Method Article

AMEBaS: Automatyczna ekstrakcja linii środkowej i odejmowanie tła poklatkowych fluorescencji ratiometrycznej spolaryzowanych pojedynczych komórek

DOI:

10.3791/64857

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Mathematics and Statistics, University of São Paulo, 2Center for Mathematics, Computing and Cognition, Federal University of ABC, 3Department of Botany, Institute of Biosciences, University of São Paulo, 4Cell Biology and Molecular Genetics Department, University of Maryland, 5Department of Biosciences, University of Milan, 6Department of Physics, Politecnico di Milano

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne metody analizy dynamiki wewnątrzkomórkowej spolaryzowanych pojedynczych komórek są często ręczne i brakuje im standaryzacji. Niniejszy manuskrypt wprowadza nowatorski potok analizy obrazu do automatyzacji ekstrakcji linii środkowej pojedynczych spolaryzowanych komórek i ilościowego określania zachowań czasoprzestrzennych na podstawie upływu czasu w przyjaznym dla użytkownika interfejsie online.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polaryzacja komórek to makroskopowe zjawisko ustanowione przez zbiór przestrzennie skoncentrowanych cząsteczek i struktur, których kulminacją jest pojawienie się wyspecjalizowanych domen na poziomie subkomórkowym. Jest to związane z rozwojem asymetrycznych struktur morfologicznych, które leżą u podstaw kluczowych funkcji biologicznych, takich jak podział komórek, wzrost i migracja. Ponadto zakłócenie polaryzacji komórek zostało powiązane z zaburzeniami związanymi z tkankami, takimi jak rak i dysplazja żołądka.

Obecne metody oceny dynamiki czasoprzestrzennej fluorescencyjnych reporterów w pojedynczych spolaryzowanych komórkach często obejmują ręczne kroki w celu wytyczenia linii środkowej wzdłuż głównej osi komórek, co jest czasochłonne i podatne na silne odchylenia. Ponadto, chociaż analiza ratiometryczna może skorygować nierównomierny rozkład cząsteczek reporterowych za pomocą dwóch kanałów fluorescencyjnych, techniki odejmowania tła są często arbitralne i brakuje im wsparcia statystycznego.

Ten manuskrypt wprowadza nowatorski potok obliczeniowy do automatyzacji i ilościowego określania czasoprzestrzennego zachowania pojedynczych komórek przy użyciu modelu polaryzacji komórek: wzrostu łagiewki pyłkowej/włośnika korzeniowego i dynamiki jonów cytozolowych. Opracowano trzyetapowy algorytm do przetwarzania obrazów ratiometrycznych i wyodrębniania ilościowej reprezentacji dynamiki i wzrostu wewnątrzkomórkowego. Pierwszy krok segmentuje komórkę od tła, tworząc maskę binarną za pomocą techniki progowania w przestrzeni intensywności pikseli. Drugi krok śledzi ścieżkę przez linię środkową komórki poprzez operację szkieletyzacji. Wreszcie trzeci krok dostarcza przetworzone dane jako timelapse ratiometryczne i daje kimograf ratiometryczny (tj. profil przestrzenny 1D w czasie). Do porównania metody wykorzystano dane z obrazów ratiometrycznych uzyskanych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów fluorescencyjnych z rosnących łagiewek pyłkowych. Ten potok pozwala na szybszą, mniej stronniczą i dokładniejszą reprezentację dynamiki czasoprzestrzennej wzdłuż linii środkowej spolaryzowanych komórek, rozwijając w ten sposób ilościowy zestaw narzędzi dostępnych do badania polaryzacji komórek. Kod źródłowy AMEBaS Python jest dostępny pod adresem: https://github.com/badain/amebas.git

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polaryzacja komórek to podstawowy proces biologiczny, w którym skoordynowane działanie zbioru przestrzennie skoncentrowanych cząsteczek i struktur kończy się ustanowieniem wyspecjalizowanych morfologicznych domen subkomórkowych1. Podział, wzrost i migracja komórek zależą od takich miejsc polaryzacji, podczas gdy jej utrata jest związana z rakiem w zaburzeniach związanych z tkankami nabłonkowymi2.

Komórki rosnące wierzchołkowo są dramatycznym przykładem polaryzacji, gdzie miejsce polaryzacji na końcu zazwyczaj zmienia orientację na sygnały zewnątrzkomórkowe3. Należą do nich rozwijające się neuryty, strzępki grzybów, włośniki i łagiewki pyłkowe, w których wiele procesów komórkowych wykazuje wyraźne różnice od czubka komórki w kierunku trzonu. W szczególności w łagiewkach pyłkowych polimeryzacja aktyny, transport pęcherzyków i stężenia jonów są wyraźnie spolaryzowane, wykazując gradienty skoncentrowane na końcówce4. Łagiewki pyłkowe są męskimi gametofitami roślin kwitnących i są odpowiedzialne za dostarczanie plemników do zalążka, rosnąc wyłącznie na wierzchołku komórki w jednym z najszybszych temp wzrostu znanych dla pojedynczej komórki. Skoncentrowane na końcówce gradienty jonów, takich jak calcium5 (Ca2+) i protony6 (H+) odgrywają główną rolę w podtrzymywaniu wzrostu łagiewki pyłkowej, która jest niezbędna do realizacji jej głównej funkcji biologicznej, której kulminacją jest podwójne zapłodnienie5,6. W związku z tym ilościowe metody analizy dynamiki czasoprzestrzennej wzdłuż linii środkowej komórek rosnących wierzchołkowo są niezbędne do zbadania mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw spolaryzowanego wzrostu7,8,9. Badacze często używają kymogramów, tj. matrycy, która przedstawia intensywność pikseli linii środkowej komórki (np. kolumny) w czasie (np. wiersze), co pozwala na wizualizację wzrostu i migracji komórek po przekątnej (Rysunek 1)). Pomimo swojej użyteczności, kimografy są często wyodrębniane poprzez ręczne śledzenie linii środkowej, są podatne na uprzedzenia i błędy ludzkie, a jednocześnie są dość pracochłonne. Wymaga to zautomatyzowanej metody ekstrakcji linii środkowej, która jest pierwszą cechą przedstawionego tutaj potoku o nazwie AMEBaS: Automatic Midline Extraction i Background Subtraction ratiometrycznych fluorescencji upływów czasu spolaryzowanych pojedynczych komórek.

Jeśli chodzi o procedury eksperymentalne, ilościowe obrazowanie interesujących jonów/molekuł/gatunków w pojedynczych komórkach można osiągnąć za pomocą genetycznie kodowanych sond fluorescencyjnych10. Wśród stale poszerzających się opcji, sondy ratiometryczne są jednymi z najdokładniejszych, ponieważ emitują różne długości fal fluorescencyjnych, gdy są związane/niezwiązane z cząsteczkami będącymi przedmiotem zainteresowania11. Pozwala to na skorygowanie niejednorodności przestrzennej w stężeniu wewnątrzkomórkowym sondy poprzez zastosowanie stosunku dwóch kanałów z odjętym tłem specyficznym dla ich kanału. Jednak oszacowanie progu tła dla każdego kanału i punktu czasowego może być złożonym zadaniem, ponieważ często zmienia się w przestrzeni z powodu efektów, takich jak cieniowanie, gdzie rogi obrazu mają zmiany jasności w stosunku do środka, a w czasie z powodu blaknięcia fluoroforu (fotowybielanie)12. Chociaż istnieje wiele możliwych metod, w tym manuskrypcie zaproponowano automatyczne określenie intensywności tła przy użyciu progu segmentacji uzyskanego za pomocą algorytmu Isodata13, który jest następnie standardowo wygładzany w poprzek ramek za pomocą regresji wielomianowej. Składowe przestrzenne wynikające z niejednorodności fluorescencji niezwiązanej z komórką docelową usuniętą w12 zostały jednak zignorowane przez tę metodę. Automatyczne progowanie można przeprowadzić kilkoma metodami, ale algorytm Isodata dał najlepsze wyniki empirycznie. Tak więc automatyczne odejmowanie wartości tła i obliczanie ratiometryczne są drugą główną cechą AMEBaS (Rysunek 1), który razem wzięty otrzymuje jako dane wejściowe stos obrazów z dwukanałowej mikroskopii fluorescencyjnej, szacuje linię środkową komórki i tło specyficzne dla kanału, a następnie wyprowadza kimografy obu kanałów i ich stosunek (główny wynik #1) po odjęciu tła, wygładzeniu, i usuwanie wartości odstających wraz ze stosem obrazów ratiometrycznych (główny wynik #2).

AMEBaS został przetestowany z fluorescencyjnymi upływkami czasu rosnących łagiewek pyłkowych Arabidopsis uzyskanymi pod mikroskopem, albo za pomocą Ca2+ (CaMeleon)8 lub pH (pHluorin)6 czujników ratiometrycznych wyrażonych pod specyficznym dla pyłku promotorem LAT52. Obrazy z każdego kanału były wykonywane co 4 s sprzężone z odwróconym mikroskopem, kamerą z oświetleniem przednim (2560 pikseli × 2160 pikseli, rozmiar piksela 6,45 μm), oświetlaczem fluorescencyjnym i soczewką obiektywu zanurzonego w wodzie 63x, 1,2NA. Dla CaMeleon zastosowano następujące ustawienia filtrów: wzbudzenie 426-450 nm (CFP) i 505-515 nm (YFP), emisję 458-487 nm (CFP) i 520-550 nm (YFP), natomiast dla pHluorin wzbudzenie 318-390 nm (DAPI) i 428-475 nm (FITC), emisję 435-448 nm (DAPI) i 523-536 nm (FITC). Kompletny zestaw danych został dodany do testów w Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)14.

Ponadto, rurociąg został przetestowany z danymi dotyczącymi włośników, gdzie obrazowanie wykonano za pomocą mikroskopu z arkuszem świetlnym (SPIM), jak wcześniej opisano15,16 z włośnikami Arabidopsis wykazującymi ekspresję genetycznie kodowanego reportera Ca2+ NES-YC3.6 pod kontrolą promotora UBQ1017. Domowe oprogramowanie LabView, które sterowało akwizycją kamery, translacją próbki i migawką mikroskopu arkuszowego światła, pozwoliło na obserwację dwóch kanałów cpVenus i CFP, ale także wizualizację ich stosunku w czasie rzeczywistym. Każdy obraz poklatkowy reprezentował projekcję maksymalnej intensywności (MIP) między obrazami kanałów fluorescencyjnych cpVenus i CFP uzyskanymi z 15 warstw próbki oddalonych od siebie o 3 μm. Stosunek poklatkowy cpVenus/CFP MIP został zapisany i bezpośrednio wykorzystany do analizy AMEBaS.

Chociaż ten potok może pracować z wieloma typami rosnących i migrujących komórek, został specjalnie zaprojektowany do analizy rosnących komórek, które rosną wyłącznie na czubku, takich jak łagiewki pyłkowe, włośniki i strzępki grzybów, gdzie występuje zgodność nierosnących regionów cytoplazmatycznych między ramkami. W przypadku braku takiej korespondencji, użytkownik powinien wybrać opcję complete_skeletonization w kroku 1.3.1.1 (więcej szczegółów w sekcji Dyskusja).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przegląd przepływu pracy w potoku. Potok AMEBaS analizuje i przetwarza mikroskopijne upływy czasu w trzech głównych krokach: segmentacja pojedynczych komórek, śledzenie linii środkowej i generowanie kimografu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Interaktywny protokół notatnika

Notatnik Jupyter może być używany bezpośrednio w sieci za pomocą Google Colab na https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb, gdzie znajdują się poniższe instrukcje. Alternatywnie notes Jupyter jest dostępny w https://github.com/badain/amebas, skąd można go pobrać i skonfigurować do uruchamiania lokalnie w Jupyter (Anaconda może zapewnić łatwy i międzyplatformowy proces instalacji). Pełne dane testowe można znaleźć w Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), zawierające jedno- i dwukanałowe dane łagiewek pyłkowych Arabidopsis wyrażających pH lub Ca2+ reporters14. Potok został podzielony na części, w których każdy krok można wykonać, klikając przycisk odtwarzania po ustawieniu opcji specyficznych dla użytkownika. Pliki niezbędne do tego badania są dostępne w głównym folderze zip AMEBaS (Uzupełniający Plik Kodowania 1).

  1. Otwórz notes Jupyter i odczytaj pliki poklatkowe.
    1. Przejdź do strony głównej interaktywnego notatnika w Google Colab, o którym mowa powyżej, lub pobierz i otwórz notatnik AMEBaS_Local.ipynb z GitHub.
    2. Przygotuj konfigurację katalogu dla danych wejściowych i wyjściowych:
      1. Jeśli używasz wersji lokalnej, umieść fluorescencyjny film poklatkowy jako plik TIFF lub plik DV w folderze o nazwie data, który musi znajdować się w folderze głównym programu. Aby otrzymać wygenerowane dane, należy utworzyć folder o nazwie out. Następnie uruchom blok kodu instalacji.
      2. Jeśli korzystasz z notatnika w Google Colab, uruchom blok kodu konfiguracji, aby automatycznie wygenerować dane i foldery wyjściowe.
    3. Uruchom blok kodu wprowadzania pliku, aby odczytać dane poklatkowe, klikając przycisk odtwarzania. Jeśli korzystasz z wersji notatnika Google Colab, kliknij przycisk Wybierz plik, aby bezpośrednio przesłać plik poklatkowy do folderu danych.
      UWAGA: Liczba kanałów zostanie automatycznie wykryta na podstawie wymiaru obrazu.
    4. Wybierz, czy dodatkowe dane wyjściowe każdego kroku będą generowane, ustawiając parametr "verbose" na wartość True lub False.
  2. Wykryj główną komórkę i segment w tle (Rysunek 2).
    1. Uruchom blok kodu Segmentacja pojedynczej komórki, aby automatycznie oddzielić interesującą komórkę od tła, klikając przycisk odtwarzania.
      UWAGA: Filtry mediany i gaussowskiej zostaną zastosowane jako etap przetwarzania wstępnego w celu usunięcia niechcianego szumu przed segmentacją pierwszego planu od tła przez progowanie Isodata i odizolowanie obszaru największego obszaru w celu usunięcia niepożądanych artefaktów.
      1. Dostosuj wartość sigma używaną przez gaussa w zmiennej "sigma", aby precyzyjnie dostroić gładkość maski segmentacji. Wartość domyślna to 2,0.
      2. Ustaw wartość oszacowania zmiennej na Fałsz, aby zapisać próg oszacowany bezpośrednio na podstawie danych Isodata, lub na wartość Prawda, aby wygładzić go w sąsiednich ramkach przy użyciu lokalnej regresji wielomianowej (LOESS). Dostosuj jego funkcję, zmieniając zmienną n_points. Wartość domyślna to 40.
  3. Śledź linię środkową wzdłuż przedłużenia komórki (Rysunek 3).
      Uruchom blok kodu śledzenia linii środkowej komórki, klikając przycisk odtwarzania, aby automatycznie szkieletować komórkę przy użyciu metody Lee18 i rozszerz końcówkę ostatniego szkieletu za pomocą ekstrapolacji liniowej.
      1. Wybierz, czy linia środkowa ma być śledzona tylko w ostatniej klatce, czy raz na klatkę, dostosowując argument complete_skeletonization.
        UWAGA: Gdy wszystkie klatki są szkieletowane, ekstrapolacja jest pomijana.
      2. Ustaw ułamek punktów w szkielecie, które mają być interpolowane podczas ekstrapolacji, dostosowując interpolation_fraction zmienną. Wartość domyślna to 0,25.
      3. Wybierz długość ekstrapolacji linii środkowej, zmieniając zmienną extrapolation_length. Wartość domyślna to -1, co powoduje wydłużenie szkieletu do najbliższej krawędzi.
  • Wygeneruj kimografy dla każdego kanału ( Rysunek 4).
    1. Uruchom pierwszy blok kodu Wizualizacja danych, klikając przycisk odtwarzania, aby automatycznie wygenerować kimogramy dla obu kanałów.
      1. Wybierz rozmiar jądra Gaussa używanego do wygładzania, dostosowując zmienną kymograph_kernel.
        UWAGA: Odpowiada rozmiarowi otoczenia (w pikselach), w którym uśredniane są intensywności pikseli. Wartość domyślna to 3 x 3 piksele.
      2. Nierozszerzone szkielety generują kimografy z ograniczeniami, które muszą używać niestandardowej mapy kolorów, aby prawidłowo wyświetlić ich intensywność. Wybierz ułamek procentowy intensywności, który zostanie przypisany do koloru tła, czarnego, dostosowując shift_fraction zmienną. Wartość domyślna to 0,7.
  • Oblicz stosunek między kanałami (Rysunek 5).
    1. Uruchom drugi blok kodu Wizualizacja danych, klikając przycisk odtwarzania, aby automatycznie wygenerować kimograf ratiometryczny i timelapse ratiometryczny (Rysunek 6).
      UWAGA: Ten krok jest dostępny tylko w przypadku korzystania z dwukanałowych poklatkowych. Próg intensywności tła zapisany w kroku 1.2.1.2 jest odejmowany od każdego kanału.
      1. Dostosuj zmienną switch_ratio, aby zmienić kolejność kanałów używanych jako licznik i mianownik podczas obliczania współczynnika. Wartość domyślna to False.
      2. Wybierz, czy timelapse proporcji ma być dodatkowo wygładzony za pomocą filtra mediany, dostosowując zmienną smooth_ratio. Wartość domyślna to False.
      3. Wybierz, czy chcesz usunąć wartości odstające utworzone przez niski sygnał kanału mianownika, manipulując zmienną reject_outliers. Wartość domyślna to Prawda i definiuje wartości odstające jako wartości 1,5 razy większe od przedziału międzykwartylowego powyżej trzeciego kwartyla (gdzie leży 75% wartości).
      4. Określ, czy tło w danych wyjściowych ratiometrycznych ma zostać wyeksportowane, dostosowując background_ratio zmiennej. Wartość domyślna to False, która powoduje zastąpienie jej zerami.

    • figure-protocol-1
    Rysunek 2: Krok segmentacji pojedynczej komórki. Techniki przetwarzania obrazu, takie jak filtrowanie, progowanie i oznaczanie obszarów, są używane do izolowania sygnału będącego przedmiotem zainteresowania (krok 1.2). Te konkretne dane miały następujące wartości dla najniższej intensywności: 2556, mediany: 3441 i najwyższej intensywności: 32125. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

    figure-protocol-2
    Rysunek 3: Przegląd śledzenia linii środkowej- Linię środkową pojedynczej komórki uzyskuje się poprzez obliczenie jej szkieletu (białego). Końcówka (magenta) jest ekstrapolowana liniowo od ostatnich punktów na końcu szkieletu (krok 1.3). W tej kompozycji zarówno linia środkowa, jak i jej koniec są nałożone na pierwotną komórkę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

    figure-protocol-3
    Rysunek 4: Kimogramy Timelapse- Porównanie kymografów dla każdego kanału wygenerowanego z wyłączonym 'complete_skeletonization' (krok 1.4). Oś pionowa opisuje postęp czasu, a oś pozioma przedstawia średnią intensywność ekstrapolowanej ścieżki linii środkowej, po której następuje pojedyncza komórka. Dla tych konkretnych danych mapa kolorów przedstawia następujące wartości dla kanału 1 Najniższa intensywność: 2886, Mediana: 3167, Najwyższa intensywność: 21021. Najniższa intensywność kanału 2: 3030, mediana: 3400, najwyższa intensywność: 29688. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

    figure-protocol-4
    Rysunek 5: Wygładzanie progu tła - Próg segmentacji tła jest szacowany za pomocą algorytmu izodanych, a następnie wygładzany za pomocą lokalnej regresji wielomianowej (krok 1.5). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

    figure-protocol-5
    Rysunek 6: Wyniki ratiometryczne- (A) Porównanie między ostatnią klatką timelapse ratiometrycznego a oryginalnym pierwszym kanałem z segmentacją. (B) Kymograf wygenerowany z timelapse ratiometrycznego (krok 1.5). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

    2. Protokół trybu wsadowego

    1. Pobierz i umieść plik pipeline.py z repozytorium GitHub AMEBaS w tym samym katalogu co dane.
    2. Wpisz lokalizację pliku w wierszu poleceń po pliku programu.
    3. W razie potrzeby dołącz --v jako argument pozycyjny, aby pokazać wewnętrzne kroki potoku.
    4. Dołącz --s, aby wybrać wartość sigma używaną w kroku wstępnego przetwarzania filtru Gaussa w ramach przygotowań do segmentacji komórek. Wartość domyślna to 2.
    5. Dołącz --a, aby prześledzić linię środkową dla każdej klatki poklatkowej. Domyślnie potok używa tylko ostatniej klatki.
    6. Dołącz --f, aby wybrać ułamek [0,1] szkieletu, który ma być używany w interpolacji. Wartość domyślna to 0,25.
    7. Dołącz -e, aby wybrać długość ekstrapolowanego szkieletu w pikselach. Wartość domyślna to -1, co powoduje wydłużenie szkieletu do najbliższej krawędzi.
    8. Dołącz --sf, aby wybrać część zakresu kolorów, która zostanie przesunięta na tło w nieekstrapolowanych kymografach. Wartość domyślna to 0,7.
    9. Include --k, aby określić rozmiar jądra używanego w filtrowaniu Gaussa w kimografie. Wartość domyślna to 3.
    10. Uwzględnij --eb, aby oszacować intensywność globalnego progu tła za pomocą regresji wielomianowej LOESS intensywności progu tła specyficznego dla ramy.
      1. Dostosuj liczbę punktów używanych w wygładzaniu wartości progowych tła metodą Loess, modyfikując parametr --n. Wartość domyślna to 40.
    11. Przełącz kanały używane jako licznik i mianownik podczas obliczeń stosunku, w tym -r lub --switch_ratio, jeśli timelapse ma dwa kanały. Domyślnie drugi kanał jest licznikiem, a pierwszy jest mianownikiem.
    12. Wybierz, czy timelapse współczynnika ma być dodatkowo wygładzony za pomocą przejścia filtru mediany z argumentem --sm . Wartość domyślna to False.
    13. Dołącz -o, aby odrzucić piksele o nietypowej intensywności podczas ratiometrycznego generowania poklatkowego.
    14. Wybierz, czy tło w danych wyjściowych ratiometrycznych musi zostać wyeksportowane przy użyciu argumentu --b. Wartość domyślna to False, która powoduje zastąpienie jej zerami.
    15. Naciśnij Enter, aby uruchomić. Dane wyjściowe zostaną wygenerowane w tym samym katalogu, w którym znajduje się plik programu.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Potok AMEBaS automatyzuje ekstrakcję dynamiki linii środkowej spolaryzowanych pojedynczych komórek ze stosów obrazów mikroskopii fluorescencyjnej, dzięki czemu jest mniej czasochłonny i podatny na błędy ludzkie. Metoda określa ilościowo te upływy czasu, generując kimografy i stosy obrazów ratiometrycznych (Rysunek 1) w rosnących pojedynczych komórkach. Można go dostosować do pracy nad migracją pojedynczych komórek, ale konieczne są dalsze eksperymenty. AMEBaS jest zaimplementowany w Pythonie jako inte...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Przedstawiona tutaj nowatorska metoda jest potężnym narzędziem usprawniającym i automatyzującym analizę stosów obrazów mikroskopii fluorescencyjnej spolaryzowanych komórek. Obecne metody opisane w literaturze, takie jak wtyczki ImageJ Kymograph, wymagają ręcznego śledzenia linii środkowej spolaryzowanej komórki będącej przedmiotem zainteresowania, co jest zadaniem nie tylko czasochłonnym, ale także podatnym na błędy ludzkie. Ponieważ definicja linii środkowej w tym potoku jest wspierana przez metodę numeryczną

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Autorzy niniejszego manuskryptu deklarują, że nie istnieją konkurencyjne interesy finansowe ani inne konflikty interesów.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Autorzy są wdzięczni grantom FAPESP 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, grantom NIH R01 GM131043 oraz grantom NSF MCB1714993, MCB1930165 za wsparcie finansowe. Dane dotyczące włośników zostały opracowane przy użyciu infrastruktury i pod nadzorem prof. Andrei Bassi i prof. Alexa Costy.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    GithubGithubhttps://github.com/badain/amebas
    Google ColabGooglehttps://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Drubin, D. G., Nelson, W. J. Origins of cell polarity. Cell. 84 (3), 335-344 (1996).
    2. Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
    3. Palanivelu, R., Preuss, D. Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip growth mechanisms. Trends in Cell Biology. 10 (12), 517-524 (2000).
    4. Portes, M. T., et al. The Pollen Tube Oscillator: Integrating Biophysics and Biochemistry into Cellular Growth and Morphogenesis. Rhythms in Plants: Dynamic Responses in a Dynamic Environment. , Springer. Cham. (2015).
    5. Wudick, M. M., et al. CORNICHON sorting and regulation of GLR channels underlie pollen tube Ca2+ homeostasis. Science. 360 (6388), 533-536 (2018).
    6. Hoffmann, R. D., et al. Plasma membrane H+-ATPases sustain pollen tube growth and fertilization. Nature Communications. 11 (1), 1-15 (2020).
    7. Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by pistil D-serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
    8. Damineli, D. S., Portes, M. T., Feijó, J. A. Oscillatory signatures underlie growth regimes in Arabidopsis pollen tubes: computational methods to estimate tip location, periodicity, and synchronization in growing cells. Journal of Experimental Botany. 68 (12), 3267-3281 (2017).
    9. Li, K., et al. An optimized genetically encoded dual reporter for simultaneous ratio imaging of Ca2+ and H+ reveals new insights into ion signaling in plants. New Phytologist. 230 (6), 2292-2310 (2021).
    10. Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiology. 187 (2), 485-503 (2021).
    11. Grenzi, M., et al. Illuminating the hidden world of calcium ions in plants with a universe of indicators. Plant Physiology. 187 (2), 550-571 (2021).
    12. Munglani, G., Vogler, H., Grossniklaus, U. Fast and flexible processing of large FRET image stacks using the FRET-IBRA toolkit. PLoS Computational Biology. 18 (4), 1009242(2022).
    13. Ridler, T., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
    14. Portes, M. T., Feijó, J. Growing Arabidopsis pollen tubes expressing genetically encoded reporters for calcium and pH. , (2023).
    15. Candeo, A., Doccula, F. G., Valentini, G., Bassi, A., Costa, A. Light sheet fluorescence microscopy quantifies calcium oscillations in root hairs of Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 58 (7), 1161-1172 (2017).
    16. Romano Armada, N., et al. In vivo light sheet fluorescence microscopy of calcium oscillations in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1925, 87-101 (2019).
    17. Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. The Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
    18. Lee, T. -C., Kashyap, R. L., Chu, C. -N. Building skeleton models via 3-D medial surface axis thinning algorithms. CVGIP: Graphical Models and Image Processing. 56 (6), 462-478 (1994).
    19. Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 6, 4312(2018).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Cell PolarityRatiometric FluorescenceMidline ExtractionBackground SubtractionSingle Cell AnalysisFluorescence Time LapseCell SegmentationSkeletonizationKymograph GenerationPolarized Cells

    Related Articles