Artykuł metodologiczny

Protokół konstruowania modelu rany szczurzej cukrzycy typu 1

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64914

⸱

17 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Nursing, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Model ran cukrzycowych wywołanych streptozotocyną u samców szczurów SD jest obecnie najczęściej używanym modelem do badania gojenia się ran w cukrzycy typu I. Niniejszy protokół opisuje metody użyte do skonstruowania tego modelu. Przedstawiono również potencjalne wyzwania i omówiono je, a także zbadano progresję i charakterystykę angiogenną ran cukrzycowych.

Streszczenie

Pojedyncza wysoka dawka streptozotocyny, a następnie wycięcie pełnej grubości skóry na grzbiecie szczurów jest powszechną metodą konstruowania zwierzęcych modeli ran cukrzycowych typu 1. Jednak niewłaściwa manipulacja może prowadzić do niestabilności modelu i wysokiej śmiertelności u szczurów. Niestety, istnieje niewiele wytycznych dotyczących modelowania ran cukrzycowych typu 1, brakuje w nich szczegółów i nie przedstawiono konkretnych strategii referencyjnych. Dlatego w niniejszym protokole szczegółowo opisano pełną procedurę konstruowania modelu rany cukrzycowej typu 1 oraz analizowano postęp i charakterystykę angiogenną ran cukrzycowych. Modelowanie rany cukrzycowej typu 1 obejmuje następujące etapy: przygotowanie iniekcji streptozotocyny, indukcję cukrzycy typu 1 oraz budowę modelu rany. Obszar rany zmierzono w 7 i 14 dniu po zranieniu, a tkanki skórne szczurów pobrano do analizy histopatologicznej i immunofluorescencyjnej. Wyniki wykazały, że cukrzyca typu 1 wywołana przez streptozotocynę w dawce 55 mg/kg wiązała się z niższą śmiertelnością i wysokim wskaźnikiem sukcesu. Poziom glukozy we krwi był stosunkowo stabilny po 5 tygodniach indukcji. Szybkość gojenia się ran cukrzycowych była znacznie niższa niż w przypadku normalnych ran w 7. i 14. dniu (p < 0,05), ale w obu przypadkach mogła osiągnąć ponad 90% w 14. dniu. W porównaniu z grupą normalną, zamknięcie warstwy naskórka ran cukrzycowych w 14. dniu było niepełne i opóźniało reepitelializację i znacznie obniżało angiogenezę (p < 0,01). Model rany cukrzycowej typu 1 skonstruowany w oparciu o ten protokół ma cechy przewlekłego gojenia się ran, w tym słabe zamknięcie, opóźnioną reepitelializację i zmniejszoną angiogenezę w porównaniu z normalnymi ranami szczurów.

Wprowadzenie

Cukrzyca typu 1 (T1DM) jest przewlekłą chorobą metaboliczną charakteryzującą się hiperglikemią i niszczeniem komórek β trzustki1. Rana T1DM jest przewlekłą, niegojącą się raną oraz najczęstszym i najbardziej wyniszczającym powikłaniem cukrzycy u ludzi2,3. Modele zwierzęce są najodpowiedniejszymi prototypami do badania zmian patologicznych podczas gojenia się ran oraz bezpieczeństwa i skuteczności potencjalnych środków terapeutycznych4. W porównaniu z innymi typami, samce szczurów Sprague-Dawley (SD) są bardziej wrażliwe na streptozotocynę (STZ) i wykazują niższy wskaźnik śmiertelności z tym związanej, co czyni je popularnymi w badaniach nad ranami cukrzycowymi5,6.

Opisano liczne metody konstruowania modeli ran T1DM. Jeśli chodzi o model T1DM, badania koncentrowały się przede wszystkim na wpływie metody iniekcji STZ na wskaźnik powodzenia indukcji cukrzycy7,8. Jednak proces modelowania cierpi z powodu niespójnego działania tego samego kroku. W jednym z badań szczury pościły przez 18 godzin przed wstrzyknięciem STZ; szczury z poziomem glukozy we krwi wyższym niż 16,67 mmol/L 1 tydzień po wstrzyknięciu STZ zostały uznane za cukrzyce, a rana cukrzycowa została wprowadzona po 3 tygodniach9. I odwrotnie, w powiązanym badaniu, Zhu i in. pościli szczury przez 12 godzin przed wstrzyknięciem STZ; Szczury z poziomem glukozy we krwi wyższym niż 16,7 mmol/L po 72 godzinach od wstrzyknięcia były uważane za cukrzyce, a rana cukrzycowa została wprowadzona po 4 tygodniach10. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją niespójności w protokołach iniekcji STZ, kryteriach diagnozy cukrzycy i czasie wprowadzania rany.

Jeśli chodzi o modelowanie ran, w większości badań, cała grubość skóry grzbietowej jest wycinana w celu stworzenia ran T1DM po udanej indukcji cukrzycy11,12,13. Chociaż model ten jest podatny na przykurcze skóry u szczurów, jest najczęściej stosowanym modelem w badaniach nad gojeniem się ran, ponieważ jest mniej pracochłonny i tani14,15. Niemniej jednak brakuje badań opartych na metodach dotyczących tej techniki wycinania pełnej grubości. Ponadto w istniejących badaniach nie ma jednolitych standardów dotyczących wielkości i lokalizacji rany12,16. Wielkość i lokalizacja rany mogą pośrednio wpływać na spójność projektu doświadczenia i naukową ważność wyników. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania standardowego protokołu indukcji cukrzycy typu 1 i modelowania ran jako punktu odniesienia dla badaczy. Celem tego badania jest wizualizacja specyficznego protokołu modelowania ran w cukrzycy typu 1, który może być wykorzystany jako odniesienie w badaniach nad ranami w cukrzycy typu 1.

Protokół

Protokół został przeprowadzony zgodnie z Deklaracją Helsińską, a wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Zarządzający Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (Rekord nr 2021-13).

1. Przygotowanie iniekcji streptozotocyny

  1. Wybierz 15 szczurów SD wolnych od swoistego dla samców patogenu (SPF) w wieku 8 tygodni i ważących od 220 g ± 20 g. Stosując prostą metodę randomizacji, podziel szczury na grupę z cukrzycą (n = 10) i grupę normalną (n = 5).
  2. Zmierzyć początkową masę ciała szczurów i określić dawkę STZ poprzez podanie 55 mg/kg.
    UWAGA: Na podstawie wstępnych eksperymentów, optymalna dawka STZ wynosi 55 mg/kg.
  3. Dokładnie zważ proszek STZ i umieść go w światłoszczelnym pojemniku.
  4. Dodać odpowiednią ilość buforu cytrynianu sodu o stężeniu 0,1 mol/l (pH 4,5), aby rozpuścić STZ do stężenia 1 %,
    UWAGA: Bufor cytrynianu sodu musi być przed użyciem wstępnie schładzany przez 2 godziny w lodówce o temperaturze 4 °C. Przygotowanie roztworu STZ musi zapewniać sterylność.
  5. Wstrząsaj przez 30 s za pomocą oscylatora leku. Umieść w pojemniku na lód i odstaw na bok.
    UWAGA: Wstrzyknięcie należy zużyć w ciągu 15 minut.

2. Wprowadzenie modelu T1DM

  1. Przed wstrzyknięciem STZ szczury powinny pościć przez 18 godzin i umożliwić swobodny dostęp do wody.
  2. Wykonać wstrzyknięcie dootrzewnowe 1% roztworu STZ.
    1. Chwyć szczura i odsłoń skórę brzucha i miejsce wstrzyknięcia (przecięcie linii łączącej korzenie dwóch ud i linię środkową brzucha).
    2. Zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia dwukrotnie za pomocą wacika nasączonego 75% alkoholem (raz zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a raz przeciwnie do ruchu wskazówek zegara). Umieść głowę szczura poniżej brzucha.
    3. Wprowadzić igłę równolegle do linii środkowej brzucha pod kątem 45°, a po przekłuciu skóry zmniejszyć kąt igły do 30°, a następnie wprowadzić igłę na 2-3 mm. Delikatnie pociągnąć za zatyczkę igły, upewniając się, że do strzykawki nie została zassana krew ani płyn. Wstrzyknąć roztwór STZ, wyciągnąć igłę i zatamować krwawienie bawełnianym wacikiem.
      UWAGA: Jeśli żółty płyn zostanie wciągnięty z powrotem do strzykawki, igła mogła przebić pęcherz, a jeśli zostanie pobrany ciemnozielony płyn, igła może przebić się przez jelito grube lub kątnicę. W każdym przypadku igłę należy natychmiast usunąć. Zwierzę powinno zostać ocenione przez personel weterynaryjny.
  3. Zmierz przypadkowy (na czczo lub na czczo) poziom glukozy we krwi o godzinie 09:00 w dniu 3 i dniu 7 po indukcji STZ.
    UWAGA: Czas losowego pomiaru stężenia glukozy we krwi jest stały. W tym protokole jest on ustalony na godzinę 09:00. Nie jest to jednak jedyny używany czas. Krew pobrana z żyły ogonowej przez nakłucie igłą jest mniej podatna na płyn tkankowy niż krew pobrana z odciętego ogona, więc wartości stężenia glukozy we krwi są dokładniejsze.
    1. Unieruchomij szczura za pomocą stabilizatora szczura (Rysunek 1).
    2. Znajdź lokalizację żyły ogonowej. Zdezynfekuj ogon szczura dwukrotnie za pomocą wacika nasączonego 75% alkoholem.
    3. Nakłuj żyłę ogonową, aby wywołać krwawienie i zmierz poziom glukozy we krwi za pomocą glukometru. Zatamuj krwawienie bawełnianym wacikiem.
      UWAGA: Poziom glukozy wyższy niż 16,7 mmol/L w 7 dniu po wstrzyknięciu STZ jest uważany za T1DM.
  4. Waż szczury co tydzień i mierz poziom glukozy we krwi i inne parametry, w tym dietę, spożycie wody i wydalanie moczu.
  5. Karmić zwierzęta normalnie przez 8 tygodni po indukcji STZ.

3. Budowa modelu rany

  1. Ogol szczury elektryczną maszynką do golenia 1 dzień przed modelowaniem rany. Ogolony obszar o wymiarach 5 cm x 5 cm po stronie grzbietowej szczura jest ogólnie idealny.
  2. Przetrzyj ogolony obszar ciepłym wacikiem z soli fizjologicznej, pozostaw do wyschnięcia, a następnie nałóż krem do depilacji na 5 minut. Oczyść obszar gazą, a resztki kremu do depilacji zmyj ciepłą normalną solą fizjologiczną.
  3. Zważyć szczury i obliczyć wymaganą dawkę Nembutalu w oparciu o normę 35 mg/kg. Rozpuść Nembutal za pomocą zwykłej soli fizjologicznej do stężenia 3%. Do tej procedury można użyć innych środków znieczulających ogólnie, takich jak ketamina/ksylazyna lub izofluran. Prosimy o współpracę z Instytucjonalnymi Komitetami ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania, aby zapewnić to, co najlepsze.
    UWAGA: Aby zapewnić skuteczność, roztwór powinien być świeżo przygotowany, a proszek i roztwór Nembutal należy chronić przed światłem.
  4. Pościć szczury przez 12 godzin przed znieczuleniem. Wstrzyknąć znieczulenie dootrzewnowe. Stosować tetracyklinową maść do oczu lub ogólny lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu po podaniu znieczulenia.
    UWAGA: Znieczulenie uważano za umiarkowane, gdy mięśnie szczura były stosunkowo rozluźnione, ruchy gałek ocznych znikały, oddech był regularny, a reakcja na bolesne bodźce była niewielka.
  5. Zdezynfekuj skórę grzbietową dwukrotnie za pomocą wacików nasączonych jodem (raz zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a raz przeciwnie do ruchu wskazówek zegara) i 75% alkoholem (alternatywne krążki).
  6. Po wyschnięciu przeciąć skórę okrągłym dziurkiem do biopsji o średnicy 20 mm.
  7. Zabezpiecz skórę sterylnymi kleszczami, a następnie użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby usunąć skórę o pełnej grubości wzdłuż śladów po przebiciu. Zatrzymaj krwawienie zwykłym wacikiem z soli fizjologicznej.
    UWAGA: Górna granica rany powinna znajdować się 5-10 mm poniżej dolnej granicy szkaplerza i 5-10 mm na prawo/lewo od kręgosłupa szczura (Ryc. 2). Rany są symetryczne wzdłuż kręgosłupa, gdy zbudowane są dwie rany.
  8. Użyj gazy wazelinowej do zakrycia ran i owiń je gazą i oddychającym bandażem przytrzymywanym gumową taśmą. Karprofen należy wstrzykiwać podskórnie (5 mg/kg) raz na dobę w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego. Zmieniaj bandaż na ranę raz dziennie (stosowanie karprofenu w celu złagodzenia bólu).
    UWAGA: Obserwuj ruchy i oddech szczura pod kątem wszelkich nieprawidłowości po zakończeniu bandażowania i upewnij się, że oddychający bandaż jest odpowiednio napięty.
  9. Umieść linijkę pod raną i fotografuj ranę aparatem cyfrowym do 14 dnia. Poddaj szczury eutanazji w 14 dniu zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich użytkowania. Przeciąć tkankę skórną rany w odległości 5 mm od krawędzi rany. Podziel próbkę tkanki na dwie części, umyj je PBS w celu usunięcia widocznych plam krwi, a następnie utrwal je 4% roztworem paraformaldehydu.

4. Obliczanie powierzchni rany za pomocą oprogramowania ImageJ

  1. Kliknij przycisk Plik po otwarciu oprogramowania, a następnie rozwiń i kliknij Otwórz, aby otworzyć zdjęcia ran
    2. .
  2. Wybierz narzędzie Prosto i narysuj linię prostą o długości 1 cm wzdłuż linijki na obrazkach z ranami.
  3. Kliknij polecenie Ustaw skalę w menu Analizuj i ustaw znaną odległość na 1.
  4. Wybierz narzędzie Zaznaczanie odręczne i naszkicuj kontur rany na obrazie.
  5. Kliknij polecenie Zmierz w menu Analizuj i odczytaj wartość Obszar po wyświetleniu wyniku.

5. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E)

  1. Usuń tkankę skórną z utrwalacza, pokrój ją na cienkie kawałki skalpelem w dygestorium i umieść w kasecie odwadniającej.
  2. Umieść kasetę odwadniającą w maszynie do odwadniania i odwodnij tkanki w następujących krokach: 75% alkoholu przez 4 godziny; 85% alkoholu przez 2 godziny; 90% alkoholu przez 2 godziny; 95% alkoholu przez 1 h; bezwodny etanol I i II przez 30 minut każdy; alkohol benzen przez 5-10 minut; ksylen I i II po 5-10 minut; i wosk I, II i III po 1 godzinie.
  3. Zanurz tkanki w wosku. Schłodzić w temperaturze -20° na stole do zamrażania i starannie poprawić blok wosku.
  4. Bloki wosku pociąć wzdłużnie za pomocą maszyny do cięcia parafiny na odcinki o grubości 3 μm.
  5. Sekwencyjnie moczyć sekcję w ksylenie I i II przez 20 minut każda, bezwodnym etanolu I i II przez 5 minut każdy, a wodę z kranu przez 5 minut.
  6. Zalej tkanki barwnikiem hematoksylinowym przez 3-5 minut, 0,5% wodny roztwór kwasu solnego rozcieńcz, 0,5% wodny roztwór amoniaku z powrotem do niebieskiego koloru i spłucz wodą.
  7. Odwodnić skrawki tkanek 85% i 95% alkoholem. Zalej tkanki roztworem barwiącym eozynę przez 5 min.
    UWAGA: Zwykle barwienie eozyną trwa od 30 s do 2 minut, a czas można dostosować do wyników barwienia i wymagań.
  8. Odwodnić skrawki kolejno następującymi roztworami: etanol bezwodny I, etanol bezwodny II, etanol bezwodny III, ksylen I i ksylen II, każdy przez 5 minut. Na koniec przykryj szkiełka neutralnym balsamem.
  9. Zbadaj tkanki barwione H&E pod mikroskopem przy 40x, 20x i 10x i zrób zdjęcia, aby zachować reprezentatywne obrazy każdego szkiełka.

6. Barwienie immunofluorescencyjne CD31

  1. Namocz skrawki tkanki w ksylenie I i II przez 15 minut każdy, bezwodnym etanolu I i II po 5 minut, 85% alkoholu przez 5 minut i 75% alkoholu przez 5 minut, a następnie spłucz wodą destylowaną.
  2. Naprawa antygenu
    1. Dodać odpowiedni 10 mM bufor kwasu cytrynowego o pH 6,0 do pojemnika kuchenki mikrofalowej, podgrzać go do wrzenia na wysokim poziomie, a następnie umieścić w nim szkiełko szklane.
    2. Gotować przez 8 minut na średnim ogniu, zatrzymać na 8 minut, a następnie ponownie gotować na średnim ogniu przez 7 minut.
    3. Pozwól szkiełkom ostygnąć, umieść je w PBS (pH 7,4) i umyj je trzy razy przez 5 minut za pomocą wytrząsarki do odbarwiania.
  3. Dodaj kroplami 5% koziej surowicy do koła i inkubuj przez 30 minut.
  4. Delikatnie strząsnąć roztwór zamykający (5% koziej surowicy) i stopniowo dodawać na skrawki królicze przeciwciało anty-CD31 (rozcieńczone przy użyciu PBS w stosunku 1:200). Umieścić skrawki w wilgotnym pudełku i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.
  5. Umyj szkiełka trzykrotnie PBS (pH 7,4) na wytrząsarce do odbarwiania przez 5 minut każda. Lekko potrząśnij sekcjami, aby je wysuszyć, a następnie przykryj je okrągłą kroplą koziej anty-króliczej IgG z oznaczeniem FITC. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 50 minut w ciemności.
  6. Umyj szkiełka trzykrotnie PBS (pH 7,4) na wytrząsarce do odbarwiania przez 5 minut każda. Wysuszyć skrawki na powietrzu, lekko potrząsając i dodać roztwór barwiący DAPI. Inkubować sekcje w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Po wysuszeniu skrawków narysuj kółka wokół tkanki za pomocą PepPen (aby zapobiec utracie przeciwciał), dodaj do kółek środek gaszący autofluorescencyjną (0,3% Sudan Black B) przez 5 minut, a następnie płucz je pod bieżącą wodą przez 10 minut.
  8. Umyj szkiełka trzykrotnie PBS (pH 7,4) na wytrząsarce do odbarwiania przez 5 minut każda. Lekko potrząśnij sekcjami i uszczelnij je środkiem montażowym zapobiegającym blaknięciu.
  9. Obserwuj i fotografuj skrawki pod mikroskopem fluorescencyjnym przy 40x, 20x i 10x.
    UWAGA: Długość fali wzbudzenia DAPI UV wynosi 330-380 nm, a długość fali emisji wynosi 420 nm (światło niebieskie). Długość fali wzbudzenia FITC wynosi 465-495 nm, a długość fali emisji 515-555 nm (światło zielone).

7. Analiza statystyczna

  1. Zbieraj i analizuj dane za pomocą SPSS.
  2. Podać dane jako średnią ± odchylenie standardowe.
  3. Użyj testu t dla niezależnych prób, aby przeanalizować różnice między grupami chorych na cukrzycę a grupą normalną.
  4. Ustaw istotność statystyczną na **p < 0,01 i *p < 0,05.

Wyniki

Łącznie 10 szczurów szczepu SD otrzymało pojedynczy wtrysk wewnątrzbrzuszny STZ w celu indukcji modelu T1DM. Jeden szczur padł przedwcześnie (10%), jednak cukrzyca została wywołana u wszystkich szczurów (100%). Po 3 dniach od iniekcji STZ poziom glukozy we krwi wszystkich szczurów przekroczył 16,7 mmol/L, a poziomy glukozy ustabilizowały się 5 tygodni po indukcji (Rysunek 3A). Masa ciała w grupie cukrzycowej stopniowo rosła po iniekcji STZ, lecz spadła w 3. tygodniu, a następnie ponownie powoli zaczęła rosnąć od 4. tygodnia (Rysunek 3B). W przeciwieństwie do nich, masa ciała szczurów w grupie kontrolnej zwiększała się stale, a ich średnia masa ciała 3 dni po indukcji cukrzycy była wyższa niż w grupie cukrzycowej (Rysunek 3B). Wszystkie cukrzycowate szczury wykazywały typowe objawy pragnienia, wielomoczu i utraty masy ciała, co jest zgodne z wynikami uzyskanymi przez Hao i współpracowników17.

W 7. i 14. dniu po zranieniu analiza makroskopowa wykazała, że reepitelializacja była bardziej wyraźna u szczurów z grupy prawidłowej niż z grupy cukrzycowej (Rycina 4A). Wyniki ilościowe wykazały, że tempo gojenia ran było znacznie niższe w grupie cukrzycowej niż w grupie prawidłowej w 7. i 14. dniu (p < 0,01). Jednak w 14. dniu tempo gojenia ran mogło przekroczyć 90% również w grupie cukrzycowej (p < 0,05, Rycina 4B). Sugeruje to, że model rany w T1DM charakteryzuje się słabym zamykaniem się rany, lecz nie w stopniu odpowiadającym przewlekłemu brakowi gojenia obserwowanemu w cukrzycowych ranach u ludzi.

H&Barwienie na #38;E w 14. dniu gojenia rany ujawniło niepełny naskórek rany, spowolnioną proliferację keratynocytów oraz opóźnioną reepitelializację w grupie z cukrzycą w porównaniu z grupą prawidłową. W ranach grupy z cukrzycą stwierdzono częściową utratę mieszków włosowych i gruczołów łojkowych. Widoczne były również nieliczne kapilary (Rysunek 5).

Cukrzyca powoduje dysfunkcję komórek śródbłonka, glikozylację białek macierzy zewnątrzkomórkowej oraz denerwację naczyniową18. Powikłania te prowadzą do niższej niż normalnie angiogenezy w ranach cukrzycowych18. Angiogeneza jest niezbędna do gojenia ran, a angiogenezę w ranie często analizuje się za pomocą immunobarwienia CD31 (Rysunek 6A)19,20. Na podstawie średniej gęstości optycznej (AOD) ekspresji CD31 stwierdzono, że angiogeneza w miejscu rany była znacząco wyższa w grupie zdrowej niż w grupie z cukrzycą (p < 0,01, Rysunek 6B).

figure-results-1
Rysunek 1: Zdjęcie szczurów unieruchomionych za pomocą stabilizatorów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat lokalizacji rany u szczura. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Poziomy glukozy we krwi i masa ciała szczurów doświadczalnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Rany pełnej grubości skóry (o średnicy 20 mm) na grzbietach szczurów doświadczalnych. (A) Makroskopowy wygląd ran w dniu 0, dniu 7 i dniu 14. Obrazy morfologii ran w dniu 0, dniu 7 i dniu 14 zostały wykonane aparatem cyfrowym. (B) Pole powierzchni rany zmierzono przy użyciu oprogramowania ImageJ i wykorzystano do obliczenia tempa gojenia ran. Tempo gojenia rany (%) obliczono w następujący sposób: (początkowe pole rany − pole rany w wskazanym punkcie czasowym)/początkowe pole rany × 100. Wartości przedstawiono jako średnia ± SD (n = 14). Istotność statystyczną określono jako ** p < 0.01 oraz * p < 0.05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5Reprezentatywne obrazy histopatologiczne H&Obrazy E w 14. dniu po utworzeniu rany. Niebieskie strzałki wskazują naczynia włosowate. Czerwone strzałki pokazują proliferację keratynocytów. Skala po lewej stronie: jeden pasek = 200 µm; skala po prawej: jeden pasek = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Analiza barwienia immunofluorescencyjnego w celu oceny ekspresji CD31. Poziomy CD31 wykorzystano do określenia stanu angiogenezy. (A) Reprezentatywne obrazy barwienia immunofluorescencyjnego CD31 w grupach cukrzycowej i normalnej. Zintegrowaną gęstość optyczną (IOD) oraz pole powierzchni w pikselach (AREA) dla każdej próbki skóry obliczono przy użyciu oprogramowania Image-Pro Plus 6.0. Wyznaczono również średnią gęstość optyczną (AOD) (AOD = IOD/AREA). Wartość AOD była wprost proporcjonalna do pozytywnej ekspresji CD31. (B) Ilościowe porównanie pozytywnej ekspresji CD31 w grupach cukrzycowej i normalnej. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. ** p < 0.01. Skala: jeden pasek = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Protokół ten wyjaśnia sporne operacje w modelowaniu ran w cukrzycy typu 1. W pracy tej omówiono obawy dotyczące protokołów iniekcji STZ, kryteriów powodzenia indukcji cukrzycy typu 1, czasu stabilizacji stężenia glukozy we krwi oraz lokalizacji i wielkości rany. Ponadto doprecyzowano charakterystykę patologiczną i mierzalne parametry oceny gojenia się ran w cukrzycy typu 1.

Szczury pościły przez 18 godzin przed wstrzyknięciem STZ, aby uniknąć konkurencyjnego wiązania glukozy lub jej analogów z komórkami β, co mogłoby wpłynąć na skuteczność STZ. Najczęściej stosowaną metodą indukcji cukrzycy typu 1 jest pojedyncza duża dawka STZ, która zwiększa poziom glukozy we krwi poprzez uszkodzenie wysp trzustkowych i zmniejszenie wydzielania insuliny21. Badania przedeksperymentalne wykazały, że optymalna dawka STZ dla wysokiego wskaźnika sukcesu i niskiej śmiertelności wynosiła 55 mg/kg, czyli mniej niż optymalne dawki zgłoszone w poprzednich badaniach 22,23,24. W tym protokole cukrzycę typu 1 indukowano za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia dootrzewnowego w dawce 55 mg/kg STZ.

Poziom glukozy we krwi był wyższy niż 16,7 mmol/L 3 dni po wstrzyknięciu STZ. Jednak poziom glukozy we krwi wyższy niż 16,7 mmol/L w 7. dniu po wstrzyknięciu STZ jest zalecanym kryterium udanego modelowania cukrzycy typu 1, ponieważ zakres uszkodzenia wysp trzustkowych różni się u szczurów, a odpowiednie wydłużenie czasu diagnostyki może zmniejszyć odsetek wyników fałszywie ujemnych. Ponadto wahania stężenia glukozy we krwi ustabilizowały się 5 tygodni po wstrzyknięciu STZ, a szczury stopniowo przybierały na wadze w tym okresie, zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami25,26. Oznacza to, że poziom glukozy we krwi w modelu T1DM powinien być ustabilizowany przez co najmniej 6 tygodni, a wzrost masy ciała szczura po 6 tygodniach zmniejsza śmiertelność podczas modelowania rany. W związku z tym w protokole tym przeprowadzono modelowanie rany 8 tygodni po wstrzyknięciu STZ.

Wskaźnik zamykania się ran w 7. i 14. dniu po zranieniu był znacznie niższy u chorych na cukrzycę niż w grupie z prawidłową raną, co wskazuje na powolne gojenie. Co więcej, reepitelializacja rany i angiogeneza były istotnie niższe u diabetyków niż w grupie prawidłowej. Pokazuje to, że model rany T1DM wykazuje wolniejsze gojenie się ran i opóźnioną reepitelializację niż u normalnych szczurów, co może być związane z patologicznymi zmianami zmniejszonej angiogenezy ran. Jednak w 14. dniu tempo gojenia się ran T1DM również przekraczało 90%, co różni się od przewlekłego niegojenia charakterystycznego dla ludzkich ran cukrzycowych. Może to wynikać z faktu, że fizjologiczne mechanizmy gojenia się ran u gryzoni różnią się od mechanizmów stosowanych u ludzi27. W związku z tym najlepsza średnica rany wynosi co najmniej 20 mm, co jest wystarczająco duże, aby dać czas na ocenę skuteczności interwencji w badaniu ran cukrzycowych. Lokalizacja rany powinna omijać łopatkę i kręgosłup, ponieważ ciągły ruch w tych dwóch miejscach może zakłócić gojenie się rany.

Podsumowując, budowa modelu rany T1DM z wykorzystaniem metody tego protokołu jest skuteczna. Protokół powiela niektóre cechy przewlekłych ran cukrzycowych, takie jak wolniejsze gojenie się ran, opóźniona reepitelializacja i zmniejszona angiogeneza w porównaniu z normalnymi ranami szczurów. Nie wiadomo jednak, czy model może replikować inne przewlekłe fenotypy ran cukrzycowych. Ponadto protokół ten opisuje najbardziej podstawową i szeroko stosowaną metodę, która nie uwzględnia problemu skurczu skóry u szczurów. Przyszłe badania mogą włączyć do tego protokołu stosowanie szyn na rany lub zbadać dodatkowe modele przewlekłych ran cukrzycowych, co będzie poważnym wyzwaniem dla naukowców w przyszłości.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy oświadczają, że w niniejszym manuskrypcie nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

To badanie było finansowane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82104877).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Środek zapobiegający blaknięciuSouthern Biotechnology Associates, Inc.0100-01
AutoFluo QuencherServicebio Technology co., Ltd.G1221
Automatyczny barwnik do szkiełekThermo Fisher Scientific Inc.Varistain&handel; Gemini ES
CD31Servicebio Technology co., Ltd.GB11063-2
Roztwór do odzyskiwania antygenu cytrynianowegoServicebio Technology co., Ltd.G1201
Szkło nakrywkoweCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd.10212432C
DAPIServicebio Technology co., Ltd.G1012
Shaker do odbarwianiaScilogexS1010E
Krem do depilacjiGuangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd.—
DimetylobenzenChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.64-17-5
Oscylator lekówShenzhen Jiashi Technology Co., Ltd.VM-370
Elektryczna maszynka do goleniaShanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd.FC5908
Maszyna do zatapianiaWuhan Junjie Electronics Co., Ltd.JB-P5
Absolut etanoluChengdu Kelong Chemical Co., Ltd.1330-20-7
Koza anty-królicza z oznaczeniem Fitc IgGServicebio Technology co., Ltd.
Kozia surowicaThermo Fisher Scientific Inc.
Roztwór do barwienia hematoksyliny i eozynyBeijing Regan Biotechnology Co., Ltd.DH0020
Oprogramowanie Image JNarodowe Instytuty Zdrowia—
Kuchenka mikrofalowaMidea Group Co., Ltd. M1-L213B
Mini wirówkaScilogexD1008
Neutralny balsamSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004160
bufor PBSBiosharpG4202
Przenośny glukometrSinocare Inc.GA-3
Szybki procesor tkanekThermo Fisher Scientific Inc.STP420 ES
Stabilizator szczurówGlobalebio (Beijing) Technology co., LtdGEGD-Q10G1
KrajalnicaThermo Fisher Scientific Inc.HM325
Szkło szkiełkoweCitotest Labware Manufacturing Co., Ltd.80312-3181
Bufor cytrynianu soduBeijing Solarbio Science & Technologia Co., Sp. z o.o.c1013
StreptozotocynaSigma57654595
GB2230316210064

Bibliografia

  1. Zimmet, P., Alberti, K. G., Shaw, J. Global and societal implications of the diabetes epidemic. Nature. 414 (6865), 782-787 (2001).
  2. Grennan, D. Diabetic foot ulcers. Journal of the American Medical Association. 321 (1), 114(2019).
  3. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 265sr6(2014).
  4. Patel, S., Srivastava, S., Singh, M. R., Singh, D. Mechanistic insight into diabetic wounds: Pathogenesis, molecular targets and treatment strategies to pace wound healing. Biomedicine & Pharmacotherapy. 112, 108615(2019).
  5. Deeds, M. C., et al. Single dose streptozotocin-induced diabetes: Considerations for study design in islet transplantation models. Laboratory Animals. 45 (3), 131-140 (2011).
  6. Chao, P. C., et al. Investigation of insulin resistance in the popularly used four rat models of type-2 diabetes. Biomedicine & Pharmacotherapy. 101, 155-161 (2018).
  7. Furman, B. L. Streptozotocin-induced diabetic models in mice and rats. Current Protocols. 1 (4), e78(2021).
  8. Wu, J., Yan, L. J. Streptozotocin-induced type 1 diabetes in rodents as a model for studying mitochondrial mechanisms of diabetic β cell glucotoxicity. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 8, 181-188 (2015).
  9. Yang, J., Chen, Z., Pan, D., Li, H., Shen, J. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cell-derived exosomes combined pluronic F127 hydrogel promote chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. International Journal of Nanomedicine. 15, 5911-5926 (2020).
  10. Zhu, Y., Wang, Y., Jia, Y., Xu, J., Chai, Y. Roxadustat promotes angiogenesis through HIF-1α/VEGF/VEGFR2 signaling and accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats. Wound Repair and Regeneration. 27 (4), 324-334 (2019).
  11. Shao, Z., et al. Wound microenvironment self-adaptive hydrogel with efficient angiogenesis for promoting diabetic wound healing. Bioactive Materials. 20, 561-573 (2022).
  12. Asfour, H. Z., et al. Enhanced healing efficacy of an optimized gabapentin-melittin nanoconjugate gel-loaded formulation in excised wounds of diabetic rats. Drug Delivery. 29 (1), 1892-1902 (2022).
  13. Wei, L., et al. Mesenchymal stem cells promote wound healing and effects on expression of matrix metalloproteinases-8 and 9 in the wound tissue of diabetic rats. Stem Cells and Development. 32 (1-2), 25-31 (2022).
  14. Pastar, I., et al. Preclinical models for wound-healing studies. In Skin Tissue Models., edited by. , Academic Press. Cambridge, MA. 223-253 (2018).
  15. Yang, R. H., et al. Epidermal stem cells (ESCs) accelerate diabetic wound healing via the Notch signalling pathway. Bioscience Reports. 36 (4), e00364(2016).
  16. Suliman Maashi, M., Felemban, S. G., Almasmoum, H. A., Jarahian, M. Nicaraven-loaded electrospun wound dressings promote diabetic wound healing via proangiogenic and immunomodulatory functions: A preclinical investigation. Drug Delivery and Translational Research. 13 (1), 222-236 (2023).
  17. Hao, M., Ding, C., Sun, S., Peng, X., Liu, W. Chitosan/sodium alginate/velvet antler blood peptides hydrogel promotes diabetic wound healing via regulating angiogenesis, inflammatory response and skin flora. Journal of Inflammation Research. 15, 4921-4938 (2022).
  18. Kolluru, G. K., Bir, S. C., Kevil, C. G. Endothelial dysfunction and diabetes: Effects on angiogenesis, vascular remodeling, and wound healing. International Journal of Vascular Medicine. 2012, 918267(2012).
  19. Okonkwo, U. A., DiPietro, L. A. Diabetes and wound angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1419(2017).
  20. Yi, C., et al. Targeted inhibition of endothelial calpain delays wound healing by reducing inflammation and angiogenesis. Cell Death & Disease. 11 (7), 533(2020).
  21. Goodson 3rd, W. H., Hung, T. K. Studies of wound healing in experimental diabetes mellitus. Journal of Surgical Research. 22 (3), 221-227 (1977).
  22. Luippold, G., Klein, T., Mark, M., Empagliflozin Grempler, R. a novel potent and selective SGLT-2 inhibitor, improves glycaemic control alone and in combination with insulin in streptozotocin-induced diabetic rats, a model of type 1 diabetes mellitus. Diabetes, Obesity & Metabolism. 14 (7), 601-607 (2012).
  23. Sayed, N., et al. Effect of dapagliflozin alone and in combination with insulin in a rat model of type 1 diabetes. The Journal of Veterinary Medical Science. 82 (4), 467-474 (2020).
  24. Han, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells implantation accelerates cutaneous wound healing in diabetic rats via the Wnt signaling pathway. European Journal of Medical Research. 24 (1), 10(2019).
  25. Ansell, D. M., Marsh, C., Walker, L., Hardman, M. J., Holden, K. Evaluating STZ-induced impaired wound healing in rats. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 994-997 (2018).
  26. Liu, Y., et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells not only ameliorate blood glucose but also protect vascular endothelium from diabetic damage through a paracrine mechanism mediated by MAPK/ERK signaling. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 258(2022).
  27. Zindle, J. K., Wolinsky, E., Bogie, K. M. A review of animal models from 2015 to 2020 for preclinical chronic wounds relevant to human health. Journal of Tissue Viability. 30 (3), 291-300 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wstrzykni cie streptozotocynygojenie ran cukrzycowychwyci cie pe nej grubo ci sk rypomiar glikemiireepitelializacjaangiogeneza w raniebarwienie immunohistochemiczne CD31model rany przewlek ej

Powiązane artykuły