Prosty protokół mapowania cech architektury systemu korzeniowego roślin

Summary

Używamy prostych narzędzi laboratoryjnych do badania architektury systemu korzeniowego (RSA) Arabidopsis i Medicago. Sadzonki są uprawiane hydroponicznie na siatce i rozprowadzane za pomocą pędzla artystycznego, aby odsłonić RSA. Obrazy są wykonywane za pomocą skanowania lub kamery o wysokiej rozdzielczości, a następnie analizowane za pomocą ImageJ w celu zmapowania cech.

Abstract

Kompleksowa wiedza na temat rozwoju architektury systemu korzeniowego roślin (RSA) jest kluczowa dla poprawy efektywności wykorzystania składników odżywczych i zwiększenia tolerancji odmian roślin uprawnych na wyzwania środowiskowe. Przedstawiono protokół eksperymentalny dotyczący konfiguracji systemu hydroponicznego, wzrostu sadzonek, rozprzestrzeniania RSA i obrazowania. W podejściu wykorzystano purpurowy system hydroponiczny oparty na pudełku zawierającym siatkę polipropylenową wspartą na klinach poliwęglanowych. Przykładem warunków eksperymentalnych jest ocena RSA sadzonek przy zmiennym zaopatrzeniu w składniki odżywcze (fosforany [Pi]). System został stworzony do badania RSA rzodkiewnika, ale można go łatwo przystosować do badania innych roślin, takich jak Medicago sativa (lucerna). Sadzonki Arabidopsis thaliana (Col-0) są używane w tym badaniu jako przykład pozwalający zrozumieć roślinę RSA. Nasiona są sterylizowane powierzchniowo poprzez obróbkę etanolem i rozcieńczonym wybielaczem komercyjnym i przechowywane w temperaturze 4 °C w celu rozwarstwienia. Nasiona kiełkują i rosną na płynnym podłożu pół-MS na siatce polipropylenowej wspartej na klinach poliwęglanowych. Sadzonki są uprawiane w standardowych warunkach wzrostu przez żądaną liczbę dni, delikatnie wybierane z siatki i zanurzane w płytkach agarowych zawierających wodę. Każdy system korzeniowy sadzonek jest delikatnie rozprowadzany na wypełnionej wodą płytce za pomocą okrągłego pędzla artystycznego. Te płytki Petriego są fotografowane lub skanowane w wysokiej rozdzielczości w celu udokumentowania cech RSA. Cechy korzenia, takie jak korzeń pierwotny, korzenie boczne i strefa rozgałęzienia, są mierzone za pomocą bezpłatnego oprogramowania ImageJ. Badanie to dostarcza technik pomiaru cech korzeni roślin w kontrolowanych warunkach środowiskowych. Omówiliśmy, jak (1) uprawiać sadzonki oraz zbierać i rozprowadzać próbki korzeni, (2) uzyskiwać zdjęcia rozsianych próbek RSA, (3) przechwytywać obrazy i (4) używać oprogramowania do analizy obrazu do ilościowego określania atrybutów korzeni. Zaletą obecnej metody jest wszechstronny, łatwy i skuteczny pomiar cech RSA.

Introduction

Architektura systemu korzeniowego (RSA), która znajduje się pod ziemią, jest kluczowym organem dla wzrostu i produktywności roślin^1,2,3. Po fazie embrionalnej rośliny przechodzą swoje najważniejsze zmiany morfologiczne. Sposób, w jaki korzenie rosną w glebie, ma duży wpływ na wzrost części roślin nad ziemią. Wzrost korzeni jest pierwszym krokiem do kiełkowania. Jest to cecha informacyjna, ponieważ w unikalny sposób reaguje na różne dostępne składniki odżywcze^1,2,3,4. RSA wykazuje wysoki stopień plastyczności rozwojowej, co oznacza, że środowisko jest zawsze wykorzystywane do podejmowania decyzji dotyczących rozwoju^2,5. Zmiany w otoczeniu sprawiły, że produkcja roślinna w obecnym scenariuszu stała się trudniejsza. RSA w sposób ciągły włącza sygnały środowiskowe do wyborów rozwojowych⁵. W rezultacie, dokładne zrozumienie zasad rozwoju korzeni jest niezbędne do poznania, jak rośliny reagują na zmieniające się środowisko^2,5.

RSA wykrywa różne stężenia składników odżywczych i generuje zmiany fenotypowe^4,6,7^{,8,9,10,11,12}. Badania sugerują, że morfologia korzenia/RSA jest wysoce plastyczna w porównaniu z morfologią pędów^1,3. Mapowanie cech RSA jest bardzo skuteczne w rejestrowaniu wpływu zmiany otaczającego środowiska glebowego^1,11,12.

Ogólnie, rozbieżności w wpływie różnych niedoborów składników odżywczych na fenotyp korzenia zostały zgłoszone w wielu wcześniejszych badaniach^{3,11,13,14,15}. Na przykład istnieje kilka sprzecznych doniesień na temat wywołanych głodem fosforanów (Pi) zmian w liczbie, długości i gęstości korzeni bocznych (LR). Wzrost gęstości LR został zgłoszony w stanie niedoboru liczby Pi^6,8. W przeciwieństwie do tego, spadek gęstości LR w warunkach niedoboru liczby Pi został również zgłoszony przez innych autorów^3,13,16. Jedną z głównych przyczyn tych niespójności jest użycie podatnego na zanieczyszczenia pierwiastkowe podłoża żelującego, które agar często zawiera¹⁰. Naukowcy zazwyczaj uprawiają swoje eksperymentalne rośliny na systemie płytek na bazie agaru i rejestrują cechy korzeni. Liczne cechy RSA są często ukryte lub zakorzenione w materiale agarowym i nie można ich udokumentować. Eksperymenty związane z wywoływaniem niedoboru składników odżywczych, w których użytkownicy często całkowicie wykluczają jeden składnik z pożywki, nie mogą być przeprowadzane w pożywce żelującej podatnej na zanieczyszczenia pierwiastkowe^11,14,15. Liczne składniki odżywcze są często obecne w znacznych ilościach w podłożach agarowych, w tym P, Zn, Fe i wiele innych^11,14,15. Co więcej, wzrost RSA jest wolniejszy w pożywkach na bazie agaru niż w pożywkach płynnych na bazie nieagarów. W związku z tym istnieje potrzeba ustanowienia alternatywnego, nieopartego na agarze podejścia do ilościowego i jakościowego rejestrowania fenotypu RSA. W związku z tym opracowano obecną metodę, w której sadzonki są hodowane w purpurowym systemie hydroponicznym opartym na pudełku na siatce polipropylenowej wspartej na klinach poliwęglanowych^1,10,11.

To badanie przedstawia szczegółową improwizowaną wersję wcześniejszej metody opisanej przez Jain et al.¹⁰. Strategia ta została dostosowana do aktualnych wymagań w zakresie biologii korzeni roślin i może być również stosowana w przypadku roślin takich jak lucerna, innych niż rośliny modelowe. Protokół jest podstawowym sposobem pomiaru zmian w RSA i wymaga jedynie prostego sprzętu. Niniejszy protokół ilustruje, w jaki sposób fenotypowo fenotypowo wyodrębnić kilka cech korzenia, takich jak korzenie pierwotne i boczne w pożywce normalnej i zmodyfikowanej (niedobór liczby Pi). Wskazówki krok po kroku i inne pomocne wskazówki zebrane z doświadczeń autora są dostarczane, aby pomóc badaczom podążać za metodologiami oferowanymi w tej metodzie. Niniejsze badanie ma na celu dostarczenie prostej i skutecznej metody ujawniania całego systemu korzeniowego roślin, w tym LR wyższego rzędu. Ta metoda polega na ręcznym rozprowadzeniu systemu korzeniowego za pomocą okrągłego pędzla akwarelowego, co pozwala na precyzyjną kontrolę nad ekspozycją korzeni^1,10,11,12. Nie wymaga drogiego sprzętu ani skomplikowanego oprogramowania. Ta metoda poprawiła pobieranie składników odżywczych i tempo wzrostu; Rośliny mają bogaty w składniki odżywcze roztwór, który jest łatwo wchłaniany przez ich korzenie. Obecna metoda jest odpowiednia dla badaczy, którzy chcą szczegółowo zmapować cechy systemu korzeniowego rośliny, szczególnie we wczesnym okresie rozwoju (10-15 dni po wykiełkowaniu). Nadaje się do małych systemów korzeniowych, roślin modelowych, takich jak Arabidopsis i tytoń, oraz roślin niekonwencjonalnych, takich jak lucerna, dopóki ich system korzeniowy nie zmieści się w purpurowych pudełkach.

Kroki analizy fenotypowej rozwoju RSA u Arabidopsis są opisane w tym protokole w następujący sposób: (1) metoda sterylizacji powierzchni nasion roślin (Arabidopsis), (2) kroki do założenia systemu hydroponicznego, a następnie wysiew nasion na podłożu, (3) procedura pobierania kompletnych nasion i rozsiewania na płytce Petriego w celu analizy RSA, (4) jak rejestrować obrazy dla RSA oraz (5) obliczać ważne parametry RSA za pomocą oprogramowania ImageJ.

Protocol

Cały protokół jest schematycznie podsumowany w Rysunek 1, pokazujący wszystkie niezbędne kroki związane z odkrywaniem architektury systemu korzeniowego (RSA) sadzonek. Kroki protokołu są szczegółowo podane poniżej:

1. Sterylizacja powierzchni nasion rzodkiewnika

1. Przenieś maleńką miarkę (około 100 nasion = około 2,5 mg) nasion do probówki do mikrofuge i moczyć przez 30 minut w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej (RT). Cała ta procedura odbywa się w warunkach aseptycznych.
2. Krótko odwirować probówkę do mikrofuge zawierającą nasiona o sile 500 x g przez 5 s, używając dowolnej wirówki stołowej o temperaturze pokojowej, aby nasiona osiadły.
3. Zdekantować wodę, dodać 700 μl etanolu o stężeniu 70% (v/v), wirować przez kilka sekund i wirować. W razie potrzeby powtórzyć wirowanie i wirowanie, ale upewnij się, że czas obróbki 70% etanolu wynosi 3 minuty.
4. Po 3 minutach natychmiast spłukać sterylną wodą. Utrzymuj etap mycia etanolem tak szybko, jak to możliwe, ponieważ długotrwałe narażenie na etanol zmniejsza kiełkowanie.
5. Potraktuj nasiona rozcieńczonym komercyjnym wybielaczem (4% v/v) z kroplą Tween-20 przez 7 minut. Wymieszaj nasiona z roztworem wybielacza, szybko odwracając probówki 8-12 razy, a następnie krótko odwiruj (500 x g przez 5 s w temperaturze pokojowej). W tubie pojawia się piana.
6. Zdekantować supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml i przepłukać nasiona co najmniej pięcioma płukaniami sterylną wodą, postępując zgodnie z tą samą procedurą wirowania.
7. Pozostaw wysterylizowane nasiona powierzchniowe w wodzie i inkubuj przez 2-3 dni w temperaturze 4 °C w celu stratyfikacji¹⁰.

2. Ustawienie systemu hydroponicznego do kiełkowania nasion

1. Napełnij do połowy standardowe purpurowe pudełko wodą destylowaną i wlej je do autoklawu. Arkusz poliwęglanu należy sterylizować w autoklawie (wyraźny kolor i gładka tekstura) i wyciąć prostokąty o wymiarach 4 cm x 8 cm, z punktem środkowym naciętym więcej niż w połowie prostokąta, tak aby dwa prostokąty mogły się ze sobą zespolić, tworząc kształt X¹⁰. Użyj tej konfiguracji, aby przytrzymać siatkę polipropylenową (kwadraty 6 cm x 6 cm o wielkości porów 250 μm lub w zależności od wymagań) wyciętą z arkuszy 12 x 24 cale10.
   UWAGA: Polipropylen jest wysoce odporny na kwasy, zasady i inne chemikalia; W związku z tym zdecydowano się na jego przyjęcie. Autoklawowanie ma tendencję do zniekształcania siatki polipropylenowej; Dlatego zaleca się noszenie go oddzielnie owiniętego w folię aluminiową. Zalecane są typowe warunki autoklawowania wynoszące 16 minut, 121 °C, 15 psi lub 775 mm Hg.
2. Dodaj sterylną pożywkę podstawową half-MS z witaminami + 1,5% (w/v) sacharozy, zgodnie z opisem Shukla et al.¹, do każdego pudełka, aby dotrzeć do dolnej krawędzi siatki polipropylenowej w przepływie laminarnym. Wszystkie zabiegi przeprowadzane są w warunkach aseptycznych.
3. Wysterylizowane powierzchniowo nasiona należy wysiewać hydroponicznie na siatce (porów o wielkości 250 μm) i pozostawić im do wzrostu przez 3 dni.
4. Po 3 dniach przenieś sadzonki na siatkę (wielkość porów 500 μm) i pozwól im rosnąć przez 2 dni.
5. Po 2 dniach (łącznie 5 dni) przenieść siewki na pożywkę kontrolną (tj. zmodyfikowaną pożywkę MS ¹ zawierającą 2,0 mM NH₄NO₃, 1,9 mM KNO₃, 0,15 mM MgSO₄·7H₂O, 0,1 mM MnSO₄·H₂O, 3,0 μM ZnSO₄·7H₂O, 0,1 μM CuSO₄·5H₂O, 0,3 mM CaCl₂·2H₂O, 5,0 μM KI, 0,1 μM CoCl₂·6H₂O, 0,1 mM FeSO₄·7H₂O, 0,1 mM Na₂EDTA·2H₂O, 1,25 mM KH₂PO₄, 100 μM H₃BO₃, 1 μM Na₂MoO₄·2H₂O, 1,5% sacharozy, 1,25 mM MES, pH 5,7 skorygowane 0,1 M MES [pH 6,1]) i do pożywek doświadczalnych (np. P- [0 mM]; KH₂PO₄ zastępuje się 0,62 mM K₂SO₄ z kompozycji pożywki kontrolnej, jak wspomniano powyżej¹. W przypadku zabiegów z nadmiarem liczby Pi, stężenie KH₂PO₄ zwiększa się w zmodyfikowanym podłożu MS [2,5, 5,0, 10,0, 20,0 mM]¹) i pozostawia nasiona do wzrostu przez 7 dni.
   UWAGA: Większy rozmiar porów oczek (500 μm) ułatwia płynne wybieranie całych sadzonek bez żadnych uszkodzeń lub konieczności cięcia na hipokotylu. Sadzonki rosną w standardowych warunkach wzrostu (tj. 16 godzin światła/8 godzin ciemnego fotoperiodu, natężenie światła 150 μmol·^m-2·^s-1, wilgotność 60%-70%) w temperaturze 23 °C.

3. Badanie RSA

1. Przygotuj płytki agarowe (1,1%) do rozsiewania korzeni (rozmiar płytki Petriego: 150 mm x 15 mm).
2. Dodaj 10-20 ml autoklawowanej przefiltrowanej wody z kranu do płytki Petriego, jak wspomniano powyżej. Delikatnie wyciągnij sadzonki z siatki (500 μm) i zanurz je w wodzie na płytkach.
3. Delikatnie rozprowadź korzeń każdej sadzonki w talerzu wypełnionym wodą za pomocą okrągłego pędzla akwarelowego (rozmiary: nr 14, 16, 18 i 20).
   UWAGA: Przeprowadzając rozsiewanie systemu korzeniowego, najpierw chwyć główny korzeń i rozłóż go w linii prostej, ponieważ służy jako oś. Następnie rozprowadź LR symetrycznie po każdej stronie pierwotnego korzenia, jeśli to możliwe. Następnie rozłóż LR drugiego rzędu połączonego z LR pierwszego rzędu. Ten proces rozprowadzania jest rodzajem sztuki; Rób to delikatnie, powoli, jak artysta rysujący obraz RSA.
4. Lekko przechyl płytkę, aby usunąć wodę.
   UWAGA: W tym momencie procedurę można wstrzymać, umieszczając te płytki rozprowadzające w temperaturze 4 °C. Później, gdy wymagane jest przetwarzanie obrazu, wyjmij płyty i umieść je na chwilę w RT. Zetrzyj skondensowaną wodę, a następnie obraz można wygodnie przetworzyć.

4. Nagrywanie obrazów dla RSA

1. Zeskanuj lub sfotografuj te płytki Petriego w odpowiedni sposób.
   UWAGA: Aby uzyskać wysokiej jakości zdjęcia, do skanowania zalecana jest rozdzielczość 600 dpi, a do fotografii zalecany jest aparat o rozdzielczości co najmniej 12 megapikseli.
2. Zmierz cechy architektury systemu korzeniowego za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Aby szybko wykonać kroki w celu zmierzenia długości korzenia za pomocą oprogramowania ImageJ, zapoznaj się z przykładem "pomiar długości konturu DNA"¹⁷.
   UWAGA: Te kroki są wykonywane, aby zmierzyć długość korzenia na zdjęciach zrobionych za pomocą skanera lub aparatu o wysokiej rozdzielczości.
   1. Użyj podanej odległości długości, aby ustawić skalę. Znana odległość podziałki liniowej w Rysunek 3 wynosi 2 cm. Wybierz narzędzie Linia prosta z paska narzędzi ImageJ (piąte narzędzie od lewej). Użyj narzędzia Linia prosta, aby utworzyć zaznaczenie linii, która obrysuje podziałkę liniową. Zakończ tworzenie konspektu, klikając prawym przyciskiem myszy, klikając dwukrotnie lub klikając pole na początku.
   2. Zmierz długość znanej podziałki liniowej w pikselach za pomocą paska narzędzi Analizuj > Zmierz. Zanotuj długość w pikselach.
   3. Otwórz okno dialogowe Ustawianie skali, klikając kartę Ustawianie skali na karcie Analiza. W polu Odległość w pikselach wprowadź długość piksela (jak wspomniano powyżej). Następnie w polu Znana odległość wprowadź wartość, zgodnie z podziałką liniową (w tym przypadku jest to 20 mm). Ustaw jednostkę długości na mm. Współczynnik proporcji pikseli wynosi 1,0. Teraz skala jest określona przez x liczbę pikseli na milimetr. Aby zablokować skalę dla tego konkretnego obrazu, kliknij OK.
   4. Utwórz zaznaczenie linii, które wyznacza długość korzenia, za pomocą narzędzia Linia segmentowa. Zakończ tworzenie konspektu, klikając prawym przyciskiem myszy, klikając dwukrotnie lub klikając pole na początku. Kliknij i przeciągnij małe czarno-białe "uchwyty" wzdłuż konturu, aby dostosować wybór linii zgodnie z potrzebami.
   5. Użyj polecenia Zmierz na karcie Analiza w narzędziu ImageJ, aby określić ilościowo długość pierwiastka. Aby przenieść zmierzone dane do arkusza kalkulacyjnego, kliknij prawym przyciskiem myszy okno Wyniki, wybierz Kopiuj wszystko z menu podręcznego, przełącz się do arkusza kalkulacyjnego, a następnie wklej dane.
      UWAGA: Jak opisano powyżej, ustaw skalę, używając znanej odległości od paska skali w opcji ImageJ ustaw skalę. Daje to liczbę pikseli na jednostkę długości. Wymagane jest świeże ustawienie skali za każdym razem, gdy analizowany jest nowy obraz.
3. Pomiar i obliczanie cech RSA
   1. Zmierz długość pierwotnego korzenia między połączeniem hipokotylowym a końcem wierzchołka korzenia.
   2. Zmierz długość LR pierwszego i drugiego rzędu.
   3. Zmierz strefę rozgałęzienia (BZ) korzenia pierwotnego. Strefa rozgałęzienia korzenia pierwotnego (BZ^PR) rozciąga się od pierwszego punktu wyłaniającego się LR do ostatniego punktu wyłaniającego się LR.
   4. Należy zapisać liczbę LR, która jest liczbą LR pochodzących z granic^{BZ PR.}
   5. Zmierz średnią długość LR pierwszego i wyższego rzędu. Wyprowadź średnią długość LR pierwszego rzędu (1° LR) (centymetr na pierwiastek), dzieląc całkowitą długość LR 1° przez całkowitą liczbę LR 1°
   .
   6. Zmierz średnią długość LR drugiego rzędu. Obliczyć średnią długość LR drugiego rzędu (2° LR), dzieląc całkowitą długość 2° LR przez całkowitą liczbę 2° LR.
   7. Zmierz gęstość LR 1°. Obliczyć gęstość 1° LR (liczbę 1° LR na jednostkę długości BZ^PR), dzieląc liczbę 1° LR przez długość BZ^PR.
   8. Zmierz gęstość LR 2°. Obliczyć gęstość 2° LR, dzieląc liczbę 2° LR przez długość BZ wynoszącą 1° LR (liczba 2° LR na jednostkę długości BZ 1° korzeni bocznych).
   9. Zmierz całkowitą długość korzenia (TRL). Jest to suma długości korzenia pierwotnego, 1° LR i 2° LR (i więcej, jeśli występuje).

5. Pomiar włośnika

UWAGA: Chociaż system hydroponiczny nie jest dobry w promowaniu wzrostu i rozwoju włosów na korzeniach, mimo że jest tak wytrzymały jak w przypadku stałych pożywek wzrostowych, nadal ważne jest, aby go badać w obecnym kontekście. Wykonaj poniższe czynności, aby przeanalizować rozwój włośników w odcinku 5 mm od czubka pierwotnego korzenia siewek.

1. Odetnij 2 cm odcinek korzenia pierwotnego od wierzchołka korzenia.
2. Zamontuj sekcję korzeniową na szkiełku, używając 10% glicerolu jako podłoża montażowego.
3. Umieść szkiełko pod mikroskopem stereoskopowym.
4. Użyj nośnika osiowego, aby wizualizować i rejestrować obrazy włośników.
5. Przeanalizuj obrazy, aby zbadać strukturę i charakterystykę włośników za pomocą oprogramowania ImageJ, jak opisano wcześniej.

Results

Różne cechy morfometryczne architektury systemu korzeniowego (RSA) są mierzone za pomocą prostych narzędzi laboratoryjnych, a kroki są przedstawione schematycznie w Rysunek 1. Szczegóły konfiguracji hydroponicznej pokazują potencjał protokołu w pomiarze RSA (Rysunek 1 i Rysunek 2).

Biorąc pod uwagę zaobserwowane różnice w środkach żelujących, użyliśmy hydroponicznego systemu uprawy do przeprowadzenia wszystki...

Discussion

W ramach tej pracy zademonstrowano mapowanie RSA przy użyciu prostego sprzętu laboratoryjnego. Za pomocą tej metody zmiany fenotypowe są rejestrowane na poziomie wyrafinowanym. Zaletą tej strategii jest to, że część pędów nigdy nie styka się z podłożem, więc fenotyp sadzonek jest oryginalny. Metoda ta polega na skonfigurowaniu systemu hydroponicznego do uprawy sadzonek zgodnie z opisem w protokole. Następnie każdą sadzonkę wyjmuje się w stanie nienaruszonym i umieszcza na wypełnionej agarem płytce Petriego. Następnie sys...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Arabidospsis thaliana (Col 0)	Lehle Seeds	WT-02	Columbia (Col-0**, bez markerów)*
Pędzle artystyczne	Amazon lub dowolny inny sprzedawca		Okrągły pędzel do akwareli nr 14 (8 mm), 16 (9,5 mm), 18 (12 mm) i 20 (14,2 mm)
Mikroskop automatyczny z kamerą cyfrową	Leica Microsystems		LAS wersja 4.12.0, oprogramowanie do obrazowania Leica Microsystems
	ImageJ		ImageJ V   1.8.0
Purpurowe pudełko GA-7	Fisher Scientific	50-255-176
Medicago sativa	Johnny's Seeds Płytka
Petriego (150 mm x 15 mm)	USA Scientific	8609-0215	150 mm x 15 mm PS Szalka Petriego (https://www.usascientific.com)
Aparat fotograficzny	Cannon lub Nikon		Dowolny aparat o wysokiej rozdzielczości megapikseli (co najmniej 12 megapikseli na cal) w trybie makro
Plant-Agar	Sigma-Aldrich	A3301	Agargel  Nadaje się do hodowli tkanek roślinnych
Arkusze poliwęglanu	Amazon		1 mm  gruba
siatka polipropylenowa	Amazon		Rozmiar porów 250 i mikro; m, 500 i mikro; m oraz 1000 &mikro;
m Skaner	Epson		Epson Perfection V700 Photo (skanowanie w rozdzielczości 600 dpi)