Szybkie rozluźnienie mięśnia sercowego i serca jest niezbędne dla normalnej fizjologii. Obecnie wiadomo, że mechaniczne mechanizmy relaksacji są zależne od szybkości odkształcania. Protokół ten zawiera przegląd pozyskiwania i analizy eksperymentów w celu dalszego badania mechanicznej kontroli relaksacji.
Artykuł metodologiczny
Mechaniczna kontrola relaksacji za pomocą nienaruszonych beleczków serca
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dysfunkcja rozkurczowa jest powszechnym fenotypem w chorobach sercowo-naczyniowych. Oprócz podwyższonej sztywności serca (podwyższonego ciśnienia końcoworozkurczowego lewej komory), upośledzona relaksacja serca jest kluczowym wskaźnikiem diagnostycznym dysfunkcji rozkurczowej. Podczas gdy relaksacja wymaga usunięcia cytozolowego wapnia i dezaktywacji cienkich włókien sarkomerowych, celowanie w takie mechanizmy nie zapewniło jeszcze skutecznych metod leczenia. Teoretyzuje się, że mechanizmy mechaniczne, takie jak ciśnienie krwi (tj. obciążenie następcze), modyfikują relaksację. Niedawno wykazaliśmy, że modyfikacja szybkości odkształcania podczas rozciągania, a nie obciążenia następczego, była zarówno konieczna, jak i wystarczająca, aby zmodyfikować późniejszą szybkość rozluźniania tkanki mięśnia sercowego. Zależność relaksacji od szybkości odkształcania, zwana mechaniczną kontrolą relaksacji (MCR), można ocenić za pomocą nienaruszonych beleczków serca. Protokół ten opisuje przygotowanie modelu małego zwierzęcia, systemu i komory doświadczalnej, izolację serca i późniejszą izolację beleczki, przygotowanie komory doświadczalnej oraz protokoły eksperymentalne i analityczne. Dowody na wydłużanie się szczepów w nienaruszonym sercu sugerują, że MCR może zapewnić nowe obszary dla lepszej charakterystyki leczenia farmakologicznego, wraz z metodą oceny kinetyki miofilamentów w nienaruszonych mięśniach. W związku z tym badanie MCR może wskazać drogę do nowatorskich podejść i nowych granic w leczeniu niewydolności serca.
Wprowadzenie
Relaksacja serca jest upośledzona w prawie wszystkich formach niewydolności serca (w tym w niewydolności serca ze zmniejszoną frakcją wyrzutową) oraz w wielu chorobach sercowo-naczyniowych. Oprócz licznych metod oceny czynności serca w mięśniach przepuszczalnych, coraz większym zainteresowaniem cieszy się ocena nienaruszonego mięśnia sercowego. Takie tkanki są oceniane jako nieobciążone (końce swobodnie się kurczą) lub obciążone (kontrolowana długość lub siła). Historycznie rzecz biorąc, nienaruszone izolowane miocyty oceniano w stanie nieobciążonym, w którym ciało komórki może się swobodnie skracać podczas skurczu. Nienaruszone beleczki serca są często oceniane w warunkach izometrycznych, w których długość nie może się zmieniać, ale generowane jest naprężenie (siła na pole przekroju poprzecznego). Zarówno metoda nienaruszonych miocytów, jak i beleczków zaczyna się zbiegać z modyfikacjami load1,2.
Protokoły do zaciskania obciążenia mięśnia (tj. kontrolowania rozwiniętego stresu mięśnia przy określonej wartości, która symuluje fizjologiczne obciążenia następcze) były opracowywane przez kilka dziesięcioleci3,4,5. W nienaruszonych tkankach serca zaciski obciążeniowe pozwalają badaczom na dokładniejsze naśladowanie cyklu serca in vivo za pomocą izotonicznych lub podobnych do Windkessela obciążeń następczych6,7,8,9. Celem tego protokołu jest uzyskanie danych wykorzystywanych do ilościowego określenia MCR (tj. zależności szybkości odkształcania od współczynnika relaksacji)8,9.
Chociaż protokół MCR został zaadaptowany z wcześniejszych prac, ten protokół (w porównaniu do podobnych protokołów wykorzystujących nienaruszone tkanki serca) skupia się na mechanizmach biomechanicznych, które modyfikują relaksację. Istnieje kilka protokołów wykorzystujących zaciskanie obciążenia3,4,5,7,10 oraz protokoły skupiające się na modelach Windkessel1,2,11, ale ten protokół opisuje szczegółowo, w jaki sposób rozciąganie przed relaksacją modyfikuje tempo relaksacji. Wykazaliśmy, że ta kontrola zachodzi w okresie protorozkurczowym8, fazie pierwotnie opisanej przez Wiggers12. W normalnych, zdrowych sercach mięsień sercowy ulega wydłużeniu podczas wyrzutu przed zamknięciem zastawki aortalnej (tj. przed relaksacją izowolumiczną)13. Jest to naśladowane poprzez wydłużenie czasu kontroli obciążenia następczego, aż mięsień zacznie się rozciągać. Dowody kliniczne sugerują, że to wydłużenie może być osłabione lub utracone w stanach chorobowych14, a implikacje i mechanizmy zmienionego tempa odkształcenia końca skurczowego nie zostały w pełni wyjaśnione. Biorąc pod uwagę rzadkie możliwości leczenia chorób rozkurczowych i niewydolności serca z zachowaną frakcją wyrzutową, zakładamy, że MCR może dostarczyć wglądu w nowe mechanizmy leżące u podstaw upośledzonej relaksacji.
Podczas gdy opisana tutaj sekcja skupia się na gryzoniach, izolacja beleczki może być wykonana z dowolnego nienaruszonego serca i była wcześniej stosowana z ludzkim trabekulą serca8. Podobnie, pozyskiwanie i analiza danych może być również stosowana do kardiomiocytów lub innych izolowanych typów mięśni1,10. Dyskusja zawiera komentarz na temat możliwych zmian i adaptacji metody, wraz z ograniczeniami, takimi jak ostrzeżenie przed wykorzystywaniem mięśni brodawkowatych ze względu na właściwości mechaniczne struny9.
Protokół
Poniższy protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Wayne. Protokół tutaj opisuje kroki wykorzystania badanych doświadczalnych gryzoni, ale może być dostosowany do użycia w innych organizmach modelowych.
1. Przygotowanie
- Zdobądź obiekt eksperymentalny i pozwól mu zaaklimatyzować się w laboratorium.
- Przygotować 250 ml roztworu perfuzyjnego i 250 ml zmodyfikowanego roztworu Tyrode'a (Tabela 1), natleniając każdy z nich do 10-20 ppmO2 o pH 7,3.
- Przygotować strzykawkę o pojemności 5 ml z dołączoną kaniulą. Napełnić strzykawkę roztworem perfuzyjnym. Użyj kaniul o wadze odpowiednio 23 G dla myszy i 18 lub 16 G dla małego lub dużego szczura. Wsuń rurkę polietylenową (PE) o długości 1 mm na koniec igły (tabela materiałów), aby zapobiec zsuwaniu się aorty z kaniuli po związaniu.
- Kompletne przygotowanie obszaru rozwarstwienia i kaniulacji (Rysunek 1)
- Napełnij dwie czyste łodzie wagowe co najmniej do połowy roztworem perfuzyjnym. Zanurz końcówkę kaniuli w roztworze perfuzyjnym z co najmniej jednym szwem z podwójną pętlą umieszczonym wokół kaniuli. Trzymać strzykawkę na miejscu za pomocą pręta clamp.
- Umieść nożyczki chirurgiczne, hemostat, kleszcze do tęczówki, parę małych zakrzywionych nożyczek i dwa kleszcze #3, aby uzyskać łatwy dostęp.
- Przygotuj system eksperymentalny (Rysunek 2), przygotowując i rozprowadzając zmodyfikowany roztwór Tyrode'a po całym systemie eksperymentalnym. Upewnij się, że komora jest całkowicie wypełniona i stabilna.
- Włącz wszystkie skrzynki do zbierania danych, w tym przetwornik siły, silnik długości, system stymulacji, system kontroli temperatury i komputer akwizycji danych.
- Skopiuj i zmień nazwę folderu szablonu zawierającego wymagane pliki *.dap i wskaźnika, aby odwołać się do bieżącego eksperymentu. Otwórz oprogramowanie do akwizycji danych.
- Przygotuj narzędzia do izolacji beczek (nożyczki Vannas, kleszcze #5 lub #55, szklana sonda), zanurzając ich końcówki w 10% (w/v) albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w ultraczystej wodzie lub roztworze perfuzyjnym, aby pokryć metal białkiem (Rysunek 2B).
UWAGA: Cały system doświadczalny musi być przygotowany przed preparacją.
2. Grube rozwarstwienie i kaniulacja
- Zapisz dane identyfikacyjne, masę ciała i inne istotne informacje o badanym zwierzęciu.
- Opcjonalnie należy wstrzyknąć gryzoniowi 1000 j./kg heparyny w sterylnym roztworze soli fizjologicznej we wstrzyknięciu dootrzewnowym co najmniej 10 minut przed eutanazją, aby zminimalizować ryzyko zakrzepów przed perfuzją wieńcową.
- Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i wywołaj znieczulenie ogólne za pomocą 3%-5% izofluranu odparowanego w 100% tlenu, zgodnie ze standardową procedurą.
UWAGA: Włącz wszelkie zewnętrzne zmiatacze, stoły wyciągowe lub wyciągi dygestorium używane w celu zminimalizowania narażenia na izofluran. - Gdy gryzoń straci odruch prostowania, a tempo oddychania zwolni:
- (W przypadku szczura) wyjąć zwierzę z komory indukcyjnej i położyć je na wznak na podkładce preparcyjnej, z ciągłym znieczuleniem przez stożek nosowy.
- (W przypadku myszy) należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy natychmiast po wyjęciu zwierzęcia z komory indukcyjnej. Stożek nosowy nie jest konieczny. Ustaw parownik izofluranu na 0%.
- W razie potrzeby przymocuj górne kończyny gryzonia do podkładki preparacyjnej z dala od ściany klatki piersiowej za pomocą taśmy wspartej na szpilkach, uważając, aby nie przebić się przez zwierzę. Przed przystąpieniem do sekcji sprawdź, czy głębokość znieczulenia jest właściwa (brak reakcji na uszczypnięcie palca).
- Za pomocą nożyczek chirurgicznych (Mayo dla szczurów, Metzenbaum dla myszy), tuż poniżej wyrostka ksyloidalnego, przeciąć skórę poprzecznie na całej szerokości brzucha gryzonia do przestrzeni otrzewnej.
- Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj dwa pionowe cięcia przystrzałkowe (po bokach ściany klatki piersiowej) po lewej i prawej stronie ściany klatki piersiowej od cięcia poprzecznego. Następnie przetnij przeponę, łącząc nacięcia przystrzałkowe i uwalniając przestrzeń piersiową.
- Zacisnąć i podnieść wyrostek ksylufoidalny za pomocą hemostatu w kierunku głowy gryzonia, aby przesunąć mostek i ścianę klatki piersiowej w górę w kierunku głowy gryzonia, odsłaniając przestrzeń piersiową i serce. W razie potrzeby szybko rozszerz nacięcia przystrzałkowe w okolice drugiej przestrzeni kręgowej, aby całkowicie odsłonić serce i/lub przerwać błonę osierdziową.
- Używając zakrzywionych kleszczyków do tęczówki, ostrożnie podnieś serce, aby uwidocznić wielkie naczynia. Umieść kleszcze między mięśniem sercowym a kręgosłupem gryzonia, zaciśnij większe naczynia i podnieś serce, uważając, aby nie zacisnąć przedsionków lub segmentów komorowych.
- Lekko unosząc serce, szybko umieść zakrzywione nożyczki tęczówki (wklęsłe do góry) między zakrzywionymi kleszczami tęczówki a kręgosłupem gryzonia i odetnij wielkie naczynia i płuca od serca. Szybko przenieś serce do łodzi wagowej lub zlewki zawierającej świeży roztwór perfuzyjny i wstrząśnij, aby usunąć krew z serca.
- Ustaw parownik izofluranu na 0%, jeśli jeszcze tego nie zrobiłeś. Jeśli duże segmenty płuc, osierdzia lub innych tkanek pozostają przyczepione do serca, ostrożnie je odetnij i wyrzuć w tym czasie, aby zminimalizować zakłócenia kanneulacji.
- Za pomocą zakrzywionych kleszczyków do tęczówki przenieś serce do czystej łodzi wagowej lub zlewki, z zanurzoną przygotowaną kaniulą. Unieruchomij aortę, zabezpiecz aortę, zaciskając jedwabny szew pętelkowy i przepłucz do 5 ml roztworu perfuzyjnego.
- Wyjmij serce z kaniuli i umieść je w naczyniu wagowym pokrytym elastomerem silikonowym, aby przygotować się do izolacji beleczka.
3. Izolacja i równoważenie beleczki
- Umieść serce w naczyniu pokrytym elastomerem silikonowym pod mikroskopem stereoskopowym i oświetl je.
- Zlokalizuj prawą drogę odpływu komory. Przypnij lewy przedsionek i wierzchołek komory do elastomeru silikonowego w naczyniu.
- Za pomocą długich nożyczek Vannas przeciąć od drogi odpływu prawej komory do wierzchołka wzdłuż przegrody. Przeciąć od drogi odpływu prawej komory do prawego przedsionka w pobliżu aorty, a następnie przeciąć prawy przedsionek (Ryc. 3B).
- Za pomocą kleszczy ostrożnie rozciągnij wolną ścianę prawej komory (RV) od drogi odpływowej, uważając, aby nie rozciągnąć tkanki.
UWAGA: Eksperymentatorzy mogą znaleźć cienkie, białe pasma tkanki łącznej, które można bez obaw przeciąć. Większe, różowe (tkankowe) pasma należy oceniać ostrożnie, ponieważ mogą to być beleczki, które można odizolować. - Przypnij wolną ściankę trójkąta prawej komory do naczynia, aby odsłonić prawą komorę (Rysunek 3C).
- Używając szklanej pipety, która została stopiona i uformowana z cienkim (<500 μm średnicy), ale bez ostrego końca, przeszukaj odsłonięte wsierdzie w poszukiwaniu wolnostojących beleczek (Rysunek 3C).
UWAGA: Wolnostojący bebecula to pasek mięśni, który można w pełni zbadać pod spodem. Używaj beleczków, które mają równoległe boki (stała szerokość), unikając trójkątnych mięśni brodawkowatych. Zachowaj ostrożność podczas tego procesu i późniejszego rozwarstwienia, ponieważ naprężenie bełeczki może spowodować uszkodzenie, zmniejszając wytworzone siły. - Wypreparuj beleczkę za pomocą małych nożyczek Vannas. Pozostaw kawałek tkanki o grubości ≥1 mm w kostce na każdym końcu beczekuli, aby umożliwić przyczepienie. Nie rozciągaj beleczki tam, gdzie to możliwe, i zminimalizuj kontakt z metalowymi narzędziami, ponieważ oba mogą również spowodować uszkodzenie mięśni. W razie potrzeby przenieś szpilki przytrzymujące serce, aby zminimalizować obciążenie mięśnia w pobliżu zidentyfikowanych beleczków.
- Odetnij ~ 2 cale od końca pipety transferowej o pojemności 7 ml, powoli wciągnij bełeczkę do pipety i przenieś ją do nowego naczynia wagowego zawierającego 50% roztworu perfuzyjnego i 50% zmodyfikowanego roztworu Tyrode'a. Pozwól mięśniom zrównoważyć się ze wzrostem wapnia zewnątrzkomórkowego w zmieszanym roztworze przez kilka minut.
- Powtórz kroki 3.7-3.8, aby w tym momencie przeanalizować dodatkowe beleczki i uzyskać dodatkowe beleczki jako kopię zapasową.
- Wyłączyć pompę doprowadzającą do przefuzji i/lub ssania do komory doświadczalnej. Za pomocą pipety transferowej o dużym otworze przenieś belekus do komory doświadczalnej wypełnionej roztworem Tyrode'a.
- Przypnij jeden kawałek tkanki o średnicy >1 mm na końcu beczek do haczyka na przetworniku siły, a następnie przypnij drugą kostkę do silnika.
UWAGA: Oddziel silnik i przetwornik siły podczas montażu pierwszej strony, aby uzyskać lepszy dostęp do przetwornika, a następnie przesuń haczyki jak najbliżej siebie podczas montażu drugiej kostki tkanki, podczas gdy bełka pozostaje luźna. - Uruchom ponownie superfuzję i zacznij stymulować mięsień, aby określić napięcie progowe. Tempo przy napięciu progowym o 20% powyżej napięcia przez około 1 godzinę, aby umożliwić bełeczce równowagę.
- Pod koniec tego okresu równowagi powoli rozciągaj mięsień za pomocą mikrometru podłączonego do silnika, aż do osiągnięcia optymalnie rozwiniętego generowania stresu, obserwując rozwinięte napięcie (od minimum do szczytu). Przestań zwiększać długość mięśnia, gdy bierne napięcie rozkurczowe rośnie szybciej niż napięcie szczytowe, co wskazuje, że optymalna długość została przekroczona.
- Wyłącz oświetlenie mikroskopu transmitowanego i oświetl beleczkę za pomocą oświetlacza na gęsiej szyi pod ostrym kątem. Za pomocą kamery podłączonej przez optykę mikroskopu, która została wcześniej skalibrowana, uchwyć obraz beczek podczas rozkurczu do folderu eksperymentalnego. Jeśli beleczka jest szersza niż pole widzenia aparatu, wykonaj wiele zdjęć w poprzek mięśnia.
- Otwórz obrazy w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu, które raportuje odległości pikseli.
- Zmierz odległość pikseli średnicy mięśnia cztery razy wzdłuż jego długości. Zmierz długość mięśnia (beleczkowej) w pikselach, z wyłączeniem dużego sześcianu tkanki.
- Jeśli długość mięśnia jest dłuższa niż pole widzenia, użyj punktów odniesienia wzdłuż mięśnia, aby zmierzyć całą długość.
- Korzystając z szablonu w folderze eksperymentalnym, uśrednij miary średnicy i przelicz średnicę i długości z pikseli na mm, korzystając z wcześniej uzyskanej kalibracji. Oblicz pole przekroju poprzecznego jako π * średnica2/4 w mm2, a długość mięśnia w μm.
4. Akwizycja danych
- Gdy mięsień zostanie zrównoważony, otwórz oprogramowanie do akwizycji danych, wybierz Eksperymenty | Kontrola długości i wprowadź skalibrowaną długość beczek (FL) i pole przekroju poprzecznego (pole [m2]) w polu Kalibracja.
- W folderze szablonu (krok 1.7) upewnij się, że freeform_file.txt wskazuje właściwy folder, a następnie otwórz plik freeform.dap w edytorze tekstu. Ustaw poziom izotoniczny (izoton) na 32 000 w pliku *.dap.
- W polu Formant długości wybierz kartę Dowolny kształt i przejdź do odpowiedniego pliku listy dowolnych kształtów. Upewnij się, że ścieżka do archiwizacji danych jest również odpowiednim folderem do zapisywania danych. Rozpocznij pobieranie danych z w pełni izometrycznych drgań, naciskając przycisk Uruchom Eksperymentt, a następnie uzyskaj dane o obciążeniu za pomocą sterowania ze sprzężeniem zwrotnym z parametrami wzmocnienia proporcjonalnego i całkującego.
- Pobieraj dane o ograniczonym obciążeniu, definiując obciążenie wtórne (isoton) w pliku *.dap, a następnie iteruj wartości parametrów wzmocnienia proporcjonalnego (propgain) i integracji (Ki), zapisując plik w edytorze tekstu. Naciśnij przycisk Uruchom eksperyment w interfejsie oprogramowania do akwizycji danych.
- Upewnij się, że zacisk obejmuje ponowne wydłużenie z powrotem do pierwotnej długości (czasami określane jako obciążenie relaksacyjne5) podczas tej iteracji, aby osiągnąć maksymalny zakres szybkości odkształcania, ustawiając tryb (flswitch) od jednego i zwiększając próg zakończenia zacisku obciążenia (flthreshold) od zera.
- Kontroluj koniec zacisku obciążenia, zmieniając tryb (przełącznik płaski) z jednego na zero. Powtórz akwizycję, zmieniając koniec zacisku obciążenia od zerowego ponownego wydłużenia do całkowitego ponownego wydłużenia z powrotem na długość początkową.
- Aby zwiększyć długość, stopniowo zwiększaj próg zakończenia zacisku obciążenia (flthreshold) od zera, aż mięsień prawie powróci do swojej pierwotnej długości.
- Zresetuj tryb (flswitch = 1) i próg (flthreshold = 0), a następnie uruchom jedną końcową akwizycję danych.
- W razie potrzeby zmodyfikuj obciążenie następcze w badaniu, powtarzając kroki 4.4-4.6. To przejęcie może zostać dokonane natychmiast.
- W razie potrzeby zmodyfikuj napięcie wstępne, rozciągając lub skracając mięsień, lub potraktuj mięsień, dodając związki do roztworu Tyrode. W przypadku zmiany obciążenia wstępnego lub dodawania związków, odczekaj co najmniej 20 minut, aby upewnić się, że reakcja o niskiej sile9,15 ustabilizowała się i/lub aby związek w pełni wniknął do mięśnia.
- Po zakończeniu zbierania danych usuń beleczkę. W razie potrzeby zamrozić lub utrwalić bełeczkę do analizy biochemicznej lub histologicznej.
- Oczyść obszary robocze i system eksperymentalny, przepłucz wszystkie rurki wodą i wyłącz wszystkie komponenty.
5. Analiza danych
- Otwórz pliki danych za pomocą programu do analizy ilościowej, kierując program do odpowiedniej ścieżki pliku.
- Określ ilościowo relaksację, upewniając się, że program do analizy danych analizuje zaciśnięte uderzenie i że program prawidłowo uzyskuje początek zacisku obciążenia.
- Upewnij się, że koniec zacisku obciążenia jest zidentyfikowany, tak aby szybkość relaksacji (1/τ) została określona ilościowo na podstawie szczytowej ujemnej pochodnej naprężenia podczas relaksacji izometrycznej.
- Użyj metody Glantza16, aby wyznaczyć tę wykładniczą stałą czasową lub inną odpowiednią kwantyfikację relaksacji (minimalna pochodna naprężenia, logistyczna stała czasowa17, lub model kinematyczny 18).
- Upewnij się, że program do analizy danych oblicza szybkość odkształcania, biorąc pochodną czasową odkształcenia, gdzie odkształcenie jest obliczane jako długość w funkcji czasu podzielona przez długość przy optymalnym skurczu.
- Powtórz powyższe kroki dla wszystkich śladów danego stanu.
- Wykreślić zależność między szybkością relaksacji a szybkością odkształcania, ograniczając maksymalne dane do fizjologicznej szybkości odkształcania mniejszej niż 1 s-1. Wyklucz dane przy niskich szybkościach odkształcania (Rysunek 4C), ponieważ faza relaksacji może nie odzwierciedlać wykładniczego zaniku17,18.
- Uzyskaj nachylenie linii między szybkością relaksacji a szybkością odkształcania i zapisz nachylenie jako wskaźnik MCR.
- Powtórz powyższą analizę dla każdego badanego warunku.
Wyniki
Reprezentatywny zestaw danych przedstawiono na Rysunku 4, a dodatkowe wyniki można znaleźć w poprzednich publikacjach8,9. W skrócie, szybkość odkształcenia oblicza się z pochodnej odkształcenia bezpośrednio przed relaksacją izometryczną. Odkształcenie to długość jako funkcja czasu podzielona przez długość mięśnia przy długości optymalnej. Szybkość relaksacji oblicza się jako 1/τ, gdzie τ jest wykładniczą stałą czasową16. Do wyznaczenia mechanicznej kontroli relaksacji (MCR) wymagane są wielokrotne szybkości odkształcenia i wynikające z nich szybkości relaksacji. Dane te nanosi się na wykres zależności szybkości relaksacji od szybkości odkształcenia. Nachylenie linii wyznacza indeks MCR.
Należy zauważyć, że końcowe prędkości odkształcenia skurczowego i rozkurczowego prawdopodobnie nie przekroczą 1 s-1. Zatem nachylenie powinno obejmować jedynie prędkości odkształcenia < 1 s-1. Prędkość relaksacji przy niskich prędkościach odkształcenia może być zaburzona przez zmiany minimalnej pochodnej naprężenia po czasie (dStress/dtmin); w takich przypadkach można pominąć dane z rozciągnięć mniejszych niż około 0,15 s-1.
Rysunek 1: Organizacja stanowiska do sekcji makroskopowej i kanulacji serca. Od prawej do lewej: a. komora do indukcji znieczulenia zwierzęcia znajdująca się w pobliżu obszaru sekcji. b. rurka doprowadzająca do opcjonalnego pochłaniacza gazów lotnych. c. podkładka do sekcji, na której zwierzę zostanie umieszczone na plecach, otoczona przez (zgodnie z ruchem wskazówek zegara) d. maskę nosową, zapewniającą ciągłe znieczulenie gryzonia, e. kleszczyki hemostatyczne, f. nożyczki chirurgiczne, g. zakrzywione nożyczki precyzyjne umieszczone w łatwym zasięgu dominującej ręki (tnącej), h. zakrzywione pęsety irydowe umieszczone w łatwym zasięgu ręki niedominującej. Przednie kończyny gryzonia można przymocować do podkładki do sekcji za pomocą taśmy, a i. naczynie do sekcji (lub mały zlew) z roztworem perfuzyjnym powinno zostać umieszczone w pobliżu w celu przemywania serca. j. W pobliżu musi znajdować się obszar przygotowany do kanulacji. Strzykawka z odpowiednią kaniulą jest zamocowana na statywie z pierścieniem. k. (Wstawka) Powiększony obraz kaniuli 16 G z przymocowanym 1 mm rurki PE205 i luźno zawiązaną nicią chirurgiczną. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.
Rycina 2: Obszar eksperymentalny i narzędzia. (A) Obszar eksperymentalny. Komora eksperymentalna i system akwizycji danych są przygotowane na pobliskim mikroskopie odwróconym (po lewej). Izolacja i montaż beleczek odbywa się pod stereomikroskopem (po prawej). (B) Końcówki dwóch pęset, duże i małe nożyczki Vannasa oraz specjalna szklana sonda są przygotowane poprzez namoczenie w 10% roztworze BSA. (C) Dodatkowe narzędzia do sekcji. Szalka wyłożona elastomerem silikonowym umożliwia montaż serca podczas precyzyjnej sekcji. Poniżej szalki i szklanej sondy widoczna jest pipeta transferowa o pojemności 7 mL z odciętym końcem. Odcięty koniec pipety transferowej jest usuwany, a powiększony otwór służy do przenoszenia mięśnia przy minimalnym ryzyku rozciągnięcia lub odwodnienia. (D) Powiększony obraz końcówki szklanej pipety, która ma około 2 mm długości i 0,25-0,5 mm średnicy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Przewodnik po sekcji. (A) Sekcję makroskopową należy rozpocząć od cięcia poprzecznego (1. zielone) przez skórę do jamy otrzewnej poniżej wyrostka mieczykowatego (dolne żebra i wyrostek mieczykowaty zaznaczono cienką szarą linią). Następnie należy wykonać cięcia parasagitalne od jamy otrzewnej w górę klatki piersiowej (2. linie morskie i 3. niebieskie), po czym należy przeciąć przeponę. Można następnie użyć hemostatu do zaciśnięcia wyrostka mieczykowatego i uniesienia ściany klatki piersiowej w stronę głowy. (B) Nienaruszone serce szczura przytwierdzone do tacki z elastomeru silikonowego, zorientowane tak, aby widoczny był odpływ z prawej komory (RVOT), prawy przedsionek (RA), aorta (Ao) i lewy przedsionek (LA). Pierwszy zestaw cięć powinien przebiegać od RVOT do wierzchołka wzdłuż przegrody (1. linia żółta). Drugi zestaw cięć powinien prowadzić od RVOT wzdłuż podstawy serca, a następnie przez prawy przedsionek (2. linia pomarańczowa). (C) RVOT można ostrożnie odsunąć od aorty, aby otworzyć serce, a następnie przypiąć go z powrotem. Linie żółta i pomarańczowa odpowiadają cięciom opisanym w punkcie B. Wolnostojące mięśnie trawiaste (trabeculae) często występują w pobliżu podstawy wolnej ściany prawej komory oraz w pobliżu przegrody, ale mogą pojawić się w dowolnym miejscu (linie czerwone wskazują częste lokalizacje). (D) Powiększony widok sondy szklanej pod mięśniem trawiastym (żółta strzałka wskazuje punkt styku mięśnia trawiastego i sondy). (E) Mięsień trawiasty (czerwona strzałka) jest zamontowany w układzie eksperymentalnym pomiędzy przetwornikiem siły (po lewej) a silnikiem (środek-prawo) i jest flankowany przez dwa elektrody stymulujące (poziomo nad i pod mięśniem trawiastym). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Reprezentatywne przebiegi i wyniki. (A) Pojedyncza beleczka mięśniowa serca oświetlona za pomocą elastycznej lampy LED pod dużym kątem (~75°) względem osi obiektywu mikroskopu, co zwiększa kontrast beleczki. W tym przykładzie dwa obrazy zostały zestawione obok siebie, aby pokazać pełną długość beleczki. (B) Krzywe naprężenie-czas (góra) i odkształcenie-czas (dół) dla tej samej beleczki. Przedstawiono skurcz izometryczny oraz trzy skurcze z zastosowaniem zacisku obciążenia (load-clamp) przy zwiększających się końcowych szybkościach odkształcenia skurczowego. (C) Reprezentatywne obliczenie MCR. MCR definiuje się jako nachylenie linii między szybkością relaksacji a szybkością odkształcenia. Jak wspomniano w dyskusji, szybkości odkształcenia mogą być ograniczane w celu uzyskania ilościowego i powtarzalnego MCR. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Tabela 1: Roztwory. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Dyskusja
Mechaniczna kontrola relaksacji (MCR) określa ilościowo zależność szybkości relaksacji mięśnia sercowego od szybkości naprężania mięśnia przebiegającego rozluźnienie 8,9. Szybkość odkształcania, a nie obciążenie następcze, jest zarówno konieczna, jak i wystarczająca do modyfikacji szybkości relaksacji8. Ponieważ nie udowodniono, że interwencje mające na celu modyfikację dawki wapnia znacząco poprawiają relaksację serca, interwencja mechaniczna może dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmu i zapewnić nowe leczenie dysfunkcji rozkurczowej.
Opisany tutaj protokół modyfikacji szybkości odkształcania mięśnia sercowego wykorzystuje izotoniczny zacisk obciążenia 8,9. Mocną stroną izotonicznego zacisku obciążenia jest ilościowa kontrola naprężenia obciążenia następczego. Protokoły podobne do Windkessel mogą być wykorzystywane do dalszego badania zmian obciążenia następczego, obciążenia wstępnego i pracy serca 2,6,7. Rampa niekontrolowana przez zacisk obciążenia może być również wykorzystana do lepszego odizolowania zmiany odkształcenia od szybkości odkształcania. Niezależnie od tego, samo obciążenie następcze nie wydaje się być silnym modyfikatorem współczynnika relaksacji8.
Protokół może być również dostosowany do bardziej fizjologicznych warunków dotyczących temperatury i tempa stymulacji. Aktualne szczegóły protokołu zostały wykorzystane do wykazania obecności MCR. Przeprowadzanie eksperymentów w warunkach fizjologicznych jest ogólnie zalecane, w zależności od pytania doświadczalnego. Jednak eksperymenty przeprowadzane w temperaturze 37 °C lub w szybkim tempie mogą szybciej wywołać wyczerpanie (uszkodzenie) mięśni. Może być potrzebne rozwiązanie o ulepszonej zdolności przenoszenia tlenu. Co więcej, akwizycja danych musi być w stanie próbkować długość i siłę wystarczająco szybko, aby rozwiązać gwałtowne drgania i zapewnić kontrolę sprzężenia zwrotnego.
Obecny protokół nie opisuje pomiaru wapnia ani pomiaru i kontroli długości sarkomeru. Pomiary wapnia zostały omówione w innych protokołach11, podczas gdy pomiar długości sarkomeru można dodać za pomocą odpowiedniego sprzętu. Kontrola długości sarkomeru nie jest wykorzystywana w obecnych badaniach MCR, ponieważ długość mięśni jest parametrem najbardziej skorelowanym ze stanem klinicznym19. Dalsza kontrola długości sarkomeru (w porównaniu z kontrolą długości mięśni) dostarczyłaby konkretnych odpowiedzi na pytania kinetyczne, ale jest mało prawdopodobne, aby wzbogaciła wiedzę translacyjną ze względu na zmienność między sarkomerami i minimalne zrozumienie zmian długości sarkomeru in vivo.
W tym miejscu podkreślono trzy kwestie eksperymentalne w celu zwiększenia odtwarzalności danych.
Po pierwsze, u niektórych zwierząt może być trudno znaleźć wolnostojące beleczki serca (niepublikowane wyniki i komunikaty). Podczas gdy drgające mięśnie można znaleźć u większości szczurów, rozsądny wskaźnik sukcesu w uzyskiwaniu danych z beleczki u szczurów wynosi jeden na trzy. Sukces Trabecula może być wyższy w przypadku szczurów Brown Norway x Lewis F1, które również były używane historycznie20 i zgłoszono, że mają więcej beleczków (niepublikowane komunikaty). W przypadku myszy wskaźniki sukcesu będą prawdopodobnie niższe, przy czym mniej niż jedna na 10 oczekuje się u myszy z tła BL/6; jednak oczekuje się, że wyższy wskaźnik będzie miał miejsce w przypadku myszy z FVBN (niepublikowane komunikaty i obserwacje).
Po drugie, uszkodzenie mięśni może zmniejszyć wydajność. Jeśli wytworzone siły są mniejsze niż 10 mN mm-2 w temperaturze 25 °C i stymulacji 0,5 Hz, badacze mogą być zmuszeni do wykonania rozwiązywania problemów, aby ocenić, czy dochodzi do niezamierzonego rozciągania lub kontaktu między metalowymi kleszczami a mięśniami, czy roztwory nie są odpowiednio przygotowane lub czy stymulacja lub sprzęt eksperymentalny działają prawidłowo. Inne protokoły wykorzystujące nienaruszoną bełeczkę sugerowały użycie strzykawek Luer-lock jako naczyń transferowych11. Chociaż jest to możliwe, zwłaszcza jeśli użytkownik kontroluje bardzo wolne tempo przepływu lub mniejszy segment mięśni, obecny protokół wykorzystuje znacznie większą pipetę do przenoszenia otworu, aby zminimalizować możliwe uszkodzenia. Innym krokiem, w którym może dojść do uszkodzenia niedokrwiennego, jest rozwarstwienie. Aortę należy kaniulować i przepłukać roztworem perfuzyjnym w ciągu 3 minut od pierwszego przecięcia brzucha (szczur) lub zwichnięcia szyjki macicy (mysz), podobnie jak limity wymienione w protokołach izolacji kardiomiocytów21,22. Minimalizuje to czas, w którym tkanka serca nie jest narażona na działanie roztworu perfuzyjnego podobnego do kardioplegii. Co więcej, sekcje trwające dłużej niż 30 minut na ogół nie powodują drgania beleczkowania. Dlatego operatorzy powinni ćwiczyć szybką, ale ostrożną sekcję, aby zminimalizować uszkodzenia. Pole przekroju poprzecznego powyżej 0,2mm2 (2 x 10-7 m2) może cierpieć na niedokrwienie rdzenia20.
Po trzecie, należy wziąć pod uwagę sposób, w jaki mięśnie są przymocowane do motoryki i przetwornika siły. Protokół ten koncentruje się obecnie na hakach i wolnostojących beleczkach. Czasami szybkie tempo naprężania rozciągania przed rozluźnieniem może spowodować ślizganie się mięśnia, jeśli nie jest prawidłowo przymocowany, dlatego obecny protokół nie używa "koszy" do trzymania beleczki23,24. Można również rozważyć i zatwierdzić alternatywne metody montażu (kleje, klipsy itp.25,26). Opisany tutaj protokół wykorzystuje beleczki, a nie mięśnie brodawkowate. Struny mięśnia brodawkowatego indukują elastyczność szeregową, która może hamować zmiany w MCR9. Jednak dokładne rozmieszczenie przyczepów w mięśniu prawdopodobnie nie wpłynie na pomiary, ponieważ długość (i średnica) bełeczki znacznie się różnią.
Ograniczeniem nakłuwania końcówek mięśni haczykami jest to, że sam punkt mocowania również może zostać uszkodzony. Ewentualne naderwanie zrostowej tkanki mięśniowej przy częstych skurczach (w zależności od ich siły) może zmienić długość lub elastyczność serii. Ta szybkość rozdzierania jest trudna do kontrolowania. Podobnie, uszkodzenie tkanki i haczyka może ulec nasileniu podczas rozciągania, co również może powodować problemy. Oględziny i rozwinięte wartości siły pozostałe >80% zrównoważonej siły izometrycznej powinny być wykorzystane do oceny, czy preparat jest uszkodzony i należy go wykluczyć.
Inne ograniczenie lub rozważanie wpływa na to, na jakie pytania eksperymentalne można odpowiedzieć za pomocą metody. Na przykład rozważmy zastosowanie monoksymu 2,3-butanodionu (BDM) w roztworze perfuzyjnym. BDM to fosfataza, która może zmieniać funkcję mięśni. Ponadto długi okres rozładunku i brak stymulacji oznaczają, że utajony stan fosforylacji prawdopodobnie uległ zmianie. W związku z tym należy zachować ostrożność przy próbie bezpośredniej oceny kurczliwości mięśni zwierzęcia (w porównaniu z różnicami między genotypami lub leczeniem), ponieważ stan skurczu prawdopodobnie uległ zmianie. Jednak wpływ fosforylacji można ocenić farmakologicznie, dodając agonistę lub antagonistę szlaku.
Podsumowując, MCR zapewnia wgląd w to, w jaki sposób relaksacja jest regulowana przez ruch mięśni (szybkość naprężenia). MCR może pomóc w zapewnieniu lepszego wglądu w diagnostykę i monitorowanie choroby rozkurczowej, wraz z celami interwencji farmakologicznej, takimi jak modyfikacja kinetyki miozyny. Przedstawiony tu protokół i porady stanowią podstawę wiedzy zdobytej w ciągu kilku lat badań klinicznych i powinny mieć zastosowanie do innych systemów i modeli chorób serca.
Podziękowania
Ta praca jest wspierana przez National Institutes of Health (1R01HL151738) i American Heart Association (18TPA34170169).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| igła / kaniula | do kaniulacji aorty szczura, użyj 1 mm rurki PE160 lub PE205 jako ogranicznika | ||
| 2,3-butanodionu Monoxime | Sigma-Aldrich | B0753-25G | |
| 23 igła / kaniula | kaniulacji aorty myszy, użyj 1 mm rurki PE50 jako | ||
| strzykawki | 5 ml BD Luer-Lock | 309646 | |
| 95% tlenu/5% CO2 | AirGas | Z02OX9522000043 | |
| System anestezjologiczny | EZ Systems | EZ-SA800 | Może użyć dowolnej odpowiedniej metody/systemu anestezjologicznego |
| Albumina surowicy bydlęcej | BioReodczynniki Fisher | BP-1600 | do powlekania końcówek drobnych forceptów, nożyczek |
| Dwuwodny chlorek wapnia | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Pojemniki/ naczynia preparacyjne | FisherBrand | 08-732-113 | Naczynia wagowe do tworzenia płyt preparacyjnych |
| Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | do preparacji myszy |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Oprogramowanie do akwizycji danych | SLControl | ||
| System akwizycji danych | MicrostarLabs | DAP5216a | Może korzystać z dowolnego DAQ. Jest to akwizycja danych oparta na PCI do użytku z SLControl; musi mieć komputer z gniazdem PCI |
| Oprogramowanie do analizy danych | Mathworks | Matlab | Custom Script |
| Dumont #3 Kleszcze | Fine Science Tools | 11231-30 | 2x do kaniulacji aorty |
| Dumont #5 Kleszcze | Fine Science Tools | 11254-20 | 2x do izolacji beczek |
| System eksperymentalny | Aurora Scientific | 801C | Może używać dowolnej odpowiedniej komory eksperymentalnej z kontrolą siły i długości |
| Drobne nożyczki, zakrzywione | Fine Science Tools | 14061-09 | do usuwania serca |
| Iluminator typu piggyback na gęsiej szyi | AmScope | LED-6WA | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Oprogramowanie do obrazowania | IrfanView | ||
| Kleszcze do tęczówki | Świat Instrumenty precyzyjne | 15915 | do usuwania serca |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| Sześciowodny chlorek magnezu | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| Siarczan magnezu | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Nożyczki majonezowe | Narzędzia do nauki | 14110-15 | do preparacji szczurów |
| Nożyczki Metzenbaum | Fine Science Tools | 14116-14 | do preparacji myszy Mikroskop podłączony |
| do kamery Flir | BFS-U3-27S5M-C | Zawiera oprogramowanie do akwizycji | |
| Mikroskop / cyfrowy system obrazowania | Olympus | IX-73 | Może używać dowolnego odpowiedniego mikroskopu. Potrzebny do pomiaru długości mięśni, pola przekroju poprzecznego |
| Kołek montażowy/igła | BD PrecisionGlide | 305136 | Do przytrzymywania serca do naczynia. 27 G x 1-1/4 |
| Kołek montażowy/igła | Fine Science Tools | 26000-40 | Do przytrzymywania serca do naczynia. Szpilka do owadów o średnicy 0,4 mm (igła Alt do 27G) |
| Tlen (O2) | Pompa | AirGas OX USP300 | |
| Królik Rainin | Może być dowolnym środkiem do wytworzenia przepływu w komorze eksperymentalnej | ||
| Czujnik pH i tlenu | Mettler Toledo | SevenGo pH i DO | |
| Wodorowęglan potasu | Sigma-Aldrich | 237205-100G | |
| Chlorek potasu | Fisher Chemical | P217-500 | |
| Fosforan potasu jednozasadowy | Sigma-Aldrich | 795488-500G | |
| Rochester-pean Hemostat | World Precision Instruments | 501708 | do grubej sekcji szczurów |
| Szew jedwabny, rozmiar: 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | pocięte na ~1,5 cala kawałki, namoczone w wodzie |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S9888-1KG | |
| Wodorotlenek sodu | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy | Sigma-Aldrich | S7907-100G | |
| Mikroskop stereoskopowy | AmScope | SM-1TX | |
| Student Vannas Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 91500-09 | do otwierania RV |
| SYLGARD 184 Silikonowa baza elastomerowa | Dow Corning | 3097358-1004 | Do tworzenia płyt preparacyjnych |
| Uchwyt strzykawki | Harbor Frieght | Helping Hands 60501 | Może być używany jako alternatywa dla stojaka na pierścionki |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625-1KG | |
| Pipeta transferowa | FisherBrand | 13-711-7M | wytnij ~ 1 "od końcówki do poszerzenia otworu |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | do izolacji beczek |
Bibliografia
- Iribe, G., Helmes, M., Kohl, P. Force-length relations in isolated intact cardiomyocytes subjected to dynamic changes in mechanical load. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 292 (3), 1487-1497 (2007).
- Dowrick, J. M., et al. Work-loop contractions reveal that the afterload-dependent time course of cardiac Ca(2+) transients is modulated by preload. Journal of Applied Physiology. 133 (3), 663-675 (2022).
- ter Keurs, H. E., Rijnsburger, W. H., van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation. Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).
- Sonnenblick, E. H. Force-velocity relations in mammalian heart muscle. The American Journal of Physiology. 202, 931-939 (1962).
- Brutsaert, D. L., Rademakers, F. E., Sys, S. U. Triple control of relaxation: implications in cardiac disease. Circulation. 69 (1), 190-196 (1984).
- Taberner, A. J., Han, J. C., Loiselle, D. S., Nielsen, P. M. F. An innovative work-loop calorimeter for in vitro measurement of the mechanics and energetics of working cardiac trabeculae. Journal of Applied Physiology. 111 (6), 1798-1803 (2011).
- De Tombe, P. P., Little, W. C. Inotropic effects of ejection are myocardial properties. Am J Physiol. 266, 1202-1213 (1994).
- Chung, C. S., Hoopes, C. W., Campbell, K. S. Myocardial relaxation is accelerated by fast stretch, not reduced afterload. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 103, 65-73 (2017).
- Schick, B. M., et al. Reduced preload increases Mechanical Control (strain-rate dependence) of Relaxation by modifying myosin kinetics. Archives of Biochemistry and Biophysics. 707, 108909(2021).
- Parikh, S. S., Zou, S. Z., Tung, L. Contraction and relaxation of isolated cardiac myocytes of the frog under varying mechanical loads. Circulation Research. 72 (2), 297-311 (1993).
- Dowrick, J. M., et al. Simultaneous brightfield, fluorescence, and optical coherence tomographic imaging of contracting cardiac trabeculae ex vivo. Journal of Visualized Experiments. (176), e62799(2021).
- Wiggers, C. J. Studies on the consecutive phases of the cardiac cycle I. The duration of the consecutive phases of the cardiac cycle and the criteria for their precise determination. American Journal of Physiology-Legacy Content. 56 (3), 415-438 (1921).
- Rosen, B. D., et al. Late systolic onset of regional LV relaxation demonstrated in three-dimensional space by MRI tissue tagging. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1740-1746 (2004).
- Saito, M., et al. The differences in left ventricular torsional behavior between patients with hypertrophic cardiomyopathy and hypertensive heart disease. International Journal of Cardiology. 150 (3), 301-306 (2011).
- Monasky, M. M., Biesiadecki, B. J., Janssen, P. M. L. Increased phosphorylation of tropomyosin, troponin I, and myosin light chain-2 after stretch in rabbit ventricular myocardium under physiological conditions. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (5), 1023-1028 (2010).
- Raff, G. L., Glantz, S. A. Volume loading slows left ventricular isovolumic relaxation rate. Evidence of load-dependent relaxation in the intact dog heart. Circulation Research. 48, 813-824 (1981).
- Matsubara, H., Takaki, M., Yasuhara, S., Araki, J., Suga, H. Logistic time constant of isovolumic relaxation pressure-time curve in the canine left ventricle. Better alternative to exponential time constant. Circulation. 92 (8), 2318-2326 (1995).
- Chung, C. S., Kovacs, S. J. Physical determinants of left ventricular isovolumic pressure decline: model prediction with in vivo validation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1589-1596 (2008).
- Campbell, K. B., Kirkpatrick, R. D., Tobias, A. H., Taheri, H., Shroff, S. G. Series coupled non-contractile elements are functionally unimportant in the isolated heart. Cardiovascular Research. 28 (2), 242-251 (1994).
- Raman, S., Kelley, M. A., Janssen, P. M. Effect of muscle dimensions on trabecular contractile performance under physiological conditions. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 451 (5), 625-630 (2006).
- Czeiszperger, T. L., Wang, M. P., Chung, C. S. Membrane stabilizer Poloxamer 188 improves yield of primary isolated rat cardiomyocytes without impairing function. Physiol Rep. 8 (4), 14382(2020).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Loiselle, D. S., Johnston, C. M., Han, J. C., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. Muscle heat: a window into the thermodynamics of a molecular machine. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 311-325 (2016).
- de Tombe, P. P., ter Keurs, H. E. Force and velocity of sarcomere shortening in trabeculae from rat heart. Effects of temperature. Circulation Research. 66 (5), 1239-1254 (1990).
- Palmer, B. M., Bell, S. P. Preparing excitable cardiac papillary muscle and cardiac slices for functional analyses. Frontiers in Physiology. 13, 817205(2022).
- Brunello, E., et al. Myosin filament-based regulation of the dynamics of contraction in heart muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 8177-8186 (2020).
Przedruki i uprawnienia
