Method Article

Ocena terapii modulacji kurczliwości serca w kardiomiocytach 2D pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

DOI:

10.3791/64848

⸱

December 16th, 2022

 ,  ,  , 
1Office of Science and Engineering Laboratories, Center for Devices and Radiological Health, U.S. Food and Drug Administration

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj demonstrujemy nieinwazyjną metodę oceny kurczliwości kardiologicznych urządzeń medycznych przy użyciu monowarstw 2D indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z kardiomiocytów (hiPSC-CM), platerowanych na elastycznym podłożu, w połączeniu z mikroskopią opartą na wideo. Narzędzie to będzie przydatne do oceny in vitro właściwości skurczowych urządzeń do elektrofizjologii serca.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (hiPSC-CMs) są obecnie badane pod kątem wielu zastosowań in vitro i były wykorzystywane w zgłoszeniach regulacyjnych. W tym miejscu rozszerzamy ich zastosowanie na bezpieczeństwo kardiologicznych wyrobów medycznych lub oceny działania. Opracowaliśmy nowatorską metodę oceny właściwości kurczliwości kardiologicznych wyrobów medycznych w solidnie kurczących się monowarstwach 2D hiPSC-CM platerowanych na elastycznym podłożu hydrożelowym na bazie elastycznej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Narzędzie to umożliwia ilościowe określenie wpływu sygnałów urządzenia do elektrofizjologii serca na czynność serca człowieka (np. właściwości skurczowe) za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego. Monowarstwy 2D hiPSC-CM hodowano przez 2-4 dni na elastycznym podłożu hydrożelowym w formacie 48-dołkowym.

hiPSC-CMs byli wystawieni na standardowe sygnały elektryczne urządzeń medycznych z modulacją kurczliwości serca (CCM) i porównani z kontrolnymi (tj. tylko stymulacją) hiPSC-CM. Podstawowe właściwości kurczliwe hiPSC-CM 2D określono ilościowo za pomocą analizy detekcji wideo opartej na przemieszczeniu pikseli. Stymulowane CCM 2D hiPSC-CM osadzone na elastycznym podłożu hydrożelowym wykazywały znacznie ulepszone właściwości kurczliwe w stosunku do linii podstawowej (tj. przed stymulacją CCM), w tym zwiększoną szczytową amplitudę skurczu oraz przyspieszoną kinetykę skurczu i relaksacji. Co więcej, wykorzystanie elastycznego substratu hydrożelowego umożliwia zwielokrotnienie odczytów sprzężenia skurczu serca i pobudzenia serca na podstawie wideo (tj. elektrofizjologii, obchodzenia się z wapniem i skurczu) u zdrowych i chorych hiPSC-CM. Dokładne wykrywanie i ilościowe określanie wpływu sygnałów elektrofizjologicznych serca na skurcz serca u ludzi ma kluczowe znaczenie dla opracowywania, optymalizacji i zmniejszania ryzyka wyrobów medycznych do pracy serca. Metoda ta umożliwia solidną wizualizację i ilościowe określenie właściwości skurczowych syncytium serca, co powinno być cenne dla nieklinicznych testów bezpieczeństwa lub skuteczności kardiologicznych wyrobów medycznych. W artykule szczegółowo opisano metodykę generowania monowarstw substratów hydrożelowych 2D hiPSC-CM.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz ze starzeniem się populacji Stanów Zjednoczonych, liczba pacjentów z niewydolnością serca stale rośnie, wraz z bezpośrednimi kosztami leczenia1,2. Istnieje pilna potrzeba opracowania nowatorskich terapii leczenia niewydolności serca oraz innowacyjnych metodologii nieklinicznych w celu przetestowania takich terapii. Kardiomiocyty pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-CMs) zostały zaproponowane jako narzędzie in vitro wspomagające proces rozwoju terapii i były wykorzystywane w zgłoszeniach regulacyjnych3,4. Jednak ich powszechne zastosowanie w badaniach kurczliwości było ograniczone ze względu na brak solidnych właściwości kurczliwych podczas powlekania w standardowych sztywnych warunkach hodowli 2D (tj. konwencjonalnych kultur tkankowych z tworzywa sztucznego lub szkła)5,6,7,8. Wcześniej zademonstrowaliśmy użyteczność powlekania izolowanych pojedynczych hiPSC-CM na elastycznym podłożu hydrożelowym w celu uzyskania solidnych widocznych właściwości kurczliwości9. Wykazaliśmy, że izolowane hiPSC-CM mają porównywalne właściwości kurczliwe do świeżo izolowanych dorosłych kardiomiocytów komorowych królika. Ponadto wykazaliśmy przydatność tej metody do oceny reakcji skurczowych na czynniki farmakologiczne7. Co więcej, w innych badaniach zastosowano tę technologię do ocen mechanistycznych w naukach podstawowych i modelowaniu chorób10,11,12. W tym przypadku metodologia ta została rozszerzona na monowarstwy 2D hiPSC-CM i wykazano jej przydatność w ocenie fizjologicznie istotnych sygnałów elektrycznych urządzeń medycznych z modulacją kurczliwości serca (CCM) in vitro.

CCM to wewnątrzsercowa terapia niewydolności serca, w której niepobudzające sygnały elektrofizjologiczne są dostarczane do mięśnia sercowego podczas bezwzględnego okresu refrakcji cyklu sercowego13,14. Brakuje powtarzalnych metod oceny CCM w modelach ludzkich komórek serca. W poprzednich pracach wykorzystano różne modele komórek serca do oceny odpowiedzi skurczowej CCM. Wykazaliśmy in vitro, że świeżo wyizolowane kardiomiocyty komorowe królika reagują na stymulację CCM przejściowym wzrostem wapnia i amplitudy skurczu15. Inne badanie na izolowanych kardiomiocytach komorowych psów wykazało indukowane przez CCM zwiększenie wewnątrzkomórkowej amplitudy przejściowej wapnia wapnia16. Jednak w większości badań CCM stosowano preparaty pochodzenia zwierzęcego ex vivo i in vivo. Badania te są trudne do skorelowania ze sobą, ponieważ stosują różne parametry impulsu CCM i species17. Jedno badanie na izolowanym modelu brodawkowatym królika wykazało zwiększoną kurczliwość wywołaną przez CCM8,18, a szereg badań całego serca wykazał indukowane przez CCM poprawę funkcji skurczu19,20,21. Badania te dostarczyły ważnych informacji mechanistycznych. Brakuje jednak odtwarzalnych modeli ludzkich do badań in vitro skurczliwości EP serca, w tym CCM. W tym celu opracowaliśmy kilka modeli 2D i 3D hiPSC i wykazaliśmy indukowaną przez CCM poprawę właściwości skurczowych w sposób zależny od parametrów. Co więcej, stwierdzono, że efekty inotropowe wywołane przez CCM są częściowo pośredniczone przez wejście neuronalne i sygnalizację β-adrenergiczną8,17,22. Mimo to trzeba wiedzieć więcej o mechanizmach terapii CCM, a wykorzystanie kurczących się ludzkich kardiomiocytów może pomóc w osiągnięciu tego wyniku. W związku z tym istnieje znacząca potrzeba opracowania nieklinicznych narzędzi stosowanych u ludzi w celu oceny nowych urządzeń i sygnałów CCM, przyspieszenia procesu regulacyjnego, zmniejszenia obciążenia modeli zwierzęcych i pomocy w podejmowaniu decyzji dotyczących twórców urządzeń8,17,23,24. Ważne jest, aby opracować łatwe protokoły typu "zrób to sam", które można przenieść do dowolnego laboratorium i które wykorzystują standardowy sprzęt i niskie wymagania dotyczące ogniw w celu obniżenia kosztów. Metoda ta wyjaśnia wpływ stymulacji CCM na funkcję ludzkich kardiomiocytów i dostarcza ważnych informacji na temat bezpieczeństwa i skuteczności CCM17. W tym miejscu opisujemy metodę generowania monowarstw 2D hiPSC-CM na elastycznym podłożu hydrożelowym w celu wytworzenia znormalizowanego nieklinicznego narzędzia do ilościowego określania odpowiedzi skurczowych urządzenia medycznego do elektrofizjologii serca (tj. CCM) w zdrowiu i chorobie.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie płyt i mediów

UWAGA: Typowa porcja hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) to ~200 μL w sterylnej probówce 1,5 ml przechowywanej w temperaturze -20 °C.

  1. W sterylnym kapturze do hodowli tkanek przygotuj sterylną 6-dołkową płytkę, przenosząc 2 ml 0,1% żelatyny (tabela materiałów) do każdego dołka. Umieścić pokrywkę na płytce 6-dołkowej i pozostawić pokrytą płytkę do inkubacji w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę.
  2. Na jeden dzień przed wysiewem hiPSC-CM na elastycznym podłożu hydrożelowym, należy rozmrozić podwielokrotność hydrożelu (tabela materiałów) w lodówce na lodzie.
  3. Przygotuj pożywkę kardiomiocytową (tabela materiałów), mieszając 500 ml RPMI 1640, 10 ml 50x suplementu B-27 i 5 ml penicyliny-streptomycyny9.

2. Wysiewanie kriokonserwowanych hiPSC-CM

  1. Dwa dni przed wysiewem hiPSC-CM na elastycznym podłożu hydrożelowym, należy wstępnie pokryć hiPSC-CM na sterylnych 6-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną o zawartości 0,1%. Rozmrażanie hiPSC-CM przy użyciu standardowego protokołu rozmrażania9,25.
  2. Następnie należy umieścić łącznie 1 500 000 hiPSC-CM (Tabela materiałów) na studzience zgodnie z instrukcjami producenta ( Rysunek 1A) < sup class = "xref">26.
  3. Hodować hiPSC-CM w standardowej pożywce kardiomiocytowej przez 2-4 dni, aby umożliwić hiPSC-CM regenerację po kriokonserwacji w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zużytą pożywkę należy odświeżać pożywką 100% kardiomiocytów co 48 godzin.

3. Dysocjacja i zliczanie wstępnie platerowanych hiPSC-CM

  1. Sprawdź stan hiPSC-CM przed dysocjacją. Oceń stan hiPSC-CM, zapewniając żywotność i stabilne bicie.
    UWAGA: Czystość populacji hiPSC-CM jest ważna (np. >90% sercowej troponiny T)7. Metoda selekcji kardiomiocytów (np. selekcja metaboliczna lub sortowanie) jest zalecana w celu zmniejszenia rozerwania substratu hydrożelowego przez komórki niekardiomiocytów25,26.
  2. Przemyć hiPSC-CMs 2x 4 ml na studzienkę D-PBS bez CaCl2 lub MgCl2 (tabela materiałów). Odessać D-PBS, dodać 1 ml odczynnika dysocjacyjnego w temperaturze pokojowej do każdego dołka, a następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Dodać 10 ml pożywki kardiomiocytowej do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  4. Odłącz hiPSC-CM od płytki 6-dołkowej za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl (Rysunek 1B). Dodać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml26.
  5. Przepłukać studzienkę 1 ml świeżej pożywki kardiomiocytowej, aby zebrać wszelkie pozostałości hiPSC-CM i dodać je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Doprowadzić końcową objętość stożkowej rurki do 15 ml.
  6. Wirować przez 5 minut (200 × g). Usunąć supernatant do oznaczenia 1 ml. Zawiesić komórki w pożywce kardiomiocytowej do końcowej objętości 5 ml.
  7. Policz hiPSC-CM za pomocą ręcznego lub automatycznego licznika komórek.
  8. Zawiesinę hiPSC-CM należy inkubować w temperaturze pokojowej podczas przygotowywania elastycznych substratów hydrożelowych (maksymalnie 30 minut).

4. Przygotowanie elastycznych substratów hydrożelowych

  1. Przygotuj zestaw pipet o pojemności 20 μl i objętości 1 μl, końcówki do pipet o pojemności 20 μl (np. 20 μl) i sterylną 48-dołkową szklaną płytkę dolną. Upewnij się, że stoper/minutnik jest gotowy przed przygotowaniem substratów hydrożelowych.
  2. W sterylnym kapturze do hodowli tkankowych wymieszaj podłoże hydrożelowe na bazie ECM, delikatnie stukając w probówkę, a następnie natychmiast umieść go z powrotem na lodzie.
  3. Następnie uruchom stoper/minutnik bezpośrednio przed nałożeniem pierwszego podłoża hydrożelowego - jest to czas zerowy.
  4. Odpipetować 1 μl podłoża hydrożelowego w górę iw dół ~3x, aby schłodzić końcówkę pipety. Nałóż ~ 1 μl nierozcieńczonego substratu hydrożelowego poziomo na dno każdej studzienki płytki 48-dołkowej (Rysunek 1C, Rysunek 2A i Rysunek 3A), trzymając pipetę pod kątem 45°. Ułóż wszystkie podłoża hydrożelowe w tej samej orientacji w każdym dołku (Rysunek 2 i Rysunek 3), aby pomóc zidentyfikować podłoże podczas wykonywania eksperymentów przy 40-krotnym powiększeniu7,9,17,27.
    UWAGA: Każda linia ~1 μL to jeden substrat hydrożelowy (Rysunek 3). Zazwyczaj przygotowanie 48 dołków zajmuje ~5 minut. Zastosowanie nachylonego w poziomie stojaka na mikropłytki (np. 30°) może umożliwić lepszy widok dna studni i podłoża hydrożelowego. Pamiętaj, aby przejść przez całą długość studni (tj. od lewej do prawej). Krótkie podłoża hydrożelowe mogą być zbyt grube, co zmniejsza stabilność podłoża. Nie dopuścić do wyschnięcia podłoża hydrożelowego w końcówce pipety. W takim przypadku szybko przełącz się na nową końcówkę i natychmiast kontynuuj. Alternatywnie można użyć schłodzonych końcówek do pipet. Podłoże hydrożelowe na bazie ECM może szybko polimeryzować, gdy nie znajduje się na lodzie. Sugeruje się przygotowanie kilku studzienek jednocześnie (np. 10). Dodatkowo zaleca się ćwiczenie na próbie 48-dołkowej płytki.
  5. Umieść pokrywkę na 48-dołkowej płytce i pozwól substratom hydrożelowym inkubować przez 8-10 minut w temperaturze pokojowej w sterylnym kapturze do hodowli tkanek przed dodaniem komórek (Rysunek 2B).
    UWAGA: Ważne jest, aby przestrzegać sugerowanych czasów inkubacji. Czas inkubacji dłuższy niż 10 minut doprowadzi do powstania sztywnych substratów hydrożelowych i braku widocznych skurczów. Czas inkubacji krótszy niż 8 minut może prowadzić do zapadania się substratów.
  6. Natychmiast wysiew hiPSC-CM kroplami bezpośrednio na podłoża hydrożelowe, z ~ 30 000 żywotnych hiPSC-CM na studzienkę w małej objętości pożywki ~ 200 μl pożywki kardiomiocytowej, używając pipety 1 000 μl (Rysunek 2B i Rysunek 3B).
    UWAGA: Proces ten zatrzymuje polimeryzację substratu hydrożelowego i zapewnia, że hiPSC-CM znajdują się na podłożu7,9,17,27.
  7. Umieść pokrywkę na płytce i pozwól hiPSC-CM inkubować bez zakłóceń przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej (Rysunek 2C) w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych, aby umożliwić hiPSC-CM przyleganie do podłoża hydrożelowego.
  8. Delikatnie dodaj ~100 μL świeżej pożywki kardiomiocytowej do każdej studzienki (końcowa objętość: ~300 μL na dołek). Umieść pokrywkę na szalce i przenieś do inkubatora w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 2-4 dni. Odświeżaj 100% podłoże co 24 godziny przed wykonaniem eksperymentów skurczowych.
    UWAGA: Sprawdź wzrokowo hiPSC-CM pod kątem prawidłowej morfologii; Natychmiast po poszyciu hiPSC-CM powinny pojawić się okrągłe (Rysunek 3B). Do 2 dnia po wysiewie zaobserwuje się zlewający się monowarstwowy syncytium 2D hiPSC-CM (Rysunek 3C) (Dodatkowe wideo S1) z silnym widocznym skurczem (Uzupełniający film S2).

5. Rejestracja i analiza skurczów

  1. Przygotować pożywkę do oznaczania CCM, która jest roztworem Tyrode'a zawierającym następujące substancje (w mmol/l): CaCl2 0,5, NaCl 134, KCl 5,4, MgCl2 1, glukoza 10 i HEPES 10, o pH dostosowanym do 7,4 z NaOH i zrównoważyć do 37 °C w łaźni wodnej><. UWAGA: Submaksymalny wapń zewnątrzkomórkowy (0,5 mM) służy do poprawy okna testu CCM.
  2. Włącz mikroskop i komorę kontroli środowiska, aby zrównoważyć temperaturę do 37 °C i 5% CO2 .
  3. Usunąć pożywkę kardiomiocytów z płytki 48-dołkowej i delikatnie przepłukać każdą pożywkę dwukrotnie 600 μl pożywki do oznaczania CCM.
  4. Dodać 300 μl pożywki testowej CCM do dołka i umieścić 48-dołkową płytkę na mikroskopie w komorze kontroli środowiska. Włóż elektrody i równoważ ogniwa przez 5 minut.
  5. Użyj mikroskopii wideo, aby nagrać filmy skurczowe. Otwórz oprogramowanie do nagrywania wideo i ustaw liczbę klatek na sekundę 100 klatek/s. Wybierz obszar zainteresowania (ROI) w pobliżu środka monowarstwy hiPSC-CM.
    UWAGA: Nie wybieraj ROI w pobliżu krawędzi monowarstw hiPSC-CM, ponieważ może to być niestabilne w przypadku nagrań kurczliwych.
  6. Następnie pole stymuluje komórki za pomocą komercyjnego generatora impulsów (Tabela materiałów), aby elektrycznie nadawać tempo monowarstwom 2D hiPSC-CM. Tempo hiPSC-CM przy 1,5-krotnym progu przy 1 Hz z podstawowymi parametrami impulsu (np. monofazowe impulsy stymulacyjne fali prostokątnej z czasem trwania impulsu bodźca 2 ms wynoszącym ~14 V/cm)17.
  7. Nagraj linię bazową, tylko tempo (tj. przed CCM) (Rysunek 1D) wideo skurczu przez co najmniej pięć uderzeń17,28.
  8. Następnie stymuluj monowarstwę hiPSC-CM eksperymentalnym sygnałem elektrycznym (Rysunek 1D). Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć standardowych parametrów stymulacji CCM: dwa symetryczne impulsy dwufazowe o czasie trwania fazy 5,14 ms (całkowity czas trwania 20,56 ms), ~28 V/cm (amplituda fazy), zerowy interwał międzyfazowy i opóźnienie 30 ms (tj. czas od końca impulsu stymulującego do początku impulsu CCM) (Rysunek 1D)29,30, i nagraj wideo z wywołanym CCM skurczem przez minimum pięć uderzeń.
  9. Wyłącz sygnał CCM, stymuluj impulsem stymulującym linię bazową i nagraj film skurczowy z okresu rekonwalescencji (tj. po CCM) przez co najmniej pięć uderzeń.
  10. Użyj standardowego oprogramowania do skurczu, aby automatycznie przeanalizować filmy skurczu i określić ilościowo kluczowe właściwości skurczu (np. amplituda skurczu, nachylenie skurczu, nachylenie relaksacji, czas do szczytu, czas do linii bazowej 90% i czas trwania skurczu 50%)7,17,31,32.
  11. Użyj 2D hiPSC-CMs na elastycznym podłożu hydrożelowym do eksperymentów kurczliwości od 2 do 14 dni po posiewie na podłożu.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane w tym protokole jest proste, solidne narzędzie do generowania widocznie kurczących się monowarstw 2D hiPSC-CM na elastycznym podłożu hydrożelowym. Pomiar właściwości kurczliwości odbywa się za pomocą zapisu wideo połączonego z oprogramowaniem do analizy kurczliwości. Umożliwia to ilościowe określenie kluczowych parametrów kurczliwości kardiomiocytów, w tym amplitudy skurczu, nachylenia skurczu, nachylenia relaksacji, czasu do szczytu, czasu do linii podstawowej 90% i czasu trwania skurczu 50%. Model ten służy do charakteryzowania podstawowych właściwości kurczliwych hiPSC-CM (Rysunek 4) od różnych "zdrowych" dawców i może być rozszerzony o ocenę sygnałów urządzeń medycznych do elektrofizjologii serca (tj. CCM). Zastosowanie standardowych parametrów stymulacji CCM (Rysunek 1D)29,30 zaowocowało zwiększeniem właściwości kurczliwości in vitro (Rysunek 5 i Tabela 1)17.

Wykazaliśmy ponadto, że ta metoda może być wykorzystana do oceny wpływu modulacji zewnątrzkomórkowych stężeń wapnia na właściwości skurczowe człowieka z i bez stymulacji CCM (Rysunek 6)17. Zaobserwowano oczekiwaną wyjściową zależność skurczu od wapnia7,17, a także wywołany przez CCM wzrost wrażliwości wapnia na poziomie monowarstwy kardiomiocytów. Ponadto farmakologiczne badanie szlaku sygnałowego β-adrenergicznego (Ryc. 7) ujawniło, że intonowane przez CCM efekty inotropowe były częściowo pośredniczone przez sygnalizację β-adrenergiczną17. Co więcej, narzędzie to można rozszerzyć na kardiomiocyty specyficzne dla pacjenta, w tym kardiomiopatię rozstrzeniową (DCM)33,34,35 (Rysunek 8), aby zrozumieć wpływ CCM w kontekście stanów chorobowych; rzeczywiście, zwiększoną amplitudę skurczu oraz przyspieszoną kinetykę skurczu i relaksacji zaobserwowano przy testowanej tutaj "dawce" CCM (Ryc. 8). Chociaż w naszym laboratorium mamy urządzenie naśladujące CCM, zastosowana tutaj metodologia nie jest specyficzna dla tego systemu i może być zastosowana do innych urządzeń do elektrofizjologii serca.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczne podsumowanie modelu 2D hiPSC-CM in vitro CCM. (A) HiPSC-CM są wstępnie powlekane w formacie jednowarstwowym na 6-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną (0,1%). (B) Po 2 dniach w hodowli hiPSC-CM są dysocjowane i przygotowywane do posiewu na elastycznym podłożu hydrożelowym. (C) Wyizolowane hiPSC-CM są siane z dużą gęstością na podłożach hydrożelowych ułożonych w formacie 48-dołkowym (po lewej) i oznaczane w (0,5 mM) zewnątrzkomórkowym roztworze wapnia Tyrode (po prawej). (D) Komercyjny generator impulsów i standardowe kliniczne parametry impulsów CCM29,30 (po prawej) są używane do stymulacji hiPSC-CMs; Czynność serca ocenia się za pomocą analizy wideo (po lewej). (E) Reprezentatywne zapisy skurczu przed CCM (wartość wyjściowa: 5 V), w trakcie CCM (CCM: 10 V) i po CCM (odzysk: 5 V). Ten rysunek został przedrukowany z Feaster et al.17. Skróty: hiPSC-CM = ludzki indukowany pluripotencjalny kardiomiocyt pochodzący z komórek macierzystych; CCM = modulacja kurczliwości serca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat powlekania i wysiewu elastycznego podłoża hydrożelowego. (A) Całkowicie rozmrożony, nierozcieńczony substrat hydrożelowy na bazie ECM nakłada się na sterylną płytkę 48-dołkową (lewy panel), z 1 μL podłoża hydrożelowego na dołek (prawy panel). (B) Substrat hydrożelowy pozostawia się do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 8-10 minut (prawy panel), a następnie posiewa się hiPSC-CM o dużej gęstości w małej średniej objętości (~ 200 μL) (lewy panel). (C) Po 10-15 minutach inkubacji do każdej studzienki (lewy panel) dodaje się pożywkę, a płytki przenosi się do standardowego inkubatora do hodowli tkankowych (prawy panel). Skróty: ECM = macierz zewnątrzkomórkowa, hiPSC-CM = kardiomiocyty pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych; RT = temperatura pokojowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Podłoże hydrożelowe na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej. (A) Reprezentatywny substrat hydrożelowy (bez komórek) w jednym dołku z 48-dołkowej szklanej płytki dennej natychmiast po nałożeniu substratu do studzienki. (B) Czas 0 po wysianiu hiPSC-CM. (C) Czas 24 godziny po wysianiu hiPSC-CM. Ten panel został przedrukowany z Feaster et al.17. Białe strzałki wskazują krawędź podłoża hydrożelowego, powiększenie 4x. Podziałka = 1 mm. Skrót: hiPSC-CM = ludzki indukowany pluripotencjalny kardiomiocyt pochodzący z komórek macierzystych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Charakterystyka właściwości kurczliwości monowarstwy 2D hiPSC-CM. (A) Reprezentatywny zapis skurczu 2D hiPSC-CM z częstotliwością 1 Hz (5 V). (B) Reprezentatywne ślady skurczu przedstawiające jeden cykl skurczu. (C) Podsumowujące wykresy słupkowe. Dane są średnie± SEM. n = 18. Skrót: hiPSC-CM = ludzki indukowany pluripotencjalny kardiomiocyt pochodzący z komórek macierzystych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Ostry wpływ CCM na właściwości kurczliwe 2D hiPSC-CM. (A) Reprezentatywny zapis skurczu dla okresu przed CCM (5 V), podczas CCM (10 V) i po CCM (5 V). (B) Reprezentatywne ślady skurczu natychmiastowych efektów (tj. ostatnie uderzenie przed CCM, pierwsze uderzenie CCM i pierwsze uderzenie po CCM, oznaczone przez +). (C) Podsumowujące wykresy słupkowe natychmiastowych efektów. Zmiana procentowa, dane są średnie ± SEM. n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Ten rysunek został przedrukowany z Feaster et al.17. Skróty: hiPSC-CM = ludzki indukowany pluripotencjalny kardiomiocyt pochodzący z komórek macierzystych; CCM = modulacja kurczliwości serca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Wpływ zewnątrzkomórkowej modulacji wapnia na odpowiedź CCM. (A) Reprezentatywne ślady skurczu natychmiastowych efektów dla każdej grupy przed CCM (5 V), podczas CCM (10 V) i po CCM (5 V); hiPSC-CM były narażone na rosnące stężenia wapnia zewnątrzkomórkowego (Cao) o 0,25-2 mM. (B-D) Przekształcone dane (sigmoidalne) w celu poprowadzenia oka, wykazując wpływ CCM na wrażliwość na wapń właściwości kurczliwych (tj. amplitudy i kinetyki) (nachylenie wzgórza = 1,0). n = 6-8 na grupę. Ten rysunek został przedrukowany z Feaster et al.17. Skróty: hiPSC-CM = ludzki indukowany pluripotencjalny kardiomiocyt pochodzący z komórek macierzystych; CCM = modulacja kurczliwości serca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Wyzwanie farmakologiczne. Reprezentatywne ścieżki skurczu dla każdej grupy przed CCM (5 V), podczas CCM (10 V) i po CCM (5V); hiPSC-CM poddano wstępnej obróbce (A) nośnikiem lub (B) metoprololem (2 μM). (C,D) Wykresy słupkowe podsumowania dla każdego warunku. Zmiana procentowa, dane są średnie ± SEM. n = 10 na grupę. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, p < 0,0001. Ten rysunek został przedrukowany z Feaster et al.17. Skróty: hiPSC-CM = ludzki indukowany pluripotencjalny kardiomiocyt pochodzący z komórek macierzystych; CCM = modulacja kurczliwości serca. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8: Ostry wpływ CCM na właściwości kurczliwe chorych 2D hiPSC-CMs. (A) Reprezentatywny ślad skurczu dla DCM L35P, kontrolna linia bazowa (przed, 6 V) i DCM L35P plus CCM (10 V). (B) Podsumowujące wykresy słupkowe. Zmiana procentowa, dane są średnie ± SEM. n = 3. *p < 0,05, **p < 0,01. Skróty: hiPSC-CM = ludzki indukowany pluripotencjalny kardiomiocyt pochodzący z komórek macierzystych; CCM = modulacja kurczliwości serca; DCM = kardiomiopatia rozstrzeniowa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo S1: Timelapse hiPSC-CMs na hydrożelu opartym na macierzy zewnątrzkomórkowej. Dwuwymiarowe hiPSC-CM powleczone na elastycznym podłożu hydrożelowym; Czas: 0-90 h; jeden studzienek z 48-dołkowej szklanej płyty dennej; 4-krotne powiększenie. HiPSC-CM tworzą poziome jednowarstwowe syncytium (tj. od lewej do prawej). Podziałka = 1 mm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dodatkowe wideo S2: hiPSC-CMs na hydrożelu na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej. Dwuwymiarowe hiPSC-CM powleczone na elastycznym podłożu hydrożelowym; Czas: ~24 h; jeden studzienek z 48-dołkowej szklanej płyty dennej; 4-krotne powiększenie. HiPSC-CM tworzą morfologię monowarstwową i wykazują silny skurcz po ~24 godzinach od posiewu. Podziałka = 1 mm. Ten film pochodzi z Feaster et al.17. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

parametrCcmpo
amplituda 16 ± 4%**4 ± 5%
Czas do osiągnięcia szczytu 50% -20 ± 9%*7 ± 5%
Czas do osiągnięcia szczytu: 90% -22 ± 8%*6 ± 5%
Czas do osiągnięcia linii bazowej 50% -8 ± 5%4 ± 4%
Czas do osiągnięcia punktu bazowego 90% -12 ± 6%*5 ± 5%
Czas trwania skurczu 10% -13 ± 6%3 ± 5%
Czas trwania skurczu 50%-6 ± 5 %3 ± 5%
Czas trwania skurczu 90% 0 ± 5%3 ± 4%
N2323

Tabela 1: Właściwości kurczliwości. Procentowa zmiana w stosunku do stanu przed CCM (5 V); dane są średnie ± SEM dla wszystkich uderzeń w każdej grupie podczas CCM (10 V) i po CCM (5 V). n = 23. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Ta tabela została przedrukowana z Feaster et al.17.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół opisuje metodę generowania solidnie kurczących się monowarstw 2D hiPSC-CM na elastycznym podłożu hydrożelowym na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) z dostępnymi w handlu odczynnikami 7,17. HiPSC-CM wysiane na elastycznym podłożu hydrożelowym zachowują żywotność i mają ulepszone właściwości kurczliwe7. Technika ta opiera się na standardowym sprzęcie i możliwościach laboratoryjnych7. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków, w tym związanych z pracą z substratem hydrożelowym na bazie ECM, które wymagają szczególnej dbałości o szczegóły. Jednym z potencjalnych problemów jest obecność surowicy w pożywce. Może to spowodować, że hiPSC-CM utworzą sieci (np. sieci śródbłonka/naczyniowe) zamiast zlewającego się arkusza monowarstwowego; w związku z tym zaleca się stosowanie pożywki bez surowicy podczas tworzenia elastycznych monowarstw hydrożelowych hiPSC-CM (tj. od dnia 0 do dnia 4). Podobnie, przygotowanie zbyt wielu substratów hydrożelowych za jednym razem może skutkować słabymi lub nierównymi podłożami z powodu zmęczenia operatora. Chociaż ważne jest, aby pracować szybko, integralność każdego podłoża hydrożelowego ma kluczowe znaczenie. Podobnie, należy ostrożnie wysiewać hiPSC-CM i zmieniać pożywkę; Nie należy tego robić na siłę. Podczas zmiany podłoża należy je dodawać delikatnie od górnej krawędzi studzienki, aby nie naruszyć podłoża hydrożelowego ani komórek. Podobnie jak w przypadku standardowych kultur 2D hiPSC-CM (tj. konwencjonalnych kultur tkankowych z tworzywa sztucznego lub szkła), powlekanie o niskiej gęstości spowoduje niepełne tworzenie monowarstwy. Ważne jest, aby dokonać oględzin hiPSC-CM, aby upewnić się, że znajdują się na podłożu hydrożelowym i użyć timera, aby zapewnić dokładny czas. Co więcej, hodowla monowarstw 2D hiPSC-CM przez ponad 14 dni na podłożu hydrożelowym może spowodować rozerwanie monowarstwy, w oparciu o właściwości ECM i instrukcje producenta substratu.

Istnieje kilka ograniczeń obecnej metody, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, komórki użyte w tym protokole pochodziły od komercyjnego dostawcy hiPSC-CMs, a komórki te tworzą syncytium elektrycznie sprzężonych komórek. Syncytium zawiera mieszaninę hiPSC-CM ze wszystkich trzech podtypów serca (tj. komorowych, przedsionkowych i węzłowych)17. Korzyści z badań mogą dotyczyć populacji hiPSC-CM z wyjątkiem dla podtypu (tj. 100% komorowego lub 100% przedsionkowego). Po drugie, w tej metodzie wykorzystano tylko hiPSC-CM, podczas gdy nie-miocyty, w tym fibroblasty serca, komórki śródbłonka i neurony, mogą zwiększać funkcjonalność hiPSC-CM22,36. Po trzecie, 2D hiPSC-CM wykazują kilka cech stosunkowo niedojrzałych kardiomiocytów, w tym spontaniczne bicie, amorficzną morfologię i brak odpowiedzi inotropowej 8,37. Po czwarte, podczas gdy protokół ten wytwarza solidnie kurczące się monowarstwy 2D hiPSC-CM, jest prawdopodobne, że funkcjonalnie ulepszone modele 3D hiPSC-CM, takie jak zmodyfikowane tkanki serca (ECT), spowodują zwiększoną reakcję skurczową indukowaną przez CCM przy fizjologicznych stężeniach wapnia 8,38. Wreszcie, opisany tutaj protokół jest przeznaczony dla formatu 48-dołkowego. Jednak dzięki optymalizacji i włączeniu automatyzacji można to przeskalować do formatu o wysokiej przepustowości (np. płytki 96-dołkowe lub 384-dołkowe).

Obecnie złotym standardem w badaniach hiPSC-CM są konwencjonalne, sztywne warunki hodowli 2D (tj. kultura tkankowa z tworzywa sztucznego lub szkła). Chociaż konwencjonalna metodologia jest przydatna w badaniach elektrofizjologii3 i obchodzenia się z wapniem39, skutkuje ona minimalnymi właściwościami skurczowymi 5,6,7. W rezultacie, konwencjonalne sztywne warunki hodowli 2D nie są podatne na ocenę efektów kurczliwości CCM8. Funkcjonalnie ulepszone metody 3D hiPSC-CM ECT38 są technicznie trudne, czasochłonne i wymagają zaawansowanego sprzętu, który nie jest łatwo dostępny w każdym laboratorium. W tym protokole opisujemy prostą metodologię generowania solidnie kurczących się monowarstw 2D hiPSC-CM w krótszym czasie niż metody 3D ECT lub długoterminowe, konwencjonalne metody 2D 7,40,41. Co więcej, stosowane tutaj odczynniki są dostępne na rynku, w tym substrat hydrożelowy i hiPSC-CM, i oba mają znaczną konsystencję między partiami. Chociaż użyliśmy wymiennych elektrod z drutu platynowego (odległość między elektrodami: 2,0 mm, szerokość: 1,0 mm), różne materiały i konfiguracje elektrod są podatne na ocenę kurczliwości CCM in vitro 8,15,17,18,22. Podobnie, dostępnych jest wiele zautomatyzowanych programów, które umożliwiają analizę filmów skurczowych 7,31,32.

Większość nieklinicznych metod oceny kurczliwości kardiologicznych wyrobów medycznych opiera się w dużej mierze na kosztownych modelach zwierzęcych in vivo (np. psy lub świnie) i trudnych technicznie paskach mięśni brodawkowatych (np. króliki)18. W artykule opisano ludzki model in vitro do oceny wpływu sygnałów urządzeń medycznych do elektrofizjologii serca na kurczliwość. Narzędzie to może zmniejszyć zależność od badań na zwierzętach i być przydatne do oceny in vitro właściwości skurczowych urządzeń do elektrofizjologii serca.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy artykuł odzwierciedla poglądy autorów i nie powinien być interpretowany jako reprezentujący poglądy lub politykę Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków. Wzmianka o produktach komercyjnych, ich źródłach lub wykorzystaniu w związku z materiałami zgłoszonymi w niniejszym dokumencie nie może być interpretowana jako faktyczne lub dorozumiane poparcie takich produktów przez Departament Zdrowia i Opieki Społecznej. Autorzy deklarują, że nie ma sprzecznych interesów w odniesieniu do tej pracy.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez nominację do Programu Uczestnictwa w Badaniach w Centrum Urządzeń i Zdrowia Radiologicznego zarządzanego przez Oak Ridge Institute for Science and Education poprzez międzyagencyjną umowę między Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych a Amerykańską Agencją ds. Żywności i Leków. Autorzy dziękują Richardowi Grayowi, Trentowi Robertsonowi i Annie Avila za ich sugestie i pomoc techniczną. Badanie zostało sfinansowane przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków, Biuro Laboratoriów Naukowych i Inżynieryjnych.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1% żelatynaSTEMCELL Technologies7903Wstępne posiewanie podłoża hodowlanego
48-dołkowa płytkaMatTek P48G-1.5-6-FPodłoże hydrożelowe hiPSC-CM Culture, szklana
6-dołkowa płytkaThermofisher140675hiPSC-CM Culture,
plastikowy suplement B-27, z insulinąInvitrogen17504-044Kardiomiocyty Podłoże
Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2)Fisher Scientificc70-500Tyrode' s rozwiązanie
Platforma i oprogramowanie CellOPTIQ Clyde BiosciencesRejestracja i analiza skurczu Rurka
stożkowa 15 mlCorning 352099hiPSC-CM Dysocjacja
Cyfrowa kamera CMOSHamamatsuC11440-42U30Nagrywanie wideo skurczu
D-PBSLife Technologies14190-144Komora kontroli środowiska do mycia komórek
OKOLAB INCH201-K-FRAMERegulacja środowiskowa
Glukoza Sigma-AldrichG8270-1kgTyrode' s rozwiązanie
HemocytometrFisher Scientific22-600-107hiPSC-CM Liczenie
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode' s solution
iCell Kardiomiocyty Pożywka galwanicznaFujifilm Cellular Dynamic, Inc. M1001hiPSC-CM Pożywka galwaniczna
iCell Kardiomiocyty2, 01434Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. Inkubator R1017hiPSC-CMs
(37 ° C, 5% CO2)Thermofisher50116047hiPSC-CMs
OlympusIX73Obrazowanie hiPSC-CMs
Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl2) Fisher Scientificm33-500Tyrode' s rozwiązanie
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane MatrixCorning 356230z podłożem hydrożelowym
1,5 mlFisher Scientific05-408-129Podłoże hydrożelowe Wielokrotność
Model 4100 Izolowany stymulator dużej mocyAM-SystemsModel 4100 Generator impulsów
Kardiomiocyty MyCell DCM LMNA L35P, 01016Fujifilm Cellular Dynamic, Inc. R1153DCM hiPSC-CMs
Pen-StrepInvitrogen15140-122Pipeta do kardiomiocytów
L-20Pipetahydrożelowa do podłoża17014392
P1000Fisher ScientificF123602G
Końcówki do pipet, 1000 ulFisher Scientific02-707-509
Końcówki do pipet, 20 ulRaininGPS-L10SWytwarzanie podłoża hydrożelowego
Chlorek potasu (KCl) Fisher ScientificP330-500Tyrode' s roztwór
RPMI 1640, z glukozą Invitrogen11875Kardiomiocyty Media
Chlorek sodu (NaCl)Fisher Scientifics641-212Tyrode' s roztwór
wodorotlenku sodu (NaOH)Sigma-Aldrich221465Tyrode" s rozwiązanie
ElektrodyStymulacja i stymulacja CCM
Stoper/TimerFisher Scientific02-261-840Podłoże hydrożelowe do powlekania
Trypan Blue StainLife TechnologiesT10282hiPSC-CM Liczenie
TrypLE Express Life Technologies12605-010hiPSC-CM Dysocjacja
Utrzymuj mikroskop odwrócony Elastyczne probówki do mikrowirówek podwielokrotności Rainin stymulacyjne

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. National burden of heart failure events in the United States, 2006 to 2014. Circulation: Heart Failure. 11 (12), 004873(2018).">Jackson, S. L., et al. National burden of heart failure events in the United States, 2006 to 2014. Circulation: Heart Failure. 11 (12), 004873(2018).
  2. The annual global economic burden of heart failure. International Journal of Cardiology. 171 (3), 368-376 (2014).">Cook, C., Cole, G., Asaria, P., Jabbour, R., Francis, D. P. The annual global economic burden of heart failure. International Journal of Cardiology. 171 (3), 368-376 (2014).
  3. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).">Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  4. Use of human iPSC-CMs in nonclinical regulatory studies for cardiac safety assessment. Toxicology Sciences. 190 (2), 117-126 (2022).">Yang, X., Ribeiro, A. J. S., Pang, L., Strauss, D. G. Use of human iPSC-CMs in nonclinical regulatory studies for cardiac safety assessment. Toxicology Sciences. 190 (2), 117-126 (2022).
  5. 3D cardiac cell culture: A critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87(2019).">Zuppinger, C. 3D cardiac cell culture: A critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87(2019).
  6. Conventional rigid 2D substrates cause complex contractile signals in monolayers of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 600 (3), 483-507 (2022).">Huethorst, E., et al. Conventional rigid 2D substrates cause complex contractile signals in monolayers of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 600 (3), 483-507 (2022).
  7. Matrigel mattress: A method for the generation of single contracting human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 117 (12), 995-1000 (2015).">Feaster, T. K., et al. Matrigel mattress: A method for the generation of single contracting human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 117 (12), 995-1000 (2015).
  8. Acute effects of cardiac contractility modulation stimulation in conventional 2D and 3D human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte models. Frontiers in Physiology. 13, 1023563(2022).">Feaster, T. K., et al. Acute effects of cardiac contractility modulation stimulation in conventional 2D and 3D human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte models. Frontiers in Physiology. 13, 1023563(2022).
  9. Implementation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte to model excitation-contraction coupling in health and disease. , Vanderbilt University Medical Center. PhD thesis (2015).">Feaster, T. K. Implementation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte to model excitation-contraction coupling in health and disease. , Vanderbilt University Medical Center. PhD thesis (2015).
  10. Real-time visualization of titin dynamics reveals extensive reversible photobleaching in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 163-173 (2020).">Cadar, A. G., et al. Real-time visualization of titin dynamics reveals extensive reversible photobleaching in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 163-173 (2020).
  11. Thyroid and glucocorticoid hormones promote functional T-tubule development in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 121 (12), 1323-1330 (2017).">Parikh, S. S., et al. Thyroid and glucocorticoid hormones promote functional T-tubule development in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 121 (12), 1323-1330 (2017).
  12. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).">Wang, L., et al. Hypertrophic cardiomyopathy-linked mutation in troponin T causes myofibrillar disarray and pro-arrhythmic action potential changes in human iPSC cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 320-327 (2018).
  13. Optimizer Smart in the treatment of moderate-to-severe chronic heart failure. Future Cardiology. 16 (1), 13-25 (2020).">Campbell, C. M., Kahwash, R., Abraham, W. T. Optimizer Smart in the treatment of moderate-to-severe chronic heart failure. Future Cardiology. 16 (1), 13-25 (2020).
  14. https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf18/P180036B.pdf (2019).">PMA P180036. FDA Summary of Safety and Effectiveness Data. Food and Drug Administration. , Available from: https://www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf18/P180036B.pdf (2019).
  15. Acute effects of nonexcitatory electrical stimulation during systole in isolated cardiac myocytes and perfused heart. Physiological Reports. 2 (8), 12106(2014).">Blinova, K., et al. Acute effects of nonexcitatory electrical stimulation during systole in isolated cardiac myocytes and perfused heart. Physiological Reports. 2 (8), 12106(2014).
  16. Cardiac contractility modulation with the impulse dynamics signal: Studies in dogs with chronic heart failure. Heart Failure Reviews. 6 (1), 45-53 (2001).">Sabbah, H. N., et al. Cardiac contractility modulation with the impulse dynamics signal: Studies in dogs with chronic heart failure. Heart Failure Reviews. 6 (1), 45-53 (2001).
  17. Acute effects of cardiac contractility modulation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Physiological Reports. 9 (21), 15085(2021).">Feaster, T. K., Casciola, M., Narkar, A., Blinova, K. Acute effects of cardiac contractility modulation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Physiological Reports. 9 (21), 15085(2021).
  18. Cardiac contractility modulation by non-excitatory currents: Studies in isolated cardiac muscle. European Journal of Heart Failure. 8 (1), 7-15 (2006).">Brunckhorst, C. B., Shemer, I., Mika, Y., Ben-Haim, S. A., Burkhoff, D. Cardiac contractility modulation by non-excitatory currents: Studies in isolated cardiac muscle. European Journal of Heart Failure. 8 (1), 7-15 (2006).
  19. Cardiac contractility modulation by electric currents applied during the refractory period. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 282 (5), 1642-1647 (2002).">Mohri, S., et al. Cardiac contractility modulation by electric currents applied during the refractory period. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 282 (5), 1642-1647 (2002).
  20. Electric currents applied during refractory period enhance contractility and systolic calcium in the ferret heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (4), 1119-1123 (2003).">Mohri, S., et al. Electric currents applied during refractory period enhance contractility and systolic calcium in the ferret heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 284 (4), 1119-1123 (2003).
  21. Electric currents applied during the refractory period can modulate cardiac contractility in vitro and in vivo. Heart Failure Reviews. 6 (1), 27-34 (2001).">Burkhoff, D., et al. Electric currents applied during the refractory period can modulate cardiac contractility in vitro and in vivo. Heart Failure Reviews. 6 (1), 27-34 (2001).
  22. Human in vitro neurocardiac coculture (ivNCC) assay development for evaluating cardiac contractility modulation. Physiological Reports. 10 (21), 15498(2022).">Narkar, A., Feaster, T. K., Casciola, M., Blinova, K. Human in vitro neurocardiac coculture (ivNCC) assay development for evaluating cardiac contractility modulation. Physiological Reports. 10 (21), 15498(2022).
  23. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).">Harris, K., et al. Comparison of electrophysiological data from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes to functional preclinical safety assays. Toxicological Sciences. 134 (2), 412-426 (2013).
  24. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).">Blinova, K., et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  25. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).">Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  26. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, 1-15 (2015).">Burridge, P. W., Holmstrom, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 87, 1-15 (2015).
  27. Production of single contracting human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Matrigel mattress technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. 42, 1-7 (2017).">Cadar, A. G., Feaster, T. K., Durbin, M. D., Hong, C. C. Production of single contracting human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Matrigel mattress technique. Current Protocols in Stem Cell Biology. 42, 1-7 (2017).
  28. Chronic cardiotoxicity assays using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3199(2022).">Narkar, A., Willard, J. M., Blinova, K. Chronic cardiotoxicity assays using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). International Journal of Molecular Sciences. 23 (6), 3199(2022).
  29. https://impulse-dynamics.com/wp-content/uploads/2020/05/13-290-008-01-US-Rev-01-OPT-Smart-IPG-IFU.pdf (2018).">OPTIMIZER® Smart Implantable Pulse Generator INSTRUCTIONS FOR USE. ImpulseDynamics. , Available from: https://impulse-dynamics.com/wp-content/uploads/2020/05/13-290-008-01-US-Rev-01-OPT-Smart-IPG-IFU.pdf (2018).
  30. https://impulse-dynamics.com/wp-content/uploads/2021/02/13-290-011-EU-Rev-00-OPTIMIZER-Smart-Mini-IPG-IFU-EU.pdf (2019).">OPTIMIZER™ Smart Mini Implantable Pulse Generator INSTRUCTIONS FOR USE. ImpulseDynamics. , Available from: https://impulse-dynamics.com/wp-content/uploads/2021/02/13-290-011-EU-Rev-00-OPTIMIZER-Smart-Mini-IPG-IFU-EU.pdf (2019).
  31. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).">Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circulation Research. 122 (3), 5-16 (2018).
  32. The "MYOCYTER" - Convert cellular and cardiac contractions into numbers with ImageJ. Scientific Reports. 9, 15112(2019).">Grune, T., Ott, C., Haseli, S., Hohn, A., Jung, T. The "MYOCYTER" - Convert cellular and cardiac contractions into numbers with ImageJ. Scientific Reports. 9, 15112(2019).
  33. Use of cardiac contractility modulation as bridge to transplant in an obese patient with advanced heart failure: A case report. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 833143(2022).">Masarone, D., et al. Use of cardiac contractility modulation as bridge to transplant in an obese patient with advanced heart failure: A case report. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 9, 833143(2022).
  34. All-cause mortality outcomes of usage of cardiac contractility modulation in patients with dilated cardiomyopathy ineligible for cardiac re-synchronization therapy: An updated meta-analysis of randomized controlled trials. Cureus. 12 (9), 10627(2020).">Nadeem, M., Tariq, E. F., Aslam, H. M., Illahi, Y., Shah, R. All-cause mortality outcomes of usage of cardiac contractility modulation in patients with dilated cardiomyopathy ineligible for cardiac re-synchronization therapy: An updated meta-analysis of randomized controlled trials. Cureus. 12 (9), 10627(2020).
  35. Use of cardiac contractility modulation in an older patient with non-ischemic dilated cardiomyopathy: A case report. Clinics and Practice. 11 (4), 835-840 (2021).">Manganelli, G., et al. Use of cardiac contractility modulation in an older patient with non-ischemic dilated cardiomyopathy: A case report. Clinics and Practice. 11 (4), 835-840 (2021).
  36. Automated contraction analysis of human engineered heart tissue for cardiac drug safety screening. Journal of Visualized Experiments. (122), e55461(2017).">Mannhardt, I., et al. Automated contraction analysis of human engineered heart tissue for cardiac drug safety screening. Journal of Visualized Experiments. (122), e55461(2017).
  37. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).">Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756(2020).
  38. Engineered cardiac tissues generated in the Biowire™ II: A platform for human-based drug discovery. Toxicology Sciences. 172 (1), 89-97 (2019).">Feric, N. T., et al. Engineered cardiac tissues generated in the Biowire™ II: A platform for human-based drug discovery. Toxicology Sciences. 172 (1), 89-97 (2019).
  39. Human induced pluripotent stem cell (hiPSC) derived cardiomyocytes to understand and test cardiac calcium handling: A glass half full. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 379-380 (2015).">Hwang, H. S., et al. Human induced pluripotent stem cell (hiPSC) derived cardiomyocytes to understand and test cardiac calcium handling: A glass half full. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 379-380 (2015).
  40. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).">Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  41. Automated analysis of contractile force and Ca2+ transients in engineered heart tissue. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1353-1363 (2014).">Stoehr, A., et al. Automated analysis of contractile force and Ca2+ transients in engineered heart tissue. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (9), 1353-1363 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac Contractility ModulationHuman Stem Cell CardiomyocytesFlexible Hydrogel SubstrateElectrophysiology DevicesVideo Based DetectionCalcium HandlingBeta Adrenergic SignalingContraction AmplitudePatient Specific CardiomyocytesExcitation Contraction Coupling

Related Articles