Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie biologii i metabolizmu tłuszczów beżowych przy użyciu systemu aktywacji CRISPR SunTag-p65-HSF1

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64849

⸱

6 stycznia 2023

 ,  , 
1Obesity and Comorbidities Research Center, State University of Campinas, 2Department of Structural and Functional Biology, Institute of Biology, State University of Campinas

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia użycie CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) w adipocytach (AdipoSPH) jako alternatywnej strategii dla wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do badania biologii beżowego tłuszczu. Wstrzyknięcie in vivo sgRNA przenoszącego AAV ukierunkowanego na endogenny gen Prdm16 jest wystarczające do wywołania rozwoju beżowego tłuszczu i wzmocnienia programu genów termogenicznych.

Streszczenie

Technologia CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) wywołała rewolucję w biologii, a najnowsze narzędzia zostały zastosowane daleko poza pierwotnie opisaną edycją genów. System aktywacji CRISPR (CRISPRa) łączy katalitycznie nieaktywne białko Cas9 (dCas9) z odrębnymi modułami transkrypcyjnymi w celu indukowania endogennej ekspresji genów. SunTag-p65-HSF1 (SPH) to niedawno opracowana technologia CRISPRa, która łączy składniki synergicznych mediatorów aktywacji (SAM) z aktywatorami SunTag. System ten umożliwia nadekspresję jednego lub wielu genów poprzez zaprojektowanie niestandardowego jednoprzewodnikowego RNA (sgRNA). W tym badaniu wcześniej opracowana mysz SPH została wykorzystana do wygenerowania warunkowej myszy wyrażającej SPH w adipocytach (linia adiponektyny Cre), o nazwie AdipoSPH. Aby wywołać fenotyp tłuszczu od białego do beżowego (brązowienia), do pachwinowej białej tkanki tłuszczowej (iWAT) wstrzyknięto wirusa związanego z adenowirusem (AAV) przenoszącym sgRNA ukierunkowanym na endogenny gen Prdm16 (dobrze znany czynnik transkrypcyjny związany z rozwojem brązowej i beżowej tkanki tłuszczowej). Ten mysi model indukował ekspresję endogennego Prdm16 i aktywował program genów termogenicznych. Co więcej, nadekspresja Prdm16 indukowana in vitro SPH zwiększyła zużycie tlenu przez beżowe adipocyty, fenokopiując wyniki poprzedniego transgenicznego modelu myszy Prdm16. W związku z tym protokół ten opisuje wszechstronny, opłacalny i efektywny czasowo model myszy do badania biologii tkanki tłuszczowej.

Wprowadzenie

Beżowe (lub brite) adipocyty to adipocyty bogate w ekspresję białka 1 (UCP1) i mitochondria, które znajdują się w magazynach białej tkanki tłuszczowej (WAT). Beżowy tłuszcz wyłania się z podzbioru komórek progenitorowych adipocytów lub dojrzałych białych adipocytów w odpowiedzi na ekspozycję na zimno i inne bodźce1,2. Beżowe adipocyty mogą przekształcać energię w ciepło w sposób zależny lub niezależny od UCP13. Niezależnie od swojej funkcji termogenicznej, beżowy tłuszcz może również poprawiać zdrowie metaboliczne za pomocą innych środków, takich jak wydzielanie adipokin oraz działanie przeciwzapalne i przeciwzwłóknieniowe. Badania na myszach i ludziach wykazały, że indukcja beżowego tłuszczu poprawia homeostazę glukozy i lipidów w całym organizmie3. Jednak chociaż nasza wiedza na temat biologii beżowego tłuszczu szybko ewoluowała w ostatnich latach, większość jej korzyści metabolicznych i powiązanych mechanizmów nadal nie jest w pełni zrozumiała.

Zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) zostały po raz pierwszy opisane w komórkach eukariotycznych jako narzędzie zdolne do generowania dwuniciowego pęknięcia (DSB) w określonym miejscu genomu poprzez aktywność nukleazy białka Cas94,5. Cas9 jest kierowany przez syntetyczny jednoprzewodnikowy RNA (sgRNA) w celu ukierunkowania na określony region genomu, co prowadzi do DNA DSB. Oprócz wykorzystania nukleazy Cas9 do celów edycji, technologia CRISPR-Cas9 ewoluowała, aby być wykorzystywana jako narzędzie do regulacji genów specyficzne dla sekwencji6. Opracowanie katalitycznie nieaktywnego białka Cas9 (dCas9) i połączenie modułów transkrypcyjnych zdolnych do zwiększenia ekspresji genów dało początek narzędziom do aktywacji CRISPR (CRISPRa). Pojawiło się kilka systemów CRISPRa, takich jak VP647,8, synergiczny mediator aktywacji (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 i SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, który łączy w sobie składniki aktywatorów SAM i SunTag. Niedawno wykazano, że indukowana ekspresja genów neurogennych w neuroblastach N2a i pierwotnych astrocytach jest wyższa przy użyciu SPH w porównaniu z innymi systemami CRISPRa14, co pokazuje, że SPH jest obiecującym narzędziem CRISPRa.

Tutaj skorzystaliśmy z wcześniej opracowanego SPH mouse14, aby wygenerować warunkowy model myszy wyrażający SPH specyficznie w adipocytach przy użyciu linii adiponektyny Cre (AdipoSPH). Za pomocą wirusa związanego z adenowirusem (AAV) przenoszącego gRNA ukierunkowanego na endogenny gen Prdm16, indukowano brązowienie (konwersję z białego do beżowego) pachwinowego WAT (iWAT) w celu zwiększenia ekspresji programu genów termogenicznych. Co więcej, nadekspresja Prdm16 in vitro zwiększała zużycie tlenu. Dlatego protokół ten zapewnia wszechstronny mysi model SPH do badania mechanizmów rozwoju beżowego tłuszczu w tkance tłuszczowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Uniwersytetu Campinas dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (protokół CEUA #5810-1/2021).

1. Klonowanie molekularne

  1. Projektowanie pojedynczych przewodnikowych RNA (sgRNA)
    1. Zaprojektuj sgRNA do aktywacji CRISPR za pomocą CHOPCHOP, dostępnego pod https://chopchop.cbu.uib.no/, lub dowolnego innego odpowiedniego narzędzia. Użyj następujących parametrów, aby zaprojektować sgRNA ukierunkowane na gen Prdm16: Cel: Prdm16; W: Mus musculus; Za pomocą: CRISPR/Cas9; Dla kogo: Activation.
      UWAGA: Zaprojektuj sgRNA dla każdego regionu zainteresowania rozłożonego na 200 pz w regionie miejsca rozpoczęcia transkrypcji (TSS). Na przykład, sgRNA ukierunkowane na Prdm16 użyte w tym badaniu wiąże 154 pz przed TSS.
    2. Dodaj zwisy do sgRNA, aby dopasować miejsce restrykcji SacI w szkielecie wektora pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (patrz Tabela materiałów). Zawierają: 5'- (N20)AGCT-3' (N = nukleotydy). Na przykład sekwencja ukierunkowana na gen Prdm16 to 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3', a z nawisami to 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
    3. Uzyskaj sekwencję odwróconego dopełniacza 3' sgRNA za pomocą narzędzia dostępnego pod adresem https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. Na przykład sekwencja 3' sgRNA ukierunkowana na gen Prdm16 to 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.
  2. Wyżarzanie jednoniciowych oligonukleotydów komplementarnych
    1. Dodać 1 μl każdego jednoniciowego oligonukleotydu 5' i 3' (stężenie podstawowe: 100 μM), 1 μl buforu ligazy T4, 0,5 μl kinazy polinukleotydowej T4 (PNK) (1 × 104 jednostki/ml) i 6,5 μlH2Odo końcowej objętości reakcji 10 μL. Wyżarzać komplementarne jednoniciowe oligonukleotydy za pomocą termocyklera w następujących warunkach: 37 °C przez 30 min i 95 °C przez 5 min, a następnie prędkość zmniejszania 5 °C/min.
      UWAGA: Enzym PNK jest dostarczany z buforem PNK i nie zawiera wystarczającej ilości ATP wymaganej do reakcji fosforylacji (patrz Tabela materiałów). Aby uprościć reakcję, należy użyć buforu ligazy T4 (zamiast buforu PNK). Bufor ligazy T4 dostarcza odpowiednią ilość (1 mM ATP) fosforanu do reakcji fosforylacji. Enzym PNK zapewnia fosforylację końca 5' oligonukleotydów do późniejszej reakcji ligacji.
  3. Ligacja wyżarzonych oligonukleotydów sgRNA
    1. Dodać 25 ng plazmidu pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry do 2 μl wyżarzonych oligonukleotydów sgRNA, 1 μl enzymu SacI, 2 μl 10x buforu ligazy DNA T4, 1 μl ligazy DNA T4 (1-3 u/μL) (patrz tabela materiałów) iH2Odo końcowej objętości reakcji 10 μL.
    2. Ligację przeprowadzić przez inkubację mieszaniny reakcyjnej przy użyciu termocyklera w następujących warunkach: 15 cykli w temperaturze 37 °C przez 5 minut i w temperaturze 25 °C przez 5 minut, a następnie utrzymywanie w temperaturze 4 °C.
  4. Transformacja, po której następuje reakcja łańcuchowa polimerazy kolonii (PCR)
    1. Przekształć właściwe komórki E. coli DH10B (patrz tabela materiałów) za pomocą 4 μl produktu ligacji, stosując szok termiczny (42 °C przez 45 s) i rozprowadzić na płytce agarowej zawierającej 100 μg/ml ampicyliny.
    2. Potwierdzić przekształcone kolonie metodą PCR kolonii przy użyciu głównej mieszanki PCR (patrz tabela materiałów). Wybrać kolonię i wymieszać z 5 μl mieszanki wzorcowej, 0,1 μl startera uniwersalnego (stężenie podstawowe: 100 μM), 0,1 μl startera odwrotnego sgRNA (stężenie podstawowe: 100 μM) (tabela 1) i 5 μlH2O. Uruchomić PCR za pomocą termocyklera w następujących warunkach: początkowa denaturacja (94 °C przez 2 min), następnie następuje 35 cykli denaturacji (94 °C przez 20 s), wyżarzania (60 °C przez 30 s), przedłużania (72 °C przez 30 s) i końcowego etapu wydłużania (72 °C przez 5 min). Rozpuść DNA za pomocą agarozy (1,5%) elektroforezy żelowej w 0,5x buforze TAE przy 90 V przez 30 min.
      UWAGA: Dodatnie klony dają pasmo ~280 pz.
    3. Przesłać próbki dodatnie do sekwencjonowania Sangera przy użyciu uniwersalnego startera (Tabela 1, Plik uzupełniający 1).
  5. Oczyszczanie plazmidu
    1. Oczyść plazmid z dodatniego klonu za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Oczyść plazmid za pomocą żywicy anionowymiennej lub innego zestawu odpowiedniego do użycia w transfekcji komórek.
    2. Inkubować dodatni klon (12 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min) przy użyciu standardowej pożywki bakteryjnej zawierającej 100 μg/ml ampicyliny.
    3. Odwirować komórki bakteryjne w temperaturze 6 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Opakowanie AAV

UWAGA: pakowanie AAV zostało wykonane zgodnie z poprzednimi publikacjami15,16 z niewielkimi modyfikacjami.

  1. Umieścić komórki 293T (patrz tabela materiałów) w kolbie o długości175 cm2 (wysiew 5 × 106 komórek na kolbę) przy użyciu 25 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S). Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%, aż komórki osiągną zbieżność 50%-70%.
  2. Zmieszać 14 μl polietyleniminy (1 μg/μl) z 1 ml 150 mM NaCl. Wymieszaj trzy plazmidy wymagane do produkcji AAV w stosunku molowym 1:1:1 (tj. 17,7 μg pAdDeltaF6, 7,9 μg AAV2/8 (patrz Tabela materiałów) i 5,9 μg sklonowanego sgRNA z etapu 1 w 1 ml 150 mM NaCl. Przenieść mieszaninę polietyleneniminy:NaCl kropla po kropli do probówki zawierającej DNA (mieszaninę plazmidów) i inkubować przez 20 minut w temperaturze 25 °C.
    UWAGA: pAdDeltaF6 jest plazmidem pomocniczym, a pCapsid pAAV2/8 jest plazmidem pakującym eksprymującym geny replikacji (Rep) i kapsydu (cap). Oba plazmidy są niezbędne do produkcji AAV.
  3. Przed transfekcją należy zastąpić pożywkę do wzrostu komórek 18 ml DMEM zawierającego 1% FBS i L-alanylo-L-glutaminę (0,5 g/l). Dodać 2 ml mieszaniny polietyleninaminy:DNA do każdej kolby hodowlanej i inkubować komórki w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2 wilgotności).
  4. Po 5 godzinach dodaj 5 ml DMEM uzupełnionego o 10% FBS i L-alanylo-L-glutaminę (0,5g/L).
  5. Po 3 dniach inkubacji oderwać komórki od kolby hodowlanej za pomocą skrobaka do komórek. Zebrać komórki 293T z 10 (175cm2) kolb do hodowli komórkowych do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i dodać DMEM (patrz tabela materiałów) do 30 ml.
  6. Dodać 3 ml chloroformu do każdej stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej komórki 293T i mieszać za pomocą mieszalnika wirowego z dużą prędkością przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki, dodając 7,6 ml 5 M NaCl i krótko wirować. Wirować w temperaturze 3 000 × g i temperaturze 4 °C przez 5 min.
  7. Przenieś fazę wodną do nowej stożkowej probówki i dodaj 9,4 ml 50% (v/v) glikolu polietylenowego (PEG) 8000. Mieszać mieszalnikiem wirowym z dużą prędkością przez 10 s i umieszczać próbki na lodzie na 1 godzinę.
  8. Wirować w temperaturze 3 000 × g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Usunąć supernatant i pozostawić osad do wyschnięcia na 10 minut.
  9. Dodać 1,4 ml HEPES (50 mM, pH 8) i mieszać przez 5 minut za pomocą mieszalnika wirowego na wysokich obrotach. Dodać 3,5 μl 1 M MgCl2, 14 μl DNazy I (20 jednostek/μl) i 1,4 μl RNazy A (10 μg/μL). Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie przenieść próbki do nowych probówek o pojemności 1,5 ml (po 700 ml w każdej probówce).
  10. Dodać 700 μl chloroformu do każdej probówki o pojemności 1,5 ml i mieszać za pomocą mieszalnika wirowego na wysokich obrotach przez 10 s. Odwirować przy 3 000 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i przenieść fazę wodną do nowej probówki. Powtórz ten krok 3 razy.
  11. Odparowywać chloroform przez 30 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Następnie przenieść 300 μl fazy wodnej do probówki ultrawirówkowej o pojemności 0,5 ml (patrz tabela materiałów). Obracać filtr w temperaturze 14 000 × g w temperaturze 25 °C przez 5 minut. Wyjmij przepływ i ponownie zakręć filtrem, aż cała objętość przejdzie przez filtr.
  12. Umyć filtr, dodając 300 μl buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco i wymieszać roztwory przez pipetowanie. Odwirować filtr przez 5 minut w temperaturze 14 000 × g w temperaturze 25 °C. Powtórzyć ten etap mycia 4 razy.
  13. Odwirować filtr przez 8 minut w temperaturze 14 000 × g w temperaturze 25 °C. Umieścić filtr do góry nogami w nowej probówce i wirować przez 2 minuty w temperaturze 1 000 × g w temperaturze 25 °C.

3. Miareczkowanie AAV metodą qPCR

  1. Przygotuj krzywą wzorcową do miareczkowania AAV i określ miano AAV zgodnie z oryginalnym badaniem przeprowadzonym przez Fripont et al.15.

4. Iniekcja in vivo AAV do pachwinowej białej tkanki tłuszczowej (iWAT)

  1. Oddziel narzędzia chirurgiczne i materiały potrzebne do operacji i wysterylizuj je zgodnie z zaleceniami dla każdego konkretnego materiału.
  2. Znieczulić mysz 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Potwierdź znieczulenie, wywierając energiczny nacisk na łapę i ogon oraz sprawdzając, czy nie ma odruchu. Nałóż maść na oczy myszy, aby uniknąć wysuszenia oczu podczas zabiegu.
  3. Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na plecach i ogol niewielki obszar na bokach, proksymalnie do stawów biodrowych w przypadku wstrzyknięć iWAT, za pomocą golarki. Nakładaj krem do depilacji przez 5 minut. Usuń resztki kremu wodą, aby uniknąć poparzenia skóry.
  4. Zdezynfekuj skórę za pomocą trzech naprzemiennych rund nakładania roztworu antyseptycznego (powidon-jod) na skórę za pomocą czystej gazy i 70% alkoholu. Wyrzuć gazę po każdym użyciu.
  5. Wykonaj ostateczną aplikację roztworu antyseptycznego na skórę. Następnie wykonaj 1-2 cm nacięcie wysterylizowanymi nożyczkami w bliższym obszarze stawów i przytrzymaj skórę otwartą za pomocą kleszczy, aby odsłonić magazyn tłuszczu. WAT można znaleźć przyczepiony do skóry po obu stronach, rozciągający się od początku z tyłu i w dół w kierunku jądra.
    UWAGA: Używaj serwet, aby uniknąć zanieczyszczenia podczas operacji lub zabiegów szwów.
  6. Za pomocą kleszczy, przez nacięcie, delikatnie pociągnij magazyn tłuszczu do góry, aby upewnić się, że wstrzyknięcie znajduje się we właściwym miejscu i na odpowiedniej głębokości.
    UWAGA: Uważaj, aby nie usunąć tkanki z jej pierwotnego położenia.
  7. Napełnij strzykawkę mikrolitrową (wskaźnik: 33; styl punktowy: 4; kąt: 12; długość: 10) (patrz tabela materiałów) 2,5 μl (5,6 × 1010 genomów wirusa [VG]/μL) AAV (zawierających sgRNA ukierunkowane na endogenny gen Prdm16). Ostrożnie włóż igłę pod kątem 30°-45° do iWAT. Powtórz wstrzyknięcie 5 razy w różne miejsca tkanki, aby jednorodnie zainfekować całą poduszeczkę tłuszczową iWAT. Do zainfekowania iWAT.
    zalecana jest całkowita objętość 15 μl UWAGA: Głębokość wprowadzenia strzykawki zależy od grubości osadu poduszeczki tłuszczowej. Do wykonania wstrzyknięcia należy użyć techniki bezdotykowej.
  8. Zamknij ogolone nacięcie skóry za pomocą szwów monofilamentowych 4/0. Umieść mysz na poduszce grzewczej, aż odzyskasz przytomność. Monitoruj zwierzę co 10-15 minut, aż w pełni wyzdrowieje. Po odzyskaniu przytomności zwierzęcia należy obserwować profilowanie lokomotoryczne, które powinno być liniowe i nie powinno nosić oznak niepokoju czy bólu.
  9. Przeprowadzić kontrolę bólu pooperacyjnego w ciągu 48 godzin po zabiegu, podając chlorowodorek tramadolu (5 mg/kg) dootrzewnowo przez 3 dni (2x/dobę).
    UWAGA: Zwracaj uwagę na oznaki niepokoju i dyskomfortu oraz monitoruj spożycie wody i pokarmu. Podaj skuteczną dawkę leku przeciwbólowego w sposób zapobiegawczy, najlepiej przed lub na początku zabiegu.
  10. Trzymaj mysz w klatce ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody w okresie gojenia. Po okresie gojenia przystąp do eutanazji myszy. W tym badaniu eutanazja została przeprowadzona przez przedawkowanie środków znieczulających do wstrzykiwań (dootrzewnowych) od 3-krotności dawki indukującej (300-360 mg/kg chlorowodorku ketaminy + 30-40 mg/kg chlorowodorku ksylazyny), a następnie dekapitację.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się trzymanie zwierząt w oddzielnych klatkach do czasu całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia.

5. Różnicowanie in vitro komórek naczyniowych zrębu (SVF) w beżowe adipocyty

  1. Wykonaj izolację i posiew pierwotnych SVF z iWAT myszy AdipoSPH zgodnie z Aune et al.17. Wysiewaj SVF pochodzące od myszy AdipoSPH iWAT na 6-dołkową płytkę zawierającą kompletne podłoże (DMEM zawierające 3,1 g / l glukozy, 0,5 g / l L-alanylo-L-glutaminy, 10% FBS i 2,5% P / S) przez 1-2 godz.
    UWAGA: Frakcja SVF zawiera mieszaninę różnych typów komórek. Na tym etapie nie jest możliwe określenie liczby wysianych komórek progenitorowych, które dają początek adipocytom.
  2. Odessać pożywkę, przemyć studzienkę 2x roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (1x PBS) i zastąpić świeżą kompletną pożywką. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2, wilgotności 95%, aż komórki osiągną zlewność 70%-80%.
  3. Indukować różnicowanie (dzień 0) poprzez traktowanie komórek pożywką indukcyjną (Tabela 2).
    UWAGA: Koktajl leku z pożywki indukcyjnej jest niezbędny do zwiększenia różnicowania beżowych adipocytów i do ekspresji genu termogenicznego program17.
  4. Po 2 dniach (dzień 2) zastąpić pożywkę indukcyjną pożywką konserwacyjną (Tabela 2).
  5. Po 2 dniach (dzień 4) należy wymienić pożywkę podtrzymującą na nową pożywkę do konserwacji (Tabela 2) na 2 do 3 dni.
  6. Zmieniaj pożywkę podtrzymującą co 48 godzin, aż preadipocyty całkowicie zróżnicują się w adipocyty (zwykle 6 dni po dodaniu pożywki indukcyjnej). Dojrzałe adipocyty można obserwować za pomocą mikroskopii świetlnej, ponieważ zróżnicowane komórki wydają się być naładowane kropelkami lipidów.

6. Zakażenie in vitro AAV SVF

UWAGA: SVF-y pochodzące od myszy AdipoSPH iWAT zostały zainfekowane sgRNA-Prdm16 przenoszącym AAV, jak to wcześniej opisali Wang et al.18 z kilkoma modyfikacjami.

  1. Hoduj komórki na 6-dołkowej płytce hodowlanej z kompletnym podłożem, aż komórki osiągną zbieżność 70%-80%, jak opisano wcześniej w krokach 5.1-5.3.
  2. Zmieszać 5,6 ×10 10 VG/μL sgRNA-Prdm16 przenoszącego AAV z 2 ml kompletnej pożywki i bromkiem heksadimetryny (8 μg/ml) (patrz tabela materiałów). Transdukuj komórki, zastępując kompletną pożywkę i dodając kompletną pożywkę zawierającą AAV. Inkubować transdukowane komórki przez 12 godzin w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5% CO2 .
  3. Podziel i wysiewaj komórki zgodnie z opisem w kroku 5 w celu proliferacji i różnicowania komórek w beżowe adipocyty.
    UWAGA: Do testu zużycia tlenu, wysiewaj 4.0 × 104 komórek (od kroku 6.2) na studzienkę z pożywką indukcyjną na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowych. Kolejne etapy proliferacji i różnicowania komórek przeprowadza się zgodnie z opisem w kroku 5. Test zużycia tlenu jest wykonywany, gdy komórki osiągną 80%-100% zbiegu i są w pełni zróżnicowane, jak wcześniej podano19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Myszy AdipoSPH opracowano poprzez krzyżowanie szczepów myszy SPH oraz Adipoq-Cre. Oba szczepy myszy posiadały hybrydowe tło C57BL6J-DBA/2J (zgodnie z informacjami od dostawcy komercyjnego; patrz Tabela Materiałów). Linia myszy SPH została pierwotnie opisana przez Zhou i współpracowników14.

Rozwój adipocytów beżowych in vivo poprzez nadekspresję Prdm16 za pośrednictwem AdipoSPH
Aby ocenić zdolność modelu op...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jednym z najbardziej użytecznych zastosowań technologii CRISPR bez edycji jest badanie funkcji genów poprzez aktywację endogennych genów za pomocą systemówCRISPRa 6. SPH to potężny CRISPRA, który został pierwotnie opisany jako indukujący konwersję astrocytów w aktywne neurony poprzez celowanie w kilka genów neurogennych14. W tym badaniu wykazano, że AdipoSPH jest odpowiednim narzędziem do badania biologii beżowego tłuszczu poprzez aktywację ekspresji endogennego Prdm16 w ad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie otrzymane od Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, dla pokolenia myszy AdipoSPH, Laboratorium Inmmunometabolizmu i Sygnalizacji Komórkowej oraz National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC) za wszelkie wsparcie eksperymentalne. Dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Fundacji Badawczej Sao Paulo (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3,3',5-triiodo-L-tyroninaSigma-AldrichT2877
3-izobutylo-1-metyloksantynaSigma-AldrichI5879
Linia komórkowa AAVpro 293TTakarabio632273
100 KDa
DeksametazonSigma-AldrichD1756
Modyfikacja pożywki Eagles Medium (DMEM) firmy DulbeccoCorning10-017-CV
Zmodyfikowana pożywka Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco F-12, GlutaMAX™ suplementGibco10565-018wysokie stężenia glukozy, aminokwasów i witamin
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)Sigma-AldrichD8662
Excelta Samootwierające mikronożyczkiFisher Scientific17-467-496
Płodowa surowica bydlęcaSigma-AldrichF2442
Skrobaki do komórek Fisherbrand (100 szt.)Fisher Scientific08-100-241
Fisherbrand Wysoka precyzja, prosta, stożkowa, ultra cienka pęseta/kleszczeFisher Scientific12-000-122
Fisherbrand Ostre nożyczki preparacyjneFisher Scientific08-940
GlicerolSigma-AldrichG5516
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Bromek heksadimetryny (Polybrene)Sigma-AldrichH9268
IndometacynaSigma-AldrichI7378
InsulinaSigma-AldrichI9278
LigaFast Rapid System ligacji DNAPromegaM8225
Zestaw do oczyszczania Maxiprep Qiagen12162
Strzykawka mikrolitrowaHamilton80308Model 701
NEB 10-beta/Stabilny New England BiolabsC3019HE. coli kompetentne komórki
pAAV2/8 Addgene 
pAAV-U6-gRNA-CBh-mDodatek wiśniowy 91947
pAdDeltaF6 Addgene 
PEG 8000Sigma-Aldrich89510
Penicylina/streptomycynaGibco15140-122
PolietylenSigma-Aldrich23966Liniowy, MW 25000
Powidon-jodRioquí mika510101303Antyseptyczny
rozyglitazonSigma-AldrichR2408
Enzym SacINew England BiolabsR0156
Projekt chirurgiczny Kleszcze Premier AdsonFisher Scientific22-079-741
StrzykawkaHamilton475-40417
Ligaza DNA T4PromegaM180B
Bufor ligazy DNA T4 Zestaw enzymatyczny New England BiolabsB0202S
T4 PNKNew England BiolabsM0201S
Chlorowodorek tramadoluSEM43930
Żel Vidisic Bausch + Lomb Numer katalogowy: 99620
Ultra Filtr odśrodkowy Amicon UFC510008 112864112867

Bibliografia

  1. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
  2. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  3. Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
  7. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  8. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  9. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  10. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  13. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  14. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  15. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960(2019).
  16. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103(2020).
  17. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).
  18. Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
  19. Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118(2020).
  20. Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
  21. Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
  22. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
  23. Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
  24. Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
  25. Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
  26. Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  27. Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
  28. Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
  29. Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Aktywacja CRISPRekspresja genów w adipocytachnadekspresja Prdm16wirus towarzyszący adenowirusombiała tkanka tłuszczowatermogenny program genowyzużycie tlenukomórki naczyniowo-stromalne
Badanie biologii i metabolizmu tłuszczów beżowych przy użyciu systemu aktywacji CRISPR SunTag-p65-HSF1
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.