Artykuł metodologiczny

Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

DOI:

10.3791/64913

⸱

7 kwietnia 2023

 ,  ,  , 
1Joint Center for Single Cell Biology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykonalność i skuteczność wysokoprzepustowych metod sekwencyjnych scRNA zwiastuje erę jednokomórkowych w badaniach roślinnych. Przedstawiono tutaj solidną i kompletną procedurę izolowania określonych typów komórek korzenia rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) oraz późniejszej budowy i analizy biblioteki transkryptomu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W organizmach wielokomórkowych programowanie rozwojowe i reakcje środowiskowe mogą być bardzo rozbieżne w różnych typach komórek, a nawet w obrębie komórek, co jest znane jako heterogeniczność komórkowa. W ostatnich latach izolacja pojedynczych komórek i typów komórek w połączeniu z technikami sekwencjonowania nowej generacji (NGS) stała się ważnymi narzędziami do badania procesów biologicznych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Jednak izolowanie komórek roślinnych jest stosunkowo trudniejsze ze względu na obecność roślinnych ścian komórkowych, co ogranicza stosowanie podejść jednokomórkowych u roślin. Protokół ten opisuje solidną procedurę izolacji pojedynczych komórek i typów komórek z komórkami roślinnymi opartej na sortowaniu komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), która jest odpowiednia do dalszych analiz multiomicznych i innych badań. Korzystając z linii markerów fluorescencyjnych korzenia rzodkiewnika, pokazujemy, w jaki sposób izolowane są poszczególne typy komórek, takie jak komórki perycyklowe ksylemowo-polowe, początkowe komórki korzenia bocznego, komórki czapeczki korzenia bocznego, komórki kory i komórki endodermalne. Ponadto zapewniona jest skuteczna metoda analizy transkryptomu w dół przy użyciu Smart-seq2. Metoda izolacji komórek i techniki analizy transkryptomu mogą być dostosowane do innych typów komórek i gatunków roślin oraz mają szeroki potencjał aplikacyjny w naukach o roślinach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki są podstawową jednostką wszystkich organizmów żywych i pełnią funkcje strukturalne i fizjologiczne. Chociaż komórki w organizmach wielokomórkowych wykazują pozorną synchronizację, komórki różnych typów i poszczególne komórki wykazują różnice w swoich transkryptomach podczas rozwoju i reakcji środowiskowych. Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) zapewnia bezprecedensową moc w zrozumieniu heterogeniczności komórek. Zastosowanie scRNA-seq w naukach o roślinach przyczyniło się do pomyślnego skonstruowania atlasu komórek roślinnych1, zostało wykorzystane do identyfikacji rzadkich taksonów komórkowych w tkanka....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujący protokół został zoptymalizowany dla nasion A. thaliana typu dzikiego (WT) bez fluorescencji i fluorescencyjnych linii markerowych dla następujących typów komórek korzeniowych: komórki perycyklowe ksylemowo-biegunowe (J0121), początkowe komórki korzenia bocznego, komórki czapeczki korzeniowej bocznej (J3411), komórki endodermy i kory (J0571) (Rysunek 1A). Wszystkie linie markerowe uzyskano ze źródła komercyjnego (patrz Tabela Materiałów), z wyjątkiem linii markera komórki inicjującej boczną inicjację korzenia, która została wygenerowana przez wprowadzenie konstruktu GFP opartego na promotorze GATA23 do ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja protoplastów
Protokół ten jest skuteczny w sortowaniu protoplastów fluorescencyjnych linii markerów korzeniowych A. thaliana. Te linie markerów zostały opracowane przez fuzję białek fluorescencyjnych z genami wyrażającymi się specyficznie w docelowych typach komórek lub przy użyciu linii pułapek wzmacniających (Rysunek 1). Wiele tkanek i narządów zostało wypreparowanych na typy komórek wyrażających specyficzne markery fluorescencyjne w modelowych roślinach i upra.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół oparty na Smart-seq2 może generować niezawodne biblioteki sekwencjonowania z kilkuset komórek8. Jakość materiału wyjściowego ma zasadnicze znaczenie dla dokładności analizy transkryptomu. FACS jest potężnym narzędziem do przygotowywania komórek będących przedmiotem zainteresowania, ale ta procedura, zwłaszcza etap protoplastingu, musi być zoptymalizowana pod kątem zastosowań roślinnych. Mikrodysekcja wychwytu laserowego (LCM) lub ręcznie wypreparowane komórki mogą być również wykorzystane.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utworzyliśmy ten protokół w jednokomórkowym ośrodku multi-omicznym Szkoły Rolnictwa i Biologii Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju i byliśmy wspierani przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 32070608), Shanghai Pujiang Program (Grant nr 20PJ1405800) oraz Shanghai Jiao Tong University (Grant No. Agri-X20200202, 2019TPB05).

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m sitkoSorfa 622110
AgarYeasen70101ES76
Analizator fragmentów AgilentAglientAglient 5200
Agilent zestaw DNA o wysokiej czułościAglientDNF-474-0500
Koraliki Ampure XPBECKMANA63881
BetainayuanyeS18046-100g
WybielaczMr MuscleFnBn83BK20% (v/v) wybielacz
BSAsigma9048-46-8
CaCl2yuanyeS24109-500g
Celulaza R10Yakult (Japonia)9012-54-8
Celulaza RSYakult (Japonia)9012-54-8
Probówka wirówkowa (1,5 ml)Eppendolf30121589
DNazy, RNazy, DNA i RNA Odkażanie powierzchniBeyotimeR0127
dNTPs (10 mM)NEBN0447S
DTT (0,1 m)
Invitrogen		18090050
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092680
FACSBD FACS MelodyBD-65745
FACSSonySH800S
Końcówka filtra  (1000 &mikro; L)Thermo ScientificTF112-1000-Q
Końcówka filtra  (200 i mikro; L)Thermo ScientificTF140-200-Q
Końcówka filtra (10 &mikro; L)Thermo ScientificTF104-10-Q
Końcówka filtra (100 µ L)Thermo ScientificTF113-100-Q
Mikroskop fluorescencyjnyNikonEclipse Ni-E
Czterowymiarowy mikser obrotowyKylin -BellBE-1100
Hemicelulazasigma9025-56-3
IS Starter5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'KAPA
HiFi HotStart ReadyMix ( 2X)Roche 
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd7447-40-7
Macerozyme R10Yakult (Japonia)9032-75-1
Stojak do separacji magnetycznejinvitrogen12321D
Mannitolaladdin69-65-8
MESaladdin145224948
MgCl2 yuanyeR21455-500ml
MikrowirówkiEppendorfWirówka 5425
Mikro-mini-wirówkaTitanTimi-10k
MSPhytotechM519
Nextera XT Zestaw do przygotowania biblioteki DNAilluminaFC-131-1024
oligo-dT30VN starter5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'PCR
TermocyklerA24811
PectolyaseYakult (Japonia)9033-35-6
Linie znaczników roślinNottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x zestaw do oznaczania DSDN HSinvitrogenQ33231
Fluorometr Qubit 2.0invitrogenQ32866
Inhibitor RNazy Thermo ScientificEO0382
Bezrakowyinvitrogen10977023
roztwór A400 mM mannitol, 0,05 % BSA , 20 mM MES (pH 5,7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Roztwór B1 % (w/v)celulaza R10, 1 % (w/v) celulaza RS, 1 %  (w/v)hemicelulaza, 0,5 %  (w/v)pektoliaza i 1 %  (w/v) Macerozym R10 w świeżej porcji roztworu A
Sterylny tłuczekBIOTREAT453463
sitko (40 &mikro; m )Sorfa 251100
Odwrotna transkryptaza SuperScript IV (200 U/µ L)invitrogen18090050
SuperScript IV buffer (5x)invitrogen18090050
probówka (5 mL)BD Falcon352052
Cienkościenne probówki do PCR z nakrętkami (0,5 mL)AXYGENPCR-05-C
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
TSO primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'Vortex
TitanVM-T2
do PCR 7958935001 wodny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).
  2. Denyer, T., et al.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rek ro linnychsekwencjonowanie pojedynczych kom reksortowanie kom rek aktywowane fluorescencjkom rki korzenia Arabidopsissortowanie protoplast wsekwencjonowanie RNAprotok Smart seq2heterogeniczno typ w kom rekanaliza multiomiczna

Powiązane artykuły