Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar kinetyki tkanki tłuszczowej in vivo u ludzi przy użyciu metody znakowania deuterem (2H)

718 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64883

⸱

21 lipca 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, 2University of California at Berkeley

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół do pomiaru kinetyki tkanki tłuszczowej in vivo u ludzi przy użyciu metody znakowania deuterem (2H).

Streszczenie

Biała tkanka tłuszczowa to wysoce plastyczny organ, który jest niezbędny do utrzymania homeostazy energetycznej całego ciała. Masa tkanki tłuszczowej oraz zmiany w masie lub rozmieszczeniu tkanki tłuszczowej są regulowane przez zmiany w syntezie i rozkładzie (tj. obrocie) komórek tłuszczowych i triacylogliceroli. Dowody sugerują, że sposób i wielkość podskórnej ekspansji tkanki tłuszczowej (tj. hipertrofia vs. hiperplazja) i obrotu mogą wpływać na zdrowie metaboliczne, ponieważ adipogeneza jest zaangażowana w patogenezę otyłości i chorób pokrewnych. Pomimo potencjalnej roli obrotu tkanki tłuszczowej w zdrowiu człowieka, brakuje wiedzy na temat kinetyki komórek tłuszczowych in vivo. Wynika to częściowo z powolnego tempa wymiany komórek w tkance tłuszczowej i praktycznej złożoności bezpośredniego znakowania ich metabolicznych prekursorów in vivo. W niniejszym artykule opisano metody pomiaru kinetyki tkanki tłuszczowej in vivo i szybkości obrotu u ludzi poprzez spożywanie wody znakowanej deuterem (2H). Włączenie 2H do ugrupowań dezoksyrybonukleotydowych DNA w preadipocytach i adipocytach zapewnia dokładny pomiar powstawania i śmierci komórek (obrotu tkanki tłuszczowej). Ogólnie rzecz biorąc, jest to innowacyjne podejście do pomiaru kinetyki tkanki tłuszczowej in vivo i stanowi istotne odejście od innych ocen in vitro.

Wprowadzenie

Otyłość jest chorobą charakteryzującą się nadmiarem białej tkanki tłuszczowej (AT) i stanowi istotny czynnik ryzyka rozwoju cukrzycy typu II i chorób sercowo-naczyniowych1. Biały AT jest wysoce plastycznym organem, który magazynuje energię w postaci triacylogliceroli (TG) i jest niezbędny do homeostazy metabolicznej2. Biały AT zachowuje zdolność do rozszerzania, zmniejszania i przebudowy w wieku dorosłym3, a masa AT jest określana przez dynamiczne zmiany objętości adipocytów (poprzez syntezę i rozpad TG), ciągłe tworzenie adipocytów poprzez proliferację i różnicowanie preadipocytów (tj. hiperplazja lub adipogeneza) oraz śmierć komórek tłuszczowych4.

Dowody sugerują, że istnieje ważny związek między podskórnym obrotem AT (np. powstawaniem i śmiercią adipocytów) a zdrowiem kardiometabolicznym5,6,7,8, a rola adipogenezy w patogenezie zaburzeń związanych z otyłością pozostaje dyskusyjna4. Jednak niewiele wiadomo na temat obrotu AT in vivo u ludzi, częściowo ze względu na powolne tempo obrotu komórkowych składników AT i złożoność bezpośredniego znakowania ich metabolicznych prekursorów in vivo. Chociaż metody in vitro dostarczyły pewnych informacji, podejścia te nie zapewniają kompleksowej oceny in vivo w naturalnym środowisku AT.

Metoda została opracowana przez laboratorium Hellerstein9 do oceny in vivo obrotu AT przy użyciu wprowadzenia stabilnego izotopu deuteru (2H) z ciężkiej wody (2H2 O) do AT (Rysunek 1)10. Protokół, który został zwalidowany na myszach i ludziach, obejmuje początkowy wzrost 2H2O w celu zwiększenia 2 H wzbogacenia wody w organizmie, a następnie odpowiednie dzienne spożycie w celu utrzymania stabilnych, bliskich plateau wartości wzbogacenia. 2H z 2H2O (tj. ciężkiej wody) jest włączane do ugrupowania dezoksyrybozy (dR) dezoksyrybonukleotydów w DNA komórek tłuszczowych, a wzbogacenie izotopów mierzy się w DNA za pomocą spektrometrii mas i zastosowania analizy rozkładu izotopów masowych (MIDA)9,10,11. Znakowanie ugrupowania dezoksyrybozy deoksyrybonukleotydów purynowych w DNA za pomocą stabilnych prekursorów izotopowych ma kilka zalet w porównaniu z poprzednimi metodami, takimi jak te, które obejmowały znakowanie grupami zasad nukleotydów pirymidynowych (np. z 3H-tymidyny lub bromo-deoksyurydyny). Warto zauważyć, że endogenne ponowne włączenie zasad, zwłaszcza pirymidyn, ale nie dR, w replikacji DNA wcześniej zakłóciło interpretację inkorporacji etykiety12. Ponadto włączenie znacznika stabilnego izotopu do dR nie powoduje genotoksyczności, w przeciwieństwie do włączenia czynników radioaktywnych lub genotoksycznych, takich jak 3H (tryt) lub bromo-deoksyurydyna. Dlatego długotrwałe stosowanie tej techniki na modelach zwierzęcych i ludziach jest bezpieczne.

Pomiar syntezy DNAznakowanego 2 znakami H oznacza przejście komórki przez fazę S podziału komórki i identyfikuje nowo powstałe preadipocyty i adipocyty (poprzez różnicowanie pre-adipocytów) lub adipogenezę13. Komórki, które ulegają szybkiej przemianie (np. monocyty), szybko zastępują swoje DNA i osiągają plateau we wzbogaceniu 2H, zapewniając w ten sposób wewnętrzne odniesienie dla testu. Stosunek wzbogacenia 2H DNA z komórek tłuszczowych do monocytów (komórek referencyjnych) lub pomiar 2H2O w zintegrowanym organizmie pozwala na obliczenie frakcji nowo zsyntetyzowanych komórek tłuszczowych. W niniejszym protokole opisano metody pomiaru szybkości wymiany komórek tłuszczowych (adipogenezy) in vivo u ludzi za pomocą protokołu znakowania metabolicznego 2H, w tym udoskonalone techniki oczyszczania adipocytów poprzez negatywną selekcję immunologiczną i wzbogacanie populacji preadipocytów14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Institutional Review Board (IRB) Pennington Biomedical Research Center zatwierdziła wszystkie procedury (#10039-PBRC), a wszyscy ludzie wyrazili pisemną świadomą zgodę.

1. Osiem tygodni 2H2Okres etykietowania O

  1. Podawać podwielokrotności 70% lub 99,9% wody znakowanej deuterem (2H2O) w sterylnych plastikowych pojemnikach.
  2. Poinstruuj uczestników, aby pili 35 ml dawek 99,9% wzbogaconych 2H2O lub 40 ml dawek 70% wzbogaconych 2H2O trzy razy dziennie w tygodniu 1 (okres wstępny) i pili dwie dawki odpowiednio 35 ml lub 50 ml dziennie w tygodniach 2-8,
    UWAGA: Przemijające zawroty głowy lub zawroty głowy są jedynymi znanymi działaniami niepożądanymi związanymi z przyjmowaniem 2H2O i są związane z szybkimi zmianami w przepływie wody, które są odbierane przez mieszki włosowe ucha wewnętrznego. Dlatego poinstruuj uczestników, aby przyjmowali dawki w odstępie co najmniej ~2 godzin, aby uniknąć rzadkiego wystąpienia przejściowych zawrotów głowy lub zawrotów głowy15. Z tego samego powodu nie należy uzupełniać pominiętych dawek poprzez podwojenie pojedynczej dawki. Podanie dawki opisanej powyżej (w odstępie ≥2 h) sprawia, że to działanie niepożądane jest niezwykle rzadkie u ludzi (<1% z kilkuset osób).
  3. Monitorować przestrzeganie 2 H2O pobierania moczu w celu zmierzenia 2H wzbogacenia w wodę w organizmie, a także cotygodniowego zwrotu pustych fiolek do liczenia.
    1. Oczyść próbki moczu za pomocą węgla aktywnego i filtra.
      1. Dodaj 8 ml moczu do 10 ml probówki z 1 ml węgla aktywowanego.
      2. Umieścić próbkę na kołysce na 10 minut i odwirowywać przez 5 minut przy 800 x g, tak aby węgiel drzewny przesunął się na dno probówki. Przefiltrować próbkę za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm.
    2. Zmierzyć wzbogacenie 2H2O w wodzie w organizmie (moczu) za pomocą spektrometrii mas ze stosunkiem izotopów (IRMS).
      UWAGA: Wzbogacenie 2H2O można analizować różnymi metodami, w tym chromatografią gazową ze spektrometrią mas 16, wysokotemperaturowym analizatorem elementarnym konwersji (TC/EA) sprzężonym z IRMS17, spektroskopią w podczerwieni z pierścieniem wnękowym (IRIS)18, lub za pomocą H/Device podłączonego do spektrometru mas (np. IRMS)19.
    3. Do obliczenia ekspozycji na prekursor 2H2O i frakcji nowo zsyntetyzowanych komórek AT należy użyć średniego wzbogacenia 2H2Omierzonego w moczu w ciągu 8-tygodniowego okresu znakowania.

UWAGA: Protokół znakowania 2H2O utrzymuje prawie plateau 2H wzbogacenie wody w organizmie w zakresie 1,0%-2,5% przez cały okres 8-tygodniowego okresu etykietowania (Rysunek 2)10.

2. Pobieranie biopsji tkanki tłuszczowej od ludzi

  1. Po oczyszczeniu skóry roztworem jodu powidonu, należy podać znieczulenie miejscowe (np. 2% lidokainy/0,5% bupiwakainy), wykonać nacięcie ~0,75 cm w skórze i pobrać podskórne biopsje AT za pomocą techniki lipoaspiracji igłowej w sterylnych warunkach13.
  2. Zważyć sterylną probówkę o pojemności 50 ml zawierającą 5 ml 1 M buforu HEPES o temperaturze pokojowej (RT), pH 7,3. Natychmiast umieścić AT w probówce z buforem HEPES w celu przetworzenia.
  3. Zważyć probówkę o pojemności 50 ml zawierającą AT, i zanotować masę.

3. Izolacja oczyszczonych adipocytów

  1. Dodać roztwór kolagenazy / HEPES typu 1 (2 mg / ml) do 2 g / ml AT.
  2. Roztrawić AT przez inkubację w łaźni wodnej z wytrząsaniem (100 obr./min) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, aż do uzyskania jednorodnej mieszaniny z kilkoma dużymi, nienaruszonymi kawałkami AT.
  3. Odwirować probówkę o masie 500 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej, aby oddzielić adipocyty i frakcję zrębowo-naczyniową (SVF).
  4. Delikatnie usuń górną warstwę tłuszczu (adipocyty) i przenieś ją do osobnej probówki. Nie należy naruszać granulatu (SVF) znajdującego się na dnie tuby.
  5. Jak wcześniej opisano14, oczyść adipocyty za pomocą immunomagnetycznej separacji komórek.
    UWAGA: Ten ważny krok ma na celu "oczyszczenie" adipocytów, ponieważ inne typy komórek o szybkim obrocie komórkowym, w tym komórki hematopoetyczne, śródbłonkowe i macierzyste, mogą przylegać do pływających adipocytów i wpływać na pomiary.
    1. Umieść ~400 μl adipocytów w probówce o pojemności 5 ml w celu negatywnego oczyszczenia immunologicznego.
    2. Dodać przeciwciało blokujące FcR (100 μL/ml).
    3. Dodać koktajl biotynylowanych przeciwciał przeciwko markerom komórek śródbłonka (anty-ludzki CD31; 1:100), komórek krwiotwórczych (anty-ludzki CD45; 1:400) i mezenchymalnych komórek macierzystych (anty-ludzki CD34; 1:100) do roztworu adipocytów przez 15 minut w RT.
    4. Dodaj koktajl selekcyjny biotyny (100 μl/ml) do roztworu adipocytów, dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym przechylaniem/obracaniem.
    5. Wymieszaj nanocząstki magnetyczne, pipetując w górę iw dół, dodaj cząstki (50 μl/ml) do roztworu adipocytów, dobrze wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym obrotem (10 obr./min).
    6. Dodać PBS/2% FBS/1 mM bufor EDTA do roztworu adipocytów, aby uzyskać całkowitą objętość 1 ml.
    7. Umieść rurkę w magnesie i pozostaw ją na 5 minut.
    8. Podnieś magnes i jednym ciągłym ruchem odwróć magnes zawierający probówkę i wlej zawartość do nowej probówki o pojemności 5 ml. Nie stukaj w rurkę podczas nalewania. Komórki przyłączone do przeciwciał są wiązane przez nanocząstki magnetyczne i usuwane, podczas gdy oczyszczone immunologicznie adipocyty są zatrzymywane.
    9. Oczyszczone adipocyty należy błyskawicznie zamrozić w płynieN2 i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji DNA.

4. Izolacja preadipocytów

  1. Aby wyizolować wzbogaconą populację preadipocytów, zastosuj protokół wykorzystujący ich zdolność do przyczepiania się do plastiku po krótkotrwałej hodowli SVF20.
  2. W okapie z przepływem laminarnym ponownie zawiesić osad SVF w 5 ml buforu do lizy erytrocytów na 5-10 minut w temperaturze pokojowej (dokładnie wymieszać) i odwirować przy 800 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10% FBS w alfa (α)MEM.
  3. Umieść komórki na plastikowym naczyniu hodowlanym przez ~ 8-12 godzin w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5%CO2
    4. .
  4. Po ~8-12 godzinach delikatnie umyj nieprzylegające komórki z płytki hodowlanej za pomocą PBS w okapie z przepływem laminarnym.
  5. Po odessaniu PBS dodaj 1-1,5 ml 0,25% trypsyny/1 mM EDTA do naczynia hodowlanego, aby odłączyć przylegające komórki (wzbogacona populacja preadipocytów). Umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37 °C na ~5-8 minut, aby pomóc w podniesieniu komórek.
  6. Dodaj 10% FBS/αMEM do płytki i dokładnie umyj płytkę, aby zebrać wszystkie komórki z płytki. Przenieść roztwór komórek do probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml i odwirować przy 800 x g przez 8 minut.
  7. Usunąć supernatant i przechowywać osad (preadipocyty) w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji DNA.

5. Izolacja monocytów krwi

UWAGA: Monocyty są analizowane tak, aby reprezentowały (prawie) całkowicie odwróconą populację komórek, a pomiar wzbogacenia 2H w monocytach może być użyty jako marker referencyjny ekspozycji na 2H2O u każdej osoby. Alternatywnie, wzbogacenie ciała o 2H2 O może być zmierzone i wykorzystane do obliczenia ekspozycji na 2H2O.

  1. Pobrać świeżą, pełną krew od ludzi do probówek próżniowych zawierających EDTA.
  2. Odwirować krew w temperaturze 1 000-2 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Nie używaj hamulca.
  3. Usuń górną warstwę plazmy. Uważaj, aby nie dotknąć białego kożuchowego płaszcza tuż pod plazmą.
  4. Odessać białą kożuchową sierść za pomocą pipety transferowej i przenieść ją do probówki o pojemności 50 ml. Dodaj ~ 10 ml PBS do kożucha kożbowego.
  5. Delikatnie dodaj 10 ml pożywki o gradiencie gęstości, aby nałożyć warstwę kożuchowego płaszcza.
    UWAGA: Upewnij się, że końcówka pipety dotyka dna probówki i ostrożnie wysuń, aby na dnie znajdowała się przezroczysta warstwa medium o gradiencie gęstości. Unikaj wprowadzania bąbelków.
  6. Odwirować probówkę o stężeniu 800 x g przez 30 minut przy wyłączonym hamulcu.
  7. Odpipetować (~10 ml) białą warstwę (frakcję jednojądrzastą), wykonując okrężne ruchy końcówką pipety transferowej blisko granicy, ale nie dotykając górnej warstwy. Przenieś do nowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 10 ml PBS. Wirować przy 800 x g przez 5 minut (nie używać hamulca) i wyrzucić supernatant.
  8. Dodać 5 ml buforu do lizy erytrocytów do osadu. Wymieszaj i pozostaw na 2 minuty w temperaturze RT.
  9. Dodać 5 ml PBS z 0,1% BSA do roztworu buforu/osadu do lizy erytrocytów, odwirować przy 800 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  10. Wyizoluj monocyty jako komórki CD14+ za pomocą kulek immunomagnetycznych. Wykonaj izolację komórek CD14+, postępując zgodnie z protokołem producenta.
  11. Przechowywać wyizolowane monocyty w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji DNA.

6. Przygotowanie DNA (izolacja, hydroliza i derywatyzacja)

  1. Wyizoluj DNA z preadipocytów, adipocytów i monocytów krwi za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Aby uwolnić dezoksyrybonukleozydy, enzymatycznie hydrolizuj DNA (~200 μL) przez noc (nie dłużej niż 24 godziny) w temperaturze 37 °C w 50 μl koktajlu hydrolizy enzymatycznej zawierającego 1 ml nukleazy S1, 1 ml enzymu fosfatazy i 36,8 ml 5x buforu hydrolizy w szklanych probówkach o wymiarach 16 mm x 100 mm (10 ml). Dodatkowo należy dołączyć następujące próbki: ślepą próbę wodną, ślepą próbę koktajlu hydrolitycznego, ślepą próbę kolumnową z zestawu do ekstrakcji DNA oraz 500 ng wzorców DNA.
    1. Aby przygotować 5x bufor do hydrolizy, umieść 94 ml czystej wody klasy biologii molekularnej w sterylnej zlewce. Odważyć 3,08 g octanu sodu i 21,5 mg siarczanu, dodać wodę i mieszać do rozpuszczenia. Dostosuj pH do 5,0 za pomocą lodowatego kwasu octowego i przetestuj za pomocą bibuły pH. Dodaj wodę, aby osiągnąć całkowitą objętość 100 ml.
    2. Aby przygotować enzym fosfatazę, należy ponownie zawiesić fiolkę z kwaśną fosfatazą w 1 ml czystej wody.
    3. Aby przygotować enzym nukleazy S1 o stężeniu 0,5 μl / μl, rozcieńczyć 2,5 μl nukleazy S1 w 2 ml 1x buforu do hydrolizy (dodać 1 ml 5x buforu hydrolizy do 4 ml czystej wody).
  3. Hydrolizaty wyprowadza się do pochodnych pentafluorobenzylohydroksyloaminy (PFBHA). W szczególności do strawionych próbek DNA, w tym wzorców i prób ślepych, w probówkach z nakrętką 16 mm x 100 mm (10 ml) należy dodać następujące elementy: 100 μl chlorowodorku pentafluorobenzylu hydroksyloaminy (PFBHA; 1 mg/ml) i 75 μl lodowatego kwasu octowego. Wprowadzić wir (krótko), zakryć fiolki i umieścić próbki hydrolizatu na bloku grzewczym ustawionym na 100 °C na 30 minut.
  4. Usuń próbki i pozwól im ostygnąć przez ~5 minut do RT. Po schłodzeniu dodać 2 ml bezwodnika octowego i 100 μl 1-metyloimidazolu do każdej probówki pod wyciągiem. Ustaw probówki na bloku grzewczym o temperaturze 100 °C na 5 minut.
  5. Usuń próbki, a następnie pozwól im ostygnąć przez ~15-20 minut. Po ostygnięciu dodaj 3 ml wody klasy biologii molekularnej do każdej próbki, krótko zwiruj i pozostaw na 10 minut.
  6. Dodać 2 ml dichlorometanu (DCM) do probówek i energicznie wirować próbki przez 15 sekund, aby wyekstrahować pochodną do fazy organicznej.
  7. Wirować przy 800 x g przez 5 minut, aby oddzielić fazy. Ostrożnie przenieść dolną warstwę dichlorometanu do czystej fiolki GC o pojemności 1,6 ml.
    UWAGA: Nie przenoś żadnej fazy wodnej, ponieważ zwiększy to tło.
  8. Odparowywać do sucha z azotem przez ~20 minut w celu usunięcia DCM i pozostałości kwasu octowego, a następnie suszyć ~10 minut w próżni z prędkością w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie ślady odczynników.

7. Chromatografia gazowa i spektrometria mas (GC-MS) analiza DNA

  1. Po wyschnięciu ponownie zawiesić pochodne PFBHA w 150 μl octanu etylu i zakryć. Następnie przeprowadzić analizę pod kątem włączenia 2H do DNA na przyrządzie do chromatografii gazowej (GC)/spektrometrii mas (MS) wyposażonym w kolumnę DB-225 wykorzystującą ujemną jonizację chemiczną metanu i zbierającą jony w trybie selektywnego monitorowania jonów przy m/z 435, m/z 436 i m/z 437 (reprezentującym izotopomery masoweM0, M1 iM2), odpowiednio). Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dla używanego instrumentu.
    1. Ustawić warunki GC w następujący sposób: kolumna: 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 μm powłoka foliowa; chromatograf: hel nośny gaz o stałym przepływie 1,0 ml/min; impulsowe wtryski bez podziału; temperatura wtryskiwacza: 250 °C; Linia przesyłowa MS: 325 °C; warunki pieca: temperatura początkowa 100 °C, przytrzymaj 2 min, rampa na 40 °C/min do temperatury 220 °C, przytrzymaj 7,5 min, druga rampa na 40 °C/min do 320 °C, przytrzymaj przez 1 min. Całkowity czas pracy wynosi 16,0 min. Typowe czasy elucji dR wynoszą odpowiednio 10,5 min i 10,8 min dla pierwszego i drugiego piku.
    2. Ustaw warunki MS w następujący sposób: źródło ujemnej jonizacji chemicznej metanu z detekcją w trybie monitorowania pojedynczych jonów; jony zebrane dla dR: m/z 435, m/z 436 i m/z 437 (reprezentujące odpowiednio izotopomery masowe M0, M1 i M2).
      UWAGA: Sikonizuj otwartą szklaną wkładkę za pomocą małej zatyczki z silikonowanej waty szklanej w dolnej części wkładki. Często zmieniaj tę wkładkę (co ~100 wstrzyknięć).
  2. Obliczyć stosunek masowej obfitości izotopomerów M1 w niewzbogaconej (naturalnej obfitości) pochodnej dR w następujący sposób:
    Stosunek M1 = obfitość M1/(suma obfitości M0, M1 i M2)
    Następnie odejmij współczynniki naturalnej obfitości M1 od współczynników M1 w dR oznaczonych próbek, aby obliczyć wzbogacenia (nadmierna obfitość izotopów lub %EM1)21.
  3. Zmierz obfitość izotopomerów masowych w podstawowych (niewzbogaconych) wzorcach DNA jednocześnie w zakresie obfitości jonów M0, które obejmują zakres obfitości jonów M0 w analizowanych próbkach.
    UWAGA: Ten krok jest niezbędny, aby skorygować "wrażliwość na obfitość" proporcji izotopów mierzonych za pomocą GC/MS22.
  4. Skonstruuj wykres zmierzonej obfitości jonów M0 w stosunku do zmierzonych stosunków masowych izotopomeru M1 w nieznakowanych wzorcach, aby określić stężenie próbki na kolumnie, które jest najdokładniejsze dla izotopomeru masowego M1 (tj. gdzie jest najbliższe znanemu, obliczonemu stosunkowi naturalnej obfitości M1 lub "słodkiemu punktowi"). Współczynnik M1 dla tej niewzbogaconej pochodnej dR wynosi 0,1669.
  5. Próbki doświadczalne należy wstrzyknąć tak, aby znajdowały się jak najbliżej tego "słodkiego punktu" w obszarze piku M0. Zastosować regresję kwadratową stosunku M1 niewzbogaconych wzorców w stosunku do powierzchni piku M0, aby oszacować stosunek M1 "skorygowanej naturalnej obfitości" dla każdej próbki przy jej konkretnym stężeniu M0. Odejmij to od stosunku M1 próbki komórek tłuszczowych, aby uzyskać procentowe wzbogacenie powyżej naturalnej obfitości, lub %EM1 (Rysunek 3)23.
  6. Oblicz teoretyczne maksymalne wzbogacenie M1 (EM1*) w komórkach tłuszczowych, korzystając z równań analizy rozkładu izotopomerów masowych (MIDA) 24 na podstawie ekspozycji organizmu na 2H2O (mierzonej w moczu) zintegrowanej w okresie 8 tygodni (Rysunek 4) lub pośrednio zmierzonych wzbogaceń monocytów (krok 7.5).

8. Obliczanie frakcji nowo zsyntetyzowanych komórek, czyli adipogeneza in vivo

  1. Obliczyć frakcję nowych komórek (%), która jest miarą adipogenezy in vivo lub tworzenia nowo zsyntetyzowanych preadipocytów lub adipocytów, stosując następujący wzór:
    Frakcja nowych komórek (%) = [(Wzbogacenie M1 w próbce komórek [tłuszczowych])/EM1* (teoretyczne maksymalne wzbogacenie M1)] x 100
    UWAGA: *Wzbogacenie 2H w monocytach może być również użyte jako mianownik równania. Pomiar ten w monocytach stanowi marker komórkowy odniesienia ekspozycji na 2H2O u każdej osoby i może być wykorzystany do potwierdzenia obliczeń teoretycznego maksymalnego wzbogaceniaM1na podstawie mierzonych wartości 2H2O w organizmie
    2. .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

The 2H2Protokół znakowania O (sekcja 1) utrzymuje poziom bliski plateau 2Wzbogacenie w H w wodzie organizmu w zakresie 1,0%–2,5% przez cały 8-tygodniowy okres znakowania10jak pokazano na Rycina 2W poprzednim badaniu wykorzystano 2H2Protokół znakowania tlenkiem węgla w celu oceny kinetyki tkanki tłuszczowej poprzez wprowadzenie 2H do DNA komórek tłuszczowych, zgodnie ze szczegółami opisanymi w s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Oceny in vivo są niezbędne w celu uzyskania nowej wiedzy na temat dynamiki obrotu białego azotanu i jego roli w otyłości i powiązanych chorobach metabolicznych, ponieważ oceny in vitro nie obejmują naturalnego środowiska AT. Chociaż zastosowanie retrospektywnego datowania radiowęglowego do oceny dynamiki tkanki tłuszczowej było pouczające 7,25, podejście to nie jest odpowiednie do uchwycenia zmian dynamicznych podczas prospektywnych badań interw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Rdzeniowi Spektrometrii Mas w Pennington Biomedical Research Center.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-metyloimidazolMiliporeSigma336092
2H2OSigma Aldrich
Bezwodnik octowyAldridge'a539996
ACK Lysing Buffer (bufor do lizy erytrocytów)Quality Biological Inc (VWR)10128-802
Agilent 6890/5973 GC/MS Agilent
Anti-human CD31 (PECAM-1) BiotynaInvitrogen13-0319-82
Anty-ludzka CD34 BiotynaInvitrogen13-0349-82
Anty-ludzka CD45BioLegend304004
Antybiotyk PrzeciwgrzybiczyMiliporeSigmaA5955
Kolagenaza typu 1Worthington Biochemiczny CorporationLS004196
Deoksyryboza (2-deoksy d-ryboza)MiliporeSigma31170
Tlenek deuteruMiliporeKolumna Sigma756822
DB-225 (30 m, 0,25 mm, 0,25 um)J& W Scientific122-2232
Dichlorometan (DCM)MilliporeSigma34856
Standard DNA (DNA grasicy cielęcej)MilliporeSigmaD4764
Dneasy Blood and Tissue Kit (zestaw do ekstrakcji DNA)Qiagen69504
Easy Sep Zestaw biotyny ludzkiejTechnologie komórek macierzystych17663
EasySep Human CD14 Pozytywna selekcja CocktailStem Cell Technologies18058C
Octan etyluFisherEX0241-1
Falcon 5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnemVWR60819-295
Ficoll-Paque PlusMilliporeSigmaGE17-1440-02
GC (2 ml)WkładkiC-4011-1W
GCFisherC-4011-631; C-4012-530
Lodowaty kwas octowyFisherAC14893-0010
Rurki szklane (do hydrolizy)Fisher14-959-35AA
Bufor HEPESThermoFisher15630080
Woda hyklonowa, klasa biologii molekularnejThomas ScientificSH30538.02
MEM alfaFisher Scientific32561-037
PFBHA (chlorowodorek o-(2, 3, 4, 5, 6)-penatfluorobenzylohydroksyloaminy)MiliporePaski
Kwas fosfatazowyCalbiochem (VWR)80602-592
Nukleaza S1 (z Aspergillus oryzae)MilliporeSigmaN5661
Siarczan soduMilliporeSigma23913
do fiolek Fisher wskaźnikowe 194484 pH Sigma 987618

Bibliografia

  1. Cypess, A. M. Reassessing human adipose tissue. The New England Journal of Medicine. 386 (8), 768-779 (2022).
  2. Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
  3. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
  4. White, U., Ravussin, E. Dynamics of adipose tissue turnover in human metabolic health and disease. Diabetologia. 62 (1), 17-23 (2019).
  5. Danforth, E. Failure of adipocyte differentiation causes type II diabetes mellitus. Nature Genetics. 26 (1), 13(2000).
  6. Virtue, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue expandability, lipotoxicity and the metabolic syndrome--An allostatic perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 338-349 (2010).
  7. Arner, E., et al. Adipocyte turnover: relevance to human adipose tissue morphology. Diabetes. 59 (1), 105-109 (2010).
  8. Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
  9. Busch, R., Neese, R. A., Awada, M., Hayes, G. M., Hellerstein, M. K. Measurement of cell proliferation by heavy water labeling. Nature Protocols. 2 (12), 3045-3057 (2007).
  10. Neese, R. A., et al. Measurement in vivo of proliferation rates of slow turnover cells by 2H2O labeling of the deoxyribose moiety of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15345-15350 (2002).
  11. Strawford, A., Antelo, F., Christiansen, M., Hellerstein, M. K. Adipose tissue triglyceride turnover, de novo lipogenesis, and cell proliferation in humans measured with 2H2O. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 286 (4), E577-E588 (2004).
  12. Macallan, D. C., et al. Measurement of cell proliferation by labeling of DNA with stable isotope-labeled glucose: Studies in vitro, in animals, and in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (2), 708-713 (1998).
  13. White, U. A., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Differences in in vivo cellular kinetics in abdominal and femoral subcutaneous adipose tissue in women. Diabetes. 65 (6), 1642-1647 (2016).
  14. Tchoukalova, Y. D., et al. In vivo adipogenesis in rats measured by cell kinetics in adipocytes and plastic-adherent stroma-vascular cells in response to high-fat diet and thiazolidinedione. Diabetes. 61 (1), 137-144 (2012).
  15. Jones, P. J., Leatherdale, S. T. Stable isotopes in clinical research: Safety reaffirmed. Clinical Science. 80 (4), 277-280 (1991).
  16. Bacchus-Souffan, C., et al. Relationship between CD4 T cell turnover, cellular differentiation and HIV persistence during ART. PLoS Pathogens. 17 (1), e1009214(2021).
  17. Simonato, M., et al. Disaturated-phosphatidylcholine and surfactant protein-B turnover in human acute lung injury and in control patients. Respiratory Research. 12 (1), 36(2011).
  18. Tremoy, G., et al. Measurements of water vapor isotope ratios with wavelength-scanned cavity ring-down spectroscopy technology: New insights and important caveats for deuterium excess measurements in tropical areas in comparison with isotope-ratio mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (23), 3469-3480 (2011).
  19. dos Santos, T. H. R., Zucchi, M. D., Lemaire, T. J., de Azevedo, A. E. G., Viola, D. N. A statistical analysis of IRMS and CRDS methods in isotopic ratios of H-2/H-1 and O-18/O-16 in water. Sn Applied Sciences. 1, 664(2019).
  20. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nature Protocols. 4 (1), 102-106 (2009).
  21. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic, and experimental considerations. The American Journal of Physiology. 276 (6), E1146-E1170 (1999).
  22. Patterson, B. W., Zhao, G., Klein, S. Improved accuracy and precision of gas chromatography/mass spectrometry measurements for metabolic tracers. Metabolism. 47 (6), 706-712 (1998).
  23. Mazzarello, A. N., Fitch, M., Hellerstein, M. K., Chiorazzi, N. Measurement of leukemic B-cell growth kinetics in patients with chronic lymphocytic leukemia. Methods in Molecular Biology. 1881, 129-151 (2019).
  24. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis: A technique for measuring biosynthesis and turnover of polymers. The American Journal of Physiology. 263, E988-E1001 (1992).
  25. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
  26. Allerton, T. D., et al. Exercise reduced the formation of new adipocytes in the adipose tissue of mice in vivo. PLoS One. 16 (1), e0244804(2021).
  27. White, U. A., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Association of in vivo adipose tissue cellular kinetics with markers of metabolic health in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (7), 2171-2178 (2017).
  28. White, U., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Adipose depot-specific effects of 16 weeks of pioglitazone on in vivo adipogenesis in women with obesity: A randomised controlled trial. Diabetologia. 64 (1), 159-167 (2021).
  29. Steele, R. Influences of glucose loading and of injected insulin on hepatic glucose output. Annals of the New York Academy of Sciences. 82, 420-430 (1959).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Znakowanie in vivoznakowanie deuteremobr t tkanki t uszczowejbia a tkanka t uszczowaobr t kom rkowypomiar adipogenezyludzki metabolizm t uszcz wpowstawanie adipocyt wzdrowie metaboliczne

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.