$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
W ciągu ostatniej dekady nastąpił gwałtowny wzrost zainteresowania zastosowaniem koherentnej mikroskopii Ramanowskiej (CRM) do obrazowania komórek i tkanek 1,2. CRM to potężna technika obrazowania chemicznego z dwoma popularnymi wariantami: koherentną mikroskopią anty-Stokesa rozpraszania Ramana (CARS) i mikroskopią wymuszonego rozpraszania Ramana (SRS). SRS jest coraz bardziej popularny w porównaniu z CARS, ponieważ jest mniej podatny na nieramanowskie zakłócenia tła i ma liniową zależność od stężenia3. CRM pozyskuje informacje o drganiach molekularnych podobnie jak spektroskopia Ramana, ale oferuje znacznie lepszą szybkość akwizycji4. Osiąga się to poprzez koherentne wzbudzenie wibracyjne za pomocą pary laserów impulsowych o wysokiej intensywności szczytowej. Ponieważ CRM zapewnia przestrzennie rozdzielcze mapowanie chemiczne w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej, znalazł ważne zastosowania w diagnostyce raka, metabolizmie lipidów, metabolizmie komórkowym, transporcie leków i wielu innych 5,6,7,8. Jednak jednym z głównych wąskich gardeł, które utrudniają powszechne przyjęcie tej techniki, jest jej złożoność techniczna i brak ustandaryzowanych protokołów. Chociaż komercyjne lasery i mikroskopy są już dostępne, prawie wszystkie systemy, które są obecnie używane w tej dziedzinie, obejmują różne poziomy dostosowania laserów, optyki, mikroskopów i detektorów, co stanowi istotną barierę dla naukowców zainteresowanych wejściem w tę dziedzinę lub przyjęciem tej technologii. Brak dostępu dodatkowo utrudnia zastosowania biologiczne. Celem tego zbioru metod jest dostarczenie szczegółowych przykładów i wskazówek dotyczących oprzyrządowania, nowych podejść do obrazowania oraz zastosowań obrazowania komórek lub tkanek in vitro/in vivo. Dołączyliśmy siedem publikacji ekspertów w tej dziedzinie, które są tutaj podsumowane.
Clark i wsp. przedstawiają porównanie hiperspektralnych SRS i CARS pod względem czułości, rozdzielczości przestrzennej i rozdzielczości spektralnej9. Obie techniki są realizowane za pomocą ogniskowania spektralnego laserów femtosekundowych, powszechnie stosowanego podejścia, które wykorzystuje widmowo ćwierkane szerokopasmowe lasery femtosekundowe w celu uzyskania wąskopasmowej rozdzielczości Ramana. Bezpośrednie porównanie pozwala na ocenę różnic w wykrywaniu i optymalny wybór modalności dla różnych zastosowań obrazowania chemicznego.
De la Cadena i in. publikują nową metodę multipleksowego SRS, która może szybko pozyskiwać szerokopasmowe obrazy SRS10. Technika ta opiera się na niestandardowej różnicowej detekcji wielokanałowego wzmacniacza typu lock-in, która pozwala na wykrywanie do 32 kanałów jednocześnie. Ponadto przedstawiono szczegółową charakterystykę szumów oraz zademonstrowano zrównoważoną metodę wykrywania w celu wyeliminowania szumów laserowych. Protokół ten stanowi praktyczne wskazówki dla użytkowników zainteresowanych budową multipleksowych systemów SRS.
Shi i wsp. demonstrują zastosowanie wysoce multipleksowanych barwników Ramana w obrazowaniu SRS11. Dzięki wzmocnieniu przed rezonansem wykazali, że SRS może zapewnić czułość porównywalną ze standardową immunofluorescencją. Metoda ta omija granicę spektralnie rozwiązywalnych kanałów w konwencjonalnej immunofluorescencji i umożliwia monitorowanie wielu białek jednocześnie i badanie ich interakcji. Szczegółowe wskazówki dotyczące przetwarzania próbek i barwienia barwnikiem Ramana ułatwiają przyjęcie tej potężnej metody.
Miao i wsp. prezentują obrazowanie wibracyjne pęczniejącej tkanki i analizę (VISTA), technikę obrazowania o wysokiej rozdzielczości, która łączy SRS z mikroskopią ekspandacyjną12. VISTA omija przeszkody związane z obrazowaniem fluorescencyjnym i osiąga bezznacznikowe obrazowanie wolumetryczne w superrozdzielczości w próbkach biologicznych o rozdzielczości przestrzennej do 78 nm. Następnie wykorzystują algorytm głębokiego uczenia się, aby osiągnąć segmentację wieloskładnikową, w tym agregaty białkowe w komórkach i tkankach mózgowych.
Espinoza i wsp. prezentują zastosowanie dwukolorowego obrazowania SRS białek i lipidów w czasie rzeczywistym do zastosowań w diagnostyce tkanek13. Dwukolorowe obrazowanie SRS może generować obrazy równoważne H&E do zastosowań patologicznych. Protokół ten opisuje szczegóły implementacji techniki modulacji ortogonalnej i ogniskowania spektralnego dla jednoczesnego dwukolorowego obrazowania SRS. Konwersja dwukolorowych obrazów SRS na obrazy pseudo-H&E jest również demonstrowana na tkance mózgowej myszy w celu zilustrowania zastosowań diagnostyki tkanek.
Yuan i wsp. publikują elastyczny system komór do długoterminowego obrazowania SRS żywych komórek14. Większość istniejących komór obserwacyjnych żywych komórek jest zaprojektowana do obrazowania w jasnym polu i obrazowania fluorescencyjnego. Są one niekompatybilne z detekcją SRS ze względu na wymóg wysokiej soczewki NA i kondensatora. Autorzy demonstrują 24-godzinne obrazowanie poklatkowe SRS za pomocą elastycznej komory, która utrzymywała stałą temperaturę, CO2 i wilgotność.
Wreszcie, Wu i in. demonstrują jednoczesną fluorescencję dwufotonową in vivo (TPEF) i obrazowanie SRS15. Dwa oddzielne systemy laserowe są połączone w celu uzyskania optymalnej czułości dla obu modalności obrazowania w celu dostarczenia uzupełniających się informacji. In vivo (in vivo) Obrazowanie tkanek metodą SRS wiąże się z wyjątkowymi wyzwaniami ze względu na konieczność detekcji epi zdepolaryzowanego, wstecznie rozproszonego światła. W protokole omówiono szczegóły optymalnej konfiguracji mikroskopu TPEF-SRS oraz sposób jego wykorzystania do obrazowania in vivo rdzenia kręgowego myszy.
Ten zbiór publikacji reprezentuje aktualny stan wiedzy w zakresie oprzyrządowania CRM i postępu technicznego. Badacze zainteresowani zarówno rozwojem metod, jak i zastosowaniami uznają ten zbiór za przydatny do porównywania konfiguracji i ustalania punktów odniesienia (czułość, rozdzielczość itp.) do konstruowania lub optymalizacji własnych systemów. Wytyczne i najlepsze praktyki zawarte w tych protokołach będą stanowić podstawę dla istniejących i przyszłych zastosowań in vitro i in vivo . Wdrożenie technologii CRM na dużą skalę wciąż czeka na kluczowe i innowacyjne zastosowania oraz komercjalizację kompletnych rozwiązań CRM. Niemniej jednak standaryzacja podejść do obrazowania i testów porównawczych jest niezbędna do zapewnienia odtwarzalności i niezawodności oraz ułatwienia szerszego wdrożenia CRM16.
Dziedzina CRM rozwija się w szybkim tempie. Postęp techniczny przesuwający granice czułości, swoistości i rozdzielczości nadal wprowadza technologię na nowe terytoria. Na przykład rozdzielczość przestrzenna SRS zaczyna przekraczać granicę dyfrakcji17,18. Czułość elektronicznego rezonansu pre-rezonansowego SRS zbliża się obecnie do czułości fluorescencji19. W porównaniu z fluorescencją, CRM ma wyraźne zalety. Na przykład zastosowanie śledzenia deuteru umożliwiło po raz pierwszy badanie in vivo dynamiki metabolicznej małych cząsteczek w rozdzielczości subkomórkowej20. Dzięki małym znacznikom możliwe jest wykonanie wysoce multipleksowanej detekcji ramanowskiej 24 lub więcej oznaczonych celów21. Postępy w dziedzinie sztucznej inteligencji otwierają nowe możliwości dla CRM poprzez wykorzystanie jego wysokiej zawartości informacji i cech specyficznych dla molekularnych do segmentacji i klasyfikowania obiektów z subtelnymi różnicami cech przestrzennych i spektralnych22. Łącznie te postępy techniczne w CRM mogą przyspieszyć i poszerzyć zastosowania zarówno w obrazowaniu biologicznym, jak i biomedycznym.