Artykuł metodologiczny

Oznaczanie immunogenności szczepionki przy użyciu komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych

DOI:

10.3791/64874

⸱

19 maja 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodologia opisuje wytwarzanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych (MoDC) i ich zastosowanie do oceny in vitro kandydatów na antygeny podczas opracowywania potencjalnych szczepionek weterynaryjnych u bydła.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki dendrytyczne (DC) są najsilniejszymi komórkami prezentującymi antygen (APC) w układzie odpornościowym. Patrolują organizm w poszukiwaniu patogenów i odgrywają wyjątkową rolę w układzie odpornościowym, łącząc wrodzoną i nabytą odpowiedź immunologiczną. Komórki te mogą fagocytować, a następnie prezentować przechwycone antygeny efektorowym komórkom odpornościowym, wywołując różnorodny zakres odpowiedzi immunologicznych. W artykule przedstawiono standaryzowaną metodę wytwarzania in vitro komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych (MoDC) wyizolowanych z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej bydła (PBMC) i ich zastosowanie w ocenie immunogenności szczepionki.

Do wyizolowania monocytów CD14+ z PBMC zastosowano sortowanie komórek oparte na magnesach, a suplementacja kompletnej pożywki hodowlanej interleukiną (IL)-4 i czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) została użyta do wywołania różnicowania monocytów CD14+ w naiwne MoDCs. Wytwarzanie niedojrzałych MoDC potwierdzono poprzez wykrycie ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej II (MHC II), CD86 i markerów powierzchniowych komórek CD40. Dostępna na rynku szczepionka przeciwko wściekliźnie została użyta do impulsacji niedojrzałych MoDC, które następnie były hodowane wspólnie z naiwnymi limfocytami.

Analiza cytometrii przepływowej MoDC z pulsacją antygenu i kohodowli limfocytów ujawniła stymulację proliferacji limfocytów T poprzez ekspresję markerów Ki-67, CD25, CD4 i CD8. Analiza ekspresji mRNA IFN-γ i Ki-67 przy użyciu ilościowej reakcji PCR wykazała, że MoDC mogą indukować specyficzne dla antygenu pobudzenie limfocytów w tym systemie kohodowli in vitro. Ponadto wydzielanie IFN-γ oceniane za pomocą testu ELISA wykazało znacznie wyższe miano (**p < 0,01) w kokulturze limfocytów MoDC z impulsem szczepionki przeciwko wściekliźnie niż w kohodowli limfocytów MoDC bez impulsu antygenu. Wyniki te pokazują ważność tego testu MoDC in vitro do pomiaru immunogenności szczepionki, co oznacza, że test ten może być wykorzystany do identyfikacji potencjalnych kandydatów na szczepionki dla bydła przed przystąpieniem do badań in vivo, a także do oceny immunogenności szczepionek komercyjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczepienia weterynaryjne stanowią kluczowy aspekt hodowli i zdrowia zwierząt, ponieważ przyczyniają się do poprawy bezpieczeństwa żywnościowego i dobrostanu zwierząt, zapewniając ochronę przed chorobami, które dotykają sektor hodowlany na całym świecie1. Skuteczna metoda in vitro służąca do oceny immunogenności potencjalnych szczepionek przyczyniłaby się do przyspieszenia procesu opracowywania i produkcji szczepionek. W związku z tym konieczne jest rozszerzenie dziedziny testów immunologicznych o innowacyjne metodologie oparte na badaniach in vitro, ponieważ pomogłoby to ujawnić złożoność procesów immunologicznych związanych z immunizacją i infekcją patogenów. Obecnie do pomiaru immunogenności potencjalnych szczepionek i adiuwantów stosuje się badania in vivo na zwierzętach i badania prowokacyjne, które wymagają okresowego pobierania próbek (np. krwi i śledziony). Testy te są drogie, czasochłonne i mają implikacje etyczne, ponieważ w większości przypadków eutanazja zwierząt jest przeprowadzana pod koniec badań.

Jako alternatywa dla testów in vivo, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zostały użyte do oceny odpowiedzi immunologicznej wywołanej szczepionką in vitro2. PBMC to niejednorodna populacja komórek składająca się z 70%-90% limfocytów, 10%-20% monocytów i ograniczonej liczby komórek dendrytycznych (DCs, 1%-2%)3. PBMC zawierają komórki prezentujące antygen (APC), takie jak limfocyty B, monocyty i DC, które stale patrolują organizm w poszukiwaniu oznak infekcji lub uszkodzenia tkanki. Lokalnie wydzielane chemokiny ułatwiają rekrutację i aktywację APC do tych miejsc poprzez wiązanie się z receptorami na powierzchni komórki. W przypadku monocytów chemokiny kierują swoim losem tak, aby różnicowały się w DC lub makrofagi4. Gdy tylko DC napotkają i wychwycą patogen, migrują do wtórnych narządów limfatycznych, gdzie mogą prezentować przetworzone antygeny peptydowe patogenu za pomocą białek powierzchniowych głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I lub klasy II odpowiednio do limfocytów T CD8 + lub limfocytów T CD4 +, wywołując w ten sposób odpowiedź immunologiczną 5,6.

Kluczowa rola odgrywana przez DC w organizowaniu ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko różnym patogenom czyni je interesującym celem badawczym dla zrozumienia wewnątrzkomórkowych mechanizmów odpornościowych, zwłaszcza podczas projektowania szczepionek i adiuwantów przeciwko czynnikom zakaźnym7. Ponieważ frakcja DC, którą można uzyskać z PBMC, jest raczej mała (1%-2%), monocyty zostały zamiast tego wykorzystane do wygenerowania DC in vitro8. Te DC pochodzące z monocytów (MoDC) zostały początkowo opracowane jako możliwa strategia leczenia w immunoterapii nowotworów9. Ostatnio MoDC były używane do badań nad szczepionkami10,11,12, a klasyczne monocyty są dominującym podtypem (89%) dla produkcji MoDC13. Wytwarzanie MoDC in vitro zostało wcześniej osiągnięte poprzez dodanie czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) podawanego w połączeniu z innymi cytokinami, takimi jak interleukina-4 (IL-4), czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α) lub IL-1314,15,16.

Sukces testu in vitro MoDC zależy od zdolności stymulowanych antygenem dojrzałych MoDC do modulowania zakresu i rodzaju odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla typu wykrytego antygenu17. Rodzaj patogenu rozpoznanego i prezentowanego przez MoDC determinuje różnicowanie komórek pomocniczych T (Th) CD4 + na komórki efektorowe Th1, Th2 lub Th17 i charakteryzuje się profilem cytokin wydzielniczych specyficznym dla patogenu. Odpowiedź Th1 jest wywoływana przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym i powoduje wydzielanie interferonu gamma (IFN-γ) i czynnika martwicy nowotworu beta (TNF-β), który moduluje ochronę zależną od fagocytarów. Odpowiedź Th2 jest wyzwalana przeciwko organizmom pasożytniczym i charakteryzuje się wydzielaniem IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13, co inicjuje niezależną od fagocytów ochronę humoralną. Th17 zapewnia zależną od neutrofili ochronę przed zewnątrzkomórkowymi infekcjami bakteryjnymi i grzybiczymi, w których pośredniczy wydzielanie IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 i TNF-α18,19,20,21. Na podstawie wcześniejszych badań zauważono, że nie wszystkie patogeny mieszczą się w oczekiwanym profilu cytokinowym. Na przykład skórne MoDC, w odpowiedzi na zakażenie pasożytnicze Leishmania, stymulują wydzielanie IFN-γ z limfocytów T CD4 + i limfocytów T CD8 +, indukując w ten sposób ochronną prozapalną odpowiedź Th1 22.

Wykazano również, że u kurczaków MoDC zaszczepionych lipopolisacharydem Salmonelli (LPS), mogą wywołać zmienną odpowiedź przeciwko Salmonella typhimurium poprzez aktywację zarówno odpowiedzi Th1, jak i Th2, podczas gdy Salmonella gallinarum indukuje samą odpowiedź Th2, co może tłumaczyć wyższą odporność tej ostatniej na klirens MoDC23. Aktywacja MoDC przeciwko Brucella canis (B. canis) została również zgłoszona zarówno u psów, jak i u ludzi, co oznacza, że może to reprezentować mechanizm infekcji odzwierzęcej24. Ludzkie MoDC zaszczepione B. canis indukują silną odpowiedź Th1, która nadaje odporność na ciężką infekcję, podczas gdy psie MoDC indukują dominującą odpowiedź Th17 ze zmniejszoną odpowiedzią Th1, co w konsekwencji prowadzi do powstania przewlekłej infekcji25. Bydlęce MoDC wykazują zwiększone powinowactwo do wirusa pryszczycy (FMDV) sprzężonego z immunoglobuliną G (IgG) w porównaniu z samą niesprzężoną FMDV, ponieważ MoDC tworzą kompleks wirusowo-przeciwciałowy w odpowiedzi na były10. Podsumowując, badania te pokazują, w jaki sposób MoDC zostały wykorzystane do analizy złożoności odpowiedzi immunologicznych podczas infekcji patogenem. Adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne można ocenić poprzez kwantyfikację specyficznych markerów związanych z proliferacją limfocytów. Ki-67, białko wewnątrzkomórkowe wykrywane tylko w dzielących się komórkach, jest uważane za wiarygodny marker w badaniach proliferacji26, i podobnie, CD25 wyrażony na powierzchni limfocytów T podczas późnej fazy aktywacji odpowiada proliferacji limfocytów27,28.

To badanie demonstruje standaryzowaną metodę generowania in vitro MoDC bydła, a następnie ich zastosowanie w teście immunologicznym in vitro używanym do testowania immunogenności szczepionek. Dostępna na rynku szczepionka przeciwko wściekliźnie (RV) została wykorzystana do walidacji skuteczności tego testu. Aktywację i proliferację limfocytów T mierzono za pomocą cytometrii przepływowej, ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) i testu immunoenzymatycznego (ELISA) poprzez analizę dobrze znanych markerów aktywacji komórek, takich jak Ki-67 i CD25 oraz wydzielanie IFN-γ28,29,30,31. Podczas testu MoDC nie przeprowadza się żadnych badań eksperymentalnych na zwierzętach ani ludziach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pobieranie krwi jest wykonywane przez certyfikowanego lekarza weterynarii zgodnie z wytycznymi etycznymi Austriackiej Agencji Zdrowia i Bezpieczeństwa Żywności (AGES) oraz zgodnie z przyjętymi standardami dobrostanu zwierząt32. Badanie uzyskało aprobatę etyczną austriackiego Ministerstwa Rolnictwa. Eksperymentalny projekt generowania MoDC i jego późniejszego zastosowania jest zilustrowany na Rysunek 1.

1. Produkcja naiwnych MoDC

UWAGA: Próbki krwi pełnej pobrano od pojedynczego cielęcia wolnego od patogenów poprzez nakłucie żyły szyjnej za pomocą heparynizowanych próżniowych (do tego badania użyto ośmiu probówek z krwią o pojemności 9 ml). Krew należy transportować w pojemniku na lód. Próbki należy przechowywać w temperaturze 2–4 °C do późniejszego użycia lub natychmiast je przetworzyć. Utrzymuj krążenie krwi, aby uniknąć krzepnięcia krwi. Wysterylizuj wakutainery 70% etanolem. Wszystkie poniższe eksperymenty przeprowadzono na jednej próbce biologicznej i sześciu powtórzeniach technicznych.

  1. Wirowanie w gradiencie gęstości w celu wyizolowania PBMC z krwi poddanej heparyniźnie
    1. Dobrze wymieszaj krew, odwracając ją 10x.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml przenieś 20 ml krwi poddanej heparyniźnie do sterylnej probówki o pojemności 50 ml i rozcieńcz ją 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    3. Odpipetować 15 ml pożywki do izolacji limfocytów do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Przed pipetowaniem należy odczekać, aż pożywka izolująca limfocyty osiągnie temperaturę pokojową.
    4. Przechylić probówkę o pojemności 50 ml zawierającą pożywkę do izolacji limfocytów do pozycji 45°. Skieruj końcówkę pipety o pojemności 25 ml prostopadle i ostrożnie ułóż 30 ml PBS krwi na pożywce do izolacji limfocytów, nie mieszając tych dwóch. Bardzo powoli ustawić probówkę o pojemności 50 ml z powrotem w pozycji pionowej.
    5. Wirować przy 800 × g przez 35 minut w temperaturze 20 °C z maksymalnym przyspieszeniem i bez hamowania (funkcja opóźniania jest wyłączona).
    6. Za pomocą pipety Pasteura zebrać warstwę PBMC (cienką białą warstwę zaraz po pierwszej warstwie osocza) i przenieść ją do nowej probówki o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Wirowanie w gradionym gradiencie gęstości rozdziela krew pełną na różne warstwy. W rezultacie erytrocyty osiadają na dole jako osad, komórki jednojądrzaste (PBMC) osiadają w warstwie interfejsowej, a plazma tworzy warstwę górną. Granulocyty znajdują się między osadem a warstwą PBMC.
    7. Zebrane PBMC umyć 2x, dodając PBS do objętości 40 ml i dokładnie mieszając, pipetując w górę iw dół. Następnie odwirować przy 500 × g w temperaturze 4 °C przez 7 minut z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem.
    8. Odrzucić supernatant przez dekantację, ponownie zawiesić osad w 15 ml 1x buforu chlorkowo-potasowego (ACK) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10-15 min.
      UWAGA: Nie inkubować dłużej niż 15 minut. Dostępny w handlu bufor ACK służy do zapewnienia lizy resztkowych czerwonych krwinek (RBC) obecnych we frakcji PBMC.
    9. Dodać PBS do objętości 40 ml, a następnie odwirować w temperaturze 500 × g i 4 °C przez 7 minut z maksymalnym przyspieszaniem i zwalnianiem.
    10. Odrzucić supernatant przez dekantację i powtórzyć krok 1.1.9.
    11. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej (w temperaturze pokojowej).
      UWAGA: Kompletna pożywka hodowlana składa się z pożywki do hodowli komórkowych RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny.
  2. Separacja magnetyczna komórek CD14+/- od populacji PBMC za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z CD14
    1. Policz komórki za pomocą czystego licznika komórek hemocytometru, używając 10 μl zawiesiny komórek zmieszanej z 10 μl roztworu błękitu trypanowego (0,4%.
      UWAGA: Niebieski barwnik trypanowy jest toksyczną substancją chemiczną i potencjalnym czynnikiem rakotwórczym. Należy obchodzić się z nim podczas noszenia środków ochrony osobistej (PPE), aby uniknąć kontaktu, a odpady należy wyrzucać do hermetycznego specjalistycznego pojemnika na odpady toksyczne. Martwe komórki będą niebieskie, podczas gdy żywe komórki będą czyste pod mikroskopem.
    2. Wirować przez 7 minut przy 500 × g.
    3. Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w aktywowanym fluorescencją buforze do sortowania komórek (FACS), stosując objętość 40 μl na każde 1 ×10 7 komórek. Dokładnie wymieszać za pomocą pipety.
      UWAGA: Bufor FACS składa się z 2% FBS i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) rozpuszczonego w PBS.
    4. Dodać 5 μl buforu mikrokulkowego CD14 na 1 × 107 komórek i dokładnie wymieszać za pomocą pipety.
    5. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4-8 °C w celu pozytywnej selekcji bydlęcych monocytów CD14+33. Wirować co 15 minut w okresie inkubacji.
    6. Etap opcjonalny (do analizy metodą cytometrii przepływowej): Dodać 10 μl przeciwciała barwiącego CD14-FITC (izotiocyjanian fluoresceiny), a następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze 4-8 °C. Szczegółowe informacje można znaleźć w analizie cytometrii przepływowej w kroku 5.
    7. Dodać 1 ml buforu FACS i wirować przez 7 minut w temperaturze 500 × g.
    8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu FACS na 1 × 108 komórek.
    9. Włóż immunomagnetyczną kolumnę do separacji komórek do separatora (uchwyt kolumny magnetycznej) i umieść probówkę o pojemności 15 ml pod wylotem kolumny w celu zebrania przepływu.
    10. Przemyć kolumnę 1 ml odgazowanego buforu FACS. Po wypłukaniu wymień zużytą probówkę o pojemności 15 ml na nową.
    11. Pozwolić, aby zawiesina komórek (z kroku 1.2.8) przeszła przez kolumnę, pipetując jednorazowo 1 × 108 komórek w 500 μl buforu.
      UWAGA: Zwróć uwagę, aby nie generować pęcherzyków powietrza podczas mieszania komórek przed przepuszczeniem ich przez kolumnę.
    12. Za każdym razem przepłukać kolumnę 3 ml odgazowanego buforu FACS.
    13. Zbierz przepływ i oznacz tę pierwszą eluowaną frakcję jako frakcję komórkową CD14 (PBMC minus monocyty CD14 +); jest to również nazywane naiwną frakcją limfocytów.
      UWAGA: Komórki CD14− są utrzymywane w kompletnej pożywce hodowlanej do momentu wytworzenia MoDC impulsowych antygenem.
    14. Wyjmij kolumnę z separatora.
    15. Umieść nową sterylną probówkę o pojemności 15 ml pod kolumną do zbierania ścieków.
    16. Odpipetować 5 ml buforu FACS do kolumny i natychmiast przepchnąć go przez nią za pomocą tłoka.
    17. Zbierz przepływ i oznacz tę drugą eluowaną frakcję jako frakcję komórek CD14 +; nazywa się to również frakcją naiwnych monocytów.
    18. Dodać kompletną pożywkę hodowlaną do zebranych monocytów CD14 +, aby uzyskać 1 × 106 komórek/ml.
      UWAGA: Policz żywe komórki w eluowanej frakcji komórek CD14+, aby oszacować objętość kompletnej pożywki hodowlanej wymaganej do uzyskania pożądanej liczby komórek.
    19. Weź sterylną 24-dołkową płytkę i dodaj 1 ml zawiesiny komórkowej (1 × 106 komórek/ml) do każdej studzienki.
  3. Różnicowanie nieuszkodzonych monocytów CD14+ w naiwne MoDC przez dodanie 3% w/v koktajlu cytokin (GM-CSF + IL-4) w sumie 5 dni inkubacji
    1. Uzupełnij każdą studzienkę zawierającą monocyty CD14+ w 40 μl (3% w/v) koktajlu cytokin dołączonego do zestawu.
    2. Inkubować płytkę w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 i w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
    3. W dniu 2 przenieść połowę zawartości każdego dołka (500 μl) za pomocą pipety do pojedynczych probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 500 × g w temperaturze 4 °C przez 7 minut.
    4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej.
    5. Przenieść 500 μl tej zawiesiny komórek z kroku 1.3.4 z powrotem do każdej wyznaczonej studzienki, tak aby końcowa objętość wynosiła 1 ml.
    6. Wzbogać każdą studzienkę o 20 μl koktajlu cytokinowego.
    7. Inkubować kulturę przez 72 godziny w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 i w temperaturze 37 °C.
    8. Po inkubacji w 5 dniu wyjąć płytkę z inkubatora.
      UWAGA: Każda studzienka będzie zawierała 1 ml zawiesiny komórkowej naiwnych MoDC. Liczba MoDC będzie stanowić procent (~ 20%) oryginalnych monocytów posianych (1 × 106 / ml).

2. Test aktywności endocytarnej MoDC

UWAGA: Test wychwytu antygenu lub test aktywności endocytarnej mierzy zdolność naiwnych MoDC do internalizacji obcego materiału. Wykonaj test przy użyciu naiwnych MoDC hodowanych z 3% w/v koktajlu cytokin i z 5-dniową inkubacją, jak opisano wcześniej34.

  1. Zbierz naiwną zawiesinę komórek MoDC z 24-dołkowej płytki i przenieś ją do probówki o pojemności 15 ml; zbierz również wszelkie pozostałe komórki, przepłukując dołki PBS.
  2. Wirować przez 500 × g przez 7 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki hodowlanej uzupełnionej 1% FBS.
  3. Policz żywe komórki MoDC, aby oszacować objętość pożywki wymaganą do osiągnięcia pożądanej liczby komórek (2 × 105 komórek / ml).
  4. Hodować naiwne MoDC w 100 μl kompletnej pożywki hodowlanej na 24-dołkowej płytce o końcowym stężeniu komórek 2 × 105 komórek/ml.
  5. Uzupełnij każdą studzienkę 1 mg / ml dekstranem sprzężonym z FITC (sonda fluorescencyjna używana jako znacznik endocytozy).
    UWAGA: FITC-dekstran działa jak sonda fluorescencyjna i jest używany jako znacznik endocytozy.
  6. Przykryć płytkę i inkubować w ciemności w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 60 min.
    UWAGA: W celu kontroli tła należy inkubować dodatkowe komórki MoDC (2 × 105 komórek/ml) z 1 mg/ml FITC-dekstranu na lodzie, ponieważ ten rodzaj inkubacji zapobiega przedostawaniu się cząsteczki znacznikowej (FITC-dekstranu) do komórek.
  7. Po inkubacji należy natychmiast przenieść 24-dołkową płytkę na lód, aby zatrzymać endocytozę dekstranu FITC.
  8. Umyj komórki lodowatym buforem FACS.
  9. Zbierz, odwiruj i ponownie zawieś pelet w 500 μl buforu FACS.
  10. Przeanalizuj intensywność fluorescencji dekstranu FITC w komórkach za pomocą cytometrii przepływowej. Szczegółowe informacje można znaleźć w analizie cytometrii przepływowej w kroku 5.2.

3. Generowanie MoDC z impulsami antygenowymi

UWAGA: Komercyjnie dostępna i klinicznie zatwierdzona szczepionka przeciwko wirusowi wścieklizny (RV) może wywołać różnicowanie się naiwnych MoDC w dojrzałe MoDC prezentujące antygen. Użyj 0,1% (~1 μL) pojedynczej dawki szczepionki RV do wygenerowania MoDC z impulsami antygenowymi. Ponadto preferowane jest wytwarzanie MoDC z impulsami RV na tej samej płytce hodowlanej, która została użyta (w kroku 1.3.8) do wytworzenia naiwnych MoDC, ponieważ przeniesienie naiwnych MoDC na nową płytkę 24-dołkową wpłynie na nie negatywnie.

  1. Z kroku 1.3.8) Dodać 1 μl/ml zawiesiny RV do 1 ml naiwnej kultury MoDC na 24-dołkowej płytce i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Naiwne MoDC hodowane bez stymulacji RV są używane jako kontrola tła (i jako niespecyficzna stymulacja do kohodowli z limfocytami w następnych krokach).
  2. Po inkubacji, w dniu 7, przechowywać 24-dołkową płytkę zawierającą MoDC impulsowane antygenem na lodzie przez 10 minut.
  3. Dodaj 1 ml lodowatego PBS do dołka. Każdą studzienkę dokładnie wymieszać pipetując i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml.
  4. Umyj studzienki 2 ml lodowatego PBS, aby zebrać resztki komórek pozostawione w każdym dołku.
  5. Przenieść zawartość do odpowiednich probówek i odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 500 × g przez 7 minut.
  6. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy (MoDC impulsowy antygenem) w kompletnej pożywce hodowlanej i dostosować objętość do końcowego stężenia komórek 1 × 105 komórek/ml.
    UWAGA: Policz żywe komórki, aby oszacować objętość podłoża wymaganą do uzyskania żądanej liczby komórek. Używaj MoDC z impulsem RV od 7 dnia do systemu kohodowli limfocytów MoDC.

4. Współhodowla limfocytów MoDC

UWAGA: System kohodowli limfocytów MoDC in vitro określa zdolność MoDC do inicjowania limfocytów specyficznych dla antygenu. Różne grupy leczone komórkami po 16 dniach wspólnej hodowli obejmują specyficzne, niespecyficzne i kontrolne. Specyficzną grupę definiuje się jako limfocyty współhodowane z MoDC pulsującymi RV; grupę nieswoistą definiuje się jako limfocyty współhodowane z MoDC niepulsującymi antygenem; a grupę kontrolną definiuje się jako limfocyty hodowane bez MoDC.

  1. Dodać kompletną pożywkę hodowlaną do eluowanej frakcji naiwnych limfocytów (komórki CD14−), aby uzyskać stężenie komórek 2 × 106 komórek/ml.
    UWAGA: Policz żywe komórki w hodowli komórkowej CD14−, które były utrzymywane w kompletnej pożywce hodowlanej na 24-dołkowej płytce od czasu ich pobrania, aby oszacować objętość pożywki wymaganą do osiągnięcia pożądanej liczby komórek.
  2. W dniu 7 weź sterylną 24-dołkową płytkę i zasiej dołki 1 ml pierwotnej zawiesiny komórek limfocytów (2 × 106 komórek/ml) plus 1 ml zawiesiny MoDC impulsowej antygenem lub niepulsującej antygenem (1 × 105 komórek/ml).
    UWAGA: Całkowita objętość w każdym dołku wyniesie 2 ml w stosunku 1:20 MoDC do limfocytów na dołek.
  3. Inkubować płytkę przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  4. Wzbogacanie i restymulacja kultur za pomocą pulsujących antygenów MoDC
    1. Po inkubacji kohodowli limfocytów MoDC z impulsami antygenu, w dniu 9, uzupełnij każdą studzienkę rekombinowanym IL-2 o stężeniu 20 ng / ml i kontynuuj inkubację przez kolejne 120 godzin (5 dni inkubacji).
    2. W dniu 14 przenieś 1 ml kokultury do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 500 × g przez 7 minut.
    3. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml pulsacyjnych lub niepulsacyjnych MoDC (1 × 105 komórek/ml). Delikatnie wymieszać pipetując i przenieść zawiesiny komórek z powrotem do wyznaczonych dołków.
      UWAGA: Na tym etapie całkowita objętość w każdej studzience wynosi 2 ml.
    4. Kontynuować inkubację w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Po inkubacji w 16 dniu kokultura jest gotowa do analizy przy użyciu cytometrii przepływowej, qPCR i ELISA.
      UWAGA: Na każde 2 ml w każdym dołku kohodowli limfocytów MoDC, 1 ml zawieszonych komórek jest barwiony do cytometrii przepływowej, 1 ml jest używany do ekstrakcji RNA, a supernatanty z obu są używane do testu ELISA.

5. Analiza cytometryczna przepływowa

UWAGA: Zabarwić komórki odpowiednimi markerami/mAb przed uruchomieniem próbek na cytometrze przepływowym. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat odczynników (barwienie mAb i kontrole izotypu), zestawu, przyrządu i oprogramowania używanego do analizy cytometrii przepływowej.

  1. Protokół barwienia cytometrem przepływowym
    UWAGA: Wykonaj barwienie powierzchni komórek dla PBMC oraz nieuszkodzonych limfocytów i monocytów za pomocą mAb anty-CD14 (krok 1.2.6). Do barwienia powierzchni komórek naiwnych MoDC należy użyć mAb specyficznych dla anty-CD86, anty-CD40 i anty-MHC II. Do barwienia powierzchni komórek z kokultur w 16 dniu należy użyć przeciwciał anty-CD4, anty-CD8, anty-CD25; do barwienia wewnątrzkomórkowego użyj anty-Ki-67 mAb. Ponadto wybarwić komórki ujemnym kontrolnym izotypem mAb lub bez mAb (FMO: fluorescencyjna minus jeden). Główna różnica w barwieniu markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych polega na tym, że w przypadku markerów powierzchniowych komórek komórki muszą być barwione specyficznym powierzchniowym mAb przed barwieniem żywym/martwym (L / D) lub jakimikolwiek innymi procesami. Jednak barwienie wewnątrzkomórkowe jest wykonywane po barwieniu L / D i wymaga etapu utrwalania i przepuszczalności, aby umożliwić penetrację wewnątrzkomórkową.
    1. Przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety i wirować przez 10 minut w temperaturze 500 × g.
      UWAGA: Po odwirowaniu, podczas przetwarzania komórek z kokultury limfocytów MoDC, zachowaj supernatant do analizy ELISA.
    2. Zawiesić osad w 1 ml PBS i przenieść go do probówki o pojemności 15 ml. Zebrać pozostałe komórki za pomocą 1 ml PBS i połączyć je z zawieszonym osadem.
    3. Dodać 10 ml PBS do probówki o pojemności 15 ml zawierającej komórki, wymieszać pipetując i odwirować przez 7 minut przy 850 x g.
    4. Odrzucić supernatant i powtórzyć krok 5.1.3.
    5. Odrzucić supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy z pozostałą zawiesiną (około 180 μl) pozostałą po dekantacji supernatantu.
    6. Przenieś zawiesinę komórek na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V i uszczelnij studzienki, aby uniknąć rozlania.
    7. Odwirować płytkę o masie 1 400 × g przez 5 minut. Po odwirowaniu przesuń płytkę nad pojemnikiem na odpady, aby opróżnić studzienki z płynu, i postukaj płytką o papier chłonny, aby zapewnić usunięcie nadmiaru płynu.
    8. Dodać 25 μl głównej mieszanki do barwienia powierzchni do każdego dołka i delikatnie wymieszać za pomocą pipety, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 min.
      UWAGA: Aby przygotować główną mieszankę do barwienia powierzchni dla pojedynczego dołka, dodaj 2,5 μl powierzchniowego mAb do 20 μl buforu FACS.
    9. Dodać 200 μl buforu FACS do studzienki i odwirować przy 1 400 × g przez 5 minut. Po odwirowaniu opróżnij studzienki z płynu przez dekantację i postukaj płytką o papier chłonny, aby usunąć nadmiar płynu.
    10. Dodać 100 μl roztworu barwiącego L/D do dołka. Dokładnie wymieszać za pomocą pipety, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut w ciemności.
      UWAGA: W przypadku pojedynczego dołka rozpuść 0,25 μl barwnika L/D w 100 μl buforu FACS. Barwnik L/D pomaga odróżnić żywe i martwe komórki.
    11. Dodać 100 μl buforu FACS. Przykryj studzienki pokrywką i odwiruj płytkę o masie 1 400 × g przez 5 minut. Odlać supernatant przez dekantację i uderzyć płytką w chłonny papier.
    12. Powtórz krok 5.1.11.
    13. Dodać 50 μl roztworu utrwalającego do dołka (dostarczonego z zestawem) i wymieszać pipetą przed inkubacją płytki w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut.
    14. Dodać 150 μl 1x buforu do przemywania permeabilizacji (PW) dostarczonego z zestawem i przykryć studzienki pokrywką.
      UWAGA: Aby przygotować 10 ml 1x buforu PW, rozcieńczyć 1 ml 10x buforu do trwałej ondulacji w 10 ml dH2O.
    15. Odwirować płytkę o stężeniu 1 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant przez dekantację i uderzyć płytką w papier chłonny.
    16. Dodać 200 μl 1x PW, a następnie odwirować w stężeniu 1 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant przez dekantację i postukać płytką w papier chłonny.
    17. W przypadku barwienia wewnątrzkomórkowego dodać 25 μl głównej mieszanki barwienia wewnątrzkomórkowego (anty-ludzki Ki-67 mAb) na studzienkę. Dobrze wymieszać i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C lub na lodzie w ciemności.
      UWAGA: Aby przygotować wewnątrzkomórkową mieszankę wzorcową do barwienia dla pojedynczego dołka, dodaj 1 μl Ki-67 mAb do 24 μl 1x PW. Wewnątrzkomórkowy marker barwienia jest używany tylko podczas przetwarzania komórek od kohodowli w 16 dniu. Barwienie wewnątrzkomórkowe nie jest wykonywane podczas przetwarzania PBMC, naiwnych limfocytów, monocytów i naiwnych MoDC.
    18. Po inkubacji dodać 200 μl 1x PW do każdej studzienki. Wymieszać pipetą i odwirować przez 1 400 × g przez 5 minut. Odlać supernatant przez dekantację i uderzyć płytką w chłonny papier.
    19. Dodać 200 μl buforu FACS, a następnie odwirować w stężeniu 1 400 × g przez 5 minut. Odlać supernatant przez dekantację i stuknąć płytkę w papier chłonny.
    20. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu FACS i przenieść zawartość każdej studzienki do oddzielnych sterylnych probówek cytometru przepływowego. Użyj 300 μl buforu FACS na studzienkę, aby zebrać pozostałe komórki. Komórki są teraz gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej.
  2. Badanie próbki na cytometrze przepływowym
    UWAGA: Próbki badano na cytometrze przepływowym (przy użyciu laserów o długości fali 488 nm, 638 nm i 405 nm) zgodnie z instrukcją producenta35. Zapoznaj się z instrukcją, aby uzyskać szczegółowe informacje, rozwiązywanie problemów i dostosowywanie protokołu.
    1. Wykonaj rutynowe procedury czyszczenia przed i po odczytaniu próbek.
      UWAGA: Nie pomijaj pozycji podczas ładowania rurek do instrumentu.
      1. Do cyklu czyszczenia należy użyć łącznie czterech probówek, z których pierwsza zawiera odczynnik do czyszczenia przepływowego, a pozostałe trzy probówki zawierają dH2O; każda probówka będzie miała 3 ml. Podczas czyszczenia należy pozyskiwać dane o średnim natężeniu przepływu przez około 1 minutę, rejestrując 100 000 zdarzeń na rurę poniżej 330 V dla rozproszenia do przodu (FSC) w porównaniu z 265 V dla rozproszenia bocznego (SSC).
        UWAGA: Podczas czyszczenia nie należy zgłaszać żadnych zanieczyszczeń ani zdarzeń komórkowych; Jeśli tak się stanie, ponownie wykonaj krok czyszczenia. W przypadku uruchamiania próbek należy upewnić się, że wszystkie próbki znajdują się w jednorodnej zawiesinie przed uzyskaniem danych, ponieważ zapewnia to dokładny odczyt.
    2. Aby podłączyć i włączyć cytometr, kliknij przycisk aplikacji znajdujący się w lewym rogu paska tytułu. Z menu rozwijanego aplikacji wybierz opcję Cytometria i kliknij opcję Power On.
      UWAGA: Z menu rozwijanego aplikacji opcja Otwórz umożliwia użytkownikom przeglądanie wstępnie zaprogramowanych testów, podczas gdy opcja Nowy protokół umożliwia użytkownikom tworzenie nowych protokołów.
    3. Początkowo załadować próbkę kontroli ujemnej do uchwytu wieloprobówkowego. Wybierz pozycję Nowy protokół i obserwuj listę roboczą po lewej stronie obszaru roboczego/ekranu.
    4. Na liście roboczej zdefiniuj pozycję próbki w uchwycie wieloprobówkowym oraz nadaj nazwę próbce i protokół identyfikacji.
    5. Z panelu sprzętowego znajdującego się po lewej stronie obszaru roboczego dostosuj i wybierz wiele parametrów, takich jak detektory (FSC, SSC i 10 zakresów fluorescencji), napięcia (V) i wzmocnienia fotopowielaczy oraz obszar-wysokość-szerokość (AHW) sygnału.
      UWAGA: Następujące ustawienia detektorów zostały wybrane na podstawie użytego eksperymentu i instrumentu: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. Na panelu sterowania akwizycji przyrządów znajdującym się pod paskiem tytułu dostosuj opcje natężenia przepływu (średnie), czasu (5 min) i zdarzeń (patrz krok 5.2.8), które mają być wykrywane. Kliknij opcję Acquire Single, aby umożliwić instrumentowi pobranie/uruchomienie próbki i pokazanie podglądu wykrytych zdarzeń w czasie rzeczywistym.
    7. Z podglądu w czasie rzeczywistym dostosuj próg fluorescencji (napięcie i wzmocnienie) oraz rozmiar komórki, aby ostatecznie narysować bramki wokół żądanej populacji komórek, wykluczając wszelkie zanieczyszczenia komórkowe.
      UWAGA: FSC pomaga rozróżniać komórki na podstawie wielkości, umożliwiając w ten sposób użytkownikom różnicowanie komórek układu odpornościowego, takich jak monocyty i limfocyty; monocyty są większe i wykazują wyższą intensywność FSC w porównaniu z limfocytami.
    8. Zdobądź łącznie około 5 000 żywych MoDC, 50 000 żywych limfocytów i 50 000 żywych monocytów.
    9. Gdy wszystkie parametry zostaną dostosowane w odniesieniu do ujemnej próbki kontrolnej, kliknij Stop i zapisz protokół.
    10. Teraz załaduj wszystkie próbki do ładowarki wielorurowej. Zdefiniuj każdą próbkę na liście roboczej i zastosuj parametry dostosowane w odniesieniu do kontroli ujemnej do wszystkich próbek w eksperymencie. Kliknij opcję Pobierz, aby zezwolić na kolejno uruchamianie wszystkich próbek w eksperymencie.
    11. Po pozyskaniu danych ze wszystkich próbek zapisz je i przekształć w czytelne dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy danych, które umożliwia generowanie sekwencyjnych histogramów dwuparametrycznych i monoparametrycznych.

6. Analiza ekspresji informacyjnego RNA (mRNA)

  1. Ekstrakcja RNA
    UWAGA: Ekstrahuj całkowite RNA z kokultury limfocytów MoDC z impulsem antygenu (specyficzna), kohodowli limfocytów MoDC bez impulsu antygenu (niespecyficzna), hodowli limfocytów bez MoDC (kontrola) oraz z naiwnych limfocytów (komórki CD14 wyizolowane przed kokulturą). Do ekstrakcji RNA przygotuj etanol przy użyciu wody wolnej od RNaz. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat zestawu do ekstrakcji i odczynników.
    1. Przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej z płytki do kohodowli limfocytów MoDC (~1 × 106 komórek/ml) do sterylnej sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety i wirować przez 10 minut przy 500 × g.
    2. Zachowaj supernatant dla testu ELISA. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS i przenieść go do probówki o pojemności 15 ml. Zebrać wszelkie pozostałe komórki za pomocą 1 ml PBS.
    3. Wirować przez 10 minut w temperaturze 500 × g.
      UWAGA: Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się delikatnie jak z żywymi komórkami, dopóki nie zostanie przeprowadzona liza komórek przy użyciu buforu do lizy dostarczonego w zestawie. Śmierć komórki uwalnia RNazy, które szybko hydrolizują matryce RNA potrzebne do dalszej kwantyfikacji. Bufor RLT lizuje komórki w roztworze, który hamuje RNazy.
    4. Dodać 350 μl buforu do lizy do każdej pustej studzienki i inkubować przez 2-3 minuty w celu lizy przylegających komórek, które nie zostały zebrane w poprzednich etapach.
    5. Po zakończeniu wirowania w kroku 6.1.3 należy odrzucić supernatant i połączyć osad komórkowy z 350 μl buforu do lizy dodanym w kroku 6.1.4.
      UWAGA: W tym momencie możliwe jest przechowywanie probówek w temperaturze -80 °C lub przystąpienie do ekstrakcji RNA (poniższe kroki).
    6. Odpipetować 350 μl 70% etanolu do lizatu w kroku 6.1.5. Ostateczna objętość próbki wynosi 700 μl.
    7. Włóż kolumnę ekstrakcyjną do probówki zbiorczej o pojemności 2 ml (dostarczonej z zestawem).
    8. Przenieść 700 μl próbki na kolumnę ekstrakcyjną i odwirować przy 10 000 × g przez 15 s. Wyrzucić przepływowy przepływ z probówki zbiorczej i umieścić go z powrotem w kolumnie wirowej.
    9. Do kolumny ekstrakcyjnej dodać 350 μl rygorystycznego buforu do przemywania (znajdującego się w zestawie) i odwirować przy stężeniu ponad 10 000 × g przez 15 s. Odrzucić przepływ.
    10. Dodać 80 μl mieszanki inkubacyjnej DNazy I na próbkę na membranę kolumny ekstrakcyjnej i pozostawić na 15 minut do zastygnięcia w temperaturze 20-30 °C.
      UWAGA: Aby przygotować mieszaninę inkubacyjną DNazy I na próbkę, dodać 10 μl roztworu podstawowego DNazy I do 70 μl buforu DNazy, aby uzyskać końcową objętość 80 μl. Dokładnie wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę, a następnie krótko odwirować w wirówce.
    11. Przemyć kolumnę ekstrakcyjną 350 μl rygorystycznego buforu do przemywania wodą, a następnie odwirować przy 10 000 × g przez 15 minut. Po odwirowaniu wyrzucić przepływowy płyn do probówki zbiorczej.
    12. Przemyć kolumnę ekstrakcyjną 2x 500 μl łagodnego buforu do przemywania za każdym razem i odwirować 10 000 × g przez 15 s i drugi raz przez 2 minuty. Po każdym odwirowaniu odrzucić przepływ
      13. .
    13. Odwirować kolumnę z maksymalną prędkością przez 1 minutę w celu wysuszenia membrany i wyrzucić probówkę zbiorczą.
    14. Umieścić kolumnę ekstrakcyjną w nowej probówce zbiorczej o pojemności 1,5 ml.
    15. Odpipetować 50 μl wody wolnej od RNaz na membranę kolumny i inkubować przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: W przypadku stężeń RNA poniżej 100 ng należy zmniejszyć objętość elucji do 30 μl i ponownie eluować membranę kolumny ekstrakcyjnej za pomocą produktu z pierwszej elucji w celu zagęszczenia produktu końcowego.
    16. Wirować przy 10 000 × g przez 1 minutę w celu elucji RNA.
    17. Zmierzyć stężenie RNA, wykrywając absorbancję przy 260 nm przy użyciu 0,5-2 μl próbki. Dostosuj końcowe stężenie RNA do 0,1-1 μg/μl za pomocą wody wolnej od RNaz.
    18. Przechowywać porcje RNA w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
  2. Synteza komplementarnego DNA
    1. Zsyntetyzuj komplementarne DNA (cDNA) z wyekstrahowanej matrycy RNA zgodnie z protokołem producenta dostarczonym z zestawem (szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli materiałów).
      UWAGA: Podsumowanie użytych odczynników i objętości przedstawiono w Tabeli 1 i Tabeli 2. Pełny protokół jest szczegółowo opisany w pliku uzupełniającym 1.
  3. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym
    1. W przypadku qPCR należy przeprowadzić próbki cDNA w trzech egzemplarzach. Określ ilościowo poziomy transkryptów mRNA bydła dla Ki-67 i IFN-γ przy użyciu określonych zestawów starterów w odniesieniu do genu GAPDH, jak pokazano w tabeli 3.
      UWAGA: Pełny protokół jest szczegółowo opisany w pliku uzupełniającym 1.

7. Test immunoenzymatyczny

  1. Przetworzone pobrane supernatanty hodowlane bogate w białka wydzielnicze do ilościowego oznaczania IFN-γ za pomocą ELISA.
    UWAGA: Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat użytkowania zestawu. Pełny protokół jest szczegółowo opisany w pliku uzupełniającym 1.

8. Analiza statystyczna

  1. Analizuj dane i twórz graficzne ilustracje projektu eksperymentalnego za pomocą komercyjnego oprogramowania. Do analizy porównawczej należy użyć niesparowanego testu nieparametrycznego. Uznajmy, że wartości P < 0,05 są statystycznie istotne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metodologia opisuje in vitro generowanie MoDC bydła do oceny potencjalnych antygenów szczepionkowych przed przeprowadzeniem badań in vivo. Rysunek 1 ilustruje eksperymentalny schemat wytwarzania MoDC bydła i zastosowanie MoDC do testów in vitro. Korzystając z techniki magnetycznego sortowania komórek, udało się zebrać około 26 milionów miocytów CD14+ z pobranych PBMC, które wcześniej wyizolowano z 50 ml krwi bydła. Eluowana frakcja komórkowa wolna od monocytów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to demonstruje standaryzowaną metodę in vitro do generowania i fenotypowania bydlęcych MoDC oraz ich późniejszego wykorzystania do pomiaru immunogenności szczepionki komercyjnej (np. RV). MoDC bydła mogą być wykorzystywane jako narzędzie do badań przesiewowych potencjalnych antygenów szczepionkowych przeciwko chorobom bydła i przewidywania ich potencjalnego wpływu klinicznego na podstawie odpowiedzi immunologicznych przed przystąpieniem do badań na zwierzętach in vivo . Wygenerowane MoDC zostały...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Eveline Wodak i dr Angelice Loistch (AGES) za wsparcie w określaniu stanu zdrowia zwierząt i za dostarczenie BTV, dr Bernhardowi Reineltowi za dostarczenie krwi bydlęcej oraz dr Bharani Settypalli i dr Williamowi Dundonowi z MAEA za przydatne porady dotyczące eksperymentów PCR w czasie rzeczywistym i edycji języka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ACK Lysing BufferGibco, Thermo FisherA1049201Bufor amonowo-chlorkowo-potasowy do lizy resztkowych krwinek czerwonych w zebranych
probówkach do heparyny próżniowej frakcjiBecton, Dickinson (BD) and Company36648010 mL, dodatek heparyny sodowej 158 jednostek USP, szklana probówka, rozmiar 16 x 100 mm
zestaw do wzrostu bydlęcych komórek dendrytycznychBio-Rad, Wielka BrytaniaPBP015KZZKoktajl cytokin złożony z rekombinowanego bydlęcego IL-4 i
bydlęcego IFN-&gamma GM-CSF; Zestaw ELISABio-RadMCA5638KZZZestaw służy do pomiaru ekspresji IFN-γ w hodowli supernatant
Przeciwciało CD14Bio-RadMCA2678FMysie przeciwciało monoklonalne anty-bydlęce CD14, klon CC-G33, izotyp IgG1
Przeciwciało CD25Bio-RadMCA2430PEMysie przeciwciało monoklonalne antybydlęce CD25, klon IL-A11, izotyp IgG1
Przeciwciało CD4Bio-RadMCA1653A647Mysie przeciwciało monoklonalne antybydlęce CD4, klon CC8, przeciwciało izotypu IgG2a
CD40Bio-RadMCA2431FMysie przeciwciało monoklonalne antybydlęce CD40, klon IL-A156, izotyp IgG1
Przeciwciało CD8Bio-RadMCA837FMysie przeciwciało monoklonalne antybydlęce CD8, klon CC63, przeciwciało izotypu IgG2a
CD86Bio-RadMCA2437PEMysie przeciwciało monoklonalne antybydlęce CD86, klon IL-A190, izotyp IgG1
CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym Maszyna do PCRBio-Rad-Thermalcycler
Probówka wirówkowaCorning Falcon Corning 352096 & 35207015 ml i 50 mL, stożkowe dno poypropylenu o wysokiej przejrzystości, z podziałką, sterialne, nakrętka z uszczelką, rurka sokoła
Cytofix/Cytoperm PlusBD Bio Sciences555028Zestaw do utrwalania/przepuszczalności z BD golgiPlug, służy do barwienia komórek cytometru przepływowego
EtanolSigma Aldrich1009832500Absolutny do analizy EMSURE  ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco, Thermo Fisher10500064 Kwalifikowana, inaktywowana termicznie
Ficoll Plaque PLUSGE Opieka zdrowotna Nauki przyrodnicze, USA341691Pożywka do izolacji limfocytów
FlowClean Środek czyszczącyBeckman Coulter, nauki przyrodniczeA64669500 ml
FlowJoFlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA-Cytometr przepływowy Oprogramowanie do histogramu
FlowTubes/ FACS  (Sortowanie pojedynczych komórek aktywowane fluorescencją) RuraFalcon Corning 3522355 mL, steryczna, okrągłodenna probówka z polistyrenu z zatrzaskiem sitka komórkowego, do stosowania w analizie cytometrii przepływowej
Fluoresceinisothiocynat-DextranSigma Aldrich, Niemcy60842-46-8FITC-dekstran MW
Gallios Cytometr przepływowyBeckman Coulter-Flow
Płytki PCR z twardą skorupą 96 dołkówBio-RadHSP960196 dołk, niskoprofilowe, cienkościenne, z listwą, biały/przezroczysty
Ludzkie mikrokulki CD14Miltenyi Bioteck, Niemcy130-050-2012 ml mikrogranulki sprzężone z monoklonalnym przeciwciałem anty-ludzkim CD14 izotyp IgG2a, używane do selekcji monocytów bydlęcych z PBMC
KaluzaBeckman Coulter,Niemcy-Cytometr przepływowy oprogramowanie do wielokolorowej analizy danych
Kolumna MACSMiltenyi Bioteck, Niemcy130-042-401Magnetyczne sortowanie komórek lub immunologiczna agentyczna separacja komórek do separacji różnych populacji komórek CD14 na podstawie antygenów powierzchniowych
komórek MHC Klasa II DQ DR Przeciwciało polimorficzneBio-RadMCA2228FMysie przeciwciało przeciw owcom MHC Klasa II DQ DR Polimorficzny: FITC, klon 49.1, izotyp IgG2a, reaktywny krzyżowo z
probówką do mikrowirówkiSigma AldrichHS43251,5 mL, dno stożkowe, z podziałką, rurka sterialna
Microsoft Power PointMicrosoft-Graficzneilustracje projektu eksperymentalnego
Mysia kontrola ujemna IgG1: FITC dla przeciwciała CD14, CD40Bio-RadMCA928FKontrola izotypu Przeciwciało monoklonalne CD14 i CD40 
Mysia kontrola ujemna IgG1: PE dla przeciwciała CD86Bio-RadMCA928PEkontrola izotypu Przeciwciało monoklonalne CD86 
Mysia kontrola ujemna IgG1: RPE dla przeciwciała CD25Bio-RadMCA928PEKontrola izotypu Przeciwciało monoklonalne CD25 
Mysia kontrola ujemna IgG2a: FITC dla przeciwciała MHC klasy IIBio-RadMCA929FKontrola izotypu dla przeciwciała monoklonalnego MHC klasy II 
Nobivac WściekliznaMSD Zdrowie zwierząt,UK-1i mikro; L/ml inaktywowanej szczepionki z hodowli komórkowej zawierającej > 2 m.j./ml szczepu wirusa wścieklizny
Uszczelki optyczneBi0-RadTCS08030,2 ml płaska probówka do PCR 8-nasadkowa, paski optyczne, ultraprzezroczyste, kompatybilne z maszyną qPCR
Penicylina-StreptomycynaGibco, Thermo Fisher15140122100 ml
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)Gibco, Thermo Fisher10010023pH 7,4, 1x stężenie
Pryzmat - Oprogramowanie GraphPad 5 Dotmatics-Oprogramowaniestatystyczne
Oczyszczone przeciwciało anty-ludzkie Ki-67Biolegend, USA350501Przeciwciało monoklonalne, reaktywne krzyżowo z krową, klon ki-67
Oczyszczona mysz IgG1 k Izotyp Ctrl PrzeciwciałoBiolegend400101Kontrola izotypu dla przeciwciała monoklonalnego Ki-67
READIDROP Jodek propidiumBD Bio Sciences1351101Marker żywej / martwej komórki stosowany do cytometrii przepływowej, barwnik reaktywny aminami
Rekombinowane ludzkie białko IL-2R& D System, USA202-IL-010/CFInterleukina-2, 20 ng/ml
RNeasy Mini KitQiagen74106Zestaw do ekstrakcji całkowitego RNA; Bufor RLT = bufor do lizy; Bufor RW1 = rygorystyczny bufor płuczący zawierający guanidynę; Bufor RDD = Bufor DNazy; Bufor RPE = łagodny bufor do mycia; RNaseOUT = inhibitor RNazy.
RPMI 1640 MediumSigma AldrichR8758Pożywka do hodowli komórkowych z L-glutaminą i wodorowęglanem sodu
SMART-servier sztuka medyczna Les Laboratories Servier-Licensedna licencji Creative Commons uznanie autorstwa 3.0 unported
license SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-52702x qPCR mix conatins dNTPs, polimeraza fuzyjna Ss07d, MgCl2, SYBR Green I supermix = supermix, barwniki normalizujące ROX.
SuperScript III First-Strand Synthesis SystemInvitrogen, Thermo Fisher18080051 Kit do syntezy cDNA
Kultura tkankowa Płytka testowa 24TPP, Szwajcaria92024Płytka 24-dołkowa, sterylizowana promieniowaniem, traktowana ze zwiększoną naturą, objętość 3,18 ml
Roztwór błękitu trypanowegoGibco, Thermo Fisher152500610,4%, 100 mL, barwnik do oceny żywotności komórek
UltraPure Invitrogen do wody destylowanej bez DNaz/RNaz, Thermo Fisher109770230,1 i mikro; m membrana filtrowana woda destylowana
Probówki do pobierania krwi VACUETTE Heparyna ThermoFisher Scientific15206067Probówki do pobierania krwi VACUETTE Heparin mają zieloną górę i zawierają suszoną rozpyłowo heparynę litową, sodową lub amonową na wewnętrznych ściankach i są stosowane w chemii klinicznej, immunologii i serologii. Heparyna przeciwzakrzepowa aktywuje antytrombinę, która blokuje kaskadę krzepnięcia i w ten sposób wytwarza próbkę krwi pełnej/osocza.
WodaSigma AldrichW3500-1LSterylnie filtrowany, bioOdczynnik odpowiedni do hodowli komórkowych
PBMC bydlęcej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502(2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424(2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214(2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72(2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215(2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112(2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
  36. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  37. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132(2020).
  38. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  39. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  40. Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369(2013).
  41. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  42. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  43. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  44. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  45. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  46. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  47. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  48. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  49. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252(2011).
  50. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bydl ce kom rki dendrytycznemononuklearne kom rki krwi obwodowejmagnetyczna separacja kom rekcytometria przep ywowaproliferacja limfocyt wprezentacja antygenuilo ciowa PCRinterferon gamma

Powiązane artykuły