Analiza morfologii mitochondriów za pomocą symulacji uczenia nadzorowanego

Summary

Ten artykuł wyjaśnia, jak używać nadzorowanego symulacji uczenia maszynowego do analizy morfologii mitochondriów w obrazach z mikroskopii fluorescencyjnej stałych komórek.

Abstract

Analiza ilościowa organelli subkomórkowych, takich jak mitochondria, na obrazach z mikroskopii fluorescencyjnej komórek jest wymagającym zadaniem ze względu na nieodłączne wyzwania związane z segmentacją tych małych i morfologicznie zróżnicowanych struktur. W tym artykule demonstrujemy wykorzystanie procesu segmentacji i analizy wspomaganego uczeniem maszynowym do ilościowego określania morfologii mitochondriów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej komórek stałych. Narzędzie do segmentacji oparte na głębokim uczeniu jest trenowane na symulowanych obrazach i eliminuje konieczność stosowania adnotacji o prawdziwości gruntowej na potrzeby nadzorowanego uczenia głębokiego. Pokazujemy użyteczność tego narzędzia na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej utrwalonych kardiomioblastów ze stabilną ekspresją fluorescencyjnych markerów mitochondriów i wykorzystujemy określone warunki hodowli komórek do wywołania zmian w morfologii mitochondriów.

Introduction

W tym artykule demonstrujemy użyteczność opartego na fizyce narzędzia do analizy segmentacji subkomórkowej¹ w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej utrwalonych kardiomioblastów wyrażających fluorescencyjne markery mitochondriów.

Mitochondria są głównymi organellami produkującymi energię w komórkach ssaków. W szczególności mitochondria są bardzo dynamicznymi organellami i często znajdują się w sieciach, które stale zmieniają długość i rozgałęzienia. Kształt mitochondriów wpływa na ich funkcję, a komórki mogą szybko zmieniać morfologię mitochondriów, aby dostosować się do zmian w środowisku². Aby zrozumieć to zjawisko, morfologiczna klasyfikacja mitochondriów jako kropek, pręcików lub sieci jest wysoce pouczająca³.

Segmentacja mitochondriów jest kluczowa dla analizy morfologii mitochondriów w komórkach. Obecne metody segmentacji i analizy obrazów mitochondriów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opierają się na ręcznej segmentacji lub konwencjonalnych podejściach do przetwarzania obrazu. Podejścia oparte na progach, takie jak Otsu⁴, są mniej dokładne ze względu na wysoki poziom szumów w obrazach mikroskopowych. Zazwyczaj obrazy do analizy morfologicznej mitochondriów zawierają dużą liczbę mitochondriów, co sprawia, że ręczna segmentacja jest żmudna. Podejścia matematyczne, takie jak MorphoLibJ⁵ i częściowo nadzorowane podejścia do uczenia maszynowego, takie jak Weka⁶, są bardzo wymagające i wymagają specjalistycznej wiedzy. Przegląd technik analizy obrazu dla mitochondriów⁷ wykazał, że techniki oparte na głębokim uczeniu mogą być przydatne w tym zadaniu. Rzeczywiście, segmentacja obrazów w życiu codziennym do zastosowań takich jak autonomiczna jazda została zrewolucjonizowana dzięki zastosowaniu modeli opartych na głębokim uczeniu.

Głębokie uczenie to podzbiór uczenia maszynowego, który dostarcza algorytmy uczące się na podstawie dużych ilości danych. Nadzorowane algorytmy głębokiego uczenia uczą się relacji na podstawie dużych zestawów obrazów, które są oznaczone etykietami prawdy podstawowej (GT). Wyzwania związane z wykorzystaniem nadzorowanego uczenia głębokiego do segmentacji mitochondriów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej są dwojakie. Po pierwsze, nadzorowane uczenie głębokie wymaga dużego zestawu danych obrazów treningowych, a w przypadku mikroskopii fluorescencyjnej dostarczenie tak dużego zestawu danych byłoby rozległym zadaniem w porównaniu z łatwiejszym dostępem do tradycyjnych obrazów opartych na kamerach. Po drugie, obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wymagają adnotacji GT interesujących obiektów na obrazach treningowych, co jest żmudnym zadaniem wymagającym wiedzy eksperckiej. To zadanie może z łatwością zająć godziny lub dni czasu eksperta na pojedynczy obraz komórek z fluorescencyjnie znakowanymi strukturami subkomórkowymi. Co więcej, różnice między adnotatorami stanowią problem. Aby wyeliminować potrzebę ręcznego dodawania adnotacji i móc wykorzystać doskonałą wydajność technik głębokiego uczenia, zastosowano tutaj model segmentacji oparty na głębokim uczeniu, który został przeszkolony na symulowanych obrazach. Symulatory oparte na fizyce umożliwiają naśladowanie i kontrolowanie procesu powstawania obrazu w mikroskopie, umożliwiając tworzenie obrazów o znanych kształtach. Wykorzystując symulator oparty na fizyce, stworzono w tym celu duży zestaw danych symulowanych obrazów mitochondriów z mikroskopii fluorescencyjnej.

Symulacja rozpoczyna się od generowania geometrii przy użyciu krzywych parametrycznych do generowania kształtów. Emitery są losowo umieszczane na powierzchni kształtu w sposób równomiernie rozłożony, tak aby gęstość odpowiadała wartościom eksperymentalnym. Funkcja rozproszenia punktowego 3D (PSF) mikroskopu jest obliczana przy użyciu wydajnego obliczeniowo przybliżenia⁸ modelu Gibsona-Lanniego⁹. Aby ściśle dopasować symulowane obrazy do obrazów eksperymentalnych, zarówno ciemny prąd, jak i szum ujęcia są emulowane w celu uzyskania realizmu fotograficznego. Fizyczny GT jest generowany w postaci mapy binarnej. Kod służący do generowania zestawu danych i trenowania modelu symulacyjnego jest dostępny¹⁰, a krok tworzenia tego symulowanego zestawu danych jest opisany w Rysunek 1.

Prezentujemy użyteczność segmentacji opartej na głębokim uczeniu, trenowanej całkowicie na symulowanym zestawie danych, analizując obrazy mikroskopii konfokalnej utrwalonych kardiomioblastów. Te kardiomioblasty wykazywały ekspresję markera fluorescencyjnego w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, co pozwalało na wizualizację mitochondriów na obrazach mikroskopii fluorescencyjnej. Przed przeprowadzeniem eksperymentu podanego tutaj jako przykład, komórki zostały pozbawione glukozy i przystosowane do galaktozy przez 7 dni w hodowli. Zastąpienie glukozy w pożywce wzrostowej galaktozą zmusza komórki w hodowli do stania się bardziej oksydacyjnymi, a tym samym zależnymi od ich mitochondriów w zakresie produkcji energii^11,12. Co więcej, sprawia to, że komórki są bardziej wrażliwe na uszkodzenia mitochondriów. Zmiany morfologii mitochondriów można eksperymentalnie indukować przez dodanie mitochondrialnego środka rozprzęgającego, takiego jak cyjanek karbonylu m-chlorofenylohydrazon (CCCP) do pożywki do hodowli komórkowych¹³. CCCP prowadzi do utraty potencjału błony mitochondrialnej (ΔΨm), a tym samym powoduje zmiany w morfologii mitochondriów z bardziej rurkowatej (pręcikowatej) na bardziej kulistą (kropkowatą)¹⁴. Ponadto mitochondria mają tendencję do pęcznienia podczas leczenia CCCP¹⁵. Pokazujemy rozkład morfologiczny zmian mitochondriów, gdy kardiomioblasty przystosowane do galaktozy były leczone mitochondrialnym rozprzęgaczem CCCP. Segmentacja mitochondriów w ramach głębokiego uczenia pozwoliła nam sklasyfikować je jako kropki, pręciki lub sieci. Następnie uzyskaliśmy wskaźniki ilościowe, aby ocenić długość gałęzi i obfitość różnych fenotypów mitochondrialnych. Etapy analizy są opisane w Rysunek 2, a szczegóły dotyczące hodowli komórek, obrazowania, tworzenia zestawów danych do segmentacji opartej na głębokim uczeniu, a także analizy ilościowej mitochondriów, są podane poniżej.

Protocol

UWAGA: Sekcje 1-4 można pominąć, jeśli pracujesz z istniejącymi obrazami mikroskopowymi mitochondriów ze znanymi warunkami eksperymentalnymi.

1. Hodowla komórkowa

1. Hoduj komórki H9c2 w DMEM bez glukozy uzupełnionej 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 10 mM galaktozy, 10% FBS, 1% streptomycyny / penicyliny i 1 μg / ml puromycyny. Pozwól komórkom przystosować się do galaktozy przez co najmniej 7 dni w hodowli przed eksperymentami.
   UWAGA: Zastosowane tutaj komórki H9c2 zostały genetycznie zmodyfikowane w celu ekspresji fluorescencyjnych mitochondriów, a także nabyły gen oporności na puromycynę. Dodatek tego antybiotyku zapewnia wzrost komórek z genem oporności, a co za tym idzie fluorescencyjnych mitochondriów.
2. Zasiaj komórki H9c2 do eksperymentu, gdy zbieg komórek osiągnie około 80% (kolba hodowlana T75, oceniana za pomocą mikroskopii jasnego pola). Podgrzej pożywkę i trypsynę do temperatury 37°C przez co najmniej 15 minut przed kontynuacją.
   UWAGA: Możliwe jest przeprowadzenie eksperymentu równolegle z dwoma lub więcej różnymi warunkami hodowli komórkowej. Zbieganie komórek H9c2 nie powinno przekraczać 80%, aby zapobiec utracie komórek mioblastycznych. Przy 100% zbiegu komórki tworzą miorurki i zaczynają się różnicować.
3. Przygotuj się do wysiewu komórek, działając w sterylnym okapie z przepływem laminarnym, umieszczając szklane szkiełko nakrywkowe #1,5 dla każdego warunku eksperymentalnego w studzience na 12-dołkowej płytce. Oznacz każdy warunek i szczegóły eksperymentu na płytce 12-dołkowej.
4. Przenieść kolbę do hodowli komórkowych z inkubatora na powierzchnię roboczą w okapie. Zassać pożywkę za pomocą systemu aspiracji lub pipety elektronicznej, a następnie przemyć dwukrotnie 5 ml PBS (temperatura pokojowa).
5. Przenieś wstępnie podgrzaną trypsynę na powierzchnię roboczą i odessaj końcowe płukanie PBS; następnie dodaj wstępnie podgrzaną trypsynę, aby odłączyć komórki (1 ml dla kolby hodowlanej T75). Umieścić kolbę hodowlaną z powrotem w inkubatorze na 2-3 minuty w temperaturze 37°C.
6. Przenieś wstępnie podgrzane podłoże na powierzchnię roboczą pod koniec inkubacji. Sprawdź, czy komórki odłączyły się za pomocą mikroskopu jasnego pola.
   1. Jeżeli wszystkie komórki nie zostały odłączone, należy kilkakrotnie ostrożnie, ale mocno stuknąć w bok kolby, aby odłączyć pozostałe komórki.
7. Umieść kolbę hodowlaną z powrotem na powierzchni roboczej. Dodać 4 ml pożywki do hodowli komórkowej do kolby hodowlanej za pomocą pipety elektronicznej, aby zatrzymać działanie trypsyny. Podczas dodawania pożywki hodowlanej do kolby, należy użyć pipety, aby kilkakrotnie rozproszyć pożywkę na powierzchni, aby odłączyć i zebrać komórki w zawiesinę komórek.
8. Odpipetować zawiesinę komórek (5 ml) z kolby do probówki o pojemności 15 ml.
9. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Otworzyć probówkę w kapturze, usunąć supernatant przez aspirację i delikatnie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki do hodowli komórkowych.
10. Oceń liczbę komórek, analizując niewielką objętość zawiesiny komórek w automatycznym liczniku komórek. Zwróć uwagę na liczbę żywych komórek na mililitr pożywki hodowlanej.
11. Przenieść żądaną objętość (np. 150 μl na studzienkę) zawiesiny komórek, obliczoną dla gęstości wysiewu około 2 x 10⁴ komórek/cm², do wstępnie oznakowanej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać wstępnie podgrzaną pożywkę do hodowli komórkowej do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml w objętości obliczonej wcześniej na podstawie liczby studzienek. W przypadku płytek 12-dołkowych należy użyć całkowitej objętości 1 ml na każdą studzienkę.
12. Upewnij się, że zawiesina rozcieńczonych komórek jest prawidłowo wymieszana, pipetując zawartość probówki wirówkowej kilka razy w górę i w dół przed dozowaniem odpowiedniej objętości do każdej studzienki. Po dozowaniu zawiesiny komórek do studzienki należy potrząsnąć płytką w dokładnie kontrolowany sposób w każdym kierunku, aby lepiej rozprowadzić komórki w studzienkach. Umieścić 12-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37°C do następnego dnia.
13. Sprawdź komórki za pomocą mikroskopu jasnego pola, aby ocenić wzrost. Jeśli komórki osiągnęły wystarczający wzrost do około 80% zbieżności, przejdź do kolejnych kroków; W przeciwnym razie powtarzaj ocenę codziennie, aż do osiągnięcia wystarczającego wzrostu.

2. Procedura eksperymentalna

1. Obliczyć ilości potrzebne do materiałów do doświadczenia zgodnie ze stężeniami roztworu podstawowego. Rozmrozić zamrożone materiały (30 mM roztwór podstawowy CCCP) w temperaturze 37 °C i wstępnie podgrzać pożywkę do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.
2. Po rozmrożeniu utworzyć roztwór roboczy 10 μM CCCP, rozcieńczając roztwór podstawowy (1:3 000) w pożywce do hodowli komórkowych.
   UWAGA: Nie pipetować objętości mniejszych niż 1 μl.
3. Zabiegi eksperymentalne należy rozpocząć po przygotowaniu i wstępnym podgrzaniu wszystkich niezbędnych materiałów. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z dołków płytki 12-dołkowej, a następnie szybko nanieść świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę do studzienek kontrolnych, a wstępnie podgrzaną pożywkę z 10 μM roztworem CCCP do studzienek do warunków badania.
4. Inkubować 12-dołkową płytkę w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37°C przez 2 godziny. W okresie inkubacji przygotuj roztwór utrwalający.
5. Do przygotowania roztworu utrwalającego należy użyć gotowego 4% paraformaldehydu (PFA) do rozcieńczenia 25% roztworu podstawowego aldehydu glutarowego (GA) do 0,2% (1:125). Ustaw roztwór na wstępne podgrzanie w temperaturze 37°C. W przypadku płytki 12-dołkowej wystarczy 500 μl na studzienkę.
   UWAGA: PFA i GA są toksycznymi chemikaliami. Pracuj w kapturze chemicznym ze sprzętem ochronnym. Aby uzyskać szczegółowe informacje, zapoznaj się z ich odpowiednimi kartami charakterystyki.
6. Po zakończeniu okresu inkubacji wyjmij 12-dołkową płytkę z inkubatora i umieść ją na powierzchni roboczej.
   UWAGA: Praca nie wymaga już sterylnego środowiska.
7. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych ze studzienek i nałożyć wstępnie podgrzany roztwór utrwalający. Włożyć 12-dołkową płytkę z powrotem do inkubatora w temperaturze 37°C na 20 minut.
8. Po zakończeniu inkubacji odessać roztwór utrwalający i dwukrotnie przemyć każdą studzienkę PBS o temperaturze pokojowej. Możliwe jest wstrzymanie eksperymentu na tym etapie protokołu i kontynuowanie go później.
   1. Jeśli eksperyment zostanie przerwany, dodać 1 ml PBS na studzienkę, zamknąć 12-dołkową płytkę folią z tworzywa sztucznego (parafilmem) i przechowywać w temperaturze 4°C.

3. Barwienie i montaż komórek na szkiełkach nakrywkowych

1. Rozmrozić bulion DAPI (plama jądrowa) i odwirować w mini wirówce przed otwarciem. Przygotuj roztwór barwiący DAPI, rozcieńczając materiał DAPI w PBS (1:1,000).
2. Odessać PBS z 12-dołkowej płytki i nanieść 1 ml roztworu barwiącego DAPI na każdą studzienkę. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
3. Zassać roztwór barwiący DAPI. Przemyć dwukrotnie 2 ml PBS na studzienkę.
4. Przygotuj szkiełka mikroskopowe z matowego szkła (szkiełka podstawowe), myjąc je w 70% etanolu, a następnie trzykrotnie myjąc w PBS. Ostrożnie osusz szkiełka za pomocą niestrzępiących się ręczników papierowych i skieruj je w stronę światła, aby sprawdzić, czy nie ma śladów kurzu lub tłuszczu.
   UWAGA: Na tym etapie wymagane są rękawice.
5. Oznacz szklane szkiełka szczegółami eksperymentalnymi. Przenieś medium mocujące do probówki mikrowirówki i odwiruj w mini wirówce.
6. Przygotuj się do montażu szkiełek nakrywkowych, aranżując przestrzeń roboczą. Miej pod ręką 12-dołkową płytkę z szkiełkami nakrywkowymi, oznakowanymi szkiełkami podstawowymi, podłożem montażowym, pipetą, końcówkami do pipet 10 μl, niestrzępiącymi się ręcznikami papierowymi i pęsetą.
7. Nanieść 10 μl podłoża mocującego (ProLong Glass) na przygotowane szkiełko podstawowe w celu zamontowania szkiełka nakrywkowego.
8. Za pomocą pęsety podnieś szkiełko nakrywkowe z płytki 12-dołkowej i zetrzyj wilgoć z szkiełka nakrywkowego, krótko dotykając krawędzi i tyłu szkiełka nakrywkowego do przygotowanego niestrzępiącego się ręcznika papierowego. Delikatnie opuść szkiełko nakrywkowe na kroplę podłoża montażowego.
9. Powtórz powyższe dwa kroki dla każdego szkiełka nakrywkowego. Umieść kropelki podłoża montażowego tak, aby na jedno szkiełko nakrywkowe przypadło od jednego do czterech szkiełek.
10. Upewnij się, że szkiełka podstawowe znajdują się na płaskiej powierzchni, aby uniknąć przesuwania się zamontowanych szkiełek nakrywkowych. Umieść szkiełka w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej na noc, aby umożliwić zastygnięcie nośnika montażowego. Próbki są teraz gotowe do obrazowania. Eksperyment może zostać wstrzymany na tym etapie protokołu i kontynuowany później.
11. Jeśli eksperyment zostanie wstrzymany na tym etapie, to po pozostawieniu próbek na noc do zastygnięcia w temperaturze pokojowej, przykryj je folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i przechowuj w temperaturze 4°C.

4. Mikroskopia i obrazowanie

1. Przykryj próbki folią aluminiową na czas transportu (jeśli jeszcze tego nie zrobiono).
2. Po przybyciu do zakładu mikroskopowego należy użyć podwójnie destylowanego_H2Oz bibułą filtracyjną mikroskopu, aby usunąć pozostałości PBS z szkiełek nakrywkowych na szkiełkach szklanych. Sprawdź, czy na szkiełkach nakrywkowych nie ma plam, trzymając szkiełka w kierunku jasnego światła.
3. Przejdź przez procedurę uruchamiania mikroskopu. Wybierz odpowiedni obiektyw (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27) i dodaj medium immersyjne.
4. Umieścić próbkę w uchwycie na próbkę. W oprogramowaniu mikroskopu użyj zakładki "Zlokalizuj", aby aktywować oświetlenie fluorescencyjne EGFP, a następnie za pomocą okularów ręcznie wyreguluj poziom z, aby uzyskać ostrość próbki. Wyłącz podświetlenie fluorescencyjne po znalezieniu ostrości.
5. Przełącz się na zakładkę "Acquire" (Pobieranie) w oprogramowaniu mikroskopu. Użyj "Smart Setup", aby wybrać kanały fluorescencji, które mają być używane do obrazowania. Do tego eksperymentu wybrano presety kanałów EGFP i DAPI.
6. Dostosuj intensywność każdego kanału od ustawień początkowych, używając histogramu intensywności jako przewodnika w celu zoptymalizowania siły sygnału. Można teraz rozpocząć obrazowanie.
7. W przypadku obrazowania należy skorzystać z opcji oprogramowania, aby umieścić pozycje obrazowania w tablicy i wyśrodkować matrycę na środku szkiełka nakrywkowego, uzyskując łącznie 12 pozycji do zobrazowania. Sprawdź, czy każda pozycja w tablicy zawiera komórki. Jeśli nie ma żadnych komórek, dostosuj położenie do obszaru z komórkami.
8. Dostosuj ostrość każdej pozycji w matrycy za pomocą autofokusa oprogramowania mikroskopu, a następnie dokonaj ręcznej precyzyjnej regulacji, aby upewnić się, że jak najwięcej mitochondriów jest ostrych.
   UWAGA: Kanał EGFP jest używany do tych ręcznych regulacji.
9. Za pomocą tej metody należy uzyskać obrazy dla każdego szkiełka nakrywkowego. Zapisz pliki obrazów i przejdź do etapów analizy morfologicznej.

5. Generowanie symulowanych danych treningowych

1. Pobierz code¹⁰ i rozpakuj zawartość. Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w README.md, aby skonfigurować wymagane środowisko.
2. Przejdź do folderu o nazwie "src", który jest folderem domowym dla tego projektu. Ponumerowane foldery w środku zawierają kody specyficzne dla różnych etapów korzystania z narzędzia.
   UWAGA: Użyj polecenia "cd <
3. Zrób kopię lub skorzystaj z folderu "2. Mitochondria Simulation Airy" i zmień jego nazwę (Airy jest tutaj używany, ponieważ jest to funkcja PSF najbliższa mikroskopowi konfokalnemu, który był używany jako obecny mikroskop). Przejdź do folderu o nazwie "simulator".
   UWAGA: Ten folder zawiera wszystkie pliki związane z symulacją danych treningowych. Istnieją trzy zestawy parametrów, które należy ustawić dla symulacji.
4. Po pierwsze, dla symulatora w pliku konfiguracyjnym partii "simulator/batch/bxx.csv", ustaw parametry dotyczące próbki, w tym liczbę mitochondriów, zakres średnic i długości struktur, zakres osi z, którą wykazuje struktura, oraz gęstość fluoroforów.
5. Następnie ustaw parametry związane z układem optycznym.
   1. Zestaw ten zawiera typ mikroskopu (który określa, który model PSF jest wybrany), aperturę numeryczną (NDA), powiększenie (M), rozmiar piksela (w μm), długość fali emisji fluoroforów, parametr szumu tła itp.
   2. Ustaw parametry optyczne N.A., powiększenie i minimalną długość fali zestawu danych w pliku "simulator/microscPSFmod.py".
   3. Ustaw żądaną wartość rozmiaru piksela i ustaw długość fali emisji zestawu danych jako parametr funkcji "process_matrix_all_z" w pliku "simulator/generate_batch_parallel.py".
   4. Ustaw trzy ostatnie parametry funkcji "save_physics_gt" w pliku "simulator/generate_batch_parallel.py". Parametry to rozmiar piksela (w nm), rozmiar obrazu wyjściowego i max_xy.
6. Ustaw trzeci zestaw parametrów dotyczących wyjściowego zestawu danych, takich jak rozmiar obrazów wyjściowych, liczba kafelków na każdym obrazie i łączna liczba obrazów w pliku "simulator/generate_batch_parallel.py".
7. Uruchom plik "simulator/generate_batch_parallel.py", aby rozpocząć symulację.
8. Aby uzyskać obraz o ostatecznym rozmiarze, utwórz kopię folderu o nazwie "5. Przygotowanie i szkolenie danych/przygotowanie danych" w folderze domowym i przejdź do niego.
   UWAGA: Każdy obraz syntetycznego zestawu danych jest tworzony przez utworzenie montażu czterech symulowanych obrazów o wymiarach 128 x 128 pikseli, co daje ostateczny rozmiar obrazu 256 x 256 pikseli. W ten sposób najpierw generowanych jest wiele pojedynczych kafelków (około 12 000) zarówno dla obrazów mikroskopowych (w folderze "output"), jak i segmentacji prawdy podstawowej (w folderze "output/physics_gt").
   1. Ustaw parametry numeru partii, liczbę obrazów na partię i zakres szumu w "data_generator.py".
   2. Uruchom plik "data_generator.py", aby utworzyć obrazy montażowe.
   3. Skopiuj foldery o nazwach "obraz" i "segment" do folderu "5. Data Preparation and Training/datatrain/train" z folderu "5. Przygotowanie i szkolenie danych/przygotowanie danych/dane".

6. Segmentacja oparta na głębokim uczeniu

1. Trenowanie modelu segmentacji na symulowanych obrazach w następujący sposób:
   1. Aby wytrenować model segmentacji dla nowego mikroskopu, przejdź do "5. Data Preparation and Training/train" i ustaw parametry wielkości partii, model szkieletowy dla segmentacji, liczbę epok oraz szybkość uczenia się dla trenowania w pliku "train_UNet.py".
   2. Uruchom "train_UNet.py", aby rozpocząć trening. W procesie trenowania jest wyświetlana metryka dotycząca wydajności segmentacji w symulowanym zestawie walidacji.
      UWAGA: Po zakończeniu trenowania model jest zapisywany jako "best_model.h5" w polu "5. Przygotowanie danych i szkolenie/szkolenie".
2. Przetestuj model na rzeczywistych obrazach mikroskopowych, które są podzielone na rozmiar pożądany dla wytrenowanego modelu, wykonując następujące kroki.
   1. Przejdź do "6. Przygotuj dane testowe" i skopiuj plik ". png" w formacie danych do folderu "PNG".
   2. Uruchom plik "split_1024_256.py", aby podzielić obrazy do rozmiaru, który jest pożądany dla wytrenowanego modelu. Spowoduje to utworzenie kadrów obrazów o wymiarach 256 x 256 pikseli w folderze "data".
   3. Skopiuj utworzony folder "dane" do folderu "7. Test Segmentation".
   4. Przejdź do folderu "7. Segmentacja testowa" i ustaw nazwę zapisanego modelu, który ma być używany.
   5. Aby podzielić uprawy na segmenty, uruchom plik "segment.py". Podzielone na segmenty obrazy są zapisywane w folderze "wyjściowym".

7. Analiza morfologiczna: Analiza morfologii mitochondriów dwóch grup danych, "Glukoza" i "CCCP"

1. Uporządkuj dane do analizy (jeden folder dla każdego obrazu, przy czym każdy folder zawiera podzielone na segmenty kadry wyjściowe jednego obrazu).
2. Pobierz i umieść plik uzupełniający o nazwie "make_montage.py" w folderze o nazwie "7. Segmentacja testów".
3. Uruchom plik "make_montage.py", aby zszyć podzielony na segmenty wynik z powrotem do oryginalnego rozmiaru obrazu.
4. Utwórz nowy folder o nazwie "9. Analiza morfologiczna" w folderze "src".
5. Zainstaluj pakiety Skan¹⁶ i Seaborn Python w środowisku za pomocą polecenia "install seaborn[stats] skan".
   UWAGA: Maski segmentacji są szkieletowane przy użyciu biblioteki o nazwie Skan, aby umożliwić analizę topologii każdego pojedynczego mitochondrium.
6. Umieść plik uzupełniający "analyze_mitochondria.py" w folderze "9. Analiza morfologiczna".
7. Ułóż obrazy różnych grup eksperymentu w różnych folderach w folderze "7. Segmentacja testów".
8. Ustaw parametry "rozmiar piksela" i "ścieżkę wejściową" w pliku "analyze_mitochondria.py".
9. Uruchom plik "analyze_mitochondria.py", aby uruchomić kod w celu szkieletyzacji i utworzenia wykresów analizy.

Results

Wyniki segmentacji mitochondriów metodą głębokiego uczenia w obrazach konfokalnych stałych kardiomioblastów wyrażających fluorescencyjne markery mitochondriów pokazują użyteczność tej metody. Metoda ta jest kompatybilna z innymi typami komórek i systemami mikroskopowymi, wymaga jedynie ponownego szkolenia.

Kardiomioblasty H9c2 przystosowane do galaktozy z fluorescencyjnymi mitochondriami były leczone CCCP lub bez niego przez 2 godziny. Komórki zostały następnie utrwalone, wybarwione barwnikiem jądrowym i zamontowane na szklanych szkiełkach do analizy mikroskopii fluorescencyjnej. Mikroskop konfokalny wykorzystano do uzyskania obrazów zarówno komórek kontrolnych, jak i komórek poddanych działaniu CCCP. Przeprowadziliśmy naszą analizę na 12 obrazach konfokalnych, z około 60 komórkami na stan. Następnie określono stan morfologiczny mitochondriów na każdym obrazie i określono go ilościowo. Maski segmentacji uzyskane z wytrenowanego modelu zostały zeszkieletowane, aby umożliwić analizę topologii każdego pojedynczego mitochondrium w tym eksperymencie. Jako parametr klasyfikacji wykorzystano długość gałęzi poszczególnych mitochondriów. Poszczególne mitochondria zostały sklasyfikowane w klasach morfologicznych według następującej reguły. W szczególności każdy szkielet mitochondrialny o długości mniejszej niż 1500 nm był uważany za kropkę, a dłuższe mitochondria były dalej klasyfikowane jako sieć lub pręt. Jeśli istniało co najmniej jedno skrzyżowanie, na którym przecinały się dwie lub więcej odgałęzień, definiowano je jako sieć; W przeciwnym razie mitochondrium zostało sklasyfikowane jako pręcik. Przykładowy obraz ze szkieletami mitochondrialnymi oznaczonymi klasami morfologii jest pokazany na Rysunek 3.

Kategoryzacja morfologii mitochondriów w Rysunek 4A pokazuje, że możliwe jest wykrycie znaczących zmian, gdy CCCP jest stosowany przez 2 godziny; jest to najbardziej wyraźnie pokazane przez wzrost kropek dla komórek traktowanych CCCP.

Średnia długość gałęzi w Rysunek 4B to kolejna droga do zilustrowania wykrywalnych i znaczących zmian w morfologii. Zarówno pręciki, jak i sieci były, zgodnie z oczekiwaniami, znacznie zmniejszone w stosunku do kontroli, gdy komórki były traktowane CCCP. Spodziewano się również znacznego wzrostu średniej długości gałęzi kropek, biorąc pod uwagę obrzęk, któremu ulegają mitochondria pod wpływem CCCP.

Rysunek 1: Potok do symulacji obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej. Potok obejmuje (i) generowanie geometrii 3D, (ii) emitery i emulację fotokinetyki, (iii) konwolucję 3D PSF, (iv) dodawanie szumów oraz (v) binaryzację. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Etapy analizy morfologii mitochondriów opartej na uczeniu maszynowym. (1) Obrazy, które mają być podzielone na segmenty, są najpierw przycinane do rozmiarów akceptowalnych dla modelu segmentacji. (2) Segmentacja oparta na głębokim uczeniu jest stosowana do kadrowania obrazu. (3) Segmentowane uprawy wyjściowe są zszywane z powrotem do ich pierwotnego rozmiaru. (4) Zmontowane segmentacje są szkieletowane. (6) Analizę morfologiczną przeprowadza się w oparciu o topologię ze szkieletów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Szkielet mitochondrialny nałożony na wynik segmentacji obrazów mikroskopowych. (A) Wynik segmentacji. (B) Szkielet w linii prostej (odległość euklidesowa między punktem początkowym i końcowym gałęzi) jest nakładany na dane wyjściowe segmentacji. Kodowanie kolorami szkieletu przedstawia klasę mitochondriów. Sieci są czerwone, pręty są zielone, a kropki są koloru fioletowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Analiza morfologii mitochondriów. (A) Przegląd względnego procentu różnych kategorii morfologicznych w oparciu o całkowitą długość mitochondriów. (B) Porównanie średniej długości gałęzi mitochondrialnej między warunkami doświadczalnymi i między kategoriami morfologicznymi. Oś x wyświetla kategoryzacje morfologiczne, a oś y wyświetla średnią długość gałęzi mitochondriów w nanometrach (nm). Istotność statystyczna w postaci wartości p jest pokazana jako * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 i **** p < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Niepowodzenie segmentacji. Duże zagęszczenie mitochondriów jest trudnym scenariuszem dla modelu segmentacji. Kolorowy szkielet pokazuje najdłuższe pojedyncze mitochondria wykryte na obrazie. Przechodząc przez pomiary długości, scenariusze te mogą być wykrywane i opracowywane w celu poprawy wyników segmentacji za pomocą operatora morfologicznego erode (wyszczupla wykryty szkielet). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Pliki uzupełniające.Kliknij tutaj, aby pobrać pliki.

Discussion

Środki ostrożności związane z krytycznymi krokami w protokole omawiamy w akapitach dotyczących "generowania geometrii" i "parametrów symulatora". Akapit zatytułowany "uczenie transferowe" omawia modyfikacje w celu zwiększenia przepustowości podczas adaptacji do wielu mikroskopów. Ustępy dotyczące "analizy cząstek" i "generowania innych struktur subkomórkowych" odnoszą się do przyszłych zastosowań tej metody. Akapit o "różnicy w stosunku do prawdy biologicznej" omawia różne powody, dla których symulacje mogą różnić się od rzeczywistych danych i czy te powody mają wpływ na naszą aplikację. Na koniec omawiamy trudny scenariusz dla naszej metody w akapicie "gęsto upakowane struktury".

Generowanie geometrii
Aby wygenerować geometrię 3D mitochondriów, prosta struktura 2D utworzona z krzywych b-splajn jako szkieletów dobrze sprawdza się w tworzeniu syntetycznego zestawu danych. Te syntetyczne kształty ściśle naśladują kształty mitochondriów obserwowane w hodowlach komórkowych 2D. Jednak w przypadku tkanek 3D, takich jak tkanka serca, kształt i układ mitochondriów są zupełnie inne. W takich przypadkach wydajność modelu segmentacji może ulec poprawie dzięki dodaniu kierunkowości w symulowanych obrazach.

Parametry symulatora
Należy zachować ostrożność podczas ustawiania parametrów symulatora, aby upewnić się, że są one zgodne z parametrami danych, na podstawie których ma być uruchamiane wnioskowanie, ponieważ niewykonanie tej czynności może prowadzić do niższej wydajności segmentacji. Jednym z takich parametrów jest zakres stosunku sygnału do szumu (SNR). Zakres SNR danych, które mają być badane, powinien być zgodny z wartościami symulowanego zbioru danych. Ponadto zastosowane poliestrowe włókna odcinkowe powinny być zgodne z docelowymi danymi testowymi. Na przykład, obrazy wytrenowane na modelu z konfokalnego PSF nie powinny być używane do testowania obrazów z mikroskopu epifluorescencyjnego. Kolejnym parametrem, na który należy zwrócić uwagę, jest zastosowanie dodatkowego powiększenia w danych testowych. Jeżeli w danych testowych zastosowano dodatkowe powiększenie, symulator również powinien być odpowiednio ustawiony.

Transfer wiedzy
Uczenie transferowe to zjawisko polegające na wykorzystaniu wyuczonego modelu wytrenowanego na jednym zadaniu do wykorzystania w innym zadaniu. Zjawisko to ma również zastosowanie do naszego problemu w odniesieniu do różnych typów danych mikroskopowych. Wagi modelu segmentacji (dostarczonego z kodem źródłowym), który jest trenowany na jednym typie danych mikroskopowych, mogą być użyte do zainicjowania modelu segmentacji, który ma być używany na innym rodzaju danych mikroskopu optycznego. Dzięki temu możemy trenować na znacznie mniejszym podzbiorze zbioru danych treningowych (3 000 obrazów w porównaniu do 10 000), zmniejszając w ten sposób koszty obliczeniowe symulacji.

Analiza cząstek
Analiza cząstek może być również przeprowadzana na maskach podzielonych na segmenty. Może to dostarczyć informacji na temat obszaru i krzywizny itp. poszczególnych mitochondriów. Informacje te mogą również służyć jako wskaźniki do ilościowego porównania mitochondriów (niewykorzystane w tym eksperymencie). Na przykład obecnie definiujemy morfologię kropki za pomocą progu opartego na długości mitochondriów. W niektórych przypadkach przydatne może być włączenie eliptyczności, aby lepiej oddzielić małe mitochondria przypominające pręciki od mitochondriów puncta lub mitochondriów przypominających kropki. Alternatywnie, jeśli pewne warunki biologiczne powodują zwijanie się mitochondriów, kwantyfikacja krzywizny może być interesująca w celu analizy populacji mitochondriów.

Generowanie innych struktur subkomórkowych
Wykazano opartą na fizyce segmentację struktur subkomórkowych dla mitochondriów i pęcherzyków¹. Chociaż pęcherzyki mają różne kształty, ich rozmiary są mniejsze i wyglądają jak proste kule, gdy są obserwowane przez mikroskop fluorescencyjny. W związku z tym geometria pęcherzyków jest symulowana za pomocą kulistych struktur o odpowiednim zakresie średnic. Oznacza to zmianę funkcji, która generuje geometrię (cylindry w przypadku mitochondriów i kule w przypadku pęcherzyków) struktur i odpowiednich parametrów (krok 5.4 w sekcji protokołu). Geometrycznie retikulum endoplazmatyczne i mikrotubule zostały również zasymulowane jako struktury rurkowe¹⁷. Modelowanie retikulum endoplazmatycznego o średnicy 150 nm i mikrotubul o średniej średnicy zewnętrznej 25 nm oraz wewnętrznej pustej rurki o średnicy 15 nm zapewnia przybliżenia kształtów tych struktur. Innym parametrem, który będzie się różnił dla każdej z tych struktur subkomórkowych, jest gęstość fluoroforu. Oblicza się to na podstawie rozkładu biocząsteczki, z którą wiążą się fluorofory, oraz prawdopodobieństwa wiązania.

Różnica w stosunku do prawdy o podstawach biologicznych
Symulowane dane używane do trenowania nadzorowanego przez symulację modelu uczenia głębokiego różnią się od danych rzeczywistych pod wieloma względami. (i) Brak niespecyficznego oznakowania w symulowanych danych różni się od danych rzeczywistych, ponieważ w rzeczywistych danych często występują swobodnie unoszące się fluorofory. Powoduje to wyższą średnią wartość tła na rzeczywistym obrazie. Różnica ta jest łagodzona przez dopasowanie sygnału do szumu (SNR) i ustawienie wartości tła w taki sposób, aby odpowiadała obserwowanym wartościom rzeczywistym. (ii) Ruch struktur subkomórkowych i fotokinetyka są dwoma źródłami dynamiki systemu. Poruszające się struktury w aktywnych komórkach (które poruszają się w zakresie kilku milisekund) powodują rozmycie ruchu. Czas naświetlania jest skracany podczas pozyskiwania rzeczywistych danych, aby uniknąć efektu rozmycia. Z drugiej strony nie symulujemy timelapse i nie zakładamy nieruchomych konstrukcji; To założenie jest słuszne, gdy czas ekspozycji w rzeczywistych danych jest krótki. Jednak to założenie może spowodować błąd w danych wyjściowych, jeśli czas ekspozycji rzeczywistych danych jest wystarczająco duży, aby wprowadzić rozmycie ruchu. Z drugiej strony fotokinetyka jest rzędu nanosekund do mikrosekund i można ją pominąć w symulacji, ponieważ zwykłe czasy ekspozycji eksperymentów są wystarczająco długie (rzędu milisekund), aby uśrednić efekty fotokinetyki. (iii) Szum na obrazach mikroskopowych ma różne źródła, a źródła te mają różne funkcje gęstości prawdopodobieństwa. Zamiast modelować te indywidualne źródła szumu, przybliżamy go jako szum Gaussa na stałym tle. Różnica ta nie wpływa istotnie na rozkład danych w warunkach niskiego stosunku sygnału do tła (w zakresie 2-4) oraz gdy mamy do czynienia z makrogęstością fluoroforów¹. (iv) Artefakty w obrazowaniu mogą powstawać w wyniku aberracji, dryfu i systematycznych rozmyć. Zakładamy, że mikroskop jest dobrze wyrównany, a obszary wybrane do analizy w rzeczywistych danych są pozbawione tych artefaktów. Istnieje również możliwość modelowania niektórych z tych artefaktów w PSF 18,19,20.

Gęsto upakowane struktury
Trudności związane z niemożnością odróżnienia nakładających się prętów od sieci są stałym problemem w segmentacji danych mikroskopowych 2D. Niezwykle trudny scenariusz przedstawiono na rysunku 5, gdzie mitochondria są gęsto upakowane, co prowadzi do nieoptymalnych wyników w modelu segmentacji i następującej po nim analizie. Pomimo tego wyzwania, użycie operatorów morfologicznych w takich sytuacjach w celu odchudlenia szkieletyzacji może pomóc w przerwaniu tych nadmiernie połączonych sieci, jednocześnie umożliwiając wykrycie znaczących zmian we wszystkich kategoriach morfologii mitochondriów. Ponadto użycie mikroskopu konfokalnego, a nie szerokokątnego do obrazowania, jest jedną z metod częściowego złagodzenia tego problemu poprzez wyeliminowanie nieostrego światła. Co więcej, w przyszłości przydatne byłoby przeprowadzenie segmentacji 3D w celu odróżnienia mitochondriów, które przecinają się (tj. fizycznie tworzą sieć) od mitochondriów pręcikowatych, których projekcje w jednej płaszczyźnie nakładają się na siebie.

Segmentacja oparta na głębokim uczeniu jest obiecującym narzędziem, które oferuje rozszerzenie możliwości analitycznych użytkowników mikroskopii, otwierając w ten sposób możliwość zautomatyzowanej analizy złożonych danych i dużych zbiorów danych ilościowych, co wcześniej byłoby niemożliwe do opanowania.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-dołkowa płytka	FALCON	353043
Wodny aldehyd glutarowy EM Grade 25%	Mikroskopia elektronowa Sciences	16200
Axio Vert.A1	Mikroskop Zeiss		Brightfield
CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
Komputer	nie	dotyczy dotyczy	Musi być uruchomiony system operacyjny Linux/Windows z procesorem graficznym NVIDIA z co najmniej 4 GB pamięci
Szkiełka nakrywkowe	VWR	631-0150
DAPI (plama)	Sigma-Aldrich	D9542
DMEM	gibco	11966-025
Surowica bydlęca	płodu Sigma-Aldrich	F7524
Szkiełka podstawowe (matowa krawędź)	epredia	AA00000112E01MNZ10
H9c2 mCherry-EGFP-OMP25			Własna stabilna linia komórkowa pochodząca z zakupionej linii komórkowej
Inkubator	Thermo Fisher Scientific	51033557
LSM 800	Mikroskop konfokalny	Zeiss Media montażowe
(szkło)	Thermo Fisher Scientific	P36980
Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBS	Thermo Fisher Scientific	J19943-K2
Plan-apochromatyczny obiektyw olejowy 63x (M27) o współczynniku NA 1,4	Zeiss	420782-9900-000
Sterylny kaptur z przepływem laminarnym	Labogene		SCANLAF MARS
Trypsyna	Sigma-Aldrich	T4049
System aspiracji	Vacusafe VACUUBRAND	20727400
ZEN 2.6	Zeiss