Artykuł metodologiczny

Opracowanie modelu gojenia zębodołu po ekstrakcji zębów trzonowych żuchwy u myszy

DOI:

10.3791/64855

⸱

13 stycznia 2023

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Stomatology Hospital, Sichuan University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół krok po kroku pokazuje, jak wydobyć pierwszy ząb trzonowy żuchwy u myszy. Stanowi alternatywną metodę dla badaczy zajmujących się gojeniem i regeneracją kości szczęki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie wprowadza rozwój modelu ekstrakcji zębów trzonowych w żuchwie, aby zapewnić praktyczny model do badania regeneracji kości wyrostka zębodołowego i kostnienia wewnątrzbłoniastego. Myszy C57 / J6 użyto do ekstrakcji pierwszego zęba trzonowego żuchwy w celu ustalenia tego modelu. Zostały one poddane eutanazji, a obustronne żuchwy pobrane odpowiednio po 1 tygodniu i 4 tygodniach od operacji. Następnie przeprowadzono seryjne stereoskopowe pobranie, ocenę histologiczną i barwienie immunofluorescencyjne, aby wykazać udaną operację. Bezpośrednio po zabiegu na obrazach stereoskopowych uwidocznił się pusty zębodół ekstrakcyjny. Hematoksylina i eozyna (H&E) po 1 tygodniu i barwienie Massonem po 4 tygodniach po operacji wykazały, że obszar pierwotnego korzenia był odpowiednio częściowo i całkowicie wypełniony beleczkami kostnymi. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało, że w porównaniu ze stroną homeostazy, ekspresja Sp7 wzrosła po 1 tygodniu od operacji, co sugeruje energiczną osteogenezę w dole wyrostka zębodołowego. Wszystkie te wyniki wykazały praktyczny model gojenia zębodołu po ekstrakcji zęba mysiego. Nadchodzące badania ujawniające mechanizmy gojenia się ubytków kości szczęki lub zębodołów mogą przyjąć tę metodę.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gojenie się zębodołu po ekstrakcji zęba jest częstym scenariuszem klinicznym, który może prowadzić do niepotrzebnych powikłań, takich jak krwotok z zębodołu, suchy zębodoł, a nawet zapalenie kości i szpiku szczęki w przypadku niepożądanego gojenia1,2,3. Te choroby współistniejące mogą pogorszyć jakość życia pacjentów, a co gorsza, stanowić poważne wyzwanie dla rehabilitacji protetycznej z powodu masywnego zaniku masy kostnej4. Chociaż etapy gojenia zębodołu zostały wyjaśnione, są one niewystarczające do kierowania opieką kliniczną po operacji ekstrakcji zęba w przypadku napotkania różnych wyzwań związanych z rokowaniem4.

Przeprowadzono wiele badań opartych na modelach zwierzęcych, aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw procesu gojenia się zębodołu i zapobiec powyższym sytuacjom. Sp7 jest głównym regulatorem różnicowania osteoblastów, odgrywając istotną rolę w rozwoju szkieletu, hemostazie kości i regeneracji kości5,6. Racjonalne modele gojenia zębodołów mogą wykazać nadmiarowość Sp7 po urazach w regeneracji kości. Ponadto, w odróżnieniu od gojenia złamań kości długich, tylko jeden proces osteogenny, kostnienie śródbłoniaste, obejmuje proces gojenia się gniazda ekstrakcyjnego7. To sprawia, że model ekstrakcji zębów zwierzęcych jest optymalny do badania terapii opartych na implantach, ponieważ osteointegracja implantu podlega tej samej regule osteogennej8.

Przez dziesięciolecia model ekstrakcji zębów był wykonywany u szczurów, królików i psów, ponieważ te gatunki mają duże zęby, które są wygodne w obsłudze9,10,11. Jednak biorąc pod uwagę rosnące zapotrzebowanie na modyfikacje genetyczne i jako bardziej adaptacyjne tło genetyczne dla ludzi, myszy są coraz częściej wykorzystywane do stworzenia modelu ekstrakcji zębów. Odtąd naukowcy mogli odkryć rolę określonej populacji komórek w procesie gojenia się zębodołu, używając myszy ze zmodyfikowanym genomem, zamiast obserwować tylko fenotypy12. Wśród modeli zębodołu do ekstrakcji zębów mysich wcześniejsze badania wykazały proces powstawania i gojenia zębów do ekstrakcji mysich zębów szczękowych i siekaczy13,14,15,16. Jednak wzorzec gojenia wynikający z rokowania oraz detektywistyczne i obserwacyjne punkty czasowe mogą się różnić w zależności od protokołu. Odwołuje się to do uniwersalnego kryterium, według którego uczeni mogą ustalić model gojenia zębodołu

.

To badanie miało na celu stworzenie praktycznego modelu leczenia mysich zębodołów dla powyższych problemów. Zęby trzonowe żuchwy u myszy mają charakterystyczne cechy morfologiczne w porównaniu z zębami trzonowymi i siekaczami szczęki, co ma wyjątkowe zalety i wady. Ponieważ modele skupiające się na mysiej żuchwie są obecnie oparte na próżni, protokół ten próbował zapewnić znakomitą metodę ekstrakcji pierwszego zęba trzonowego żuchwy u myszy. Mamy nadzieję, że ten protokół dostarczy badaczom nowych pomysłów, które pozwolą odkryć mechanizmy leżące u podstaw gojenia się zębodołów i wskażą opiekę kliniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach w tym badaniu zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Szkoły Stomatologii Zachodniochińskiej, Uniwersytetu Sichuan (WCHSIRB-D-2017-041). Do niniejszego badania wykorzystano dorosłe myszy C57BL/6, pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).

1. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Przygotowanie instrumentu
    1. Przygotuj różne igły lub jednorazowe strzykawki (26G, 25G, 23G; patrz Tabela Materiałów) do użycia jako windy. Odchyl igły o około 20°-40°, jak pokazano na rysunku Rysunek 1.
    2. Przygotuj ząbkowaną pęsetę okulistyczną jako kleszcze. Upewnij się, że pasuje do rozmiaru zębów trzonowych myszy i może mocno chwycić zęby trzonowe. Idealny rozmiar pęsety jest pokazany w Rysunek 1A, B3.
    3. Zaopatrz się w gumkę (którą można oderwać od medycznej rękawicy lateksowej), która będzie używana jako otwieracz do ust, tablicę piankową lub tablicę korkową jako platformę chirurgiczną, latarkę czołową do oświetlania obszaru operacyjnego oraz poduszkę grzewczą do ożywienia pooperacyjnego. Rozerwij suchy wacik na małe kawałki i przyłóż go do pola operacyjnego, jeśli podczas zabiegu wystąpi krwawienie.
  2. Przygotowanie znieczulenia
    1. Mysz może być znieczulona za pomocą dowolnego odpowiedniego protokołu znieczulającego, który osiąga znieczulenie ogólne potwierdzone metodą "szczypania palców u stóp". Po znieczuleniu nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy.
      UWAGA: Preferowanym protokołem znieczulenia ogólnego może być: indukcja i leczenie podtrzymujące ksylazyną (10 mg/kg) i ketaminą (100 mg/kg) dootrzewnowo (IP);
      W tym badaniu izofluran i 1% pentobarbital sodu (50 mg/kg, IP) stosowano do indukcji znieczulenia i leczenia podtrzymującego w dodatkowych dawkach w razie potrzeby.
  3. Przygotowanie do dezynfekcji i sterylizacji
    1. Zdezynfekuj platformę operacyjną i górną część boiska na świeżym powietrzu za pomocą opryskiwacza na etanol o stężeniu 75%. Przed każdym zabiegiem na myszach zaleca się użycie nowego zestawu jednorazowych igieł.
      UWAGA: Pęseta zębata jest wielokrotnego użytku i może być sterylizowana dowolną preferowaną metodą, taką jak sterylizacja parowa.

2. Proces chirurgiczny

  1. Fiksacja myszy i jej żuchwy
    1. Przywiąż mysz do platformy chirurgicznej w pozycji leżącej na plecach za pomocą taśmy klejącej. Przypnij dwie igły 26 G w linii z płaszczyzną ucha oczodołu, a kolejne dwie igły 26 G swobodnie poniżej żuchwy.
    2. Nałóż gumkę na igły i skrzyżuj siekacze, aby utrzymać otwarte usta. Lekko wyciągnij język i zamocuj go pod gumką po przeciwnej stronie chirurgicznej, aby nie zasłaniał pola widzenia (Rysunek 1C).
  2. Eliminacja oporu dystalnego
    1. Przytrzymaj ząb trzonowy pęsetą mezjalnie, wbij igłę 23 G w kość wyrostka zębodołowego dystalnego korzenia i wykonaj interwał.
      UWAGA: Ten krok należy wykonać z dużą ostrożnością, ponieważ igła, która jest osadzona zbyt głęboko, prawdopodobnie złamie korzeń.
    2. Następnie zmień na 25 G neede, aby kontynuować rozszerzanie interwału i delikatnie przesuwać się w kierunku obszaru okołowierzchołkowego, powoli obracając igłę do przodu i językowo (z anatomiczną pozycją myszy), aby wycisnąć korzeń z dołu wyrostka zębodołowego.
  3. Eliminacja oporu mezjalnego
    1. Gdy jest wystarczająco dużo miejsca, użyj igły 23 G, aby włożyć ją do widełek korzeniowych i podnieść ząb trzonowy okluzyjnie. Po mocnym przytrzymaniu zęba trzonowego, weź kolejną igłę 23 G i wepchnij ją w błonę przyzębia językowego, aby utworzyć interwał.
    2. Następnie zastąp igłą 25 G i powoli obracaj do przodu i policzkowo. Jeśli jakieś ukryte przeszkody utrudniają zwichnięcie zęba trzonowego, użyj igły 26 G, aby przebić wierzchołek korzenia i powtórzyć operacje.
  4. Ekstrakcja końcowa
    1. Usuń ząb i podczas ekstrakcji upewnij się, że korona wznosi się wysoko ponad płaszczyznę zgryzu i że wyraźnie widać dwa nienaruszone korzenie.
      UWAGA: Zwichnięcie (zwichnięcie) zęba jest uważane za najbardziej bolesny i niepokojący moment zabiegu. Przed zwichnięciem zęba należy ponownie ocenić głębokość znieczulenia za pomocą testu szczypania palca u nogi, a w związku z tym w razie potrzeby podać umiarkowaną dawkę środka znieczulającego.
  5. Opieka pooperacyjna
    1. Po usunięciu zęba nałóż suchą bawełnę, aby zatrzymać krwawienie, zmień położenie języka, podawaj karprofen (5 mg/kg) podskórnie i umieść mysz na poduszce grzewczej o stałej temperaturze do czasu wyzdrowienia ze znieczulenia.

3. Obrazowanie żuchwy myszy i gniazda ekstrakcyjnego

  1. Przygotowanie próbek
    1. Poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Użyj nożyczek okulistycznych, aby przeciąć mięśnie szkieletu przyczepione do żuchwy i łuku jarzmowego. Przeciąć od gardła wzdłuż dolnej krawędzi żuchwy do wstępującej gałęzi, a następnie do tylnej strony kłykcia, a następnie pociągnąć żuchwę w dół i przeciąć wzdłuż dolnej linii środkowej siekaczy. W ten sposób zbierane są dwie oddzielne żuchwy.
    2. Wykonaj utrwalanie, demineralizację i odwadnianie zgodnie ze standardową procedurą17. Podczas osadzania17 upewnij się, że płaszczyzna okluzyjna jest równoległa do krawędzi kasety (patrz Tabela materiałów). Zamocuj żuchwę na spodzie kasety, z jej dolną krawędzią napiętą (Rysunek 2).
      UWAGA: Ten protokół oferuje płaszczyznę strzałkową obszaru żuchwy.
  2. Utrwalanie próbki na mikrotomie
    1. Wyreguluj zacisk próbki w mikrotomie, aby wystawać kłykieć i stronę korony o 5°-20° więcej, aby uzyskać zintegrowany obraz miazgi koronowej współcześniejącej z miazgą korzeniową (Rysunek 2).
  3. Przygotowanie sekcji
    UWAGA: Kłykieć jest zawsze pierwszą strukturą anatomiczną, która ma zostać przecięta. Kiedy zniknie, obszar trzonowca można następnie pokroić na kilka plasterków.
    1. Przesuń zakres mikrotomów na 5 μm, zbierz co osiem plasterków i poszukaj zębiny w ostatnim plasterku. Jeśli zębina koronowa pojawia się po raz pierwszy bez zębiny wierzchołkowej korzenia, wyreguluj zacisk próbki tak, aby obszar korzenia wystawał i odwrotnie.
  4. Zbieranie sekcji
    UWAGA: Kąt cięcia jest odpowiedni, dopóki zębina nie zostanie równomiernie osiągnięta zarówno w koronie, jak i w obszarze wierzchołkowym.
    1. Ciąć w tym kierunku i obserwować plastry pod mikroskopem, aż miazga zębowa pojawi się zarówno w koronie, jak i korzeniach. Zbierz skrawki, gdy na powierzchni próbki parafiny pojawi się niewyraźny kontur zębów trzonowych17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wyjaśnić praktyczne zastosowanie tej metody, pobrano pierwszy ząb trzonowy prawej żuchwy dwóch zdrowych myszy C57BL/6 (3 miesiące, obie samice) i obserwowano je odpowiednio przez 1 tydzień i 4 tygodnie. Nieuszkodzone lewe żuchwy były używane jako zdrowa kontrola. Rysunek 1A pokazuje specyficzne cechy aparatu chirurgicznego, w tym igły 26-23 G i zębatą pęsetę okulistyczną. Igła 26 G jest punktowo wyjmowana i wyginana. Igła 25 G jest wygięta pod kątem około 25° w punkcie. Igły 23 G są podstawą opera...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model gojenia zębodołu jest ważną metodą odkrywania mechanizmów leżących u podstaw gojenia i regeneracji kości, ostatecznie rozwiązując problemy kliniczne. Dotychczasowe badania wykazały możliwość modelu ekstrakcji siekaczy i modelu ekstrakcji zębów trzonowych szczęki, podczas gdy w badaniach nie wykorzystano modelu pierwszego trzonowca żuchwy 13,17,18. Jednak siekacze mają kluczowe znaczenie dla życia gryzoni, a ich upośledzeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie oryginalne dane i obrazy są zawarte w tym artykule. Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez National Natural Science Foundation of China 81825005 (L.Y.), 82201045 (F.Y.) i 82100982 (F.L.), oraz przez Program Nauki i Technologii Prowincji Sichuan 2021JDRC0144 (F.L.), 2022JDRC0130 (F.Y.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
23/25/26 G igłaChengdu Xinjin Shifeng Aparatura medyczna i Instrumenty Co., Sp. z o.o.SB1-074(IV)
C57/B6J Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, ChinyC57/B6J
DAPI Beyotime Cat#C1005
Kasety do zatapianiaCITOTEST Scientific80106-1100-16
Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozynyBiosharpBL700B
IsofluraneRWD Life Science Co., LtdR510-22-10
Masson' s Zestaw bejc trichromowychSolarbioG1340
Microtome LeicaRM2235
Pentobarbital SodiumHuaxia Chemical Reagent Co., Ltd2018042001
Królik poliklonalny anty-Sp7 Abcam Cat# ab22552
PęsetaChengdu Xinjin Shifeng Aparatura medyczna i Instrumenty Co., Sp. z o.o.Zobacz materiał SB2-115
Roztwór do barwienia

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mamoun, J. Dry socket etiology, diagnosis, and clinical treatment techniques. Journal of the Korean Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 44 (2), 52-58 (2018).
  2. Laraki, M., Chbicheb, S., El Wady, W. Alveolitis: review of the literature. Odonto-Stomatologie Tropicale = Tropical Dental Journal. 35 (139), 19-25 (2012).
  3. Soundia, A., et al. Osteonecrosis of the jaws (ONJ) in mice after extraction of teeth with periradicular disease. Bone. 90, 133-141 (2016).
  4. Araújo, M. G., Silva, C. O., Misawa, M., Sukekava, F. Alveolar socket healing: what can we learn. Periodontology 2000. 68 (1), 122-134 (2015).
  5. Hojo, H., Ohba, S. Sp7 Action in the skeleton: its mode of action, functions, and relevance to skeletal diseases. International Journal of Molecular Sciences. 23 (10), 5647(2022).
  6. Zhou, X., et al. Multiple functions of Osterix are required for bone growth and homeostasis in postnatal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 12919-12924 (2010).
  7. Ito, S., et al. Pathological differences in the bone healing processes between tooth extraction socket and femoral fracture. Bone Reports. 16, 101522(2022).
  8. Vasak, C., et al. Early bone apposition to hydrophilic and hydrophobic titanium implant surfaces: a histologic and histomorphometric study in minipigs. Clinical Oral Implants Research. 25 (12), 1378-1385 (2014).
  9. Araújo, M. G., Lindhe, J. Dimensional ridge alterations following tooth extraction. An experimental study in the dog. Journal of Clinical Periodontology. 32 (2), 212-218 (2005).
  10. Kim, I. -S., Ki, H. -C., Lee, W., Kim, H., Park, J. -B. The effect of systemically administered bisphosphonates on bony healing after tooth extraction and osseointegration of dental implants in the rabbit maxilla. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 28 (5), 1194-1200 (2013).
  11. Kanyama, M., et al. Connective tissue growth factor expressed in rat alveolar bone regeneration sites after tooth extraction. Archives of Oral Biology. 48 (10), 723-730 (2003).
  12. Zhou, S., et al. The role of IFT140 in early bone healing of tooth extraction sockets. Oral Diseases. 28 (4), 1188-1197 (2022).
  13. Apaza Alccayhuaman, K. A., et al. FasL is required for osseous healing in extraction sockets in mice. Frontiers in Immunology. 12, 678873(2021).
  14. Avivi-Arber, L., Avivi, D., Perez, M., Arber, N., Shapira, S. Impaired bone healing at tooth extraction sites in CD24-deficient mice: A pilot study. PLoS One. 13 (2), 0191665(2018).
  15. Vieira, A. E., et al. Intramembranous bone healing process subsequent to tooth extraction in mice: micro-computed tomography, histomorphometric and molecular characterization. PLoS One. 10 (5), 0128021(2015).
  16. Min, K. -K., et al. Effects of resveratrol on bone-healing capacity in the mouse tooth extraction socket. Journal of Periodontal Research. 55 (2), 247-257 (2020).
  17. Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
  18. Kuroshima, S., et al. Transplantation of noncultured stromal vascular fraction cells of adipose tissue ameliorates osteonecrosis of the jaw-like lesions in mice. Journal of bone and Mineral Research. 33 (1), 154-166 (2018).
  19. Ahel, V., et al. Forces that fracture teeth during extraction with mandibular premolar and maxillary incisor forceps. The British Journal of Oral & Maxillofacial Surgery. 53 (10), 982-987 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja z ba trzonowego u myszymodel ekstrakcji uchwyregeneracja ko ci jamistejkostnienie b oniastegojenie z bodo utworzenie beleczek kostnychbarwienie immunofluorescencyjneocena histologicznaekspresja Sp7r nicowanie osteoblast w

Powiązane artykuły