Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy cytotoksyczności z liniami komórkowymi danio pręgowanego

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64860

⸱

6 stycznia 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia powszechnie stosowane testy cytotoksyczności (testy Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red i MTT) dostosowane do oceny cytotoksyczności w liniach komórkowych zarodka danio pręgowanego (ZEM2S) i wątroby (ZFL) na 96-dołkowych płytkach.

Streszczenie

Linie komórkowe ryb stały się coraz częściej wykorzystywane w badaniach ekotoksyczności, a testy cytotoksyczności zostały zaproponowane jako metody przewidywania ostrej toksyczności ryb. W związku z tym protokół ten przedstawia testy cytotoksyczności zmodyfikowane w celu oceny żywotności komórek w liniach komórkowych zarodka danio pręgowanego (Danio rerio) (ZEM2S) i wątroby (ZFL) na płytkach 96-dołkowych. Oceniane punkty końcowe cytotoksyczności to integralność mitochondrialna (testy Alamar Blue [AB] i MTT), integralność błony poprzez aktywność esterazy (test CFDA-AM) i lizosomalna integralność błony (test neutralnej czerwieni [NR]). Po wystawieniu substancji badanych na 96-dołkową płytkę przeprowadza się testy cytotoksyczności; tutaj AB i CFDA-AM są przeprowadzane jednocześnie, a następnie NR na tej samej płytce, podczas gdy test MTT jest wykonywany na osobnej płytce. Odczyty dla tych testów są wykonywane przez fluorescencję dla AB i CFDA-AM oraz absorbancję dla MTT i NR. Testy cytotoksyczności przeprowadzone na tych liniach komórkowych ryb mogą być wykorzystane do badania ostrej toksyczności substancji chemicznych dla ryb.

Wprowadzenie

Substancje chemiczne muszą być testowane pod kątem ich bezpieczeństwa dla zdrowia ludzkiego i środowiska. Biomarkery molekularne i komórkowe są coraz częściej brane pod uwagę w ocenach bezpieczeństwa w celu przewidywania skutków dla organizmów żywych przez agencje regulacyjne i/lub przepisy (np. REACH, OECD, US EPA)1,2, ponieważ mogą one poprzedzać niekorzystny wynik in vivo (np. zaburzenia endokrynologiczne, odpowiedź immunologiczna, ostra toksyczność, fototoksyczność)3,4,5,6,7. W tym kontekście, cytotoksyczność została przyjęta jako miara do przewidywania ostrej toksyczności ryb5,8; Może jednak mieć wiele innych zastosowań w badaniach ekotoksyczności, takich jak definiowanie subcytotoksycznych stężeń substancji chemicznych w celu zbadania ich najróżniejszego zestawu skutków dla ryb (np. skutków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego).

W systemach hodowli komórkowych (in vitro), cytotoksyczność substancji chemicznych może być określana metodami różniącymi się typami punktów końcowych. Na przykład metoda cytotoksyczności może opierać się na punkcie końcowym związanym ze specyficzną morfologią obserwowaną podczas procesu śmierci komórki, podczas gdy inna może określać cytotoksyczność poprzez pomiar śmierci, żywotności i funkcjonalności komórki, morfologii, metabolizmu energetycznego oraz przyczepiania i proliferacji komórek. Substancje chemiczne mogą wpływać na żywotność komórek poprzez różne mechanizmy, dlatego ocena cytotoksyczności obejmująca różne punkty końcowe żywotności komórek jest niezbędna do przewidywania skutków chemicznych9.

MTT i Alamar Blue (AB) to testy, które określają wpływ na żywotność komórek na podstawie aktywności metabolicznej komórki. Test MTT ocenia aktywność enzymu mitochondrialnego dehydrogenazy bursztynianowej10. Redukcja żółtawego bromku 3-[4,5-dimetylotiazol-2ylo]-2,5-difenylotetrazolu (MTT) do błękitu formazanu zachodzi tylko w komórkach żywotnych, a jego gęstość optyczna jest wprost proporcjonalna do liczby komórek zdolnych do życia10. Test AB jest czułym wskaźnikiem oksydacyjno-redukcyjnym, w którym pośredniczą enzymy mitochondrialne, które fluoryzują i zmieniają kolor po redukcji resazuryny do rezorufiny przez żywe komórki11; jednak enzymy cytozolowe i mikrosomalne również przyczyniają się do redukcji AB i MTT12. Enzymy te mogą obejmować kilka reduktaz, takich jak oksydoreduktazy alkoholowe i aldehydowe, NAD(P)H: oksydoreduktaza chinonowa, reduktaza flawinowa, dehydrogenaza NADH i cytochromy11.

Test neutralnej czerwieni (NR) to test żywotności komórek oparty na włączeniu tego barwnika do lizosomów żywotnych komórek13. Wychwyt NR zależy od zdolności komórek do utrzymania gradientów pH. Gradient protonów wewnątrz lizosomów utrzymuje pH niższe niż cytoplazma. Przy normalnym fizjologicznym pH NR ma ładunek netto w przybliżeniu zerowy, co umożliwia mu przenikanie przez błony komórkowe. W ten sposób barwnik zostaje naładowany i zostaje zatrzymany w lizosomach. W związku z tym, im większa ilość zatrzymanego NR, tym większa liczba żywotnych komórek14. Substancje chemiczne, które uszkadzają powierzchnię komórki lub błony lizosomalne, upośledzają wychwyt tego barwnika.

Test CFDA-AM jest fluorometrycznym testem żywotności komórek opartym na zachowaniu estru acetoksymetylowego dioctanu 5-karboksyfluoresceiny (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, substrat esterazy, jest przekształcany w karboksyfluoresceinę, substancję fluorescencyjną, która jest polarna i nieprzepuszczalna przez błony żywych komórek15; w ten sposób jest zatrzymywana w wewnętrznej stronie nienaruszonej błony komórkowej, wskazując żywe komórki.

Niedawno, trzy testy cytotoksyczności (testy CFDA-AM, NR i AB) zostały połączone w zatwierdzonych wytycznych ISO (Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna) (ISO 21115:2019)16 i OECD (Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju) metoda testowa (OECD TG 249) do oceny ostrej toksyczności ryb przy użyciu linii komórkowej RTgill-W1 (stała linia komórkowa pstrąga tęczowego [Oncorhynchus mykiss] skrzela) na płytkach 24-dołkowych17. Chociaż istnieje metoda oparta na komórkach do przewidywania ostrej toksyczności u ryb, włożono wysiłki w opracowanie podobnych metod dla innych gatunków ryb i zwiększenie przepustowości tej metody. Niektóre przykłady obejmują rozwój linii komórkowych ZFL transfekowanych genami reporterowymi dla określonych szlaków toksyczności18,19, testy fototoksyczności w linii komórkowej RTgill-W120, oraz wykorzystanie linii komórkowych ZFL i ZF4 (fibroblasty danio pręgowanego pochodzące z 1-dniowych zarodków) do oceny toksyczności za pomocą kilku testów cytotoksyczności21.

Danio rerio (danio pręgowany) jest jednym z głównych gatunków ryb wykorzystywanych w badaniach toksyczności dla organizmów wodnych; dlatego metody oparte na komórkach z liniami komórkowymi danio pręgowanego do testowania toksyczności ryb mogą być niezwykle przydatne. Linia komórkowa ZFL to linia komórkowa hepatocytów nabłonka danio pręgowanego, która przedstawia główne cechy komórek miąższowych wątroby i może metabolizować ksenobiotyki7,22,23,24,25. Tymczasem linia komórkowa ZEM2S to embrionalna linia komórek fibroblastycznych danio pręgowanego wywodząca się ze stadium blastuli, która może być wykorzystana do zbadania wpływu rozwojowego na ryby26,27. W związku z tym protokół ten opisuje cztery testy cytotoksyczności (testy MTT, AB, NR i CFDA-AM), z modyfikacjami, które należy przeprowadzić na liniach komórkowych ZFL i ZEM2S na 96-dołkowych płytkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Listę materiałów wykorzystanych w tym protokole znajduje się w Tabeli materiałów, a skład zastosowanych roztworów i pożywek w Tabeli 1.

1. Przygotowanie komórek ZFL i ZEM2S

  1. Zacznij od kolby T75 z komórkami ZFL lub ZEM2S o 80% konfluencji, hodowanymi w odpowiedniej pożywce kompletnej w temperaturze 28 °C bez CO2.
  2. Usuń pożywkę hodowlaną z kolby i przemyj komórki, dodając 10 mL 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) (0.01 M). Do kolb hodowlanych dodaj 3 mL 1x trypsyny (0,05% v/v; 0,5 mM trypsyny-EDTA). Inkubuj w temperaturze 28 °C przez 3 min.
  3. Delikatnie opukaj kolbę, aby odczepić komórki, a następnie przerwij trawienie trypsyną, dodając do kolby 3 mL kompletnej pożywki hodowlanej.
  4. Przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mL i odwiruj przy 100 × g przez 5 min.
  5. Po wirowaniu ostrożnie usuń supernatant, dodaj 1 mL pożywki kompletnej dla komórek ZFL lub ZEM2S i resuspenduj osad za pomocą mikropipety.

2. Liczenie komórek metodą wykluczania barwnika trypan blue

  1. Dodaj 10 µL zawiesiny komórkowej i 10 µL barwnika błękitu trypanowego do mikroprobówki w celu policzenia komórek i oceny ich żywotności. Wymieszać zawiesinę komórkową z barwnikiem za pomocą pipety.
  2. Następnie przenieść 10 µL tej mieszaniny (zawiesiny komórkowej + błękitu trypanu) do komory Neubauera i policzyć komórki w czterech dużych polach (kwadrantach Q) znajdujących się w narożach komory, przyjmując, że komórki żywe to takie, które nie pobrały błękitu trypanu. Wyznaczyć liczbę żywych komórek, korzystając z równania (1):
    Wzór obliczania liczby komórek, ΣQ/4 x 10^4, równanie do kwantyfikacji komórek. (1)
  3. Oblicz końcową liczbę komórek w zawiesinie komórkowej, mnożąc liczbę komórek wyznaczoną za pomocą równania (1) przez dwa (czynnik rozcieńczenia wynikający z zastosowania błękitu trypanu).
    UWAGA: Alternatywnie można zastosować zautomatyzowany system liczenia komórek (np.., można użyć cytometru z funkcją liczenia komórek i oceny ich żywotności).

3. Wysiewanie komórek na płytki 96-dołkowe

  1. Oblicz objętość zawiesiny komórkowej niezbędną do uzyskania liczby komórek wymaganej do przeprowadzenia testów cytotoksyczności. Liczba żywych komórek dla każdej linii komórkowej została wskazana poniżej:
    1. Wysiać 60 000 żywych komórek komórki ZEM2S na studzienkę; zatem dla całej płytki należy użyć sześciu milionów komórek w 20 ml pożywki kompletnej (200 µL/well, płytka 96-dołkowa).
    2. Wysiać 40 000 żywych komórek komórki ZFL na dołek; zatem dla całej płytki należy użyć czterech milionów komórek w 20 ml pożywki kompletnej (200 µL/well, płytka 96-dołkowa).
  2. Następnie przenieś odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej do zbiornika na odczynniki (sterylnego) i dopełnij pełną pożywką hodowlaną dla ZFL lub ZEM2S do objętości 20 ml. Za pomocą pipety wielokanałowej delikatnie wymieszaj roztwór, pipetując go w górę i w dół.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie dopuścić do powstania piany ani pęcherzyków powietrza.
  3. Dodaj 200 µL zawiesiny komórkowej do każdej studzienki przezroczystej 96-dołkowej płytki polistyrenowej za pomocą mikropipety wielokanałowej. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C przez 24 h.
    UWAGA: Płytka musi posiadać co najmniej trzy studzienki bez komórek dla kontroli tła, do których należy dodać wyłącznie kompletną pożywkę. W analizach z wykorzystaniem płytek 96-dołkowych często występuje efekt brzeżny (spowodowany silniejszym odparowaniem w studzienkach brzegowych), który może wpływać na żywotność komórek w tych studzienkach.28Efekt ten może być silniejszy lub słabszy w zależności od marki i konstrukcji płytki 96-dołkowej.28Chociaż nie odnotowaliśmy zaburzeń wzrostu ani żywotności komórek ZFL i ZEM2S w studzienkach brzegowych, sugerujemy uszczelnienie płytki parafimem lub samoprzylepną folią uszczelniającą w celu zapobiegania temu zjawisku lub hodowanie komórek wyłącznie w 60 studzienkach wewnętrznych i wypełnienie studzienek brzegowych PBS.

4. Ekspozycja komórek na substancję testową

  1. Ostrożnie usuń zużyte medium z dołków za pomocą mikropipety wielokanałowej.
  2. Poddaj komórki działaniu substancji testowych w różnych stężeniach. Przygotuj roztwory odpowiednich stężeń substancji testowej w pożywce hodowlanej dla ZFL lub ZEM2S bez dodatku płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (medium ekspozycyjne). Następnie dodaj 100 µL tych roztworów na dołek w trzech powtórzeniach technicznych (tj. trzy dołki na jedno stężenie substancji testowej).
  3. W przypadku kontroli, umieść grupy kontrolne na tej samej płytce co substancję testową w trzech powtórzeniach technicznych (trzy dołki na grupę kontrolną). W ten sposób dla kontroli ślepej (B) dodaj 100 µL medium ekspozycyjnego do dołków bez komórek, dla kontroli negatywnej (NC) dodaj 100 µL medium ekspozycyjnego do dołków z komórkami, a dla kontroli pozytywnej (PC) poddaj komórki działaniu 1% roztworu Triton X-100 przygotowanego w medium ekspozycyjnym. W niektórych przypadkach na płytce powinna znaleźć się kontrola rozpuszczalnika (SC), przyjmując wyraźnie niecytotoksyczne stężenie jako końcowe stężenie rozpuszczalnika.
    UWAGA: Zaleca się stosowanie 0,5% DMSO jako rozpuszczalnika; w tych liniach komórkowych DMSO może być stosowany w stężeniu do 1% bez przekraczania progu cytotoksyczności wynoszącego 10% w stosunku do kontroli negatywnej.
  4. Inkubuj płytki w temperaturze 28 °C przez 24 h. Uszczelnij płytki parafilmem lub samoprzylepną folią uszczelniającą, aby zapobiec odparowywaniu pożywki hodowlanej.
    ​UWAGA: Niektóre substancje chemiczne mogą wykazywać wewnętrzną absorbancję tła lub fluorescencję, co może zakłócać absorbancję lub fluorescencję barwnika wskaźnikowego (np. związki barwne mogą wpływać na absorbancję, albumina surowicy29 oraz związki interferujące z enzymami redukcyjnymi30,31). W takim przypadku na płytce musi znaleźć się dodatkowa kontrola poprzez dodanie roztworów substancji testowej do dołków bez komórek. Służy to weryfikacji możliwej interferencji autoabsorbancji/autofluorescencji substancji chemicznej z barwnikami. Jeśli wykryta zostanie interferencja, należy ocenić, czy można ją wykluczyć w celu uzyskania prawidłowego wyniku oceny cytotoksyczności.

5. Testy cytotoksyczności

UWAGA: Wszystkie roztwory należy przygotować zgodnie z Tabelą 1. Wszystkie opisane poniżej etapy (Rysunek 1>) są przeprowadzane w warunkach sterylnych. Nie zaleca się używania pipety do usuwania pożywki ekspozycyjnej, ponieważ komórki mogą łatwo oddzielić się od dołków po obróbce chemicznej.

  1. Testy AB i CFDA-AM
    1. Po 24 h ekspozycji na substancję testową ostrożnie usunąć medium ekspozycyjne, wlewając jego zawartość do tacy zbierającej.
    2. Przemyć płytkę 200 µL PBS. Ostrożnie usunąć PBS, wlewając go do tacy zbierającej, aby uniknąć utraty komórek.
    3. Do każdego dołka dodać 100 µL roztworu AB/CFDA-AM. Inkubować płytkę przez 30 min w ciemności w temperaturze 28 °C.
    4. Zmierz fluorescencję w płytkowym czytniku fluorescencji przy 530 nm (wzbudzenie) i 595 nm (emisja) dla AB oraz przy 493 nm (wzbudzenie) i 541 nm (emisja) dla CFDA-AM.
  2. Test NR
    UWAGA: Kroki testu NR wykonuje się bezpośrednio po testach AB i CFDA-AM (Rysunek 1).
    1. Odwirować roztwór roboczy NR (40 µg/mL) przy 600 × g przez 10 min.
      UWAGA: Osad NR w probówce nie może zostać przeniesiony na płytki. Dlatego po odwirowaniu roztworu roboczego NR należy zebrać nadsącz za pomocą pipety, nie zasysając osadu NR. Przenieść nadsącz do zbiornika na odczynniki.
    2. Ostrożnie usunąć roztwór AB/CFDA-AM, wlewając jego zawartość do tacy zbierającej.
    3. Do każdego dołka dodać 100 µL roztworu roboczego NR za pomocą wielokanałowej mikropipety. Inkubować płytkę w temperaturze 28 °C przez 3 h.
      UWAGA: Po 3 h inkubacji sprawdzić pod mikroskopem, czy w płytkach nie wystąpiło wytrącanie NR. Osady NR mogą zakłócać ilościowe oznaczenie żywotności komórek, dlatego nie powinny być obecne.
    4. Ostrożnie usunąć roztwór NR, wlewając jego zawartość do tacy zbierającej. Przemyć dołki, dodając 150 µL PBS na dołek.
    5. Do każdego dołka dodać 150 µL roztworu ekstrakcyjnego NR i inkubować płytkę na wstrząsarce do płytek przez 10 min przy łagodnym wstrząsaniu. Zmierzyć absorbancję przy 540 nm w czytniku płytek.
      UWAGA: Należy wykonać drugi odczyt przy 690 nm, aby wykluczyć jakąkolwiek absorbancję tła w płytce.
  3. Test MTT
    UWAGA: Test MTT musi być przeprowadzony oddzielnie od testów opisanych powyżej (na nowej płytce) (Rysunek 2).
    1. Ostrożnie usunąć medium ekspozycyjne, wlewając jego zawartość do tacy zbierającej.
    2. Do każdego dołka dodać 100 µL roztworu roboczego MTT za pomocą wielokanałowej mikropipety. Inkubować płytkę w temperaturze 28 °C przez 4 h.
    3. Usunąć roztwór MTT, wlewając jego zawartość do tacy zbierającej.
    4. Do każdego dołka dodać 100 µL DMSO w celu ekstrakcji kryształów formazanu, inkubując płytkę na wstrząsarce do płytek przez 10 min. Zmierzyć absorbancję przy 570 nm za pomocą czytnika płytek.
      UWAGA: Należy wykonać drugi odczyt przy 690 nm, aby wykluczyć jakąkolwiek absorbancję tła w płytce. Należy zauważyć, że substancje testowe mogą zakłócać test MTT, co musi zostać ocenione w celu zapewnienia jakości uzyskanych danych32. W tym celu należy poddać ekspozycji dołki bez komórek zawierające stężenia testowe i MTT (0,5 mg/mL), a następnie inkubować, aby zaobserwować ewentualną zmianę barwy w dołkach, która mogłaby zwiększyć absorbancję i doprowadzić do fałszywych wyników żywotności. W tym teście należy unikać substancji chemicznych wchodzących w interakcje z MTT.

6. Obliczanie żywotności komórek/cytotoksyczności

UWAGA: Uzyskana surowa absorbancja lub fluorescencja jest wykorzystywana do obliczenia żywotności komórek jako procentu w stosunku do kontroli negatywnej (dla substancji testowych przygotowanych bezpośrednio w pośrodku ekspozycyjnym) lub kontroli rozpuszczalnika (dla substancji testowych przygotowanych z użyciem rozpuszczalników, takich jak DMSO). Przed wyznaczeniem procentowej żywotności komórek dane surowe muszą zostać znormalizowane względem kontroli pustej (blanku).

  1. Oblicz średnią absorbancję lub fluorescencję dla każdego z badanych stężeń substancji chemicznej oraz grupy kontrolnej (trzy dołki/próba).
  2. Aby określić procent żywotności komórek w stosunku do kontroli (negatywnej lub rozpuszczalnika), zastosuj równanie (2):
    Wzór na obliczanie żywotności komórek, równanie dla pomiaru fluorescencji lub absorbancji, analiza badawcza. (2)
    UWAGA: Jednostki absorbancji (abs) lub fluorescencji (fluo) reprezentują średnią wartość absorbancji lub fluorescencji zmierzonej w trzech dołkach na jedno stężenie; blank oznacza dołki bez komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 3 przedstawia płytki z testami AB, CFDA-AM, NR oraz MTT. W przypadku testu AB (Rysunek 3A), studzienki kontrolne (blank) oraz studzienki bez żywych komórek lub z ich niewielką liczbą wykazują niebieski kolor i niską fluorescencję, natomiast studzienki z dużą liczbą żywych komórek mają barwę różową i wykazują wysokie wartości fluorescencji, co wynika z przekształcenia rezauryny (AB) w rezorufinę (substancję różową) przez żywe komórki. W przypadku testu CF...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Testy cytotoksyczności są szeroko stosowane do oceny toksyczności in vitro, a w niniejszym artykule protokołu przedstawiono cztery powszechnie stosowane testy cytotoksyczności zmodyfikowane do wykonywania na liniach komórkowych danio pręgowanego (tj. gęstość komórek dla płytki 96-dołkowej, czas inkubacji w teście MTT, wyczerpanie FBS w warunkach narażenia na chemikalia oraz maksymalne dopuszczalne stężenie dla SC). Ponieważ testy te określają ilościowo cytotoksyczność za pomocą różnych punktów końcowych żywotnoś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Pamięci dr Márcio Lorenciniego, współautora tej pracy, doskonałego badacza w dziedzinie kosmetyków i oddanego promowaniu badań kosmetycznych w Brazylii. Autorzy są wdzięczni Laboratorium Wielozadaniowemu na Wydziale Fizjologii (UFPR) za dostępność sprzętu oraz za wsparcie finansowe Koordynacji na rzecz Doskonalenia Kadr Szkolnictwa Wyższego (CAPES, Brazylia) (Kod Finansowy 001) i Grupo Boticario.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-CFDA, AM (dioctan 5-karboksyfluoresceiny, ester acetoksymetylowy)InvitrogenC1345
Płytka do hodowli komórkowych, płytka 96-dołkowaSarstedt83.3924Powierzchnia: Standardowa, płaska podstawa
DMEMGibco12800-017Proszek, wysoka glukoza, pirogronian
FBS - Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, regiony zatwierdzone przez USDAGibco12657-029
Szynka F-12 Mieszanka odżywcza, proszekGibco21700026Powder
HEPES (1 M)Gibco15630080
Leibovitz's L-15 MediumGibco41300021
Powder Neutralny czerwony Sigma-AldrichN4638Proszek, Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych
Wytrząsarka orbitalna WarmnestKLD-350-BIśrednicy obrotu 22 mm
Dulbeccos PBS (10X) z wapniem i magnezemInvitrogen14080055
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15140122
Sól sodowa rezazuryny Sigma-AldrichR7017Proszek, Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych
RPMI 1640 MediumGibco31800-014Proszek
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761Proszek,  bioreagent do biologii molekularnej
Błękit tiazolowy Bromek tetrazolu  98%Sigma-AldrichM2128
Niebieska plama trypanowa (0,4%)Gibco15250-061
Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowejGibco15400054
Linia komórkowa ZEM2SATCCCRL-2147Ta linia komórkowa została dzięki uprzejmości profesora Dr. Michaela J.
Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)
Linia komórkowa ZFLBCRJ256
o

Bibliografia

  1. ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
  2. Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022).
  3. Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
  4. Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
  5. Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
  6. Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
  7. Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
  8. Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
  9. Freshney, R. I. Cytotoxicity. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique. , (2005).
  10. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  11. O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  12. Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
  13. Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
  14. Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
  15. Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
  16. Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization. , Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019).
  17. Organisation for Economic Co-operation and Development. Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , OECD Publishing. Paris. (2021).
  18. Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
  19. Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
  20. Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
  21. Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
  22. Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
  23. Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843(2021).
  24. Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
  25. Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
  26. Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
  27. He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
  28. Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987(2021).
  29. Funk, D., Schrenk, H. -H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178(2007).
  30. Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD's fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
  31. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  32. Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
  33. Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
  34. Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
  35. Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , John Wiley & Sons, Inc. (2018).
  36. Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133(2021).
  37. Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368(2021).
  38. da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755(2020).
  39. Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966(2020).
  40. Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
  41. Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
  42. Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892(2020).
  43. Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24(2021).
  44. ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023).
  45. Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
  46. Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
  47. Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
  48. Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
  49. Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
  50. Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
  51. Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
  52. Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
  53. Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
  54. Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Research. 51 (10), 2515-2520 (1991).
  55. Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
  56. Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Linie komórkowe rybtoksyczność ostrażywotność komórektest Alamar Bluetest MTTtest neutralnej czerwienitest CFDA-AMpłytka 96-dołkowa
Testy cytotoksyczności z liniami komórkowymi danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.