Artykuł metodologiczny

Wypreparowanie tkanki trzustki w celu wyizolowania żywotnych pojedynczych komórek

DOI:

10.3791/64871

⸱

26 maja 2023

 ,  , 
1The Lautenberg Center for Immunology and Cancer Research, The Institute for Medical Research Israel-Canada, Faculty of Medicine, The Hebrew University of Jerusalem

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki metaplastyczne trzustki są prekursorami komórek nowotworowych, które powodują powstawanie guzów trzustki. Jednak wyizolowanie nienaruszonych żywotnych komórek trzustki jest trudne. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę dysocjacji tkanek trzustkowych. Komórki można następnie wykorzystać do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) lub do dwu- lub trójwymiarowej kohodowli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzustka składa się z dwóch głównych systemów: układu hormonalnego, który produkuje i wydziela hormony, oraz systemu zewnątrzwydzielniczego, który stanowi około 90% trzustki i zawiera komórki, które produkują i wydzielają enzymy trawienne. Enzymy trawienne są wytwarzane w komórkach groniastych trzustki, przechowywane w pęcherzykach zwanych zymogenami, a następnie są uwalniane do dwunastnicy przez przewód trzustkowy w celu zainicjowania procesów metabolicznych. Enzymy wytwarzane przez komórki groniaste mogą zabijać komórki lub degradować bezkomórkowe RNA. Ponadto komórki groniaste są delikatne, a powszechne protokoły dysocjacji skutkują dużą liczbą martwych komórek i bezkomórkowymi proteazami i RNazami. Dlatego jednym z największych wyzwań w trawieniu tkanki trzustki jest odzyskanie nienaruszonych i żywotnych komórek, zwłaszcza komórek groniastych. Protokół przedstawiony w tym artykule przedstawia dwuetapową metodę, którą opracowaliśmy, aby zaspokoić tę potrzebę. Protokół może być stosowany do trawienia normalnej trzustki, trzustki, która zawiera zmiany przednowotworowe lub guzów trzustki, które obejmują dużą liczbę komórek zrębu i komórek odpornościowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDAC) jest jednym z najbardziej agresywnych typów nowotworów1. Dowody kliniczne potwierdzają pogląd, że PDAC rozwija się z komórek układu zewnątrzwydzielniczego, w tym komórek groniastych, przez wiele lat, napędzanych przez mutacje w protoonkogenach KRAS klasy protoonkogenów2.

Guzy trzustki obejmują wiele różnych typów komórek, a wykazano, że komórki nowotworowe stanowią tylko 20%-50% masy guza3. Różne typy komórek oddziałują z komórkami nabłonka, wspomagają ich transformację oraz zwiększają powstawanie i wzrost guza. Wczesne zdarzenia powodują metaplazję zrazik, która prowadzi do mikroskopijnych zmian zwanych śródnabłonkową neoplazją trzustki (PanINs), które w niektórych przypadkach mogą przekształcić się w PDAC4.

Istnieje krytyczna potrzeba zbadania tych interakcji i ukierunkowania na kluczowe sygnały. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) to potężna metoda, która ujawnia ekspresję genów w rozdzielczości pojedynczej komórki, śledząc w ten sposób zmiany, jakie zachodzą w komórkach nabłonkowych, umożliwiając w ten sposób badanie rozwoju raka trzustki.

Sekcja tkanek i trawienie do pojedynczych komórek to pierwszy etap eksperymentu z sekwencją scRNA. Kilka czynników sprawia, że trawienie tkanki trzustki jest szczególnie trudne: i) komórki groniaste stanowią ponad 90% trzustki, a komórki groniaste zawierają duże ilości enzymów trawiennych, w tym proteaz i RNaz, które obniżają jakość bibliotek opartych na RNA; (ii) komórki groniaste są bardzo wrażliwe i mogą ulegać lizie, jeśli stosowane są standardowe protokoły; (iii) Komórki groniaste wyrażają niewielką liczbę genów na bardzo wysokich poziomach. Dlatego, jeśli komórki te zostaną poddane lizie podczas eksperymentu, może to zanieczyścić obserwowany profil ekspresji genów innych komórek; (iv) Tkanka trzustki odzyskana z guzów jest desmoplastyczna, co utrudnia jej preparację bez uszkodzenia komórek. Tak więc, mimo że wymagane jest utrzymanie wysokiej żywotności wszystkich typów komórek, duża liczba i wrażliwość komórek groniastych dodatkowo komplikuje sprawę. Czynniki te utrudniają uzyskanie zawiesiny pojedynczej komórki, która jest w ponad 80% żywotna i nie ma grudek, co jest wymagane w eksperymentach z sekwencją scRNA.

Tutaj opracowaliśmy protokół z użyciem trypsyny C i kolagenazy P, wraz z częstym monitorowaniem tkanek. Wspiera to dysocjację do pojedynczych komórek, zachowując jednocześnie wysoką żywotność, aby wspierać sukces eksperymentów z sekwencją scRNA5,6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wspólny komitet etyki (Institutional Animal Care and Use Committee) Uniwersytetu Hebrajskiego (Jerozolima, Izrael) i Hadassah Medical Center (Jerozolima, Izrael) zatwierdził protokół badania dobrostanu zwierząt (MD-18-15417-5 "Dynamika tkanek w raku trzustki u myszy"), a przedstawiony tutaj protokół był zgodny ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi dotyczącymi testów i badań na zwierzętach. Uniwersytet Hebrajski jest instytucją akredytowaną na arenie międzynarodowej przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (Stowarzyszenie na rzecz Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi).

UWAGA: Szczep myszy #007908, #019378 i #008179 pochodzą z laboratorium Jacksona. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato) powstały przez skrzyżowanie powyższych szczepów. Do badania wykorzystano myszy obu płci w wieku od 6 tygodni do 15 miesięcy. Tamoksyfen przygotowywano przez rozpuszczenie proszku w oleju kukurydzianym. Dorosłym myszom (w wieku 6-8 tygodni, samice i samce) wstrzyknięto tamoksyfen podskórnie w dniach 0 i 2 w dawce 400 mg/kg mc. i badano dwa razy w tygodniu po wstrzyknięciu. Nie było możliwe zmierzenie guzów, ponieważ były one zlokalizowane wewnętrznie; Dlatego eutanazja była wykonywana, jeśli zaobserwowano nieprawidłowe objawy kliniczne zgodnie z protokołem etycznym. Myszy poddano eutanazji w różnych punktach czasowych po indukcji tamoksyfenu, przy użyciu izofluranu i zwichnięcia szyjki macicy.

1. Rozwarstwienie trzustki

UWAGA: Dla optymalnej wydajności podczas ekstrakcji i zapewnienia dobrej żywotności komórek, kluczowe znaczenie ma szybka sekcja. Aby skrócić czas potrzebny na izolację trzustki, wszystkie instrumenty i sprzęt muszą być gotowe na lodzie przed eutanazją myszy.

  1. Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO2 i zweryfikuj za pomocą zwichnięcia szyjki macicy. Od tego momentu wszystkie zabiegi muszą być wykonywane przy użyciu sterylnych narzędzi sekcyjnych.
  2. Napraw mysz i spryskaj brzuch 70% etanolem. Wykonaj nacięcie w kształcie litery V o długości 2,5 cm w okolicy narządów płciowych za pomocą nożyczek i kleszczy i przejdź w górę, aby całkowicie otworzyć jamę brzuszną.
  3. Zlokalizuj żołądek po lewej stronie myszy. Zlokalizuj trzustkę, która znajduje się w pobliżu śledziony. Oddziel trzustkę od żołądka i dwunastnicy za pomocą dwóch kleszczy (bez rozdzierania). Kontynuuj i oddziel trzustkę od jelita cienkiego, jelita czczego i jelita krętego.
  4. Przesuń trzustkę na prawą stronę myszy. Oddziel pozostałe połączenia między trzustką a jamą piersiową za pomocą kleszczy, aby całkowicie odłączyć trzustkę i przyczepioną śledzionę.
  5. Wyjąć trzustkę i rozłożyć ją do badania na szalce Petriego na lodzie.
    UWAGA: Podczas tego kroku należy zachować ostrożność, aby usunąć tylko trzustkę, a nie tkankę tłuszczową krezkową lub inną sąsiednią tkankę wraz z trzustką, aby uniknąć zanieczyszczenia komórek.

2. Enzymatyczna i mechaniczna dysocjacja trzustki

  1. Przygotuj wcześniej następujące.
    1. Bufor dysocjacyjny 1: 4 ml trypsyny C + 6 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (patrz tabela 1) dla każdej próbki.
    2. Bufor dysocjacyjny 2: 9 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) 1x; 4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA); 1 ml kolagenazy P (10 mg/ml); 200 μl inhibitora trypsyny (10 mg/ml); i 200 μl DNazy I (10 mg/ml) (patrz Tabela 1).
    3. Bufor do przemywania : 50 ml HBSS 1x; 2 g BSA; 1 ml inhibitora trypsyny (10 mg / ml) i 1 ml DNazy 1 (10 mg / ml).
    4. Roztwór zatrzymujący aktywność enzymów: HBSS 1x zawierający 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 150 g DNazy I (0,2 mg/ml).
  2. Umieść trzustkę w probówce o pojemności 50 ml na lodzie. Wypłucz trzustkę w 10% FBS w HBSS 1x. Tkanka tłuszczowa będzie unosić się na wodzie, a trzustka opadnie. Jest to łatwy sposób na wizualizację i szybkie usunięcie zanieczyszczającej białej tkanki tłuszczowej, która nadal jest przyczepiona do trzustki.
  3. Przenieść tkankę trzustki myszy na sterylną szalkę Petriego zawierającą 5 ml HBSS 1x na lodzie. Pokrój trzustkę na małe kawałki o grubości od 1 do 3 mm3 za pomocą nożyczek Noyes i skalpela (Ryc. 2A). W przypadku więcej niż jednej próbki, próbki należy przechowywać na lodzie w 10% FBS/HBSS 1x.
  4. Przenieś tkanki do probówki wirówkowej. Wirować przy 350 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Odessać i wyrzucić supernatant w celu usunięcia fragmentów komórek i komórek krwi.
  5. Zawiesić kawałki w buforze dysocjacyjnym 1 zawierającym 0,02% trypsyny C-0,05% EDTA na 10 minut w temperaturze 37 °C z mieszaniem (180 obr./min). Natychmiast umyć 10% modyfikowanym medium Eagle's (DMEM) firmy FBS/Dulbecco. Wirować przez 5 minut w temperaturze 350 g w temperaturze 4 °C.
  6. Przemyć ponownie, ponownie zawieszając osad w 10 ml buforu do przemywania i odwirowując przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C przed następnym etapem dysocjacji.
  7. Inkubować trzustkę w buforze dysocjacyjnym 2 przez 15 minut w temperaturze 37 °C z mieszaniem (180 obr./min).
  8. Po 15 minutach przeprowadzić dysocjację mechaniczną, energicznie pipetując fragmenty trzustki w górę i w dół w sterylnych pipetach o zmniejszającym się rozmiarze (pipety serologiczne 25, 10 i 5 ml) 10 razy i przywrócić do temperatury 37 °C.
    1. Po dodatkowych 5 minutach powtórzyć dysocjację mechaniczną i użyć mikroskopii świetlnej do monitorowania dysocjacji w zależności od ilości zawiesiny pojedynczej komórki. Zwykle, jeśli na tym etapie mniej niż 90% zawiesiny składa się z izolowanych pojedynczych komórek, potrzebny jest dłuższy czas inkubacji. Użyj trypana niebieskiego do monitorowania żywotności komórek.
    2. Kontynuować inkubację i pobierać próbki w celu wykrycia dysocjacji co 5 minut
      UWAGA: Całkowity czas inkubacji zależy od tkanki i może się różnić w zależności od próbki. Inkubacja i dysocjacja tkanek powinny zakończyć się, gdy 90% komórek zostanie rozdzielonych na pojedyncze komórki lub gdy wykryte zostanie zmniejszenie żywotności.
  9. Po tym, jak tkanka trzustki jest dobrze zdysocjowana (co odpowiada zanikowi fragmentów trzustki i rosnącemu zmętnieniu roztworu) (Rysunek 2), zatrzymaj reakcję enzymatyczną, przemywając dwukrotnie roztwór zatrzymujący aktywność enzymu na 5 minut w temperaturze 4 °C. Na tym etapie utrzymuj zawiesinę komórek na lodzie.
  10. Przepuść zawiesinę komórek przez nylonową siatkę o grubości 70 μm i sprawdź żywotność komórek pod mikroskopem. Mniejsze rozmiary siatki nylonowej mogą zmniejszyć żywotność komórek.
  11. Ponownie zawiesić i przepłukać osad 5-10 ml lodowato zimnego, buforowanego roztworu do mycia. Policz komórki.
  12. Jeśli zaobserwuje się kilka czerwonych krwinek, należy je traktować buforem do lizy czerwonych krwinek przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. W przypadkach, gdy obserwuje się grudki, próbkę należy ponownie potraktować trypsyną, jak opisano w kroku 2.5. Żywotność wykrywa się za pomocą błękitu trypanowego pod mikroskopem, a jeśli żywotność jest mniejsza niż 80%, żywe komórki należy wyizolować za pomocą zestawu do usuwania martwych komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) z kolumnami MACS MS (patrz Tabela 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niedawno opublikowanym worku5, zastosowaliśmy opisany powyżej protokół, aby zbadać wczesne etapy rozwoju PDAC za pomocą modelu mysiego. Mysz została genetycznie zmodyfikowana tak, aby zawierała kasety Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7, które umożliwiają ekspresję konstytutywnie aktywnego KRAS w komórkach groniastych po wstrzyknięciu tamoksyfenu.

Po zwichnięciu szyjki macicy (zgodnie z protoko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiamy protokół dysocjacji tkanek trzustkowych. Protokół jest prosty, łatwy w użyciu i zapewnia narzędzie do izolowania żywotnych pojedynczych komórek z tkanki trzustki na różnych etapach procesu nowotworowego, w tym guzów litych. W poprzednich badaniach do trawienia trzustki stosowano różne rodzaje kolagenaz 8,9. Stosowanie bardzo silnej kolagenazy, takiej jak kolagenaza D, skutkuje dużą populacją komórek odpornościowych i niższym odsetkiem...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować dr Avital Sarusi-Portuguez za pomoc w analizie danych oraz dr Dror Kolodkin-Gal za pomoc w ustaleniu protokołu w poprzednim badaniu. Dziękujemy wszystkim byłym i obecnym członkom laboratorium Parnas. Dziękujemy dr Gillian Kay i dr Michaelowi Kanovsky'emu za pomoc w montażu. Projekt ten otrzymał dofinansowanie z grantu Izraelskiej Fundacji Naukowej (nr 526/18 O.P.), programu Alex U. Soyka oraz grantu z Izraelskiego Funduszu Badań nad Rakiem (Nagroda za Rozwój Kariery Badawczej).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik lub Zasób
70 &mikro; M Siatka nylonowa Corning cat##431751
BSASigma Aldrichcat# A7906
Collagenase PRoche cat# 11213857001
Critical Commercial Assay
DAPISigma Aldrichcat#MBD0015
Dnase IRochecat# 10104159001
Modele eksperymentalne: Organizmy/ Szczepy
Płodowa surowica bydlęca Ameryka PołudniowoamerykańskaThermoFisher Cat#10270106
Zrównoważony roztwór soli HanksaPrzemysł biologicznykat#02-018-1A 
KRASLSL-G12D myszyJackson LaboratoryJAX008179
MACS zestaw do usuwania martwych komórekMilteny Bioteccat#130-090-101
PBSPrzemysł biologicznykat#02-023-1A 
Ptf1a-CreER miceJackson LaboratoryJAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato miceJackson LaboratoryJAX007908
Trypsyna C-EDTA 0.05%Przemysł biologicznykat.# 03-053-1A
Trypsyna inhibitorRoche cat#T6522

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  2. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  3. Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777(2019).
  4. Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. Genetic progression in the pancreatic ducts. The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).
  5. Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516(2020).
  6. Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
  7. Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
  8. Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
  9. Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
  10. Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
  11. Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
  12. Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
  13. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja pojedynczych kom rekywotno kom rek acynarnychkom rki guza trzustkiprotok dysocjacji tkankidysocjacja mechanicznatrawienie enzymatyczneocena ywotno ci kom reksortowanie aktywowane fluorescencjsekwencjonowanie RNA pojedynczych kom rek

Powiązane artykuły