Method Article

Testy cytotoksyczności z liniami komórkowymi danio pręgowanego

DOI:

10.3791/64860

⸱

January 6th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia powszechnie stosowane testy cytotoksyczności (testy Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red i MTT) dostosowane do oceny cytotoksyczności w liniach komórkowych zarodka danio pręgowanego (ZEM2S) i wątroby (ZFL) na 96-dołkowych płytkach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Linie komórkowe ryb stały się coraz częściej wykorzystywane w badaniach ekotoksyczności, a testy cytotoksyczności zostały zaproponowane jako metody przewidywania ostrej toksyczności ryb. W związku z tym protokół ten przedstawia testy cytotoksyczności zmodyfikowane w celu oceny żywotności komórek w liniach komórkowych zarodka danio pręgowanego (Danio rerio) (ZEM2S) i wątroby (ZFL) na płytkach 96-dołkowych. Oceniane punkty końcowe cytotoksyczności to integralność mitochondrialna (testy Alamar Blue [AB] i MTT), integralność błony poprzez aktywność esterazy (test CFDA-AM) i lizosomalna integralność błony (test neutralnej czerwieni [NR]). Po wystawieniu substancji badanych na 96-dołkową płytkę przeprowadza się testy cytotoksyczności; tutaj AB i CFDA-AM są przeprowadzane jednocześnie, a następnie NR na tej samej płytce, podczas gdy test MTT jest wykonywany na osobnej płytce. Odczyty dla tych testów są wykonywane przez fluorescencję dla AB i CFDA-AM oraz absorbancję dla MTT i NR. Testy cytotoksyczności przeprowadzone na tych liniach komórkowych ryb mogą być wykorzystane do badania ostrej toksyczności substancji chemicznych dla ryb.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Substancje chemiczne muszą być testowane pod kątem ich bezpieczeństwa dla zdrowia ludzkiego i środowiska. Biomarkery molekularne i komórkowe są coraz częściej brane pod uwagę w ocenach bezpieczeństwa w celu przewidywania skutków dla organizmów żywych przez agencje regulacyjne i/lub przepisy (np. REACH, OECD, US EPA)1,2, ponieważ mogą one poprzedzać niekorzystny wynik in vivo (np. zaburzenia endokrynologiczne, odpowiedź immunologiczna, ostra toksyczność, fototoksyczność)3,4,5,6,7. W tym kontekście, cytotoksyczność została przyjęta jako miara do przewidywania ostrej toksyczności ryb5,8; Może jednak mieć wiele innych zastosowań w badaniach ekotoksyczności, takich jak definiowanie subcytotoksycznych stężeń substancji chemicznych w celu zbadania ich najróżniejszego zestawu skutków dla ryb (np. skutków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego).

W systemach hodowli komórkowych (in vitro), cytotoksyczność substancji chemicznych może być określana metodami różniącymi się typami punktów końcowych. Na przykład metoda cytotoksyczności może opierać się na punkcie końcowym związanym ze specyficzną morfologią obserwowaną podczas procesu śmierci komórki, podczas gdy inna może określać cytotoksyczność poprzez pomiar śmierci, żywotności i funkcjonalności komórki, morfologii, metabolizmu energetycznego oraz przyczepiania i proliferacji komórek. Substancje chemiczne mogą wpływać na żywotność komórek poprzez różne mechanizmy, dlatego ocena cytotoksyczności obejmująca różne punkty końcowe żywotności komórek jest niezbędna do przewidywania skutków chemicznych9.

MTT i Alamar Blue (AB) to testy, które określają wpływ na żywotność komórek na podstawie aktywności metabolicznej komórki. Test MTT ocenia aktywność enzymu mitochondrialnego dehydrogenazy bursztynianowej10. Redukcja żółtawego bromku 3-[4,5-dimetylotiazol-2ylo]-2,5-difenylotetrazolu (MTT) do błękitu formazanu zachodzi tylko w komórkach żywotnych, a jego gęstość optyczna jest wprost proporcjonalna do liczby komórek zdolnych do życia10. Test AB jest czułym wskaźnikiem oksydacyjno-redukcyjnym, w którym pośredniczą enzymy mitochondrialne, które fluoryzują i zmieniają kolor po redukcji resazuryny do rezorufiny przez żywe komórki11; jednak enzymy cytozolowe i mikrosomalne również przyczyniają się do redukcji AB i MTT12. Enzymy te mogą obejmować kilka reduktaz, takich jak oksydoreduktazy alkoholowe i aldehydowe, NAD(P)H: oksydoreduktaza chinonowa, reduktaza flawinowa, dehydrogenaza NADH i cytochromy11.

Test neutralnej czerwieni (NR) to test żywotności komórek oparty na włączeniu tego barwnika do lizosomów żywotnych komórek13. Wychwyt NR zależy od zdolności komórek do utrzymania gradientów pH. Gradient protonów wewnątrz lizosomów utrzymuje pH niższe niż cytoplazma. Przy normalnym fizjologicznym pH NR ma ładunek netto w przybliżeniu zerowy, co umożliwia mu przenikanie przez błony komórkowe. W ten sposób barwnik zostaje naładowany i zostaje zatrzymany w lizosomach. W związku z tym, im większa ilość zatrzymanego NR, tym większa liczba żywotnych komórek14. Substancje chemiczne, które uszkadzają powierzchnię komórki lub błony lizosomalne, upośledzają wychwyt tego barwnika.

Test CFDA-AM jest fluorometrycznym testem żywotności komórek opartym na zachowaniu estru acetoksymetylowego dioctanu 5-karboksyfluoresceiny (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, substrat esterazy, jest przekształcany w karboksyfluoresceinę, substancję fluorescencyjną, która jest polarna i nieprzepuszczalna przez błony żywych komórek15; w ten sposób jest zatrzymywana w wewnętrznej stronie nienaruszonej błony komórkowej, wskazując żywe komórki.

Niedawno, trzy testy cytotoksyczności (testy CFDA-AM, NR i AB) zostały połączone w zatwierdzonych wytycznych ISO (Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna) (ISO 21115:2019)16 i OECD (Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju) metoda testowa (OECD TG 249) do oceny ostrej toksyczności ryb przy użyciu linii komórkowej RTgill-W1 (stała linia komórkowa pstrąga tęczowego [Oncorhynchus mykiss] skrzela) na płytkach 24-dołkowych17. Chociaż istnieje metoda oparta na komórkach do przewidywania ostrej toksyczności u ryb, włożono wysiłki w opracowanie podobnych metod dla innych gatunków ryb i zwiększenie przepustowości tej metody. Niektóre przykłady obejmują rozwój linii komórkowych ZFL transfekowanych genami reporterowymi dla określonych szlaków toksyczności18,19, testy fototoksyczności w linii komórkowej RTgill-W120, oraz wykorzystanie linii komórkowych ZFL i ZF4 (fibroblasty danio pręgowanego pochodzące z 1-dniowych zarodków) do oceny toksyczności za pomocą kilku testów cytotoksyczności21.

Danio rerio (danio pręgowany) jest jednym z głównych gatunków ryb wykorzystywanych w badaniach toksyczności dla organizmów wodnych; dlatego metody oparte na komórkach z liniami komórkowymi danio pręgowanego do testowania toksyczności ryb mogą być niezwykle przydatne. Linia komórkowa ZFL to linia komórkowa hepatocytów nabłonka danio pręgowanego, która przedstawia główne cechy komórek miąższowych wątroby i może metabolizować ksenobiotyki7,22,23,24,25. Tymczasem linia komórkowa ZEM2S to embrionalna linia komórek fibroblastycznych danio pręgowanego wywodząca się ze stadium blastuli, która może być wykorzystana do zbadania wpływu rozwojowego na ryby26,27. W związku z tym protokół ten opisuje cztery testy cytotoksyczności (testy MTT, AB, NR i CFDA-AM), z modyfikacjami, które należy przeprowadzić na liniach komórkowych ZFL i ZEM2S na 96-dołkowych płytkach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby zapoznać się z listą materiałów użytych w tym protokole, a Tabela 1 zawiera skład roztworów i mediów używanych w tym protokole.

1. Przygotowanie komórek ZFL i ZEM2S

  1. Rozpocząć od kolby T75 zawierającej komórki ZFL lub ZEM2S o 80% konfluencji, hodowane w odpowiednim kompletnym pożywce w temperaturze 28 °C bez CO2 .
  2. Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby i przemyć komórki, dodając 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (0,01 M). Dodać 3 ml 1x trypsyna (0,05% v/v; 0,5 mM trypsyna-EDTA) do kolb hodowlanych. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 3 minuty.
  3. Delikatnie postukać w kolbę, aby uwolnić komórki, a następnie zatrzymać trawienie trypsyny, dodając do kolby 3 ml kompletnej pożywki hodowlanej.
  4. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 100 × g przez 5 minut.
  5. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć sklaraty, dodać 1 ml kompletnej pożywki do komórek ZFL lub ZEM2S i ponownie zawiesić osad za pomocą mikropipety.

2. Liczenie komórek przez wykluczenie barwnika trypanowego

  1. Dodać 10 μl zawiesiny komórek i 10 μl barwnika błękitu trypanowego do mikroprobówki, aby policzyć komórki i ocenić ich żywotność. Wymieszaj zawiesinę komórek i barwnik za pomocą pipety.
  2. Następnie przenieść 10 μl tej mieszaniny (zawiesina komórek + błękit trypanowy) do komory Neubauera i policzyć komórki w czterech dużych kwadratach (ćwiartki Q) umieszczonych w rogach komory, uznając za żywotne komórki te, które nie przyjmują błękitu trypanowego. Określ liczbę żywotnych komórek za pomocą równania (1):
    Wzór na liczbę komórek: Numer komórki = (ΣQ/4) × 10^4; równanie matematyczne do kwantyfikacji. (1)
  3. Obliczyć końcową liczbę komórek w zawiesinie komórek, mnożąc liczbę komórek określoną za pomocą równania (1) przez dwa (współczynnik rozcieńczenia spowodowany użyciem błękitu trypanowego).
    UWAGA: Alternatywnie można zastosować zautomatyzowany system zliczania komórek (np. cytomer z funkcją zliczania komórek i żywotności).

3. Posiewanie komórek w płytkach 96-dołkowych

  1. Obliczyć objętość zawiesiny komórkowej potrzebną do uzyskania liczby komórek wymaganej do przeprowadzenia testów cytotoksyczności. Liczba żywotnych komórek dla każdej linii komórkowej jest wskazana poniżej:
    1. Umieść 60 000 żywotnych komórek ZEM2S na dołek; w ten sposób na całą płytkę użyj sześciu milionów komórek w 20 ml kompletnego podłoża (200 μl / dołek, płytka 96-dołkowa).
    2. Umieść na płytce 40 000 żywotnych komórek ZFL na dołek; tak więc na całą płytkę użyj czterech milionów komórek w 20 ml kompletnej pożywki (200 μl / dołek, płytka 96-dołkowa).
  2. Następnie przenieś odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej do zbiornika odczynnika (sterylnego) i napełnij kompletną pożywką hodowlaną dla ZFL lub ZEM2S do 20 ml. Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie wymieszaj roztwór w górę iw dół.
    UWAGA: Uważaj, aby nie tworzyć piany ani bąbelków.
  3. Dodać 200 μl zawiesiny komórek do każdego dołka przezroczystej 96-dołkowej płytki z polistyrenu za pomocą mikropipety wielokanałowej. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C przez 24 h.
    UWAGA: Płytka musi mieć co najmniej trzy studzienki bez komórek do kontroli ślepej próby, a do tych studzienek należy dodawać tylko kompletne podłoża. Efekt krawędziowy (spowodowany wyższym parowaniem w dołkach krawędziowych) często występuje w 96-dołkowych testach płytkowych i może wpływać na żywotność komórek w dołkach krawędziowych płytki28. Efekt ten może być wyższy lub niższy w zależności od marki i konstrukcji płytki 96-dołkowej28. Chociaż nie zauważyliśmy żadnych zaburzeń wzrostu/żywotności komórek dla ZFL i ZEM2S w dołkach brzegowych, sugerujemy uszczelnienie płytki parafilmem lub samoprzylepną folią uszczelniającą, aby zapobiec temu efektowi, lub hodowlę komórek tylko w 60 studzienkach wewnętrznych i wypełnienie dołków brzegowych PBS.

4. Narażenie komórek na działanie badanej substancji chemicznej

  1. Ostrożnie wyrzuć zużyte media ze studzienek za pomocą wielokanałowej mikropipety.
  2. Poddać komórki działaniu badanych substancji chemicznych w różnych stężeniach. Przygotować roztwory o stężeniach badanej substancji chemicznej w pożywce dla ZFL lub ZEM2S bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (pożywka ekspozycyjna). Następnie dodać 100 μl tych roztworów do studzienki w trzech próbach technicznych (tj. trzy studzienki/stężenie badanej substancji chemicznej).
  3. W przypadku kontroli grupy kontrolne należy umieścić na tej samej płytce co badaną substancję chemiczną w trzech egzemplarzach technicznych (trzy studzienki/grupa kontrolna). Tak więc w przypadku ślepej próby kontrolnej (B) dodać 100 μl pożywki ekspozycyjnej w studzienkach bezkomórkowych, w przypadku kontroli ujemnej (NC) dodać 100 μl pożywki ekspozycyjnej do studzienek z komórkami, a w przypadku kontroli dodatniej (PC) należy wystawić komórki na działanie roztworu 1% Triton X-100 przygotowanego w pożywce ekspozycyjnej. W niektórych przypadkach na płytce należy dołączyć środek kontrolny rozpuszczalnika (SC), biorąc pod uwagę wyraźnie niecytotoksyczne stężenie jako końcowe stężenie rozpuszczalnika.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie 0,5% DMSO jako rozpuszczalnika; DMSO może być stosowany do 1% jako rozpuszczalnik w tych liniach komórkowych bez przekraczania progu cytotoksyczności wynoszącego 10% w odniesieniu do kontroli ujemnej.
  4. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C przez 24 godziny. Uszczelnić płytki folią parafilmową lub samoprzylepną folią uszczelniającą, aby zapobiec parowaniu pożywki hodowlanej.
    UWAGA: Niektóre substancje chemiczne mogą mieć wewnętrzną absorbancję tła lub fluorescencję, które mogą zakłócać absorbancję lub fluorescencję barwnika wskaźnikowego (barwników) (np. związki o barwie mogą wpływać na absorbancję, albumina surowicy29, a związki zakłócające enzymy redukujące30,31). W takim przypadku tabliczka musi zawierać dodatkową kontrolę polegającą na dodaniu roztworów badanej substancji chemicznej do studzienek bez komórek. Ma to na celu sprawdzenie możliwej interferencji chemicznej autoabsorbancji/autofluorescencji z barwnikami. W przypadku wykrycia interferencji należy ocenić, czy można ją wykluczyć, aby uzyskać prawidłowe przewidywanie cytotoksyczności.

5. Testy cytotoksyczności

UWAGA: Przygotuj wszystkie roztwory zgodnie z Tabelą 1. Wszystkie kroki opisane poniżej (Rysunek 1) są wykonywane w sterylnych warunkach. Nie zaleca się używania pipety do wyrzucania pożywki ekspozycyjnej, ponieważ komórki mogą łatwo oderwać się od studzienek po obróbce chemicznej.

  1. Testy AB i CFDA-AM
    1. Po 24 godzinach ekspozycji na badaną substancję chemiczną należy ostrożnie wyrzucić podłoże ekspozycyjne, wlewając zawartość do tacki zbiorczej.
    2. Umyj płytkę 200 μl PBS. Ostrożnie wyjmij PBS, wlewając go do tacki zbiorczej, aby uniknąć utraty komórek.
    3. Dodać 100 μl roztworu AB/CFDA-AM na studzienkę. Inkubować płytkę przez 30 minut w ciemności w temperaturze 28 °C.
    4. Zmierzyć fluorescencję w czytniku płytek fluorescencyjnych przy 530 nm (wzbudzenie) i 595 nm (emisja) dla AB oraz przy 493 nm (wzbudzenie) i 541 nm (emisja) dla CFDA-AM.
  2. Test NR
    UWAGA: Etapy testu NR są przeprowadzane bezpośrednio po testach AB i CFDA-AM (Rysunek 1).
    1. Odwirować roztwór roboczy NR (40 μg/ml) przy 600 × g przez 10 min.
      UWAGA: Wytrącanie się NR w rurce nie może być przenoszone na płytki. Tak więc, po odwirowaniu roztworu roboczego NR, zebrać supernatant za pomocą pipety bez zasysania osadów NR. Przenieść supernatant do zbiornika odczynnika.
    2. Ostrożnie usunąć roztwór AB/CFDA-AM, wlewając zawartość do tacki zbiorczej.
    3. Dodać 100 μl roztworu roboczego NR do dołka za pomocą mikropipety wielokanałowej. Inkubować płytkę w temperaturze 28 °C przez 3 h.
      UWAGA: Po 3 godzinach inkubacji obserwować pod mikroskopem, czy na płytkach wystąpiły opady NR. Osady NR mogą zakłócać kwantyfikację żywotności komórek, dlatego nie powinny być obecne.
    4. Ostrożnie usunąć roztwór NR, wlewając zawartość do tacki zbiorczej. Umyj studzienki, dodając 150 μl PBS na studzienkę.
    5. Dodać 150 μl roztworu ekstrakcyjnego NR do dołka i inkubować płytkę na wytrząsarce przez 10 minut w celu delikatnego wstrząsnięcia. Zmierzyć absorbancję przy 540 nm w czytniku płytek.
      UWAGA: Należy przeprowadzić drugi odczyt przy długości fali 690 nm, aby wykluczyć jakąkolwiek absorpcję odcisków palców tła w płytce.
  3. Test MTT
    UWAGA: Test MTT musi być przeprowadzony oddzielnie od testów opisanych powyżej (na nowej płytce) (Rysunek 2).
    1. Ostrożnie wyjmij nośnik naświetlania, wlewając zawartość do tacy zbiorczej.
    2. Dodać 100 μl roztworu roboczego MTT do dołka za pomocą wielokanałowej mikropipety. Inkubować płytkę w temperaturze 28 °C przez 4 godziny.
    3. Wyrzuć roztwór MTT, wlewając zawartość do tacki zbiorczej.
    4. Dodać 100 μl na dołek DMSO, aby wyekstrahować kryształy formazanu, inkubując płytkę na wytrząsarce płytek przez 10 minut. Zmierzyć absorbancję przy 570 nm za pomocą czytnika płytek.
      UWAGA: Należy przeprowadzić drugi odczyt przy długości fali 690 nm, aby wykluczyć jakąkolwiek absorpcję odcisków palców tła w płytce. Należy zauważyć, że badane substancje chemiczne mogą zakłócać MTT, co należy ocenić w celu zapewnienia jakości generowanych danych32. W tym celu należy naświetlić studzienki bezkomórkowe zawierające badane stężenia i MTT (0,5 mg/ml), a następnie przeprowadzić inkubację w celu zaobserwowania wszelkich zmian koloru w studzienkach, które mogą zwiększyć absorbancję i prowadzić do fałszywych wyników żywotności. W tym teście należy unikać substancji chemicznych, które wchodzą w interakcje z MTT.

6. Obliczanie żywotności komórek/cytotoksyczności

UWAGA: Uzyskana surowa absorbancja lub fluorescencja jest używana do obliczania żywotności komórek jako procent związany z kontrolą ujemną (dla badanych substancji chemicznych przygotowanych bezpośrednio w pożywce ekspozycyjnej) lub kontrolą rozpuszczalnika (dla badanych substancji chemicznych przygotowanych przy użyciu rozpuszczalników, takich jak DMSO). Przed określeniem procentu żywotności komórek surowe dane muszą zostać znormalizowane przez ślepą próbę.

  1. Oblicza się średnią absorbancję lub fluorescencję dla każdego stężenia badanej substancji chemicznej i grupy kontrolnej (trzy studzienki/poddanie działaniu substancji).
  2. Aby określić procent żywotności komórek w stosunku do kontroli (ujemny lub rozpuszczalnik), użyj równania (2):
    Wzór na obliczanie żywotności komórek w analizie biochemicznej, pokazujący procent na podstawie absorbancji. (2)
    UWAGA: Jednostki absorbancji (abs) lub fluorescencji (fluo) reprezentują średnią absorbancji lub fluorescencji mierzoną w trzech studzienkach na stężenie; Puste reprezentuje studzienki bez komórek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 3 pokazuje płytki testów AB, CFDA-AM, NR i MTT. W przypadku testu AB (Rysunek 3A), studzienki ślepe i studzienki bez lub ze zmniejszoną liczbą żywotnych komórek mają niebieski kolor i niską fluorescencję, podczas gdy studzienki z dużą liczbą żywotnych komórek są różowawe i wykazują wysokie wartości fluorescencji ze względu na przemianę resazuryny (AB) w rezorufinę (różowawą substancję) przez żywe komórki. W przypadku testu CFDA-AM nie ma widocznej różnicy w kolorz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy cytotoksyczności są szeroko stosowane do oceny toksyczności in vitro, a w niniejszym artykule protokołu przedstawiono cztery powszechnie stosowane testy cytotoksyczności zmodyfikowane do wykonywania na liniach komórkowych danio pręgowanego (tj. gęstość komórek dla płytki 96-dołkowej, czas inkubacji w teście MTT, wyczerpanie FBS w warunkach narażenia na chemikalia oraz maksymalne dopuszczalne stężenie dla SC). Ponieważ testy te określają ilościowo cytotoksyczność za pomocą różnych punktów końcowych żywotnoś...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pamięci dr Márcio Lorenciniego, współautora tej pracy, doskonałego badacza w dziedzinie kosmetyków i oddanego promowaniu badań kosmetycznych w Brazylii. Autorzy są wdzięczni Laboratorium Wielozadaniowemu na Wydziale Fizjologii (UFPR) za dostępność sprzętu oraz za wsparcie finansowe Koordynacji na rzecz Doskonalenia Kadr Szkolnictwa Wyższego (CAPES, Brazylia) (Kod Finansowy 001) i Grupo Boticario.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5-CFDA, AM (dioctan 5-karboksyfluoresceiny, ester acetoksymetylowy)InvitrogenC1345
Płytka do hodowli komórkowych, płytka 96-dołkowaSarstedt83.3924Powierzchnia: Standardowa, płaska podstawa
DMEMGibco12800-017Proszek, wysoka glukoza, pirogronian
FBS - Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, regiony zatwierdzone przez USDAGibco12657-029
Szynka F-12 Mieszanka odżywcza, proszekGibco21700026Powder
HEPES (1 M)Gibco15630080
Leibovitz's L-15 MediumGibco41300021
Powder Neutralny czerwony Sigma-AldrichN4638Proszek, Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych
Wytrząsarka orbitalna WarmnestKLD-350-BIśrednicy obrotu 22 mm
Dulbeccos PBS (10X) z wapniem i magnezemInvitrogen14080055
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15140122
Sól sodowa rezazuryny Sigma-AldrichR7017Proszek, Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych
RPMI 1640 MediumGibco31800-014Proszek
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761Proszek,  bioreagent do biologii molekularnej
Błękit tiazolowy Bromek tetrazolu  98%Sigma-AldrichM2128
Niebieska plama trypanowa (0,4%)Gibco15250-061
Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowejGibco15400054
Linia komórkowa ZEM2SATCCCRL-2147Ta linia komórkowa została dzięki uprzejmości profesora Dr. Michaela J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
Linia komórkowa ZFLBCRJ256
o

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
  2. Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022).
  3. Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
  4. Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
  5. Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
  6. Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
  7. Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
  8. Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
  9. Freshney, R. I. Cytotoxicity. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  12. Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
  13. Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
  14. Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
  15. Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
  16. Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization. , Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019).
  17. Organisation for Economic Co-operation and Development. Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , OECD Publishing. Paris. (2021).
  18. Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
  19. Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
  20. Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
  21. Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
  22. Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
  23. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843(2021).
  24. Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
  25. Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
  26. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  27. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
  28. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987(2021).
  29. Funk, D., Schrenk, H. -H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178(2007).
  30. Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD's fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
  31. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  32. Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
  33. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
  34. Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
  35. Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , John Wiley & Sons, Inc. (2018).
  36. Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133(2021).
  37. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368(2021).
  38. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755(2020).
  39. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966(2020).
  40. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  41. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  42. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892(2020).
  43. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24(2021).
  44. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023).
  45. Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
  46. Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
  47. Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
  48. Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
  49. Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
  50. Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
  51. Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
  52. Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
  53. Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
  54. Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Research. 51 (10), 2515-2520 (1991).
  55. Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
  56. Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cytotoxicity AssayZebrafish Cell LinesAcute ToxicityViable Cell CountZEM2S CellsZFL CellsEcotoxicity StudiesTest Chemicals96 well Plate AssayMulti channel PipetteIncubationControl GroupsFetal Bovine SerumExposure MediaTechnical Triplicates