Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda hodowli 3D sferoid embrionalnych i wątrobowych linii komórkowych danio pręgowanego

3.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64859

⸱

20 stycznia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Cell Biology, Federal University of Paraná (UFPR), 4Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy skuteczny, łatwy i szybki protokół hodowli 3D do tworzenia sferoid dwóch linii komórkowych danio pręgowanego (Danio rerio): ZEM2S (zarodek) i ZFL (normalny hepatocyt).

Streszczenie

Linie komórkowe ryb są obiecującymi modelami in vitro do oceny ekotoksyczności; jednak konwencjonalne systemy hodowli jednowarstwowej (hodowla 2D) mają dobrze znane ograniczenia (np. długowieczność hodowli i utrzymanie niektórych funkcji komórkowych in vivo). W związku z tym zaproponowano hodowle 3D, takie jak sferoidy, ponieważ modele te mogą odtwarzać struktury podobne do tkanek, lepiej odsłuchując warunki in vivo. W tym artykule opisano skuteczny, łatwy i szybki protokół hodowli 3D do tworzenia sferoid z dwiema liniami komórkowymi danio pręgowanego (Danio rerio): ZEM2S (zarodek) i ZFL (normalny hepatocyt). Protokół polega na posiewaniu komórek na okrągłej, bardzo niskiej płytce 96-dołkowej. Po 5 dniach wytrząsania orbitalnego (70 obr./min) tworzy się pojedyncza sferoida na studzienkę. Uformowane sferoidy mają stabilny rozmiar i kształt, a ta metoda pozwala uniknąć tworzenia się wielu sferoid w studni; W związku z tym nie jest konieczne ręczne wybieranie sferoid o podobnych rozmiarach. Łatwość, szybkość i powtarzalność tej metody sferoidalnej sprawiają, że jest ona przydatna w wysokoprzepustowych testach in vitro.

Wprowadzenie

Sferoidy to małe kule komórek, które powstają, gdy komórki są hodowane w bliskim kontakcie międzykomórkowym w hodowli 3D. Zdolność sferoid do naśladowania środowiska tkankowego in vivo została już zbadana w różnych liniach komórkowych i komórkach pierwotnych1,2. Jednakże, mimo że sferoidy są dobrze rozwinięte do badań toksyczności dla ssaków, rozwój sferoid do badań toksyczności na kręgowcach innych niż ssaki (np. ryby) jest nadal w toku3. W przypadku linii komórkowych ryb sferoidy zostały opracowane przy użyciu wielu różnych metod, takich jak wytrząsanie orbitalne (OS) przy użyciu różnych typów płytek studzienkowych3,4,5,6,7, oraz metoda lewitacji magnetycznej za pomocą nanocząstek magnetycznych8. Jednak niektóre z tych metod hodowli sferoidów mogą mieć więcej wad niż inne.

Na przykład, metody gyratory na dużych mikropłytkach (płytki 24-dołkowe) mogą generować dużą liczbę sferoid różniących się wielkością i kształtem; w rzeczywistości wykazano tworzenie struktur wielosferoidalnych7. Wymaga to intensywnych wysiłków, aby ręcznie wybrać sferoidy o podobnym rozmiarze i kształcie do eksperymentu. Metoda hodowli 3D wiszącej kropli jest powszechnie stosowana do generowania sferoid linii komórkowych ssaków1,2,9,10,11, dzięki czemu można wygenerować pojedyncze sferoidy na kroplę, unikając problemów opisanych powyżej. Jednakże, chociaż zmodyfikowana metoda wiszącego spadku (wisząca kropla + wytrząsanie orbitalne) jest w stanie wygenerować sferoidy ZFL przy użyciu niedrogiej metody, ma swoje wady12. Utworzone agregaty komórkowe nie mogą być utrzymywane przez długi czas w kroplach; W związku z tym należy je przenieść na płytki studzienne. Proces ten wymaga intensywnego obchodzenia się z nim i długich okresów pracy w okapie z przepływem laminarnym, ponieważ jest wykonywany kroplami za pomocą mikropipety12. Ponadto ta metoda wymaga 10 dni na pełne uformowanie sferoid ZFL (5 dni w zawieszeniu + 5 dni w systemie operacyjnym)12. Wady te mogą ograniczać zastosowanie sferoid ryb 3D do testowania toksyczności, zwłaszcza biorąc pod uwagę potencjalne zastosowania w zakresie priorytetyzacji chemicznej i zrównoważonego rozwoju produktów.

Tak więc, ten artykuł opisuje protokół hodowli 3D zdolny do generowania pojedynczych sferoid linii komórkowych ZFL (D. rerio normal hepatocyte) i ZEM2S (D. rerio blastula phase embryo) w oparciu o połączone użycie 96-dołkowych, ultra-niskich płytek przyłączeniowych (ULA-plates) i wytrząsarki orbitalnej (średnica obrotowa 22 mm). Zastosowana metoda jest prosta i powtarzalna i może wygenerować dużą liczbę sferoid o podobnej wielkości i kształcie w krótkim czasie (5 dni). Zalety tej metody mogą przyczynić się do zastosowania modeli 3D ryb do badań toksyczności dla organizmów wodnych zarówno w przemyśle, jak i środowisku akademickim, a także przyczynić się do postępu we wdrażaniu alternatywnych metod badania ekotoksyczności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Kluczowe etapy generowania sferoidów 3D z linii komórkowych ZFL i ZEM2S w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem przedstawiono na Rysunku 1.

UWAGA: Szczegóły dotyczące wszystkich materiałów użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów, a roztwory i pożywki hodowlane użyte w tym protokole w Tabeli 1.

1. Pożywka do hodowli komórkowych i hodowle monolayerowe

  1. Hodować obie linie komórkowe (ZFL, ZEM2S) jako monowarstwy w inkubatorze w temperaturze 28 °C bez CO2, a następnie pasażować w stosunku 1:3 po osiągnięciu przez nie ~80% konfluencji.
    1. Zacząć od kolby T75 z komórkami ryb zebrafish przy konfluencji ~80%, hodowanymi zgodnie z powyższym opisem.
    2. Usunąć pożywkę kompletną i przemyć komórki, dodając do kolby hodowlanej za pomocą pipety 1x roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS) (0.01 M).
    3. Za pomocą pipety dodać do kolb hodowlanych 3 mL 1x trypsyny-0,5 mM EDTA (0,05% [v/v]) i inkubować w 28 °C przez 3 min w celu odklejenia komórek od ścianek kolby.
    4. Delikatnie opukać kolbę, aby uwolnić komórki, a następnie zatrzymać trawienie trypsyną poprzez dodanie do kolby 3 mL kompletnej pożywki hodowlanej.
    5. Za pomocą pipety przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mL i wirować przy 100 × g przez 5 min.
    6. Po utworzeniu osadu ostrożnie usunąć nadsącz, dodać 1 mL pożywki kompletnej dla odpowiedniej używanej linii komórkowej (ZFL lub ZEM2S) i resuspender za pomocą mikropipety. Pobrać alikwot do zliczenia komórek.

2. Liczenie komórek z użyciem testu wykluczania barwnika trypanu błękitnego

  1. Do mikroprobówki należy dodać 10 µL zawiesiny komórkowej oraz 10 µL barwnika trypan blue w celu policzenia komórek i oceny ich żywotności. Zawiesinę komórkową i barwnik należy wymieszać za pomocą pipety.
  2. Następnie 10 µL tej mieszaniny (zawiesina komórkowa + trypan blue) należy przenieść do komory Neubauera i policzyć komórki w czterech dużych polach (kwadrantach: Q) znajdujących się w narożnikach komory, uznając za żywe te komórki, które nie przyjęły barwnika trypan blue. Liczbę żywych komórek należy obliczyć zgodnie z równaniem (1):
    Równanie liczby komórek, ΣQ/4 × 10⁴, schemat formuły do analizy ilościowej.     (1)
  3. Aby obliczyć końcową liczbę komórek w zawiesinie, liczbę komórek wyznaczoną za pomocą równania (1) należy pomnożyć przez 2 (czynnik rozcieńczenia wynikający z zastosowania trypan blue).
    UWAGA: Alternatywnie można zastosować automatyczny system liczenia komórek.

3. Wysiewanie komórek na płytki ULA

  1. Po obliczeniu liczby komórek, dostosuj zawiesinę komórkową tak, aby nanieść 200 µL zawiesiny na każdą studzienkę 96-dołkowej płytki ULA o okrągłym dnie, zachowując liczbę komórek wymaganą dla każdej linii komórkowej, zgodnie z poniższymi wytycznymi:
    1. Nanieś 7 000 żywych komórek ZFL na studzienkę; zatem dla całej płytki ULA wykorzystaj 700 000 komórek w 20 mL pożywki kompletnej.
    2. Nanieś 3 500 żywych komórek ZEM2S na studzienkę; zatem dla całej płytki ULA wykorzystaj 350 000 komórek w 20 mL pożywki kompletnej.
  2. Przygotuj zawiesinę komórkową o dostosowanym stężeniu komórek w zbiorniku na pożywkę i wymieszaj ją za pomocą mikropipety wielokanałowej, dbając o to, aby nie powstała piana ani pęcherzyki powietrza. Używając mikropipety wielokanałowej, dodaj 200 µL dostosowanej zawiesiny komórkowej do każdej studzienki płytki ULA.
    UWAGA: Płytkę należy uszczelnić parafilmem lub samoprzylepną folią uszczelniającą, aby zapobiec odparowywaniu pożywki hodowlanej z 96-dołkowej płytki.

4. Formowanie sferoidów

  1. Inkubuj płytkę ULA na wytrząsarce orbitalnej przy 70 rpm przez 5 dni w inkubatorze w temperaturze 28 °C. Pozostaw sferoidy do uformowania się podczas 5 dni wytrząsania orbitalnego (Rysunek 2), aż osiągną średnią średnicę ~225 µm (sferoidy ZFL) i ~226 µm (sferoidy ZEM2S)12.
    UWAGA: Sferoidy są gotowe do użycia po 5 dniach inkubacji (maksymalna kolistość).
  2. Aby utrzymać sferoidy w kulturze przez więcej niż 5 dni, usuwaj 100 µL zużytej pożywki co 5 dni i dodawaj 100 µL świeżej pełnej pożywki hodowlanej za pomocą wielokanałowej mikropipety.
    ​UWAGA: Należy uważać, aby nie odessać sferoidów podczas tego procesu.

5. Pomiar rozmiaru (średnicy) i kształtu (wskaźnika kolistości) sferoidów

  1. Należy przeprowadzić akwizycję obrazów.
    1. Za pomocą odwróconego mikroskopu świetlnego z systemem akwizycji obrazu należy wykonać zdjęcie o określonej skali.
      UWAGA: Należy użyć preparatu kalibracyjnego do okularu mikroskopu lub komory Neubauera (w której znane są rozmiary pól) w celu wyznaczenia skali.
    2. Pod mikroskopem, używając tego samego obiektywu, który posłużył do wykonania zdjęcia skali, należy wykonać zdjęcia w pełni uformowanych sferoidów (tj.., 5-dniowe sferoidy).
      UWAGA: Wszystkie obrazy muszą zostać wykonane przy użyciu tego samego systemu obrazowania, ponieważ rozdzielczość obrazu ma istotne znaczenie dla określenia wielkości i kształtu sferoidów, a może ona różnić się w zależności od rodzaju zastosowanego systemu.
  2. Ustaw skalę.
    1. Za pomocą oprogramowania ImageJ otwórz obraz o zdefiniowanej skali (kliknij Plik | otwórz).
    2. Wybierz selektor liniowy z paska narzędzi przeciągnij myszką linię wzdłuż długości zdefiniowanej skali na obrazie.
    3. Ustaw skalę, wybierając Analizuj | Ustaw skalęi należy poczekać na Ustawienie skali otworzyć okno.
    4. W Ustawienie skali okno, uzupełnij lukę w Znana odległość przy znanej odległości (µm) odpowiadający linii prostej; wypełnij Jednostka długości z Hm dla µmKliknij Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia..
      UWAGA: Skala w pikselach/µm jest wyświetlane na dole okna.
  3. Ustaw parametry pomiarowe.
    1. W oprogramowaniu ImageJ wybierz Analiza | Ustawienia pomiarów aby otworzyć Ustawienie pomiarów okno
    2. W Ustawienia pomiarów oknie zaznacz pola odpowiadające pożądanym pomiarom (t.j. Obszar i Kształt deskryptory). Kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..
  4. Wyznacz średnicę oraz kolistość sferoidów.
    1. Otwórz zdjęcie sferoidu (Plik | Otwórz).
    2. Wybierz narzędzie do zaznaczania swobodnego na pasku narzędzi a następnie, używając myszy, zaznacz zewnętrzną stronę sferoidu, jak pokazano w Rysunek 3A.
      UWAGA: Aby przybliżyć lub oddalić obraz, naciśnij klawisz Ctrl i użyj kółka myszy, przesuwając je w dół lub w górę, lub naciśnij Kontrola klawisz i użyj klawiszy strzałek w górę lub w dół na klawiaturze.
    3. Wybierz Analiza | Pomiar aby otworzyć Wyniki okno, w którym wyświetlane są wartości pomiarowe.
    4. Korzystając z Obszar wartość, oblicz rozmiar (średnicę) sferoidów, korzystając z równania (2):
      Wzór na średnicę koła: \(d = \sqrt{\frac{\text{Pole}}{\pi}} \times 2\); algebra geometryczna.     (2)
    5. Wskaźnik kolistości jest podawany w oknie Wyniki (Results) jako „Circ.” i jest automatycznie obliczany przez oprogramowanie zgodnie z równaniem (3):
      Wzór na zwartość kształtu, \(4\pi \times \frac{\text{Pole}}{\text{Obwód}^2}\), równanie matematyczne.     (3)
      UWAGA: Wskaźnik kolistości równy 1,0 oznacza idealny kształt sferoidalny, natomiast wartość bliska 0,0 wskazuje na kształt wydłużony13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pojedyncze sferydy w każdej studzience o stabilnym rozmiarze i kształcie tworzone są za pomocą tej metody. Rysunek 2 ilustruje proces formowania pojedynczych sferydoidów komórek ZFL i ZEM2S w dołku płytki ULA podczas wstrząsania orbitalnego (70 obr./min). Linie komórkowe ZFL i ZEM2S wykazują różne zachowania w kulturze 3D. Linia komórkowa ZEM2S posiada cechy umożliwiające łatwe formowanie sferycznej struktury już od pierwszego dnia wstrząsania orbitalnegoRycina 2E

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jest to prosta, łatwa i szybka metoda generowania sferoid linii komórkowych wątroby i zarodka danio pręgowanego. Metoda ta została opracowana przez tę grupę w oparciu o modyfikacje istniejących metod sferoidów 3D w celu przezwyciężenia problemów zgłaszanych w badaniach naukowych związanych z powstawaniem sferoidów, a także niepewności co do dokładności danych z testów sferoidalnych 3D. Na przykład zgłaszane problemy dotyczą trudności w obsłudze, czasochłonności generowania sferoid, konieczności doboru sferoid o podobnej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Pamięci dr Márcio Lorenciniego, współautora tej pracy, doskonałego badacza w dziedzinie kosmetyków i oddanego promowaniu badań kosmetycznych w Brazylii. Autorzy są wdzięczni Laboratorium Wielozadaniowemu na Wydziale Fizjologii (UFPR) za dostępność sprzętu oraz za wsparcie finansowe Koordynacji na rzecz Doskonalenia Kadr Szkolnictwa Wyższego (CAPES, Brazylia) (Kod Finansowy 001) i Grupo Boticário.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowa, przezroczysta, okrągłodenna mikropłytka o bardzo niskim nasadce, pakowana pojedynczo, z pokrywką, sterylnyCorning7007
DMEM, proszek, wysoka zawartość glukozy, pirogronianGibco12800-017
Mieszanka odżywcza Ham's F-12, proszekGibco21700026
HEPES (1M)Gibco15630080
Przetwarzanie i analiza obrazu w Javie ( ImageJ) Oprogramowanie 1.52p  National
Institutes of Health, USA		Dostępne w: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Leibovitz's L-15 Medium, shakerkaw proszku Gibco41300021
Orbital WarmnestKLD-350-BIŚrednica obrotu 22 mm
Dulbeccos PBS (10x) z wapniem i magnezemInvitrogen14080055
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15140122
RPMI 1640 MediumGibco31800-014
FBS - Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, regiony zatwierdzone przez USDAGibco12657-029
Wodorowęglan sodu, proszek,  bioodczynnik do biologii molekularnejSigma-AldrichS5761
Trypanowa niebieska plama (0,4%)Gibco15250-061
Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowejLinia komórkowa Gibco
ZEM2SATCCCRL-2147Ta linia komórkowa została dzięki uprzejmości profesora Dr. Michaela J.
Carvana (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
Linia komórkowa ZFLBCRJ256
15400054

Bibliografia

  1. Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).
  2. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).
  3. Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes. Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).
  4. Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity. Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470(2022).
  5. Baron, M. G., et al. Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance. PloS One. 12 (1), 0168837(2017).
  6. Langan, L. M., et al. Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model. Frontiers in Pharmacology. 9, 947(2018).
  7. Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1. Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).
  8. Jeong, Y., et al. Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture. Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161(2016).
  9. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), e2720(2011).
  10. Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).
  11. Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).
  12. de Souza, I. R., et al. Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods. Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).
  13. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ user guide. ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).
  14. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368(2021).
  15. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755(2020).
  16. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966(2020).
  17. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  18. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  19. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892(2020).
  20. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24(2021).
  21. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2022).
  22. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187(2016).
  23. Gajski, G., et al. Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells. Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).
  24. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843(2021).
  25. Mueller-Klieser, W. Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids. Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).
  26. Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).
  27. Ho, R. K., Kimmel, C. B. Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo. Science. 261 (5117), 109-111 (1993).
  28. Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation. The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).
  29. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  30. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla kom reksferoidy z ryb danio pr gowanychtworzenie sferoid wlinie kom rkowe ryblinia kom rkowa ZFLlinia kom rkowa ZEM2Swstrz sanie orbitalnep ytka ultra low attachmenttest ywotno ci MTTocena ekotoksyczno ci
Metoda hodowli 3D sferoid embrionalnych i wątrobowych linii komórkowych danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.