicznego potrząsania i obchodź się z nim ostrożnie.
   1. Dekorionację zarodków należy wykonać, wykonując czynności opisane w punktach 6.1.1-6.1.3.
   2. Przenieś zarodki do probówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Każda probówka powinna mieć równą liczbę zarodków i nie więcej niż 40 zarodków.
   3. Po tym, jak zarodki osiądą na dnie probówki, usuń supernatant i dodaj 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (pH 7,6).
   4. Powtórz krok 6.4.3 jeszcze raz.
   5. Usunąć supernatant, dodać 1 ml 4% formaldehydu w PBS (pH 7,6) i inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie kołysząc.
      UWAGA: Próbki w roztworze formaldehydu można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.
   6. Usunąć supernatant, dodać 1 ml metanolu o temperaturze -20 °C i inkubować probówkę na boku w temperaturze -20 °C przez co najmniej 18 godzin
      UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 1 miesiąc lub dłużej.
   7. Usunąć supernatant i dodać 1 ml buforu PDT (0,3% v/v Triton X-100, 0,1% v/v Tween-20 i 1% v/v dimetylosulfotlenku [DMSO] do buforu PBS).
   8. Powtórzyć krok 6.4.7 i inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie kołysząc.
   9. Usunąć supernatant, dodać 1 ml buforu blokującego (10% v/v inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej [FBS], 2% w/v albuminy surowicy bydlęcej [BSA] i 0,1% v/v Tween-20 w buforze PBS) i inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z delikatnym kołysaniem.
   10. Usunąć supernatant i dodać 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczonego w buforze blokującym).
   11. Usunąć supernatant, dodać 500 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczonego w buforze blokującym) i inkubować probówkę w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie kołysząc.
       UWAGA: W przypadku stosowania nowego przeciwciała pierwszorzędowego warto dołączyć kilka próbek bez barwienia przeciwciałami pierwszorzędowymi, które będą służyć jako kontrole ujemne. Jednak w idealnej sytuacji zarodki z nokautem morfolinowym lub zarodki, w których ekspresja białka docelowego została pobudzona, są bardziej wiarygodnymi środkami do walidacji przeciwciała.
   12. Usunąć supernatant, dodać 1 ml buforu PDT i inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie kołysząc.
   13. Powtórz krok 6.4.12.
   14. Usunąć sklarowany nad osadem, dodać 1 ml buforu blokującego i inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z delikatnym kołysaniem.
       UWAGA: Po tym etapie próbki należy chronić przed światłem, aby zapobiec fotowybielaniu fluoroforu sprzężonego z przeciwciałem drugorzędowym.
   15. Usunąć supernatant i dodać 200 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczonego w buforze blokującym).
   16. Usunąć supernatant, dodać 500 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczonego w buforze blokującym) i inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny, delikatnie kołysząc.
   17. Usunąć supernatant, dodać 1 ml buforu PDT i inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, delikatnie kołysząc.
   18. Powtórz krok 6.4.17.
   19. Zamontuj zarodki na 2% agarozowej płytce (wykonanej z PBS, pH 7,6) i zobrazuj zarodki za pomocą stereomikroskopu (jasne pole i odpowiednie kanały fluorescencyjne) (Rysunek 5A,B,D,F).
       UWAGA: Jeśli używasz stereomikroskopu fluorescencyjnego Leica M165 FC, użyj powiększenia 25x, aby uzyskać obrazy o dobrej rozdzielczości.
   20. Określ ilościowo/przeanalizuj intensywność sygnału fluorescencyjnego za pomocą ImageJ (NIH). Użyj narzędzia Zaznaczanie odręczne w ImageJ, aby określić ilościowo sygnał w obszarze zainteresowania.

Wyniki

Obrazowanie na żywo transgenicznych ryb reporterowych dla neutrofili/makrofagów, Tg(lyz:TagRFP) oraz Tg(mpeg1:EGFP), poddanych działaniu Z-REX. Indukcja apoptozy neutrofili/makrofagów poprzez HNEylację Keap1. (Patrz również Rysunek 2). Wpływ znakowania elektrofilem białka Keap1 na poziom neutrofili i makrofagów oceniono poprzez wstrzyknięcie heterozygotycznym zarodkom transgenicznym pochodzącym z linii Tg(lyz:TagRFP) lub Tg(mpeg1:EGFP) mRNA kodującego Halo-Keap1, a następnie poddanie ich działaniu Ht-PreHNE(alkyne). Zgodnie z procedurami dla kroku 6.1-analiza następcza Opcja 1-uwolniono HNE(alkyne) i oznakowano Keap1. Poziomy neutrofili i makrofagów oceniono za pomocą obrazowania na żywo odpowiednio linii reporterowych Tg(lyz:TagRFP) i Tg(mpeg1:eGFP). Poziom obu typów komórek spadł o 30%-40% po zastosowaniu Z-REX, w wyniku którego HNE zostało dostarczone do Keap1. Przeciwnie, nie zaobserwowano utraty neutrofili ani makrofagów w grupach kontrolnych technicznych Z-REX [bez światła i Ht-PreHNE(alkyne), samo światło lub samo Ht-PreHNE(alkyne)] (Rysunek 1D oraz Rysunek 2A-D).

Indukcja apoptozy neutrofili/makrofagów wskazała na skuteczne dostarczenie HNE do Keap1 za pomocą Z-REX. Szczegółowe informacje dotyczące analizy szlaków i mechanizmu apoptozy zostały opublikowane⁵. Aby uwzględnić efekty pozacelowe HNE(alkyne), zastosowano kilka kontroli. (1) W tych samych warunkach eksperymentalnych, zamiast mRNA Halo-TeV-Keap1, do embrionów wstrzyknięto mRNA Halo-P2A-Keap1. Łącznik P2A pozwolił na niezależną ekspresję białek Halo i Keap1. W tym scenariuszu HNE(alkyne) uwalniany z Halo nie mógł znakować Keap1, ponieważ nie znajdował się już w jego sąsiedztwie (Ryc. 1D); w związku z tym szlak sygnalizacyjny apoptozy nie został aktywowany. W tej grupie nie zaobserwowano zmian w poziomach makrofagów ani neutrofili (Ryc. 2A,B). (2) Te same warunki eksperymentalne przeprowadzono z użyciem mRNA kodującego Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E), mutantu Keap1, który nie reaguje na HNE(alkyne) (Ryc. 1D). Nie zaobserwowano zmian w poziomach makrofagów ani neutrofili (Ryc. 2G,H).

Sprzęganie typu click biotyny z azydkiem i test pull-down biotyny. Ocena znakowania celu. (Patrz również Rycina 3). Ocenę znakowania celu przeprowadzono z użyciem embrionów WT, w które wstrzyknięto mRNA kodujące albo Halo-TeV-Keap1-2xHA (konstrukt fuzyjny Halo-POI), albo Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA (konstrukt rozdzielony P2A, w którym Halo i Keap1 nie są połączone; Rycina 1D). Znakowane białko Keap1 zostało wyizolowane metodą pull-down wyłącznie w grupie wykazującej ekspresję białka fuzyjnego i poddanej działaniu Z-REX (druga ścieżka w górnym blotcie przeciwciałem anty-HA), natomiast nie w pozostałych grupach kontrolnych (brak wstrzyknięcia mRNA, konstrukt fuzyjny bez Z-REX lub konstrukt rozdzielony P2A). Wyniki wskazują, że HNE(alkyne) zostało skutecznie dostarczone do Keap1, a zmodyfikowane Keap1 zostało następnie sprzężone z biotyną w reakcji click, po czym znakowane biotyną Keap1 zostało wyizolowane przy użyciu żywicy z streptawidyną.

Analiza transkrypcyjna. RNA-seq i qRT-PCR. (Zobacz również Rysunek 4). Zmiany transkrypcyjne po zastosowaniu Z-REX oceniono za pomocą RNA-seq i qRT-PCR. W analizie RNA-seq stwierdzono obniżenie poziomu ekspresji kilku genów związanych z odpornością po podaniu Z-REX. Przeciwnie, wiele genów związanych z odpowiedzią antyoksydacyjną (AR) uległo nadekspresji po Z-REX, co było wynikiem indukcji szlaku Keap1-Nrf2-AR w następstwie HNEylacji białka Keap1¹⁰ (Rysunek 4A). W analizie qRT-PCR uzyskano podobne wyniki podczas badania trzech genów związanych z odpornością (lyz, mpeg1.1 i coro1a) (Rysunek 4B). Nadekspresja i obniżenie ekspresji odpowiednich genów wykazały skuteczną indukcję szlaków pośredniczonych przez HNEylację Keap1.

Analiza kolokalizacji i test barwienia (ko-)immunofluorescencyjnego całego preparatu. (Zobacz również Rysunek 5). Ekspresję egzogennych Halo-TeV-Keap1-2xHA oraz Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA oceniono za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego (IF) całego preparatu (Rysunek 5A,B). Konstrukt P2A-split posiadał dwukrotnie więcej znaczników HA niż konstrukt TeV-fusion, co przełożyło się na dwukrotnie silniejszy sygnał anty-HA w grupie wstrzykniętej mRNA konstruktu P2A-split w porównaniu z drugą grupą, co wskazuje na podobny poziom ekspresji obu konstruktów (Rysunek 5C). Poziomy ekspresji Halo-TeV-Keap1 (wt) oraz Halo-TeV-Keap1(C151S,C273W,C288E) okazały się również podobne podczas detekcji przeciwciałami anty-Halo (Rysunek 5D,E). Kolokalizację neutrofili i aktywnej kaspazy 3 w osobnikach Tg(lyz:TagRFP) traktowanych Z-REX zaobserwowano poprzez wspólne barwienie immunologiczne z użyciem przeciwciał anty-RFP i anty-aktywna-Kaspaza 3 (Rysunek 5F). Aktywna kaspaza 3 jest wskaźnikiem zdarzeń apoptotycznych.

Rycina 1: Schemat działania Z-REX. (A,B) Do zarodka danio pręgowanego w stadium 1-4 komórek wstrzykuje się (morfolino oraz) mRNA kodujące Halo-POI (np. Halo-Keap1). Następnie wstrzyknięte zarodki traktuje się sondą składającą się z ligandu HaloTag i fotoklatki elektrofila z dołączoną grupą funkcyjną alkinową, taką jak Ht-PreHNE(alkyne) w części B. Po usunięciu nadmiaru sondy zarodek poddaje się działaniu światła w celu uwolnienia interesującego elektrofila [np. HNE lub jego analogu, HNE(alkyne)]. Analizy w kolejnych etapach przeprowadza się w wybranym/zdefiniowanym przez użytkownika punkcie czasowym. (C) Konstrukcja i mechanizm działania sondy Ht-PreLDE, która ma zastosowanie do różnych elektrofili pochodnych lipidów (LDE). (D) Grupy kontrolne ujemne/techniczne dla Z-REX. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2: Obrazowanie na żywo transgenicznych ryb reporterowych dla neutrofili/makrofagów poddanych Z-REX. HNEylacja Keap1 zapośredniczona przez Z-REX indukuje apoptozę neutrofili/makrofagów. (A) Reprezentatywne obrazy ryb Tg(lyz:TagRFP) wykazujących ekspresję Halo-TeV-Keap1 (konstrukt fuzyjny) lub Halo-P2A-Keap1 (konstrukt rozdzielony), poddanych warunkom kontroli negatywnej [brak terapii, samo światło, sam Ht-PreHNE(alkyne) lub Z-REX]. Wiek embrionów: 36 hpf. (B) Ilościowe oznaczenie poziomu neutrofili w A. (C) Reprezentatywne obrazy ryb Tg(mpeg1:eGFP) wykazujących ekspresję Halo-TeV-Keap1 z zastosowaniem lub bez zastosowania Z-REX. Wiek embrionów: 34 hpf. (D) Ilościowe oznaczenie poziomu makrofagów w C. (E,F) Pomiary czasowe (E) poziomu neutrofili i (F) poziomu makrofagów po zastosowaniu Z-REX. (G) Eksperyment analogiczny do A u ryb wykazujących ekspresję Halo-TeV-Keap1 (WT) lub Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E), mutantu pozbawionego zdolności wykrywania HNE. (H) Ilościowe oznaczenie poziomu neutrofili w G. Paski skali: 500 µm. Wszystkie wykresy przedstawiono jako średnia ± SEM. Wartości p obliczono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA (kolor niebieski) i dwustronnego testu t Studenta (kolor czarny). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Poganik et al.⁷. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Test wyciągania biotyną. Embriony WT wykazujące ekspresję Halo-TeV-Keap1-2XHA lub Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA poddano działaniu Z-REX lub odpowiednich warunków kontrolnych negatywnych (w tym przypadku brak traktowania sondą). Po zbiorze embriony poddano lizie i potraktowano proteazą TeV przed testem wyciągania biotyną. Wyniki przeanalizowano za pomocą western blottingu. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Huang et al. Z-REX: kierowanie reaktywnych elektrofilów do konkretnych białek wyrażanych albo specyficznie tkankowo, albo powszechnie, oraz rejestrowanie wynikających z tego odpowiedzi redoks indukowanych przez elektrofile u larw ryb. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Huang et al.¹¹. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4: Analiza transkrypcyjna. (A) Wyniki RNA-seq zarodków traktowanych Z-REX w porównaniu z nietraktowanymi. Wyróżniono statystycznie istotne geny o różnej ekspresji (SDE). Geny SDE związane z odpornością zaznaczono kolorem czerwonym. Geny związane z odpowiedzią przeciwutleniającą (AR) zaznaczono kolorem zielonym. Pozostałe geny SDE zaznaczono kolorem niebieskim. Wszystkie wartości p obliczono za pomocą programu CuffDiff. (B-D) Trzy geny SDE związane z odpornością z punktu A: (B) lyz, (C) mpeg1.1 oraz (D) coro1a poddano dalszej analizie metodą qRT-PCR; jedynie w zarodkach traktowanych Z-REX zaobserwowano supresję tych transkryptów. Wszystkie wykresy przedstawiono jako średnia ± SEM. Wartości p obliczono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA (kolor niebieski) oraz dwustronnego testu t Studenta (kolor czarny). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Poganik et al.⁷. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5: Analiza barwienia immunofluorescencyjnego całego preparatu. (A,B) Reprezentatywne obrazy embrionów wykazujących ekspresję (A) Halo-TeV-Keap1-2xHA lub (B) Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA, poddanych barwieniu przeciwciałem anty-HA i przeciwciałem wtórnym sprzężonym z AlexaFluor568. Ryby wstrzyknięte z mRNA porównano z rybami niewstrzykniętymi w tym samym wieku. (C) Ilościowe oznaczenie sygnału anty-HA w (A,B). (D) Reprezentatywne obrazy embrionów wykazujących ekspresję Halo-TeV-Keap1 (WT) lub Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E), poddanych barwieniu przeciwciałem anty-Halo i przeciwciałem wtórnym sprzężonym z AlexaFluor647. Ryby wstrzyknięte z mRNA porównano z rybami niewstrzykniętymi w tym samym wieku. (E) Ilościowe oznaczenie sygnału anty-Halo w D. Wartości p obliczono za pomocą dwustronnego testu t Studenta. (F) Embriony Tg(lyz:TagRFP) poddane procedurze Z-REX poddano wspólnemu barwieniu immunofluorescencyjnemu przeciwciałami anty-RFP i anty-aktywna Kaspaza 3 oraz odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluoroforami. Biała ramka oznacza obszar powiększony. Białe strzałki wskazują kolokalizację neutrofili i aktywnej Kaspazy 3. Paski skali: 500 µm. Wszystkie wykresy przedstawiono jako średnia ± SEM. Rycina została zmodyfikowana na podstawie prac Poganik et al.⁷ oraz Huang et al.¹¹. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Tabela uzupełniająca 1: Lista buforów użytych w niniejszym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Z-REX opisany w tym protokole demonstruje solidną strategię badania par elektrofil-cel i dekonwolucji szlaków sygnałowych u żywych ryb. Podawanie ukierunkowane na odległość umożliwia dozowanie i kontrolę przestrzenną obróbki związkiem elektrofilowym. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod dozowania bolusa, w których suprafizjologiczne stężenia elektrofilu często prowadzą do problemów z niezamierzonym zapłonem, stosunkowo niewielka ilość elektrofilu uwalnianego do systemu sprawia, że Z-REX jest w dużej mierze nieinwazyjny. Użyliśmy 0,1-6 μM Ht-PreHNE (alkinu) w zarodkach danio pręgowanego, a wyniki wykazały, że leczenie nie jest szkodliwe dla rozwoju zarodka¹¹.

Procedura Z-REX jest na ogół dłuższa niż T-REX, technika przesiewowa/badawcza białek wykrywających elektrofil w hodowanych komórkach. Załóżmy, że celem eksperymentu jest badanie przesiewowe pod kątem interakcji elektrofil-cel; sugerujemy najpierw przeprowadzenie szeroko zakrojonych badań przesiewowych za pomocą T-REX w hodowanych komórkach i użycie Z-REX do walidacji in vivo i analizy fenotypowej/szlaku. W porównaniu z hodowlą komórkową, wymagania dotyczące wykonania Z-REX to podstawowe techniki hodowli ryb, a także biochemiczne umiejętności eksperymentalne wymagane przez T-REX. Typowe ramy czasowe dla Z-REX (od skrzyżowania ryb do indukowanego światłem elektrofilu) to 2-3 dni, czyli nie więcej niż 1 dzień dłużej niż typowy czas eksperymentu T-REX na transfekowanych żywych komórkach. Obrazowanie na żywo do analizy fenotypowej można wykonać 2-10 godzin po oświetleniu światłem; sprzężenie zatrzaskowe z azydkiem biotyny do testu pull-down trwa 3 dni; qRT-PCR do oznaczania odpowiedzi transkrypcyjnej trwa 3 dni; Barwienie IF trwa 5 dni. Etapy te są z grubsza podobne do ich odpowiedników w hodowlach komórkowych, chociaż interpretacja danych wymaga zrozumienia fizjologii ryb i szczepów reporterowych.

Jako procedura wielu zmiennych¹², kilka grup kontrolnych jest niezbędnych, aby Z-REX wykluczyć niepewności w wynikach (rysunek 1D). Wspólne grupy kontrolne to: (1) Tylko DMSO/leczenie nośnikiem; (2) obróbka sondą, ale bez oświetlenia świetlnego; (3) oświetlenie świetlne, ale bez obróbki sondą; (4) Konstrukcja P2A-split, w której Halo i POI są wyrażone oddzielnie, więc dostarczanie zbliżeniowe jest ablowane; oraz (5) mutanty hipomorficzne, których reszty elektrofilowe są zmutowane, takie jak Akt3 (C119S)⁶ i Keap1 (C151S, C273W, C288E)⁵, których używaliśmy w poprzednich badaniach.

Jeśli dalsze testy obejmują analizę western blot, przed zbiorem należy przeprowadzić usuwanie żółtka. Białka żółtka zmniejszają wierność ocen stężenia lizatu i mogą wiązać się niespecyficznie z przeciwciałami. Podczas wykonywania obrazowania żywych ryb lub barwienia IF w całości zaobserwowaliśmy również niespecyficzne sygnały fluorescencyjne w woreczku żółtkowym, prawdopodobnie wynikające z białek autofluorescencyjnych w woreczku żółtkowym lub niespecyficznego wiązania samych przeciwciał. Jeśli sygnał autofluorescencji zakłóca sygnał, sugerujemy wykluczenie woreczka żółtkowego z kwantyfikacji lub osobne określenie ilościowe różnych regionów. Dechorynacja jest niezbędna do obrazowania żywych ryb i testu barwienia IF w całości. Kosmówka może zakłócać obrazowanie, a później kwantyfikację/liczenie komórek. Dechorynacja ma jednak zastosowanie tylko do zarodków starszych niż 1 dpf; Młodsze zarodki w stadium blastulacji/gastrulacji/segmentacji są zbyt delikatne, aby można je było zdechorionować.

Opisany tutaj protokół Z-REX opiera się na ektopowej ekspresji POI sterowanej mRNA. Procedura jest szybka w porównaniu z używaniem/generowaniem transgenicznych żyłek do ryb. Ekspresja sterowana mRNA jest wszechobecna i przejściowa i trwa co najmniej 2 dni w przypadku mRNA stosowanych w tym protokole. Jednak czas trwania odciągania może się różnić w innych przypadkach. W związku z tym podejście to zapewnia szybkie i bardziej globalne okno badawcze dotyczące skutków konkretnego zdarzenia znakowania elektrofilowego, kompatybilne z kilkoma testami o wysokiej przepustowości i wysokiej zawartości. Linie transgeniczne ze stabilną ekspresją Halo-POI w określonych tkankach są również kompatybilne z Z-REX¹¹. Takie linie najlepiej sprawdzają się, gdy trzeba zadać bardziej precyzyjne pytanie, na przykład, gdy fenotyp w określonym narządzie jest przewidywany na podstawie danych z hodowli komórkowych lub gdy badania przesiewowe z eksperymentów z wstrzykiwaniem mRNA przewidują, że określony narząd jest wrażliwy na zdarzenie znakowania elektrofilowego. Specyficzną dla serca indukcję odpowiedzi antyoksydacyjnej za pomocą Z-REX wykazano przy użyciu Tg(gstp1:GFP; DsRed-P2A-myl7:Halo-TeV-Keap1) w naszej poprzedniej publikacji¹¹. Możliwe jest również wykonanie Z-REX na transgenicznych rybach starszych niż 2 dpf.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-merkaptoetanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
1,5-mililitrowa probówka do mikrowirówek	Axygen	MCT-150-C-S
10-cm szalka Petriego	Celltreat	229692
Probówka do mikrowirówek 2 ml	Axygen	MCT-200-C-S
30% roztwór akrylamidu i bis-akrylamidu	BioRad	1610154
Płytka 6-dołkowa	Celltreat	229506
Aceton	Fisher	A/0600/15
Agarose	GoldBio	A201-100
Wszystkie niebieskie wzorce białek barwionych	BioRad	1610373
Nadsiarczan amonu	Sigma	A3678
Biotyna-dPEG11-azydek	Quanta Biodesign	102856-142
Bradford Dye	BioRad	5000205
BSA	Fisher	BP1600-100
Rurki kapilarne	VWR	HARV30-00200
Chloroform	Supelco, Inc	1.02445.1000
cOmpete, Mini, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy	Roche	11836170001
Cu(TBTA)	Lumiprobe	21050
CuSO4	Sigma	209198
DMSO	Fisher	D128-500
Osioł anty-mysz-Alexa Fluor 647	Abcam	ab150107	1:800 (IF)
Osioł anty-królik-Alexa Fluor 647	Abcam	ab150075	1:1000 (IF)
Osioł anty-szczur-AlexaFluor 568	Abcam	ab175475	1:1000 (IF)
Podłoże ECL	Thermo Fisher Scientific	32106
Podłoże ECL-Plus	Thermo Fisher Scientific	32132
Rotator end-to-end	FinePCR	Rotator AG
Etanol	Fisher	E/0650DF/15
Bromek etydyny	Sigma	E1510
Flaming/Brown Ściągacz	do mikropipetInstrument Sutter Co.	P-97
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy	Leica	M165 FC
Kleszcze ()	samodzielnie wykonane		przez stępienie ostrych kleszczy (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40)
Kleszcze (ostre)	Narzędzia do nauki	Dumont #5, 11252-40
Końcówka do ładowania żelu	Fisher	02-707-181
Obrazownik żelowy/blot	Vilber	Fusion FX imager
Koraliki szklane	Sigma	45-G1145
Mikrometr do szklanych scen	Meiji Techno.	MA285
Inaktywowana termicznie FBS	Sigma	F2442
Podgrzewana kąpiel ultradźwiękowa	VWR	89375-470
HEPES	Fisher	BP310-1
Agaroza streptawidyny o dużej pojemności	Thermo Fisher Scientific	20359
Sonda alkinowa Ht-PreHNE	własnej produkcji		Parvez, S. i wsp. Targetowanie redoks na żądanie T-REX w żywych komórkach. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).
Płytka obrazowa (10% bufor HBSS, dla żywych zarodków)			Wykonana z szalki Petriego i 2% agarozy w 10% buforze HBSS
Płytka obrazowa (PBS, dla zarodków utrwalonych formaldehydem)			Wykonana z szalki Petriego i 2% agarozy w PBS
Płytka			Wykonana z formy do mikroiniekcji, szalki Petriego i 2% agarozy w 10% buforze HBSS
LDS	Apollo APOBI3331
Metanol	VWR	20864.32
Forma do mikroiniekcji	Adaptacyjne narzędzia naukowe	TU-1
Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf	930001007
Mikromanipulator	Narishige	MN-153
Mikroskop do mikroiniekcji	Olympus	SZ61
Mikroskopowe źródło światła	Olympus	KL 1600 LED
Olej mineralny	Sigma	M3516
mMessage mMachine SP6 Zestaw do transkrypcji	Ambion	AM1340
Mysz anty- β-aktyna HRP	Sigma	A3854	1:20000 (WB)
Mysz anty-HaloTag	Promega	G921A	1:500 (IF)
Czytnik wielomodowy	BioTek Instruments	Cytacja 5
Aparatura do elektroforezy w żelu agarozowym kwasu nukleinowego	Biorad	Mini-Sub Cell GT Systems
Oligo(dT)20	Zintegrowane technologie DNA	dostosowane: (dT)20
Pomarańczowy G	Sigma	O3756
Paraformaldehyd	Sigma	P6148
PBS	Gibco	14190144
pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-keap1-2xHA	samoklonowanie-Dostępne		w grupie prof. Yimona AYE w EPFL
pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA	samoklonowanie-Dostępne		w grupie prof. Yimona AYE w EPFL
Pneumatic PicoPump	WPI	SYS-PV820
Sprzęt i materiały do elektroforezy białek	Biorad	Mini-PROTEAN Tetra Pionowa elektroforeza
Królik antyaktywny Kaspaza-3	BD Pharmingen	559565	1:800 (IF)
Anty-HA-HRP	Sigma	H3663	1:500 (IF i WB)
Anty-RFP	ChromoTek	5F8	1:800 (IF)
Wirówka z chłodzeniem	Eppendorf	5417R
RNAseOUT Rekombinowany inhibitor rybonukleazy	ThermoFisher Scientific	10777019
Roztwór do dekontaminacji RNA RnaseZap	ThermoFisher Scientific	AM9780
Wytrząsarka kołysana	DLAB	SK-R1807-S
SDS Teknova		S9974
SuperScript III odwrotna transkryptaza	ThermoFisher Scientific	18080085
t-Butanol	Sigma	471712
TCEP-HCl	Gold Biotechnology	TCEP1
TeV proteaza (S219V)	wykonana samodzielnie	-	Parvez, S. i wsp. T-REX celowanie redoks na żądanie w żywych komórkach. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).
Tg(lyz:TagRFP)	Międzynarodowe Centrum Zasobów Zebra (ZIRC)	uwm11Tg (ZFIN)	-
Tg(mpeg1:eGFP)	Międzynarodowe Centrum Zasobów Zebrafish (ZIRC)	gl22Tg (ZFIN)	-
Termocykler	Analytik Jana	846-x-070-280
TMEDA	Sigma	T7024
Pipety transferowe	Fisher	13-711-9D
Tris	Apollo	APOBI2888
Triton X-100	Fisher	BP151-100
Odczynnik TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596018
Inhibitor trypsyny z Glycine max (soybean)	Sigma	T9003
Tween 20	Fisher	BP337-500
Lampa UV ze światłem 365-nm	Spectroline	ENF 240C
Miernik UV	Spectroline	XS-365
Vortexer	Scientific Industries, Inc.	Vortex-Genie 2
Western Blotting Sprzęt i materiały eksploatacyjne	Biorad	Mini Trans-Blot lub Criterion Blotter
		do hodowli i hodowli danio pręgowanego	w domu
Koraliki cyrkonowe	BioSpec	11079107zx

o wysokiej jakości iniekcyjna Sprzęt