Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Ostatnia dekada była naznaczona światowym rozprzestrzenianiem się jednokomórkowych podejść do biologii komórkowej i molekularnej. Podążając śladami genomiki pojedynczej komórki^1,2, obecnie możliwe jest badanie wielu składników pojedynczej komórki (np. DNA, RNA, białek), dzięki nowym technikom -omicznym pojedynczych komórek, które rozwijają się każdego roku. Techniki te rzuciły światło na stare i nowe pytania w dziedzinach immunologii, neurobiologii, onkologii i innych, zarówno przy użyciu komórek organizmu ludzkiego, jak i modelowego³. Podkreślając różnice między poszczególnymi komórkami, -omika pojedynczej komórki skłoniła do zdefiniowania nowego modelu hematopoezy, skoncentrowanego na heterogeniczności hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) i odchodzącego od klasycznego modelu dyskretnych jednorodnych populacji^4,5.

Jedną z niewielu wad wszystkich technik -omicznych jest zniszczenie interesującej komórki, co uniemożliwia ocenę jej funkcjonalności. Z drugiej strony, inne metody jednokomórkowe, takie jak test przeszczepu pojedynczej komórki i technologie śledzenia linii, zapewniają odczyt funkcjonalności komórki przodka poprzez ocenę losu poszczególnych komórek in vivo^6,7. Technologie śledzenia linii polegają na oznaczaniu interesującej komórki dziedzicznym genetycznym ⁷ lub fluorescencyjnym label^8,9, co pozwala na śledzenie losu wielu pojedynczych komórek w tym samym czasie. Jednak charakterystyka komórek wyjściowych jest zwykle ograniczona do ograniczonej liczby parametrów, takich jak ekspresja kilku białek powierzchniowych oceniana za pomocą cytometrii przepływowej¹⁰. Ponadto technologie śledzenia linii pojedynczych komórek wymagają pracochłonnego wykrywania znacznika komórkowego, zwykle za pomocą sekwencjonowania lub obrazowania DNA/RNA. W szczególności ten ostatni punkt ogranicza liczbę warunków, które można przetestować w jednym eksperymencie.

Inną klasą metod, które są używane do badania funkcjonalności pojedynczych komórek, są systemy hodowli komórkowych ex vivo pojedynczych HSPC. Łatwe do wykonania, te złote standardy obejmują sortowanie pojedynczych komórek do 96-dołkowych naczyń do hodowli komórkowych, a po hodowli, charakteryzując fenotyp potomstwa komórki, zazwyczaj za pomocą cytometrii przepływowej lub analizy morfologicznej. Testy te były najczęściej używane do scharakteryzowania długoterminowego różnicowania HSPC w dojrzałe komórki, zwykle po 2-3 tygodniach hodowli^11,12. Alternatywnie, zostały one wykorzystane do próby utrzymania i rozbudowy ex vivo HSPCs^{13,14,15,16,17,18}, z obietnicą korzyści medycznych dla przeszczepu ludzkich komórek macierzystych¹⁹. Wreszcie, wykorzystano je do zbadania wczesnego zaangażowania HSPC przy użyciu hodowli krótkoterminowej²⁰, przy czym głównym czynnikiem ograniczającym jest niska liczba komórek generowanych w tej hodowli. Jedną z wad tych różnych rodzajów testów ex vivo jest to, że tylko częściowo odzwierciedlają one złożoność in vivo; mimo to są jednym z rzadkich sposobów badania różnicowania ludzkiego HSPC.

Jedną z brakujących informacji w istniejących metodach jednokomórkowych (pojedyncza komórka-omika, śledzenie linii i hodowla ex vivo) jest dokładne wykrywanie podziałów komórkowych, niezbędny parametr do rozważenia podczas badania dynamiki HSPC²¹. Prostym sposobem oceny liczby podziałów za pomocą cytometrii przepływowej jest użycie rozpuszczalnych "barwników białkowych", takich jak ester sukcynimidylowy dioctanu 5-(i 6)-karboksyfluoresceiny (CFSE)22. Te barwniki podziałowe dyfundują wewnątrz cytoplazmy barwionych komórek i rozcieńczają się o połowę i przechodzą do dwóch komórek potomnych przy każdym podziale komórki, co pozwala wyliczyć do 10 podziałów. Łącząc kilka barwników podziałowych, możliwe jest wysiewanie wielu indywidualnych przodków w tej samej studzince, ponieważ każdy pojedynczy barwnik umożliwia separację różnych potomków. Jest to zasada stojąca za użyciem barwników komórkowych do klonalnego multipleksowania i śledzenia podziałów, która została po raz pierwszy wprowadzona dla mysich limfocytów^23,24.

Tutaj prezentujemy rozwój testu MultiGen do użytku z mysimi i ludzkimi HSPC. Pozwala na jednoczesne badanie wielu pojedynczych komórek pod kątem ich właściwości różnicowania, podziału i pokrewieństwa ex vivo. Ten wysokoprzepustowy, łatwy do wykonania i niedrogi test pozwala jednocześnie zmierzyć fenotyp komórkowy, liczbę przeprowadzonych podziałów oraz pokrewieństwo komórek i pokrewieństwo klonalne z innymi komórkami w studni. Może być wykorzystany do ilościowej oceny symetrycznego i asymetrycznego zaangażowania losu, równowagi między samoodnawianiem a zróżnicowaniem oraz liczby podziałów niezbędnych dla danego losu zobowiązania. Protokół wymaga aktywowanego fluorescencją sortownika komórek (FACS) i cytometru przepływowego z czytnikiem płytek, a także sprzętu niezbędnego do przeprowadzenia hodowli komórkowej. Oprócz protokołu technicznego do wykonania testu na ludzkich HSPC, zapewniamy również szczegółowe ramy analizy, w tym testy statystyczne niezbędne do oceny właściwości komórkowych związanych z koncepcją rodziny komórek²⁵. Protokół ten został już z powodzeniem wykorzystany do opisania mysiego przedziału HSPC^26,27.

Poniższy protokół wykorzystuje magnetycznie wzbogacone komórki CD34⁺ jako materiał wyjściowy²⁸. W ten sposób możliwe jest skuteczne barwienie i izolowanie ludzkich HSPC z różnych źródeł krwi (np. krwi pępowinowej, szpiku kostnego, krwi obwodowej). Ważne jest, aby nie odrzucać frakcji CD34^-, ponieważ będzie ona używana jako część protokołu do ustawiania różnych typów kontroli eksperymentalnych. Wspomniane ilości i objętości komórek można skalować w górę lub w dół, zgodnie z eksperymentalnym przepływem pracy i potrzebami. Podobnie, protokół można dostosować do badania różnych typów komórek progenitorowych, po prostu modyfikując przeciwciała używane do etapów sortowania komórek i cytometrii przepływowej.

Dla poniższego protokołu, jako źródło HSPC użyto pozbawionej identyfikacji krwi pępowinowej i pobrano ją zgodnie z wytycznymi określonymi przez biobank krwi pępowinowej szpitala Saint-Louis (autoryzacja AC-2016-2759) oraz z Deklaracją Helsińską.

UWAGA: Zanim zaczniesz, upewnij się, że wszystkie odczynniki i sprzęt niezbędny do tego protokołu są dostępne, zgodnie z listą w Tabeli materiałów i wymienionymi w protokole. Odpowiednie odczynniki należy przygotować w stanie świeżym i nie przechowywać ich, chyba że jest to wyraźnie zaznaczone.

1. Barwienie barwnikiem komórkowym

UWAGA: Ta sekcja opisuje barwienie czterema kombinacjami barwników CFSE i fioletowych barwników (CTV) do podziału komórek. Przetwarzaj wszystkie probówki jednocześnie, nawet jeśli nie dodano roztworu barwnika komórkowego. Wszystkie etapy są wykonywane w sterylnych warunkach, aby umożliwić kolejny etap hodowli komórkowej. Wymagany czas: ok. 100 min.

1. Przetwarzaj jednostkę krwi pępowinowej zgodnie z protokołem sortowania magnetycznego²⁹. Upewnij się, że dostępne są dwie frakcje: duża frakcja CD34^- i mniejsza frakcja CD34⁺. Wiruj obie probówki przez 5 minut przy 300 x g. Odessać supernatant bez naruszania osadu.
2. W przypadku frakcji CD34⁺ należy ją ponownie zawiesić w 1 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Policz komórki za pomocą hemocytometru; gęstość komórek nie powinna być większa niż 3 x 10⁶ komórek/ml. W takim przypadku odpowiednio dostosuj głośność. W przypadku frakcji CD34^- ponownie zawiesić w DMEM bez FBS i dostosować objętość do maksymalnie 6 x 10⁶ komórek/ml.
3. Porcjować 250 μl frakcji CD34⁺ do czterech probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml. Oznacz probówki w następujący sposób: CD34⁺/CF (CFSE_only), CD34⁺/CV (CFSE_high CTV_low), CD34⁺/VC (CFSE_low CTV_high) i CD34⁺/VI (CTV_high). Podzielić 250 μl frakcji CD34^- na kolejne cztery probówki polipropylenowe o pojemności 15 ml. Oznacz probówki w następujący sposób: CD34^-/CF (CFSE_only), CD34^-/CV (CFSE_high CTV_low), CD34^-/VC (CFSE_low CTV_high) i CD34^-/VI (CTV_high). Pozostałe komórki z frakcji CD34^- można wyrzucić.
4. Przygotuj dwa rozwiązania CFSE o nazwach CFSE_high i CFSE_low. W przypadku CFSE_high (10 μM) zmieszać 1,1 ml DMEM bez FBS z 2,2 μl roztworu podstawowego CFSE (5 mM). W przypadku CFSE_low (5 μM) zmieszaj 550 μl DMEM bez FBS i 0,55 μl roztworu podstawowego CFSE (5 mM).
5. Dodać 250 μl roztworu CFSE_high do probówek CF i CV, 250 μl roztworu CFSE_low do probówek VC i 250 μl DMEM bez FBS do probówki VI. Aby zapewnić wydajne połączenie zawiesiny komórkowej i barwnika komórkowego, nachyl rurkę o prawie 90 stopni i umieść roztwory CFSE na ściance rurki. Następnie trzymaj probówkę pionowo, aby wymieszać dwa roztwory i pipetuj trzy lub cztery razy, aby zapewnić szybkie wymieszanie roztworów CFSE z ponownie zawieszonymi komórkami. Inkubować w temperaturze 37 °C dokładnie przez 8 minut.
6. Po inkubacji dodać 5 ml DMEM + 10% FBS. Probówki należy przechowywać w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
7. Wiruj rurki przez 5 minut przy 300 x g. Usunąć supernatant przez aspirację bez naruszania osadu i przemyć osad 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1x/kwas etylenodiaminotetraoctowy (PBS 1x/EDTA). Wirować ponownie przez 5 minut przy 300 x g. Wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić osad komórkowy w 250 μl 1x PBS / EDTA.
8. Przygotuj dwa rozwiązania CTV, nazwane CTV_high i CTV_low. Aby uzyskać CTV_high (10 μM), wymieszaj 1,1 ml PBS 1x/EDTA i 2,2 μl materiału CTV (5 mM). W przypadku CTV_low (5 μM) zmieszaj 550 μl PBS 1x/EDTA z 0,55 μl bulionu CTV (5 mM).
9. Dodać 250 μl roztworu CTV_high do probówek VC i VI, 250 μl roztworu CTV_low do probówki CV i 250 μl 1x PBS / EDTA do probówki CF. Użyj tej samej techniki, która została opisana w kroku 1.5. Inkubować w temperaturze 37 °C dokładnie przez 8 minut.
10. Po inkubacji dodać 5 ml DMEM + 10% FBS. Przechowywać w temperaturze 37 °C przez 5 min.
11. Wirować probówki przez 5 minut przy 300 x g, wyrzucić supernatant bez naruszania osadu, a następnie przemyć osad 5 ml 1x PBS /EDTA. Wirować ponownie przez 5 minut przy 300 x g.
12. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić frakcje CD34^- w 1x PBS / EDTA do końcowego stężenia 1,5 x 10⁶ komórek / ml. Ponownie zawiesić frakcje CD34⁺ w 40 μl buforu barwiącego i przenieść komórki do probówek o pojemności 1,5 ml.

2. Barwienie przeciwciał

UWAGA: Barwienie przeciwciał można dostosować do potrzeb eksperymentu. Tylko frakcje CD34⁺ ulegają barwieniu przeciwciałami; frakcje CD34^- są stosowane jako pojedyncza kontrola barwienia dla kombinacji barwników podziału komórek (frakcje CV, VC, CF i VI). Poniższy panel jest dostosowany do wykrywania czterech typów HSPC: hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC), multipotencjalnych komórek progenitorowych (MPP), multipotencjalnych komórek progenitorowych zagruntowanych limfoidalnie (LMPP) i hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC)¹². Przedstawiono jednak identyfikację HSC i MPP. Czas trwania: 75 min.

1. Przygotuj pojedyncze barwienie do barwienia powierzchni za pomocą koralików kompensacyjnych. Wymieszać kulki ujemne i kulki immunoglobuliny G (IgG) w stosunku 1:1, uzyskując całkowitą objętość odpowiadającą 20 μl x liczba znaczników powierzchniowych (np. 120 μl, jeśli panel barwiący zawiera sześć przeciwciał).
2. Wyślij 20 μl kulek do oddzielnych probówek o pojemności 1,5 ml dla każdego markera. Dodać objętość odpowiadającą współczynnikowi rozcieńczenia dla każdego przeciwciała w odpowiedniej probówce (np. jeśli współczynnik rozcieńczenia wynosi 1:20, dodać 1 μl).
3. Aby wybarwić komórki CD34⁺, przygotuj główną mieszankę przeciwciał¹², w oparciu o Tabelę 1. Wymieszać przeciwciała w pojedynczej probówce o pojemności 0,5 ml. Dodać 7 μl z głównej mieszanki przeciwciał do każdego z czterech warunków CD34+.
4. Inkubować kulki kompensacyjne i próbki CD34⁺ w temperaturze 4°C przez co najmniej 30 min.
   UWAGA: Czas inkubacji musi być dostosowany do szczegółów technicznych przeciwciał stosowanych do barwienia.
5. Podczas inkubacji należy przygotować 96-dołkową płytkę okrągłodenną do użycia do sortowania, dodając 100 μl pożywki do hodowli komórkowych do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej.
   UWAGA: Studzienki H8-H12 pozostaw puste.
6. Oznaczyć probówki polipropylenowe o pojemności 5 ml do kontroli barwienia powierzchni (5, przy użyciu kulek), kontroli barwników podziału komórek (4, przy użyciu frakcji CD34⁾ i próbek CD34⁺ (4).
7. Pod koniec inkubacji przemyć komórki i kulki 1 ml buforu barwiącego. Przenieść całkowitą objętość do probówek polipropylenowych o pojemności 5 ml. Odwirowywać probówki przez 5 minut przy 300 x g, a następnie zasysać supernatant bez naruszania osadu.
8. Ponownie zawiesić komórki w buforze barwiącym, używając około 500 μl każda dla kulek i komórek CD34+ oraz 1 ml dla probówek CD34^.

Tabela 1: Szablon do przygotowania mieszanki głównej przeciwciał do eksperymentu z sortowaniem komórek. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. Sortowanie komórek

UWAGA: Posortowane numery komórek mogą się różnić w zależności od całkowitej liczby dostępnych komórek. W protokole podana jest minimalna liczba komórek dla każdej kontrolki. Wymagany czas (dla pojedynczej płyty): 100 min.

1. Otwórz eksperyment z szablonem lub ustaw nowy eksperyment. Utwórz pojedynczą próbkę i wiele probówek, po jednej na każdy warunek.
2. Ustaw strategię bramkowania szczegółowo opisaną w Rysunek 1, tworząc sześć diagramów z wykresami kropkowymi. Najpierw zwizualizuj komórki na wykresie punktowym FSC-A/SSC-A i kliknij dwukrotnie narzędzie do bramkowania wielokątów, aby wybrać populację o niskim rozrzucie bocznym (Rysunek 1A). Na poniższym wykresie kropkowym (FSC-A/FSC-H) kliknij prawym przyciskiem myszy wykres i wybierz bramkę "Komórki" z menu rozwijanego, klikając na nią. Użyj tego samego narzędzia do bramkowania, aby wybrać ciasną populację na przekątnej między dwiema osiami (Rysunek 1B).
3. Na trzecim wykresie kropkowym (APC vs. FSH-H) wyświetl populację "Pojedyncze komórki" i bramuj komórki ujemne dla ekspresji linii APC (Lin) (Rysunek 1C). Na czwartym wykresie (CFSE vs. CTV) wyświetl populację "Lin^-" i utwórz cztery oddzielne bramki, po jednej dla każdej kombinacji barwników ( Rysunek 1D).
   UWAGA: Bramki te muszą być szczelne, aby wybrać tylko niewielką frakcję jednorodnie wybarwionych komórek.
4. Użyj piątego i szóstego wykresu (APC-Cy7 vs. BV650 i PE-Cy7 vs. PE), aby zidentyfikować progenitorów będących przedmiotem zainteresowania. Hojnie przebramuj populację CD34⁺CD38^- i CD34⁺CD38⁺ na piątym wykresie (Rysunek 1E). Następnie wybierz populację CD34⁺CD38^- na szóstym wykresie i narysuj trzy bramy, zgodnie z Rysunek 1F.
5. Uruchom pojedyncze probówki barwiące zawierające koraliki kompensacyjne, klikając przycisk Nabierz. Dostosuj napięcia lampy fotopowielacza (PMT) z menu rozwijanego Parametry, szczególnie dla barwników podziału komórek (od 10⁴ do 10⁵ w skali dwuwykładniczej).
6. Doprecyzuj macierz wynagrodzeń zgodnie z panelem używanym do sortowania, korzystając z zakładki Kompensacja. Nagraj co najmniej 5 000 zdarzeń w bramce koralików, klikając przycisk Nagraj.
7. Uruchom frakcje CD34^- i ponownie sprawdź macierz kompensacji. Zarejestruj co najmniej 10 000 zdarzeń w bramie jednokomórkowej.
8. Uruchom frakcje CD34⁺, rejestrując co najmniej 5,000 zdarzeń w bramce jednokomórkowej. Dostosuj bramkę dla każdej kombinacji barwników, ustawiając ciasną bramkę, aby wybrać jednorodną populację (Rysunek 1D). Podobnie dostosuj bramkowanie do wybierania HSC i MPP.
9. Po zakończeniu analizy i zarejestrowaniu wszystkich probówek, należy umieścić płytkę w odpowiednim uchwycie, po wykonaniu standardowej kalibracji Aria do sortowania na płytkach 96-dołkowych. Zalecane jest chłodzenie płyty.
10. Przygotuj szablon sortowania płytek zgodnie ze schematem przedstawionym w tabeli 2, korzystając z eksperymentalnego układu sortowania. Studzienki o nazwie "CD34^-" zawierają 5 000-10 000 komórek, posortowanych na bramce CF/CV/VC/VI. Studzienki "Bulk" zawierają co najmniej 500 komórek, posortowanych na bramce CD34 ⁺ CD38^-. Wreszcie, studzienki jednokomórkowe zawierają tylko jedno zdarzenie na kombinację barwnika podziału komórki na studzienkę, więc w sumie cztery zdarzenia na studzienkę.
    UWAGA: Populacje "masowe" mogą być dostosowane do określonego podzbioru przodków; Nie sortuj mniej niż 500 komórek.
11. W celu sortowania postępuj w kolejności, wypełniając każdą kombinację barwnika podziału komórek przed przejściem do następnej. Na przykład zacznij od sortowania CD34-CF w trybie czystości plonu. Kliknij przycisk pozyskiwania, a następnie przycisk sortowania.
12. Pod koniec sortowania CD34 włóż rurkę CF CD34⁺. Pobierz, a następnie kliknij przycisk sortowania, upewniając się, że zaznaczyłeś 0/16/0 jako stopień czystości. Na koniec posortuj interesujące Cię komórki, po jednej komórce na studzienkę, w czystości pojedynczej komórki, upewniając się, że zaznaczyłeś opcję Sortowanie indeksów.
13. Przejdź do następnej kombinacji barwnika podziału komórek, powtarzając tę samą kolejność. Jako odniesienie, tabela 2 zawiera przykład posortowanej tabliczki.
    UWAGA: Funkcja sortowania indeksów generuje osobne pliki dla każdego posortowanego warunku.
14. Na końcu sortowania wyeksportuj pliki jako pliki .fcs 3.0. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO_{2 .} Komórki są hodowane przez wiele dni, zgodnie z planem eksperymentalnym, przez co najmniej 24 h²⁶.

Tabela 2: Szablon dla płytki 96-dołkowej do sortowania komórek, oparty na konkretnych wymaganiach dla analizy metodą cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

4. Analiza danych sortowania komórek

UWAGA: Aby sprawdzić jakość sortowania komórek, przed przejściem dalej, konieczna jest analiza danych FACS. Głównym wynikiem tego kroku jest wygenerowanie arkusza kalkulacyjnego zawierającego intensywność znaczników każdej posortowanej pojedynczej komórki.

1. Prześlij pliki .fcs 3.0 do oprogramowania analitycznego.
2. Sprawdź ustawienie kompensacji używane podczas sortowania komórek, używając pojedynczych plików barwienia zarejestrowanych przed właściwym sortowaniem.
3. Ustaw zmienioną strategię bramkowania przy użyciu plików odpowiadających różnym masom. Skopiuj i wklej te bramki do plików sortowania indeksów.
4. Sprawdź, czy komórki posortowane indeksem znalazły się w ustawionej bramce. Jeśli istnieją jakieś posortowane komórki, które zostały nieprawidłowo bramkowane, można je zidentyfikować, eksportując współrzędne tabliczki zarejestrowane podczas sortowania indeksów i usunięte w dalszej części analizy.
5. Wyeksportuj zdarzenie z plików sortowania indeksu jako parametry z kompensacją. Eksportuj je jako pliki .csv, zaznaczając opcje "wartości skali" i "parametry kompensowane". Pliki te należy wyeksportować do folderu o nazwie "Wyeksportowane pliki".
6. Połącz wszystkie pliki w jednym pliku .csv, używając skryptu w pliku uzupełniającym 1. Ustaw właściwą ścieżkę za pomocą funkcji "setwd". Danymi wyjściowymi tego skryptu jest arkusz kalkulacyjny zawierający wszystkie zdarzenia z różną bramką i względne intensywności dla wszystkich parametrów.

5. Barwienie przeciwciał po hodowli

UWAGA: Wykonaj tę część protokołu w sterylnych warunkach; kilka odczynników jest wspólnych z poprzednimi krokami i muszą pozostać sterylne. Do analizy cytometrii przepływowej należy użyć cytometru przepływowego z czytnikiem płytek. Pozwala to na przeprowadzenie barwienia bezpośrednio na płytce do hodowli tkankowej, zmniejszając utratę komórek do minimum poprzez ograniczenie ilości pipetowania i wirowania. Przygotować jednokolorowe barwienie markera powierzchniowego za pomocą koralików kompensacyjnych, z wyjątkiem studzienek A1-A4, które reprezentują pojedyncze barwienie dla kolorów CF/CV/VC/VI i są już obecne na płytce 96-dołkowej. Populacje masowe posortowane według barwnika komórkowego pomagają w ustaleniu strategii bramkowania dla liczby podziałów i ogólnego bramkowania. Czas trwania: 120 min.

1. Przed rozpoczęciem protokołu należy oznaczyć studzienki, które zawierają co najmniej jedną komórkę, sprawdzając płytkę pod odwróconym mikroskopem. Ten krok pozwala zoptymalizować ilość przeciwciał używanych do barwienia i przyspiesza procedurę.
2. Przygotować mieszankę wzorcową przeciwciał, zgodnie z tabelą 3. Ze względu na to, że pipetowanie jest w znacznym stopniu, w tabeli uwzględniono błąd techniczny wynikający z pipetowania, w tym dodatkowe 5% objętości. Przeciwciała opisane w tabeli pozwalają scharakteryzować szereg HSPC z próbek ludzkiej krwi pępowinowej¹².
3. Odwirowywać płytkę przez 5 minut przy 300 x g. Szybko odwróć płytkę pod maską i nad ręcznikiem papierowym, aby usunąć supernatant.
4. Dodać 8 μl buforu barwiącego do studzienek A1-A4. Dodać 8 μl mieszanki do pozostałych studzienek.
5. Wymieszaj kulki ujemne i kulki kompensacyjne IgG w stosunku 1:1, aby uzyskać całkowitą objętość odpowiadającą 120 μl. Wyślij 20 μl w jednej probówce o pojemności 1,5 ml na każdy marker. Dodać objętość przeciwciała odpowiadającą współczynnikowi rozcieńczenia (np. jeśli współczynnik rozcieńczenia wynosi 1:20, dodać 1 μl).
   UWAGA: Dostosuj całkowitą objętość do liczby markerów użytych do barwienia (np. 100 μl, jeśli panel barwiący zawiera pięć przeciwciał).
6. Inkubować płytkę i pojedynczą kompensację barwienia w temperaturze +4 °C, przez co najmniej 30 min.
   UWAGA: Czas inkubacji musi być dostosowany do szczegółów technicznych przeciwciał użytych do barwienia.
7. Umyj koraliki 1 ml buforu barwiącego. Przenieś całkowitą objętość do uprzednio oznaczonych probówek polipropylenowych o pojemności 5 ml. Odwirować probówki przez 5 minut przy 300 x g, a następnie usunąć supernatant przez aspirację.
8. Umyj komórki w płytce, dodając 100 μl buforu barwiącego do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. Odwirować płytkę o sile 300 x g przez 5 minut, a następnie szybko odwrócić płytkę pod pokrywą i nad ręcznikiem papierowym, aby usunąć supernatant.
9. Ponownie zawiesić komórki w 85 μl buforu barwiącego za pomocą pipety wielokanałowej.
10. Rozpocznij analizę na cytometrze przepływowym (tryb akwizycji), korzystając z dedykowanego szablonu i klikając na niestandardowy. Ten dostosowany szablon uwzględnia cechy techniczne 96-dołkowej płyty z okrągłym dnem, w szczególności wymiary każdej studzienki (średnica, głębokość i grubość). Sonda musi sięgać dna studni, więc ustaw ją dokładnie w środku studzienek A1 i H12.
11. Po wybraniu interesujących nas fluoroforów z listy zaproponowanej przez oprogramowanie, należy ustawić ustawienie płytki zgodnie ze wzorem płytki z tabeli 2, skorygowanym o liczbę studzienek zawierających co najmniej jedną komórkę.
12. Wybierz 100 μl jako limit objętości pobierania. Zaznacz opcję mieszania. Ustaw szybkość akwizycji na maksymalnie 1 μL/s, ponieważ niższa prędkość poprawia całkowitą objętość analizowaną na odwiert.
13. Dodaj odpowiednie roztwory czyszczące i myjące do studzienek H8-H12. Szablon w tabeli 2 w szczególności pozostawia studzienki H8-H12 puste, ponieważ cytometr przepływowy musi uruchomić szereg warunków płukania na końcu analizy.
    UWAGA: Ten krok jest dostosowany do specyfiki zastosowanego cytometru przepływowego.
14. W sekcji wykresy i bramki najpierw ustaw bramkę jednokomórkową, używając wykresu rozrzutu FSC-A/SSC-A, a następnie wykresu rozrzutu FSC-H/FSC-A. Utwórz histogram dla każdego interesującego Cię znacznika.
15. Po potwierdzeniu ustawień przejdź do sekcji Analiza. Najpierw przeanalizuj pojedyncze barwienie, rejestrując nie mniej niż 5 000 zdarzeń (optymalny zakres: 5 000-15 000 zdarzeń), zarówno dla kulek kompensacyjnych, jak i frakcji barwionych CD34. W razie potrzeby dostosuj napięcie.
16. Po zarejestrowaniu wszystkich pojedynczych barwień można rozpocząć właściwą akwizycję, klikając funkcję Akwizycja.

Tabela 3: Mieszanka przeciwciał do eksperymentu cytometrii przepływowej, w szczególności do identyfikacji HSPC z ludzkiej krwi pępowinowej. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

6. Analiza danych z cytometrii przepływowej po hodowli

UWAGA: Opisana analiza danych jest specyficzna dla oprogramowania wymienionego w Tabeli Materiałów. Głównym wynikiem jest wygenerowanie arkusza kalkulacyjnego zawierającego informacje o intensywności znacznika powierzchni, liczbie podziałów i pokrewieństwie na każdą analizowaną komórkę. W tej części protokołu znajduje się skrypt napisany w R, niezbędny do tego przepływu pracy do wygenerowania końcowego arkusza kalkulacyjnego analizy.

1. Eksportuj pliki z cytometru przepływowego jako pliki .fcs. Prześlij je do oprogramowania analitycznego, grupując je razem jako "barwienie pojedyncze", "masowo" i "pojedyncza komórka".
2. Przygotuj matrycę kompensacji za pomocą pojedynczych plików do barwienia i zastosuj ją do pozostałych dwóch grup, przeciągając i upuszczając.
   UWAGA: Jeśli używane jest narzędzie do automatycznej kompensacji, przed kontynuowaniem sprawdź jakość ręcznie.
3. Aby uzyskać reprezentatywne bramkowanie, połącz różne studzienki zbiorcze w jednym pliku. Ten krok szybko pokazuje, czy dwa kolory nakładają się na siebie (zwykle CV i VC) lub inne anomalie i dlatego należy je wykluczyć. Po kliknięciu na opcję konkatenacji populacji, wybierz wszystkie nieskompensowane parametry z menu "parametry", a następnie kliknij na połącz.
4. Przekaż połączony plik do obszaru roboczego, a następnie zastosuj macierz wynagrodzeń metodą przeciągnij i upuść.
5. Przygotuj strategię bramkowania zdefiniowaną w Rysunek 2 przy użyciu połączonego pliku. W bramie jednokomórkowej wyświetl zdarzenia na wykresie punktowym z CFSE i CTV. Utwórz pierwszą bramkę o nazwie Etykietowana, zawierającą wszystkie cztery kolory i wykluczającą możliwą autofluorescencję (Rysunek 2C). Następnie bramkuj każdy kolor z osobna.
6. Komórki oznaczone CV i VC wymagają przekształconej wartości, biorąc pod uwagę, że kolor jest wynikiem sygnałów CFSE i CTV. Dwa skoordynowane sygnały są zatem obracane w skali logarytmicznej o 45°, aby umożliwić rozcieńczenie dzielenia równolegle do osi x. Ta przekształcona wartość jest uzyskiwana ręcznie, klikając Narzędzia, a następnie Pobierz parametr. Wklej następującą formułę do pola formuły:
   
   UWAGA: Równanie²⁶ zakłada, że CFSE i CTV są parametrami 03 i 17.
7. Aby poprawnie zwizualizować ten nowy parametr o nazwie Parametr pochodny, ustaw oś liniową w zakresie ~3-7, klikając opcję Parametr osi i wybierając Dostosuj oś.
8. Zastosuj bramkowanie do każdego koloru indywidualnie jako wykres histogramu: dla CF i VI ustaw CFSE-A i CTV-A odpowiednio na osi x. W przypadku CV i VC ustaw nowo pochodny parametr na osi x. Ustaw bramki odpowiadające każdemu szczytowi, jak pokazano w Rysunek 3.
9. Zastosuj bramkowanie do każdej pojedynczej studzienki jednokomórkowej. Upewnij się, że dodałeś parametr pochodny do każdego analizowanego dołka. Ręcznie weryfikuj każdą bramkę koloru dla każdej studzienki, aby wykryć zdarzenia, które są nieprawidłowo przypisane do danego szczytu. Przykłady bramkowania są wyświetlane w Rysunek 4.
10. Po zakończeniu analizy i zweryfikowaniu wszystkich studzienek wybierz wszystkie bramki CF/CV/VC/VI, które zawierają co najmniej jedną komórkę. Eksportuj je jako pliki .csv, zaznaczając opcje "wartości skali" i "parametry skompensowane". Pliki te są eksportowane do folderu o nazwie "Eksportowane pliki".
11. Połącz wszystkie pliki w jednym .csv przy użyciu skryptu języka R w pliku uzupełniającym 1. Pamiętaj, aby ustawić właściwą ścieżkę za pomocą funkcji "setwd". Dane wyjściowe tego skryptu to arkusz kalkulacyjny zawierający wszystkie różne zdarzenia bramkowane i względne intensywności dla wszystkich parametrów.
12. Otwórz arkusz kalkulacyjny i zmień nazwy kolumn dla każdego parametru, na przykład używając następujących nazw: CFSE, CTV, CD90, CD123, CD45RA, CD34, CD38. Te nazwy będą używane do identyfikowania progu bramkowania, aby poprawnie przypisać do każdej komórki ich tożsamość.
13. Dodaj sześć kolumn o nazwach "Dobrze", "Warunek", "Kolor", "Generacja", "Original_cell" i "Culture_time". Te zmienne są zdefiniowane eksperymentalnie i są wnioskowane z każdego wiersza:
    export_A10 CD34 ⁺ PBS_CV_Peak 1.csv.1 = A10 (dołek), CD34⁺ (Original_cell), PBS (warunek), CV (kolor), Peak_1 (generacja).
14. Eksportuj studzienki zbiorcze, aby zidentyfikować wartości progowe dla bramkowania: wyeksportuj skompensowaną populację będącą przedmiotem zainteresowania (np. CD34⁺CD38^-) jako pliki .csv, zaznaczając opcje "wartości skali" i "skompensowane parametry"." Wyeksportuj te pliki do folderu o nazwie "Wyeksportowane pliki".
15. Aby znaleźć próg dla CD38, zidentyfikuj największą wartość liczbową dla tego parametru. I odwrotnie, aby znaleźć próg dla CD34, zidentyfikuj najmniejszą wartość liczbową dla tego parametru. Powtórz ten proces dla wszystkich interesujących Cię parametrów.
    UWAGA: Do analizy przedstawionej w protokole znacznik CD45RA służy zarówno do identyfikacji LMPP w bramce CD34⁺CD38^-, jak i CMP/GMP w bramce CD34⁺CD38⁺. Oznacza to, że dla tego znacznika należy wyodrębnić dwie różne wartości progowe.
16. Skopiuj i wklej wartości progowe do pliku programu Excel o nazwie "gating_matrix". Plik ten jest zorganizowany zgodnie z tabelą 4 i umożliwia analizę wielu niezależnych eksperymentów. Bardzo ważne jest, aby nazwać każdą kolumnę dokładnie według tego schematu: XXYYMMDD_xxh, gdzie XX oznacza dwa inicjały operatora, YY dwie ostatnie cyfry roku, MM miesiąc, DD dzień i xx punkt czasowy analizy.

Tabela 4: Macierz bramkowania dla przypisania losu komórki, przed analizą statystyczną. CD45h odnosi się do intensywności CD45RA dla bramkowania podzbioru HPC, podczas gdy CD45l odnosi się do intensywności CD45RA dla podzbiorów CD34 ⁺ CD38^-. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

7. Analiza statystyczna

UWAGA: Statystyczne testowanie wygenerowanych danych obejmuje niestandardowy potok analizy, zakodowany przy użyciu języka programowania Python (Plik uzupełniający 2, Plik uzupełniający 3 i Plik uzupełniający 4). Skrypt jest podzielony na trzy bloki: pierwszy do przetwarzania arkusza kalkulacyjnego, drugi blok do generowania mapy cieplnej do wizualizacji danych i ostatni blok do generowania wielu histogramów do analizy i testowania właściwości różnicowania i dzielenia.

1. Zaczynając od bloku "0_process_data" (Plik uzupełniający 2), upewnij się, że ścieżki gating_matrix i arkusza kalkulacyjnego danych są poprawnie zdefiniowane w skrypcie.
2. Zdefiniuj słownik "cell_cols", aby przypisać odpowiednie losy komórek do każdej komórki. W konkretnym przypadku losy są następujące: HSC, MPP, LMPP, wspólne komórki progenitorowe szpiku (CMP), progenitory granulo-monocytowe (GMP), megakariocytarno-erytroidalne komórki progenitorowe (MEP) i CD34^-.
3. Korzystając z wartości progowych zdefiniowanych na podstawie studzienek zbiorczych (krok 6.16), zdefiniuj funkcję "cell_class_exp_time". Istotne jest, aby zachować spójność w nazewnictwie kolumn, aby poprawnie zdefiniować te progi, używając tej samej nazwy, która została użyta do zdefiniowania każdej kolumny w kroku 6.12.
4. Fenotypy komórek są definiowane w skrypcie za pomocą serii stwierdzeń "if-else", w oparciu o progi wykryte podczas analizy cytometrii przepływowej.
   UWAGA: Różne fenotypy mogą być wyświetlane, modyfikując te stwierdzenia, aby dostosować je do innych kombinacji markerów.
5. Należy określić szczególne warunki doświadczalne, używając funkcji "cond_rule" (np. różne metody eksperymentalnego traktowania). Dla podanego zestawu danych warunki mają nazwy "GT" i "Diff". Proszę opisać dwie różne pożywki do hodowli komórkowych używane do hodowli komórek. Informacje te zostaną wykorzystane przez blok "1_dot_plot" (Plik uzupełniający 3) do wykreślenia mapy cieplnej.
6. W bloku "2_bar_plot" (Plik uzupełniający 4) zdefiniuj słownik "class_dct", w tym interesujące nas losy komórek dyskretnych. W przypadku podanego zestawu danych losy komórek będących przedmiotem zainteresowania są takie same, jak opisano w słowniku "cell_cols".
7. Zdefiniuj "warunki" (warunki), "or_cells" (oryginalna komórka), "sym_labs" (etykiety symetrii) i "czasy" (punkt czasu eksperymentu). Są to filtry powtarzające niezbędne do drukowania. "warunki" przyjmują ponownie warunki zdefiniowane w "cond_rule", "or_cells" to HSC i MPP, a "sym_labs" opisują rodzaj podziałów.
8. W bloku "2_bar_plot" można wykreślić komórki, które posunęły się do podziału 6,
   UWAGA: Podany zestaw danych zawiera tylko komórki do podziału 4, więc pojawia się komunikat o błędzie, ale nie uniemożliwia to działania skryptu.
9. Rysunki wygenerowane przez skrypt można pobrać w folderze o nazwie "rysunki" jako pliki pdf. Pliki o nazwie "Test" reprezentują różne testy statystyczne wykonane dla odpowiedniego histogramu.

sortowanie FACS
Strategie bramkowania sortowania przedstawione w tym protokole są oparte na powszechnie akceptowanych strategiach12,30,31. Dla strategii bramkowania przedstawionej w Rysunek 1, materiałem wyjściowym są komórki progenitorowe krwi pępowinowej, uprzednio oczyszczone przez wzbogacenie magnetyczne CD34+, co wyjaśnia znikomy odsetek komórek dodatnich w linii. Niezbędne jest użycie ciasnych bramek dla czterech wewnątrzkomórkowych kombinacji barwników (np. CTV na rysunku), aby poprawić rozdzielczość pików podczas następnej analizy i zabramkować prawidłową populację komórek (Rysunek 1D). W przypadku przedstawionym na rysunku bramki wybierane są dla największej i lepiej zdefiniowanej populacji. Z naszego doświadczenia wynika, że obecność wielu, bliskich populacji dla każdej kombinacji barwnika podziału komórkowego nie jest reprezentatywna dla różnic biologicznych. Zamiast tego może wskazywać na a) nieoptymalną procedurę barwienia lub b) dużą niejednorodność (zwłaszcza pod względem wielkości) w początkowej puli komórek. Nie jest to zaskakujące, gdy zaczynasz od krwi pępowinowej lub innych złożonych źródeł biologicznych (np. aspiratów szpiku kostnego, krwi obwodowej). Jeśli bramka nie jest ściśle zdefiniowana, postępujące rozcieńczanie różnych kombinacji barwników może prowadzić do łączenia się późniejszych pików, szczególnie w warunkach CV i VC (rysunek 2D). Inną negatywną konsekwencją nieoptymalnego bramkowania jest niezdolność do skutecznego rozróżnienia różnych pików po hodowli komórkowej, ponieważ niejednorodna populacja wyjściowa może prowadzić do płytkich pików.

Rysunek 1: Strategia bramkowania dla sortowania komórek. (A) FSC-A kontra SSC-A, aby wykluczyć zanieczyszczenia i zanieczyszczenia komórek. (B) FSC-A w porównaniu z FSC-H, w celu wykluczenia dubletów i skupisk komórek. (C) Lin kontra FSC-H, aby wykluczyć komórki, które są Lin+. (D) CTV kontra CFSE, w celu jednoznacznej identyfikacji komórek barwionych kombinacjami barwników CF, CV, VC i VI. Bramy powinny być na tyle ścisłe, aby obejmowały jednorodną populację. (E) CD34 kontra CD38, w celu oddzielenia ograniczonych progenitorów CD34 + CD38 + (zwanych również HPC) od multipotencjalnego przedziału CD34 + CD38-. (F) CD45RA w porównaniu z CD90, z populacji CD34 + CD38-, w celu oddzielenia najbardziej niedojrzałych progenitorów wzbogaconych w HSC (CD90 + CD45RA-), LMPP (CD90midCD45RA+) i bardziej zaangażowanego MPP (CD90-CD45RA-). (G) Zdarzenia posortowane indeksem, reprezentowane tutaj dla barwienia kombinacją barwników komórkowych oraz (H) ekspresja markerów powierzchniowych CD90 i CD45RA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza cytometrii przepływowej po hodowli komórkowej
Dane w Rysunek 2 są reprezentatywne dla ludzkich komórek HSC krwi pępowinowej, utrzymywanych w hodowli przez 72 godziny, w obecności wielu cytokin zdolnych do wspierania szeregu przodków i prekursorów szpiku. Panele od 2A do 2D reprezentują bramkowanie niezbędne do ustalenia pokrewieństwa każdej z pojedynczych komórek, podczas gdy panele od 2E do 2G umożliwiają fenotypowanie komórek. Zmniejszona obecność MEP na rysunku jest prawdopodobnie konsekwencją warunków hodowli zastosowanych w tym reprezentatywnym eksperymencie (Rysunek 2F). Użycie różnych cytokin i warunków hodowli zmienia względny procent każdego podzbioru, podobnie jak w przypadku wyboru różnych komórek wyjściowych do eksperymentu.

Rysunek 2: Strategia bramkowania dla analizy cytometrii przepływowej. (A) FSC-A kontra SSC-A, w celu wykluczenia zanieczyszczeń i zanieczyszczających komórek. (B) FSC-A w porównaniu z FSC-H, w celu wykluczenia dubletów i skupisk komórek. (C) CTV kontra CFSE, bramka oznaczona pozwala wykluczyć wszelkie zdarzenia autofluorescencyjne, które mogłyby wpłynąć na rozdzielczość danych. (D) OTVK kontra CFSE. Niezwykle ważne jest rygorystyczne bramkowanie czterech populacji w oparciu o rozcieńczenia barwnika podziału komórek. (E) CD34 kontra CD38, w celu rozróżnienia między zaangażowanymi prekursorami (CD34-), ograniczonymi progenitorami (HPC) (CD34 + CD38 +) i niedojrzałymi progenitorami (CD34 + CD38-). (F) CD45RA i CD123, w celu rozróżnienia trzech typów ograniczonych komórek progenitorowych: CMP (CD123+CD45RA-), MEP (CD123-CD45RA-) i GMP (CD123+CD45RA+). (G) CD45RA kontra CD90, od CD34+CD38-, do identyfikacji HSC, LMPP i MPP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Definiowanie szczytu i kroki przypisywania (Rysunek 3 i Rysunek 4) są kluczowymi aspektami protokołu i wymagają zdefiniowania ścisłych bramek. Do zdefiniowania piku (Rysunek 3) do wiarygodnej identyfikacji potrzeba co najmniej 1000 zdarzeń. W tym sensie korzystne może być wyizolowanie większej liczby komórek na etapie sortowania komórek dla studzienek "Bulk". Rysunek 4 opisuje cztery przykłady pojedynczych studni zawierających wiele rodzin. Ten rysunek wyjaśnia znaczenie bramkowania Rysunek 2D i Rysunek 3, szczególnie dla identyfikacji każdej rodziny i każdego szczytu. Rysunek 4A ilustruje prosty przykład, ponieważ wszystkie komórki w bramce CF są bardzo blisko siebie i można je łatwo przypisać do jednego szczytu. Rysunek 4C pokazuje kolejny przykład rodziny rozłożonej jednoznacznie na dwóch dobrze oddalonych od siebie szczytach, co jest wyraźnie pokazane na histogramie Rysunek 4D. Rysunek 4E,G pokazuje znaczenie ścisłego bramkowania na podstawie dużej liczby zdarzeń; Oba pokazują kilka wydarzeń, które są blisko, ale poza bramkami kombinacji barwników. Zdarzenia te mogły zostać błędnie uwzględnione w bramkach VI i CF, opierając się wyłącznie na analizie pojedynczego odwiertu. Na koniec, Rysunek 4F,H przedstawia dwa różne przykłady rodzin rozłożonych na wiele szczytów, z jednym przykładem dwóch podobnych szczytów intensywności (Rysunek 4F) i jednym z dwoma nierównymi szczytami intensywności (Rysunek 4H).

Rysunek 3: Definicja piku do analizy cytometrii przepływowej. (A-D) Piki powinny być zdefiniowane rejestrując co najmniej 500 zdarzeń, aby zapewnić dobrą reprezentację dla każdego pojedynczego piku. (A) Histogram intensywności CFSE-A. Można zidentyfikować kilka pików, z których każdy odpowiada innej populacji dzielących się komórek. (B,C) Histogramy intensywności wyprowadzonego parametru, reprezentującego mieszaninę CFSE-CTV, odpowiednio CV (B) i VC (C). (D) Histogram intensywności CTVK-A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przypisanie szczytu. (A,B) Tylko jeden pik może być wykryty dla tego odwiertu, w bramce CF. (C,D) Dwa piki o prawie jednakowej intensywności można wykryć w tej studni, w bramie VI. Szczyty są dobrze rozwiązane. (E,F) Dwa piki o porównywalnej intensywności można wykryć w tej studni, w bramie VI. Pod uwagę wzięte zostały tylko zdarzenia w bramie, w oparciu o strategię ustaloną za pomocą dużych studni. (G-H) Dwa piki o nierównej intensywności można wykryć w tym dołku, w bramce CF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Reprezentacja danych i testy statystyczne<br /> Rysunek 5 pokazuje różne typy reprezentacji danych z dwóch oddzielnych eksperymentów, oba przeprowadzone po 72 godzinach hodowli komórkowej. HSC i MPP zostały wyhodowane w dwóch różnych pożywkach do hodowli komórkowych, które mają zmieniać właściwości podziału i różnicowania komórek. Media te noszą nazwy "Diff" (Różnicowanie)32 i "GT"33; pierwszy z nich promuje różnicowanie szpiku i erytroidalne, ponieważ zawiera erytropoetynę (EPO) i czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulo-monocytowych (GM-CSF), podczas gdy drugi został opracowany w kontekście badań klinicznych terapii genowej, w celu utrzymania i amplifikacji wysokiego odsetka HSPC. Rysunek 5A to reprezentatywna mapa cieplna dla stanu "Diff", reprezentujące różne rodziny komórek, zarówno pod względem losów komórek, jak i podziałów. Na tej mapie cieplnej każdy wiersz reprezentuje indywidualną rodzinę, każdy kwadrat jest pojedynczą komórką, a kolumny grupują wszystkie komórki, które są w tej samej generacji (np. komórki w generacji 2 są podzielone co najmniej dwukrotnie). Możliwe jest rozróżnienie rodzin wysoce jednorodnych, składających się z jednego typu komórki i wykazujących taką samą liczbę podziałów (np. rodzina #63) oraz rodzin heterogenicznych, obejmujących trzy typy komórek w ciągu dwóch pokoleń (np. rodzina #84). Ponieważ wskaźnik odzysku komórkowego dla tej analizy wynosi około 70%, rzadko obserwuje się pełne rodziny, które są definiowane przez odzyskanie wszystkich komórek w możliwie różnych pokoleniach (np. rodzina jednej komórki w generacji 1 i dwóch komórek w generacji 2), (wyświetlając hashtag obok ich numeru identyfikacyjnego na rysunku 5A). Istnieje wiele wyjaśnień niepełnego wykrywania, które mogą być techniczne (problem z barwieniem, utrata komórek z powodu protokołu) lub biologiczne (śmierć komórki i/lub apoptoza). Ograniczenia techniczne można przezwyciężyć za pomocą analizatora zaprojektowanego w celu zmniejszenia martwej objętości związanej z pojedynczą próbką oraz poprzez barwienie komórek bezpośrednio na płytce do hodowli komórkowej w celu zmniejszenia pipetowania objętościowego. I odwrotnie, ortogonalne metody określania stopnia śmierci komórki (np. poprzez eksperymenty z obrazowaniem żywych komórek) mogą pomóc w rozróżnieniu czynników technicznych i biologicznych powodujących niepełne wykrycie.

Rysunek 5Bi pokazuje, jak zobrazować wpływ warunków hodowli na skład typu komórki, tak jakby ktoś przeprowadził masowy test. W tym przypadku warunek Diff sprzyja większej liczbie losów i wyższemu odsetkowi komórek CD34 + (zdefiniowanych jako wszystkie typy komórek z wyjątkiem CD34-). Przedziały ufności są obliczane w skrypcie za pomocą podstawowego bootstrapa, z 250 000 bootstrap datasets34. Warto zauważyć, że wszystkie inne histogramy w Rysunek 5 wyświetlają przedziały ufności obliczone w ten sam sposób. Tabela 5 zawiera wszystkie informacje na temat liczby rodzin i liczby komórek w każdym pokoleniu.

Rysunek 5Bii graficznie przedstawia wynik testów statystycznych przeprowadzonych w skrypcie "2_bar_plot". Dostępny jest formalny opis struktury statystycznej26. Krótko mówiąc, ramy te umożliwiają testowanie hipotez statystycznych przy założeniu, że komórki z tej samej rodziny są zależne (założenie, które samo w sobie jest testowalne), w przeciwieństwie do klasycznej statystyki, która wymagałaby niezależności między wszystkimi obserwowanymi komórkami. W konkretnym przypadku przedstawionym na rysunku test statystyczny podważa hipotezę, że wybory dotyczące losu komórek przez MPP, mierzone jako częstość występowania różnych typów komórek obecnych w hodowli, są niezależne od zastosowanych warunków hodowli komórkowej. Po pierwsze, statystyka testu G służy do oceny rozbieżności między częstościami typów komórek z różnych pożywek komórkowych (na przykład w Bii statystyka ta jest reprezentowana przez czerwony pasek). Następnie randomizacja danych jest przeprowadzana poprzez permutację, zamianę całych rodzin komórek między dwoma warunkami hodowli komórkowej. Ma to na celu zachowanie zależności między komórkami związanymi z rodziną, przy jednoczesnym zachowaniu liczby rodzin w każdym zestawie spójnej z oryginalnymi danymi. Statystyka testu G jest obliczana na podstawie losowego zestawu danych. Niebieskie wartości reprezentowane w 5Bii to statystyka testu G dla 250 000 permutacji. Na koniec obliczana jest wartość p, aby ocenić stopień, w jakim oryginalny zestaw danych odbiega od rozkładu permutowanych. W tym przykładzie pierwotna statystyka w znacznym stopniu odbiega od rozkładu, co skutkuje małą wartością p, a tym samym odrzuca hipotezę, że los komórek MPP jest niezależny od warunków hodowli.

Rysunek 5C przedstawia procent rodzin komórek na maksymalną generację, aby zbadać, jak różne warunki zmieniają podział komórek w każdej rodzinie komórek. Ten wykres danych pokazuje, że po 72 godzinach komórki hodowane w warunkach Diff wykonują większą liczbę podziałów niż komórki w stanie GT. Reprezentowana jest maksymalna liczba pokoleń na każdą rodzinę, więc jedna rodzina, która wyświetla komórki w generacjach 1 i 2, jest uważana za generację 2. Ten sam model statystyczny, który jest używany dla Rysunek 5B, może być użyty do statystycznego sprawdzenia niezależności między podziałem komórkowym a stanem hodowli.

Rysunek 5D bada typ symetrii/asymetrii pierwszego podziału dla różnych typów przodków (HSC lub MPP). Dla całych rodzin komórek w pokoleniu 1 - jedynym pokoleniu, w którym możliwe jest ostateczne ustalenie dwóch komórek potomnych jako komórek siostrzanych - można zdefiniować cztery różne typy symetrii/asymetrii: etykieta "Sym Undiff" opisuje rodziny, w których obie córki zachowują fenotyp komórki pochodzenia. "Sym Diff" oznacza, że obie córki mają ten sam fenotyp i różni się on od komórki, z której pochodzą. "Asym Undiff" oznacza, że tylko jedna córka zachowuje fenotyp komórki, z której pochodzi. Wreszcie "Asym Diff" opisuje rodziny, w których obie córki mają różne fenotypy i żadna z nich nie jest taka sama jak komórka, z której pochodzi. Aby uzyskać moc statystyczną w ocenie tych symetrycznych/asymetrycznych losów, pożądane jest przeprowadzenie analizy wielogenowej we wczesnych punktach czasowych, w celu obserwacji większej liczby rodzin, których potomstwo znajduje się w pokoleniu 1.

Na koniec, Rysunek 5E przedstawia procenty typów komórek jako funkcję liczby podziałów, aby uzyskać wgląd w progresję wzorca różnicowania między podziałami. Na przykład dane przedstawione na rysunku sugerują, że komórki przechodzą do stanu CD34, przy czym ponad 50% wykrytych komórek w tej klasie jest już po trzech podziałach. Co więcej, można wywnioskować, że MPP nie sprzyjają podziałowi samoodnawiającemu się, ponieważ niewielki odsetek komórek zachowuje oryginalny fenotyp. Niektóre z tych wniosków można następnie przetestować, korzystając z ram statystycznych przedstawionych na poprzednich rysunkach.

Rysunek 5: Przykład reprezentacji danych dla jednego 72-godzinnego eksperymentu z użyciem HSPC krwi pępowinowej. (A) Mapy cieplne dla wybranego zestawu danych (HSC, na podłożu "Diff", po 72 godzinach hodowli). Wykresy reprezentują wszystkie pojedyncze komórki (kwadraty) zgodnie z ich pokrewieństwem (wiersze), liczbą wykonanych podziałów (kolumny, zwane generacją) i fenotypem (kolory). (Bi) Histogram porównujący proporcje typów komórek progeniozy komórek HSC i MPP, między warunkiem GT a stanem Diff. (Bii) Wykres przedstawia testy statystyczne wykonane w skrypcie "2_bar_plot" dla MPP po 72 godzinach hodowli, porównując koktajle cytokin "Diff" i "GT". Wartość eksperymentalna jest wyświetlana na czerwono, a wartości wygenerowane za pomocą 250 000 permutacji na niebiesko. Wartość p. testu G jest wskazana w prawym górnym rogu wraz z liczbą rodzin użytych do testu. (C) Histogram porównujący odsetek rodzin (łącznie 314 rodzin) w każdym pokoleniu (oznaczone kolorami) dla HSC i MPP na warunek hodowli. Przedziały ufności są obliczane na podstawie 250 000 uruchomionych zestawów danych. (D) Histogram reprezentujący rodzaj symetrii/asymetrii między losami komórek potomnych dla rodzin z dwiema komórkami w generacji 1: Sym Undiff (obie córki zachowują fenotyp komórki pochodzenia), Sym Diff (obie córki mają ten sam fenotyp i różni się on od komórki pochodzenia), Asym Undiff (tylko jedna córka zachowuje fenotyp komórki pochodzenia), i Asym Diff (obie córki mają różne fenotypy i żadna z nich nie przypomina komórki, z której pochodzi). E) histogramy udziału typów komórek sklasyfikowanych według pokolenia w MPP hodowanych za pomocą koktajlu "Diff"; n = 204 komórki i 97 rodzin. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 5: Opis liczby analizowanych rodzin i komórek w każdym warunku eksperymentalnym (komórka pochodzenia i pożywka do hodowli komórkowej). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów istotnego dla tej pracy. Grantodawcy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu pracy do publikacji.