Artykuł metodologiczny

Monitorowanie zmian w komórkach śródbłonka żyły pępowinowej po zakażeniu wirusowym za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym opartej na impedancji

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64887

⸱

5 maja 2023

 ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

W tym artykule

Podsumowanie

Obecne badanie opisuje protokół monitorowania zmian w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) podczas infekcji wirusowej za pomocą systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA).

Streszczenie

Komórki śródbłonka pokrywają wewnętrzną powierzchnię wszystkich naczyń krwionośnych i limfatycznych, tworząc półprzepuszczalną barierę regulującą wymianę płynów i substancji rozpuszczonych między krwią lub limfą a otaczającymi je tkankami. Zdolność wirusa do przekraczania bariery śródbłonka jest ważnym mechanizmem ułatwiającym rozprzestrzenianie się wirusa w organizmie człowieka. Zgłasza się, że wiele wirusów zmienia przepuszczalność śródbłonka i/lub powoduje przerwanie bariery komórkowej śródbłonka podczas infekcji, co może spowodować przeciek naczyniowy. Obecne badanie opisuje protokół analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA), wykorzystujący komercyjny analizator komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania integralności śródbłonka i zmian przepuszczalności podczas infekcji wirusem Zika (ZIKV) ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Sygnały impedancyjne zarejestrowane przed i po zakażeniu ZIKV zostały przekształcone w wartości indeksu komórkowego (CI) i przeanalizowane. Protokół RTCA pozwala na wykrycie przejściowych efektów w postaci zmian morfologicznych komórek podczas infekcji wirusowej. Test ten może być również przydatny do badania zmian w integralności naczyniowej HUVEC w innych konfiguracjach eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Komórki śródbłonka (EC) pokrywają wewnętrzną powierzchnię wszystkich naczyń krwionośnych i limfatycznych. Są one połączone przylegającymi, ścisłymi połączeniami szczelinowymi, tworzącymi półprzepuszczalną barierę między krwią lub limfą a otaczającymi tkankami1,2. Nienaruszone połączenia komórka-komórka śródbłonka mają kluczowe znaczenie dla regulacji transportu makrocząsteczek, substancji rozpuszczonych i płynów, co ma kluczowe znaczenie dla fizjologicznych aktywności odpowiednich tkanek i narządów3. Bariera śródbłonkowa jest dynamiczna i modulowana przez określone bodźce4. Zaburzenie lub utrata funkcji bariery śródbłonkowej jest cechą charakterystyczną patofizjologii chorób w ostrym i przewlekłym stanie zapalnym w patogenezie wielu chorób5,6,7, w tym infekcja wirusowa8,9,10,11. W przypadku flawiwirusów stwierdzono, że niestrukturalne białko NS1 może zmieniać przepuszczalność śródbłonka, na przykład poprzez przerwanie warstwy podobnej do glikokaliksu śródbłonka w wyniku zwiększonej ekspresji i aktywacji katepsyny L, sialidaz i heparynazy endoglikozydazy9. W stanie chorobowym integralność monowarstwy śródbłonka jest zaburzona, a połączenia komórka-komórka są zakłócone, co może prowadzić do uszkodzenia i dysfunkcji śródbłonka12 i ostatecznie rozległych objawów patologicznych w wielu układach narządowych13,14. Zakażenie wirusowe EC powoduje zmiany w komórkowych szlakach sygnałowych i komórkowym profilu ekspresji genów, co może wpływać na funkcje bariery płynowej, powodować zakłócenia EC i indukować przeciek naczyniowy10,15. Stwierdzono, że zakażenie EC wirusem Zika (ZIKV) zaburza integralność połączeń, co powoduje zmiany w przepuszczalności naczyń i prowadzi do dysfunkcji bariery śródbłonkowej, co prowadzi do przecieku naczyniowego10,15. Badania wykazały, że ZIKV jest związany z poważnymi wadami wrodzonymi; Jednak niewiele wiadomo o dokładnym mechanizmie, za pomocą którego to się dzieje16,17. Zrozumienie zmian bariery śródbłonkowej podczas infekcji ma zatem kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmu choroby.

EC są obecnie używane jako ważny eksperymentalny system modeli naczyniowych in vitro dla różnych procesów fizjologicznych i patologicznych18,19,20,21. Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) były szeroko stosowane jako podstawowy, nieunieśmiertelniony system komórkowy do badania śródbłonka naczyniowego i biologii naczyń in vitro22,23,24,25. HUVEC zostały po raz pierwszy wyizolowane do hodowli in vitro na początku lat siedemdziesiątych XX wieku z żyły pępowinowej ludzkiej pępowiny26. HUVEC mają morfologię przypominającą bruk, którą łatwo jest zmusić do rozmnażania się w laboratorium. Ze względu na naprężenie ścinające po utrzymywaniu przez długi czas w stanie zlewania obserwuje się wydłużenie kształtu komórki. HUVEC można scharakteryzować obecnością ciał Weibela i Palade'a (WPB), pęcherzyków pinocytarnych, niewielkich ilości włókienek znajdujących się w pobliżu jądra, mitochondriów o rurkowatych kształtach, które rzadko wykazują rozgałęzienia, elipsoidalnego jądra z drobnoziarnistym wzorem skondensowanej chromatyny oraz od jednego do trzech jąderek obecnych w każdym jądrze27. Chociaż HUVEC wykazują liczne cechy morfologiczne, identyfikacji HUVEC nie można osiągnąć za pomocą samego badania optycznego. Testy, takie jak barwienie immunofluorescencyjne kadheryny śródbłonka naczyń krwionośnych (VE)-kadheryny, są powszechnie stosowane do monitorowania integralności naczyń krwionośnych w HUVECs28,29,30,31.

To badanie opisuje protokół analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) infekcji HUVEC. System RTCA wykorzystuje specjalistyczne, pokryte złotem płytki zawierające mikroelektrody, które zapewniają przewodzącą powierzchnię do mocowania ogniwa. Kiedy komórki przyczepiają się do powierzchni mikroelektrody, tworzy się bariera, która utrudnia przepływ elektronów przez mikroelektrody. Pomiar impedancji generowanej przez mikroelektrody może być wykorzystany do uzyskania informacji o niektórych procesach komórkowych, w tym o przyczepianiu się komórek, proliferacji i migracji32. Zgłoszony test jest testem komórkowym opartym na impedancji, który w połączeniu z analizatorem komórek w czasie rzeczywistym zapewnia ciągły pomiar proliferacji żywych komórek, zmian morfologii (takich jak kurczenie się komórek) i jakości przylegania komórek w sposób nieinwazyjny i wolny od znaczników. W tym badaniu analizator komórek w czasie rzeczywistym jest używany do monitorowania integralności śródbłonka i zmian morfologicznych HUVEC podczas infekcji ZIKV. Krótko mówiąc, przyrząd mierzy przepływ elektronów przekazywany w specjalistycznych płytkach mikromiareczkowych pokrytych złotymi mikroelektrodami w obecności pożywki hodowlanej (roztworu przewodzącego prąd elektryczny). Przyleganie komórek lub zmiany w liczbie i morfologii komórek zakłócają przepływ elektronów i powodują zmiany impedancji, które mogą być uchwycone przez instrument (rysunek uzupełniający 1). Różnica między wzrostem, proliferacją i przyleganiem HUVEC przed i po zakażeniu ZIKV jest rejestrowana w czasie rzeczywistym przez sygnał impedancji elektrycznej, a następnie przekształcana w wartość indeksu komórkowego (CI). Wartość CI sprzed infekcji jest używana jako punkt odniesienia dla normalizacji wartości CI. Zmiany wartości CI odzwierciedlają zmiany morfologiczne komórek lub utratę przylegania komórek po zakażeniu33. Wyniki badania pokazują, że protokół RTCA umożliwia wykrycie przejściowych efektów lub zmian morfologicznych komórek podczas infekcji wirusowej w porównaniu z testem końcowym, takim jak barwienie immunofluorescencyjne kadheryny VE. Metoda RTCA może być przydatna do analizy zmian integralności naczyń krwionośnych HUVEC po zakażeniu innymi wirusami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

  1. Przygotowanie HUVEC
    1. Hoduj 7,5 x 105 komórek HUVEC/ml w kolbie do hodowli komórkowej o długości 75cm2 (pokrytej 20 μg/ml kolagenu typu 1) zawierającej 12 ml pożywki dla komórek śródbłonka (ECM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 0,01% suplementem wzrostu komórek śródbłonka (ECGS), który zawiera czynniki wzrostu, hormony i białka niezbędne do hodowli HUVEC, i 0,01% penicyliny-streptomycyny (P/S). Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 (Rysunek 1).

2. Konfiguracja eksperymentu RTCA

  1. Weryfikacja rezystora przebiega na RTCA
    1. Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania RTCA na pulpicie, aby uruchomić aplikację. Pojawi się okno logowania, wpisz nazwę użytkownika i hasło, aby się zalogować.
    2. Umieść 96-dołkową płytkę rezystora RTCA z dołkiem A1 skierowanym do wewnątrz do stacji RTCA znajdującej się w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    3. W zakładce Exp Notes w oprogramowaniu RTCA wpisz nazwę eksperymentu, numer seryjny urządzenia i typ urządzenia (tabliczka QC).
    4. Na karcie Układ na karcie Komórka oprogramowania RTCA zaznacz wszystkie studnie i kliknij prawym przyciskiem myszy podświetlone studnie, aby upewnić się, że wszystkie studnie są włączone (wyszarzone).
    5. Na karcie Harmonogram w oprogramowaniu RTCA kliknij przycisk Step_1. Wprowadź przeciągnięcia: 10 i interwał: 30 s. Kliknij przycisk Zastosuj. Kliknij Start/Kontynuuj w lewym górnym rogu oprogramowania, aby rozpocząć weryfikację.
      UWAGA: Upewnij się, że połączenie studzienek ze stacją RTCA jest w porządku, obserwując "Skanowana płyta. Połączenia OK" u dołu strony.
  2. Przebieg weryfikacji rezystora w celu analizy danych
    1. Na karcie Indeks komórek sprawdź dane po zakończeniu przebiegu. Wszystkie wartości CI powinny być mniejsze niż 0,063.
    2. W dolnej części zakładki Indeks komórek sprawdź nieprzetworzone dane skanowania. Nieprzetworzone dane skanowania powinny wykazywać powtarzające się wzorce wartości 40,0 ± 2,0 (wiersze A i H), 67,5 ± 2,5 (wiersze B i G), 93,6 ± 2,9 (wiersze C i F) oraz 117,6 ± 3,2 (wiersze D i E).
    3. Aby zatrzymać przebieg weryfikacji, kliknij opcję Blacha > Blacha zwalniająca. 96-dołkowa płytka rezystora RTCA jest teraz gotowa do wyjęcia ze stacji RTCA.
  3. Uzyskiwanie informacji o tantie na RTCA
    1. Specjalistyczną złotą płytkę mikroelektrodową pokrytą kolagenem typu 1 (pokrytą 20 μg/ml kolagenu typu 1) umyć 60 μl/studzienkę zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS; wodorowęglanem sodu, bez chlorku wapnia i siarczanu magnezu) 2x.
    2. Odrzucić pozostały HBSS i dodać 50 μl/basenik ECM. Umieść specjalistyczną złotą płytkę mikroelektrodową zawierającą ECM z dołkiem A1 skierowanym do wewnątrz do stacji RTCA znajdującej się w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    3. Na karcie Exp Notes w oprogramowaniu RTCA wpisz nazwę eksperymentu, numer seryjny urządzenia i typ urządzenia (format 96-dołkowy).
    4. Na karcie Układ na karcie Komórka oprogramowania RTCA zaznacz studnie, które będą używane, i kliknij prawym przyciskiem myszy podświetlone studnie, aby upewnić się, że wszystkie studnie są włączone (wyszarzone).
    5. Na karcie Harmonogram oprogramowania RTCA kliknij Step_1, a następnie kliknij Start/Kontynuuj w lewym górnym rogu oprogramowania, aby uzyskać odczyt tła.
      UWAGA: Upewnij się, że połączenie studzienek jest prawidłowe, obserwując "Zeskanowana płyta. Połączenia OK" u dołu strony.
    6. Po uzyskaniu odczytu tła specjalistyczna płytka złotej mikroelektrody jest teraz gotowa do wysiewu komórek i gotowa do usunięcia ze stacji RTCA.
  4. Preparat HUVEC w specjalistycznej płytce złoto-mikroelektrodowej
    1. Wysiewaj HUVEC na specjalistycznej złotej płytce mikroelektrodowej z 50 μl / dołek kondycjonowanej pożywki, 1 x 104 komórki / dołek (kondycjonowane podłoże: ECM uzupełnione 10% FBS, 0,01% ECGS i 0,01% P / S). Umieścić płytkę z powrotem w stacji RTCA z dołkiem A1 skierowanym do wewnątrz w celu inkubacji przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C przy 5% CO2,
      UWAGA: Zliczanie komórek przeprowadzono na zawiesinie komórek ze współczynnikiem rozcieńczenia równym dwa za pomocą hemocytometru.
    2. Na karcie Harmonogram kliknij przycisk Dodaj krok w lewym górnym rogu. Kliknij Step_2 i zmień Przebiegi: 601 i Interwał: 2 min. Kliknij Zastosuj. Kliknij Step_2 i kliknij Start/Kontynuuj w lewym górnym rogu oprogramowania.
    3. Po 20 godzinach inkubacji i gdy wartości CI w zakładce Wykres studzienki wskazują plateau, płytka jest gotowa do infekcji. Na karcie Harmonogram w oprogramowaniu RTCA kliknij przycisk Przerwij krok.
    4. Specjalistyczna płytka ze złotą mikroelektrodą jest teraz gotowa do wyjęcia ze stacji RTCA w celu wykonania kolejnych czynności.

3. Infekcja wirusowa w HUVEC

  1. Rozcieńczenie wirusa
    1. Kultura podstawowa ZIKV jest utrzymywana w temperaturze -80 °C. W tym badaniu należy usunąć zapas wirusa znajdujący się w fiolkach kriogenicznych i rozcieńczyć zapas ZIKV za pomocą ECM bez surowicy w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) 0,1 i 1,
      UWAGA: Stado ZIKV zostało wcześniej przygotowane przez przeprowadzenie rozmnażania w komórkach Vero i zebranie supernatantu ZIKV 34.
  2. Zakażenie monowarstwy komórkowej
    1. Usuń i wyrzuć kondycjonowaną pożywkę (ECM uzupełnioną 10% FBS, 0,01% ECGS i 0,01% P/S) z każdej studzienki. Przepłucz każdą studzienkę 60 μl HBSS 2x. Włóż HBSS za pomocą boku studni; Nie strzelaj do monowarstwy komórek.
    2. Pracując od najwyższego do najniższego rozcieńczenia, dodać do studzienki 40 μl każdej rozcieńczonej próbki wirusa w ECM bez surowicy. Trzykrotnie należy wykonać studzienkę dla każdego rozcieńczenia i utrzymać sześć studzienek bez infekcji (trombina kontroli ujemnej i kontrola dodatnia). Nie strzelaj do monowarstwy komórek; Zamiast tego dodaj rozcieńczonego wirusa za pomocą boku studzienki. Do każdego wkładania należy używać nowej końcówki do pipety.
      UWAGA: Trombina została wybrana jako kontrola pozytywna, ponieważ może szybko zwiększyć przepuszczalność śródbłonka HUVEC.
    3. Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby umożliwić adsorpcję wirusa. Przesuwaj płytkę 5 razy co 15 minut, aby umożliwić adsorpcję wirusa w całej monowarstwie komórki.
  3. Dodanie pożywki do hodowli komórkowych nakładki
    1. Po 1 godzinie inkubacji usunąć i wyrzucić zawiesinę wirusa od najniższego do najwyższego stężenia.
    2. Umyj zainfekowane komórki 60 μl HBSS 2x. Pokryj studzienkę ECM uzupełnionym 2% FBS. W przypadku studzienek kontroli dodatniej rozcieńczyć trombinę do 20 U/ml z ECM uzupełnionym 2% FBS i pokryć studzienki pożywką ECM zawierającą trombinę. Nie strzelaj do monowarstwy komórek; Zamiast tego dodaj nośnik nakładki za pomocą boku studni.
  4. Umieszczenie zainfekowanej specjalistycznej płytki złotej mikroelektrody z powrotem w stacji RTCA
    1. Na karcie Harmonogram kliknij przycisk Dodaj krok w lewym górnym rogu. Kliknij na Step_3 i zmień Sweeps: 3,601 i Interval: 2 min. Kliknij Apply.
    2. Kliknij przycisk OK w wyświetlonym oknie podręcznym. Umieść zainfekowaną specjalistyczną płytkę z mikroelektrodą złotą z dołkiem A1 skierowaną do wewnątrz do stacji RTCA znajdującej się w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    3. Kliknij Step_3 i kliknij Start/Kontynuuj w lewym górnym rogu oprogramowania.

4. Analiza danych i eksport danych

  1. Dodanie informacji doświadczalnych dotyczących każdej studzienki
    1. Na karcie Układ kliknij kartę Komórka (Rysunek 2A). Aby wprowadzić informacje o komórce docelowej i określić typ studni dla każdej studzienki, podświetl studnię i wpisz nazwę, numer i kolor komórki docelowej u dołu oprogramowania. Kliknij Zastosuj (Rysunek 2B).
    2. Aby wybrać i określić typ studzienki dla każdej studzienki na karcie Komórka, podświetl studzienkę, wybierz typ studzienki (próbka, kontrola dodatnia lub kontrola ujemna) i kliknij przycisk Ustaw.
    3. W zakładce Layout kliknij na zakładkę Treatment (Rysunek 2C). Aby wprowadzić informacje o zabiegu, zaznacz studzienkę i wpisz nazwę zabiegu, stężenie zabiegu, jednostkę i kolor. Kliknij Zastosuj (Rysunek 2D).
    4. Aby wybrać i określić typ studzienki dla każdej studzienki na karcie Leczenie, podświetl studzienkę, wybierz typ studzienki (próbka, kontrola pozytywna lub kontrola ujemna) i kliknij przycisk Ustaw.
      UWAGA: Dla każdego wyboru można podświetlić wiele dołków w tym samym czasie.
  2. Normalizacja wartości CI
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy po prawej stronie karty Analiza danych i wybierz Znormalizowany indeks komórki z listy rozwijanej Oś Y (Rysunek 3A). W sekcji Oś X na dole wybierz znormalizowany czas jako ostatni zmierzony punkt czasowy, w którym specjalistyczna płytka ze złotą mikroelektrodą została usunięta z powodu infekcji (Rysunek 3B).
      UWAGA: Proces normalizacji przeprowadzany przez oprogramowanie usuwa większość zmienności wynikającej z różnic w wysiewaniu i przyczepianiu studni, o ile wybrany punkt normalizacji przypada przed dodaniem wirusa i/lub zabiegiem. W związku z tym optymalnym punktem czasowym normalizacji powinien być ostatni punkt czasowy przed dodaniem wirusa i/lub leczenia. Punkt czasowy do normalizacji można sprawdzić na karcie Harmonogram w obszarze Step_2. Całkowity wskazany czas to punkt czasowy do normalizacji (Rysunek 3C).
  3. Wykreślanie uzyskanych danych za pomocą oprogramowania RTCA
    1. Na karcie Analiza danych wybierz studnie, które mają zostać dodane do wykresu, podświetlając dołki i klikając << Dodaj. Znormalizowany indeks komórki w stosunku do wykresu czasu jest teraz gotowy do skopiowania i wyeksportowania. Upewnij się, że zaznaczyłeś pole wyboru Średnia.
  4. Eksport danych za pomocą oprogramowania RTCA
    1. W lewym górnym rogu oprogramowania RTCA kliknij Płyta, > Eksportuj informacje o eksperymencie.... Zaznacz pole wyboru, aby wybrać dane do wyeksportowania. Kliknij przycisk OK.
      UWAGA: Nieprzetworzone dane (nieprzetworzone wartości CI) można eksportować, gdy zaznaczona jest opcja Indeks komórki > Wszystko.
    2. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać plik eksportu. Kliknij ZAPISZ. Pojawi się wyskakujące okienko wskazujące eksport informacji eksperymentalnych. Po zakończeniu eksportowania pojawi się kolejne okno wskazujące, że wyeksportowane informacje o eksperymencie są gotowe do wyświetlenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przed infekcją ZIKV, CI zarejestrowany dla monowarstwy HUVEC hodowanej na specjalistycznej płytce mikromiareczkowej pokrytej złotą mikroelektrodą wynosił powyżej 8, co sugeruje silne właściwości przylegania. Płytki lub studzienki o wskaźniku CI mniejszym niż 8 należy wyrzucić. HUVEC zostały następnie zakażone ZIKV przy MOI 0,1 i 1, a impedancję komórek rejestrowano przez 7 dni. Wartość CI HUVEC zakażonych ZIKV P6-740 przy MOI 0,1 (jasnoniebieska linia) zaczęła spadać po 15 godzinach od zakażenia (HPI), w porównaniu z neg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Cytocydobójcze zakażenie wirusowe w komórkach permisywnych jest zwykle związane z istotnymi zmianami w morfologii i biosyntezie komórek36. Zmiany morfologiczne komórek wywołane przez wirusa, takie jak kurczenie się komórek, powiększanie komórek i / lub tworzenie syncytorii, są również znane jako efekty cytopatyczne (CPE), charakterystyczne dla niektórych infekcji wirusowych37. W EC CPE został opisany jako zniszczenie komórek i przerwanie ścisłych połączeń między każdym EC, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

To badanie otrzymało wsparcie od Ministerstwa Szkolnictwa Wyższego Malezji w ramach programu Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019) oraz finansowanie w ramach Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do mikrowirówek 1,5 mlNest615601
37 ° Inkubator C z 5% CO2SanyoMCO-18AIC
75 cm2 kolba do hodowli tkankowych Corning430725U
Roztwór antybiotyku penicylina-streptomycyna (P / S)Sciencell0503
Szafa bezpieczeństwa biologicznego, klasa IIHoltenHB2448
Kolagen typu 1SIgma-AldrichC3867
Suplement wzrostu komórek śródbłonka (EKGS)Sciencell1052
Pożywka z komórek śródbłonka (ECM)Sciencell1001
E-płyta 96Agilent Technologies, Inc.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sciencell0025
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)Sigma-AldrichH9394
Laboroptik LTDNeubauer poprawił
ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)Mikroskop8000
ZEISSLaptop TELAVAL 31
Latitude 3520Dell -
Mikropipety wielokanałowe (10 - 100 &mikro; L)Eppendorf3125000036
Mikropipeta wielokanałowa (30 - 300 &mikro; L)Eppendorf3125000052
Rezerwator odczynnikówTarsonsT38-524090
Płytka rezystora RTCA 96Agilent Technologies, Inc.
RTCA Software Pro (wersja 2.6.1)Agilent Technologies, Inc.
Pipety jednokanałowe (10 - 100 i mikro; L)Eppendorf3123000047
Pipety jednokanałowe (100 - 1000 &mikro; L)Eppendorf3123000063
Pipety jednokanałowe (20 - 200 &mikro; L)Eppendorf3123000055
xCELLigence Analizator komórek w czasie rzeczywistym SP (Model: W380)Agilent Technologies, Inc.00380601030https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232
05232368001Hemocytometr odwrócony Sciencell 052323500015454433001

Bibliografia

  1. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
  2. Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-340 (2000).
  3. Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (3), L419-L422 (2000).
  4. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. The Journal of Physiology. 569, 359-366 (2005).
  5. Boueiz, A., Hassoun, P. M. Regulation of endothelial barrier function by reactive oxygen and nitrogen species). Microvascular Research. 77 (1), 26-34 (2009).
  6. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 619690(2021).
  7. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  8. Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (6), L1143-L1153 (2004).
  9. Puerta-Guardo, H., et al. Flavivirus NS1 triggers tissue-specific vascular endothelial dysfunction reflecting disease tropism. Cell Reports. 26 (6), 1598-1613 (2019).
  10. Rastogi, M., Singh, S. K. Zika virus NS1 affects the junctional integrity of human brain microvascular endothelial cells. Biochimie. 176, 52-61 (2020).
  11. Soe, H. J., et al. High dengue virus load differentially modulates human microvascular endothelial barrier function during early infection. Journal of General Virology. 98 (12), 2993-3007 (2017).
  12. Krouwer, V. J., Hekking, L. H. P., Langelaar-Makkinje, M., Regan-Klapisz, E., Post, J. A. Endothelial cell senescence is associated with disrupted cell-cell junctions and increased monolayer permeability. Vascular Cell. 4 (1), 12(2012).
  13. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
  14. Bryce, C., et al. Pathophysiology of SARS-CoV-2: targeting of endothelial cells renders a complex disease with thrombotic microangiopathy and aberrant immune response. The Mount Sinai COVID-19 autopsy experience. MedRxiv. , (2020).
  15. Khaiboullina, S., et al. Transcriptome profiling reveals pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase activation in Zika virus infected human umbilical vein endothelial cells. Frontiers in Pharmacology. 10, 642(2019).
  16. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  17. Sarno, M., et al. Zika virus infection and stillbirths: a case of hydrops fetalis, hydranencephaly and fetal demise. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), e0004517(2016).
  18. Dalrymple, N. A., Mackow, E. R. Virus interactions with endothelial cell receptors: implications for viral pathogenesis. Current Opinion in Virology. 7, 134-140 (2014).
  19. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (1), 64-75 (2014).
  20. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212 (1), 173-179 (2013).
  21. Vozzi, F., Bianchi, F., Ahluwalia, A., Domenici, C. Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors. Biotechnology Journal. 9 (1), 146-154 (2014).
  22. Gallinat, A., Badimon, L. DJ-1 interacts with the ectopic ATP-synthase in endothelial cells during acute ischemia and reperfusion. Scientific Reports. 12 (1), 12753(2022).
  23. Jiménez, N., Krouwer, V. J. D., Post, J. A. A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro. Cytotechnology. 65 (1), 1-14 (2013).
  24. Latifi-Navid, H., et al. Network analysis and the impact of Aflibercept on specific mediators of angiogenesis in HUVEC cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (17), 8285-8299 (2021).
  25. Poulet, M., et al. PRL-2 phosphatase is required for vascular morphogenesis and angiogenic signaling. Communications Biology. 3 (1), 603(2020).
  26. Laurens, N., van Hinsbergh, V. W. Isolation, purification and culture of human micro- and macrovascular endothelial cells. Methods in Endothelial Cell Biology. , Springer. 3-13 (2004).
  27. Haudenschild, C. C., Zahniser, D., Folkman, J., Klagsbrun, M. Human vascular endothelial cells in culture: lack of response to serum growth factors. Experimental Cell Research. 98 (1), 175-183 (1976).
  28. Cenni, E., Perut, F., Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (1), 21-30 (2011).
  29. Lau, S., Gossen, M., Lendlein, A., Jung, F. Venous and arterial endothelial cells from human umbilical cords: potential cell sources for cardiovascular research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 978(2021).
  30. Marquez-Curtis, L. A., Sultani, A. B., McGann, L. E., Elliott, J. A. W. Beyond membrane integrity: Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells after cryopreservation. Cryobiology. 72 (3), 183-190 (2016).
  31. Park, H. -J., et al. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Reviews. 2 (2), 93-102 (2006).
  32. Dowling, C. M., Herranz Ors, C., Kiely, P. A. Using real-time impedance-based assays to monitor the effects of fibroblast-derived media on the adhesion, proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. Bioscience Reports. 34 (4), e00126(2014).
  33. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  34. Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus propagation and cell-based colorimetric quantification. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
  35. Kustermann, S., et al. A real-time impedance-based screening assay for drug-induced vascular leakage. Toxicological Sciences. 138 (2), 333-343 (2014).
  36. Albrecht, T., Fons, M., Boldogh, I., Rabson, A. S. Effects on cells. Medical Microbiology. 4th Edition. , (1996).
  37. Hematian, A., et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis. Osong Public Health and Research Perspectives. 7 (2), 77-82 (2016).
  38. Friedman, H. M. Infection of endothelial cells by common human viruses. Reviews of Infectious Diseases. 11, S700-S704 (1989).
  39. Friedman, H. M., Macarak, E. J., MacGregor, R. R., Wolfe, J., Kefalides, N. A. Virus infection of endothelial cells. The Journal of Infectious Diseases. 143 (2), 266-273 (1981).
  40. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  41. Marlina, S., Shu, M. -H., AbuBakar, S., Zandi, K. Development of a Real-Time Cell Analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8, 579(2015).
  42. Liu, S., DeLalio, L. J., Isakson, B. E., Wang, T. T. AXL-mediated productive infection of human endothelial cells by Zika virus. Circulation Research. 119 (11), 1183-1189 (2016).
  43. Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Bioscience Horizons: The International Journal of Student Research. 9, (2016).
  44. Sun, M., et al. A dynamic real-time method for monitoring epithelial barrier function in vitro. Analytical Biochemistry. 425 (2), 96-103 (2012).
  45. Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicology Reports. 7, 335-344 (2020).
  46. Kho, D., et al. Application of xCELLigence RTCA biosensor technology for revealing the profile and window of drug responsiveness in real time. Biosensors. 5 (2), 199-222 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Monitorowanie impedancjizaka enie wirusem Zikaindeks kom rkowyprzepuszczalno naczyniowazmiany morfologiczneprotok RTCA

Powiązane artykuły