Artykuł metodologiczny

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

4.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64918

⸱

24 marca 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Quantitative Immuno-hematology, CNRS UMR168, Institut Curie, 2Hamilton Institute, Maynooth University, 3Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3348, Orsay, 4Université Paris-Sud, Université Paris-Saclay, CNRS UMR 3348, Orsay

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Streszczenie

Niewiele technik może jednocześnie ocenić fenotyp i los tej samej komórki. Większość obecnych protokołów używanych do charakteryzowania fenotypu, mimo że są w stanie generować duże zbiory danych, wymaga zniszczenia komórki będącej przedmiotem zainteresowania, co uniemożliwia ocenę jej funkcjonalnego losu. Heterogeniczne systemy różnicowania biologicznego, takie jak hematopoeza, są zatem trudne do opisania. Opierając się na barwnikach śledzących podział komórek, opracowaliśmy protokół jednoczesnego określania pokrewieństwa, liczby podziałów i statusu różnicowania dla wielu pojedynczych komórek progenitorowych hematopoetycznych. Protokół ten pozwala na ocenę potencjału różnicowania ex vivo mysich i ludzkich komórek progenitorowych hematopoetycznych, wyizolowanych z różnych źródeł biologicznych. Co więcej, ponieważ opiera się na cytometrii przepływowej i ograniczonej liczbie odczynników, może szybko wygenerować dużą ilość danych na poziomie pojedynczej komórki w stosunkowo niedrogi sposób. Zapewniamy również potok analityczny do analizy pojedynczych komórek w połączeniu z solidnymi ramami statystycznymi. Ponieważ protokół ten umożliwia powiązanie podziałów i różnicowania komórek na poziomie pojedynczej komórki, może być wykorzystany do ilościowej oceny symetrycznego i asymetrycznego zaangażowania w los, równowagi między samoodnawianiem a różnicowaniem oraz liczby podziałów dla danego losu zaangażowania. Podsumowując, protokół ten może być wykorzystany w projektach eksperymentalnych mających na celu rozwikłanie różnic biologicznych między krwiotwórczymi komórkami progenitorowymi z perspektywy pojedynczej komórki.

Wprowadzenie

Ostatnia dekada była naznaczona światowym rozprzestrzenianiem się jednokomórkowych podejść do biologii komórkowej i molekularnej. Podążając śladami genomiki pojedynczej komórki1,2, obecnie możliwe jest badanie wielu składników pojedynczej komórki (np. DNA, RNA, białek), dzięki nowym technikom -omicznym pojedynczych komórek, które rozwijają się każdego roku. Techniki te rzuciły światło na stare i nowe pytania w dziedzinach immunologii, neurobiologii, onkologii i innych, zarówno przy użyciu komórek organizmu ludzkiego, jak i modelowego3. Podkreślając różnice między poszczególnymi komórkami, -omika pojedynczej komórki skłoniła do zdefiniowania nowego modelu hematopoezy, skoncentrowanego na heterogeniczności hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) i odchodzącego od klasycznego modelu dyskretnych jednorodnych populacji4,5.

Jedną z niewielu wad wszystkich technik -omicznych jest zniszczenie interesującej komórki, co uniemożliwia ocenę jej funkcjonalności. Z drugiej strony, inne metody jednokomórkowe, takie jak test przeszczepu pojedynczej komórki i technologie śledzenia linii, zapewniają odczyt funkcjonalności komórki przodka poprzez ocenę losu poszczególnych komórek in vivo6,7. Technologie śledzenia linii polegają na oznaczaniu interesującej komórki dziedzicznym genetycznym 7 lub fluorescencyjnym label8,9, co pozwala na śledzenie losu wielu pojedynczych komórek w tym samym czasie. Jednak charakterystyka komórek wyjściowych jest zwykle ograniczona do ograniczonej liczby parametrów, takich jak ekspresja kilku białek powierzchniowych oceniana za pomocą cytometrii przepływowej10. Ponadto technologie śledzenia linii pojedynczych komórek wymagają pracochłonnego wykrywania znacznika komórkowego, zwykle za pomocą sekwencjonowania lub obrazowania DNA/RNA. W szczególności ten ostatni punkt ogranicza liczbę warunków, które można przetestować w jednym eksperymencie.

Inną klasą metod, które są używane do badania funkcjonalności pojedynczych komórek, są systemy hodowli komórkowych ex vivo pojedynczych HSPC. Łatwe do wykonania, te złote standardy obejmują sortowanie pojedynczych komórek do 96-dołkowych naczyń do hodowli komórkowych, a po hodowli, charakteryzując fenotyp potomstwa komórki, zazwyczaj za pomocą cytometrii przepływowej lub analizy morfologicznej. Testy te były najczęściej używane do scharakteryzowania długoterminowego różnicowania HSPC w dojrzałe komórki, zwykle po 2-3 tygodniach hodowli11,12. Alternatywnie, zostały one wykorzystane do próby utrzymania i rozbudowy ex vivo HSPCs13,14,15,16,17,18, z obietnicą korzyści medycznych dla przeszczepu ludzkich komórek macierzystych19. Wreszcie, wykorzystano je do zbadania wczesnego zaangażowania HSPC przy użyciu hodowli krótkoterminowej20, przy czym głównym czynnikiem ograniczającym jest niska liczba komórek generowanych w tej hodowli. Jedną z wad tych różnych rodzajów testów ex vivo jest to, że tylko częściowo odzwierciedlają one złożoność in vivo; mimo to są jednym z rzadkich sposobów badania różnicowania ludzkiego HSPC.

Jedną z brakujących informacji w istniejących metodach jednokomórkowych (pojedyncza komórka-omika, śledzenie linii i hodowla ex vivo) jest dokładne wykrywanie podziałów komórkowych, niezbędny parametr do rozważenia podczas badania dynamiki HSPC21. Prostym sposobem oceny liczby podziałów za pomocą cytometrii przepływowej jest użycie rozpuszczalnych "barwników białkowych", takich jak ester sukcynimidylowy dioctanu 5-(i 6)-karboksyfluoresceiny (CFSE)22. Te barwniki podziałowe dyfundują wewnątrz cytoplazmy barwionych komórek i rozcieńczają się o połowę i przechodzą do dwóch komórek potomnych przy każdym podziale komórki, co pozwala wyliczyć do 10 podziałów. Łącząc kilka barwników podziałowych, możliwe jest wysiewanie wielu indywidualnych przodków w tej samej studzince, ponieważ każdy pojedynczy barwnik umożliwia separację różnych potomków. Jest to zasada stojąca za użyciem barwników komórkowych do klonalnego multipleksowania i śledzenia podziałów, która została po raz pierwszy wprowadzona dla mysich limfocytów23,24.

Tutaj prezentujemy rozwój testu MultiGen do użytku z mysimi i ludzkimi HSPC. Pozwala na jednoczesne badanie wielu pojedynczych komórek pod kątem ich właściwości różnicowania, podziału i pokrewieństwa ex vivo. Ten wysokoprzepustowy, łatwy do wykonania i niedrogi test pozwala jednocześnie zmierzyć fenotyp komórkowy, liczbę przeprowadzonych podziałów oraz pokrewieństwo komórek i pokrewieństwo klonalne z innymi komórkami w studni. Może być wykorzystany do ilościowej oceny symetrycznego i asymetrycznego zaangażowania losu, równowagi między samoodnawianiem a zróżnicowaniem oraz liczby podziałów niezbędnych dla danego losu zobowiązania. Protokół wymaga aktywowanego fluorescencją sortownika komórek (FACS) i cytometru przepływowego z czytnikiem płytek, a także sprzętu niezbędnego do przeprowadzenia hodowli komórkowej. Oprócz protokołu technicznego do wykonania testu na ludzkich HSPC, zapewniamy również szczegółowe ramy analizy, w tym testy statystyczne niezbędne do oceny właściwości komórkowych związanych z koncepcją rodziny komórek25. Protokół ten został już z powodzeniem wykorzystany do opisania mysiego przedziału HSPC26,27.

Poniższy protokół wykorzystuje magnetycznie wzbogacone komórki CD34+ jako materiał wyjściowy28. W ten sposób możliwe jest skuteczne barwienie i izolowanie ludzkich HSPC z różnych źródeł krwi (np. krwi pępowinowej, szpiku kostnego, krwi obwodowej). Ważne jest, aby nie odrzucać frakcji CD34-, ponieważ będzie ona używana jako część protokołu do ustawiania różnych typów kontroli eksperymentalnych. Wspomniane ilości i objętości komórek można skalować w górę lub w dół, zgodnie z eksperymentalnym przepływem pracy i potrzebami. Podobnie, protokół można dostosować do badania różnych typów komórek progenitorowych, po prostu modyfikując przeciwciała używane do etapów sortowania komórek i cytometrii przepływowej.

Protokół

W poniższym protokole jako źródło HSPC wykorzystano zanonimizowaną krew pępowinową, pobraną zgodnie z wytycznymi określonymi przez biobank krwi pępowinowej Szpitala Saint-Louis (zezwoleń AC-2016-2759) oraz zgodnie z Deklaracją Helsińską.

UWAGA: Przed rozpoczęciem należy upewnić się, że wszystkie odczynniki i sprzęt niezbędne do wykonania niniejszego protokołu są dostępne, zgodnie z wykazem w Tabeli materiałów oraz informacjami zawartymi w protokole. Odpowiednie odczynniki należy przygotować na świeżo i nie przechowywać, chyba że wyraźnie zaznaczono inaczej.

1. Barwienie komórek barwnikiem

UWAGA: Ta sekcja opisuje barwienie z wykorzystaniem czterech kombinacji barwników do podziałów komórkowych CFSE i barwnika fioletowego (CTV). Wszystkie probówki należy przetwarzać jednocześnie, nawet jeśli nie dodano do nich roztworu barwnika komórkowego. Wszystkie etapy są wykonywane w warunkach sterylnych, aby umożliwić kolejny etap hodowli komórkowej. Wymagany czas: około 100 min.

  1. Przetworzyć jednostkę krwi pępowinowej zgodnie z protokołem sortowania magnetycznego29Należy upewnić się, że dostępne są dwie frakcje: duża frakcja CD34- frakcja i mniejsza liczba CD34+ frakcję. Wirować obie probówki przez 5 min przy 300 x gOdessać nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu.
  2. Dla CD34+ frakcję, resuspender ją w 1 ml pożywki Eagle'a modyfikowanej przez Dulbecco (DMEM) bez dodatku płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Policzyć komórki przy użyciu hemocytometru; gęstość komórek nie powinna przekraczać 3 x 106 komórek/ml. W takim przypadku należy odpowiednio dostosować objętość. Dla CD34- frakcję, resuspender w DMEM bez FBS i dostosować objętość do maksymalnie 6 x 106 komórek/ml
  3. Aliquotowanie 250 µL CD34+ frakcję do czterech 15 ml polipropylenowych probówek. Probówki należy opisać w następujący sposób: CD34+/CF (tylko CFSE), CD34+/CV (CFSE_wysokie CTV_niskie), CD34+/VC (CFSE_niski CTV_wysoki) oraz CD34+/VI (CTV_high). Alikwot 250 µL CD34- frakcję do kolejnych czterech polipropylenowych probówek o pojemności 15 ml. Probówki należy opisać w następujący sposób: CD34-/CF (tylko CFSE), CD34-/CV (CFSE_wysokie CTV_niskie), CD34-/VC (CFSE_low CTV_high) oraz CD34-/VI (CTV_high). Pozostałe komórki z CD34- frakcję można odrzucić.
  4. Przygotuj dwa roztwory CFSE, oznaczone jako CFSE_high oraz CFSE_low. W przypadku CFSE_high (10 µM), wymieszać 1,1 ml DMEM bez FBS z 2.2 µL roztworu zapasu CFSE (5 mM). Dla CFSE_low (5 µM), wymieszać 550 µL pożywki DMEM bez FBS i 0.55 µL roztworu stokowego CFSE (5 mM).
  5. Dodaj 250 µL roztworu CFSE_high do probówek CF i CV, 250 µL roztworu CFSE_low do probówek VC, a następnie 250 µL DMEM bez FBS do probówki VI. Aby zapewnić efektywne wymieszanie zawiesiny komórkowej z barwnikiem komórkowym, przechyl probówkę niemal pod kątem 90 stopni i nanieś roztwór CFSE na ściankę probówki. Następnie ustaw probówkę pionowo, aby wymieszać oba roztwory, i pipetuj trzy lub cztery razy, aby zapewnić szybkie wymieszanie roztworów CFSE z resuspensowanymi komórkami. Inkubować w 37 °C przez dokładnie 8 min.
  6. Po inkubacji dodać 5 ml pożywki DMEM + 10% FBS. Przechowywać probówki w 37 °C przez 5 min.
  7. Wirować probówki przez 5 min przy 300 x g gUsuń nadsącz. poprzez odessanie bez naruszania osadu, a następnie przemycie osadu 5 ml fosforanu buforowanego soli 1x/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (PBS 1x/EDTA). Ponownie wirować przez 5 min przy 300 x gOdlej nadsącz, nie naruszając osadu, a następnie resuspenduj osad komórkowy w 250 µL z 1x PBS/EDTA.
  8. Przygotuj dwa roztwory CTV, oznaczone jako CTV_high i CTV_low. Dla CTV_high (10 µM), wymieszać 1,1 ml PBS 1x/EDTA i 2.2 µL roztworu stokowego CTV (5 mM). Dla CTV_low (5 µM), wymieszać 550 µL z PBS 1x/EDTA z 0.55 µL roztworu stokowego CTV (5 mM).
  9. Dodaj 250 µL roztworu CTV_high do probówek VC i VI, 250 µL roztworu CTV_low do probówki CV, a następnie 250 µL 1x PBS/EDTA do probówki CF. Należy zastosować tę samą technikę, która została opisana w kroku 1.5. Inkubować w 37 °C przez dokładnie 8 min.
  10. Po inkubacji dodać 5 ml DMEM + 10% FBS. Przechowywać w 37 °C przez 5 min.
  11. Wirować probówki przez 5 min przy 300 x g godlej nadsącz, nie naruszając osadu, a następnie przemyj osad 5 ml 1x PBS/EDTA. Ponownie wiruj przez 5 min przy 300 x g.
  12. Odlej nadsącz, nie naruszając osadu, a następnie resuspenduj komórki CD34- frakcje w 1x PBS/EDTA do uzyskania stężenia końcowego 1,5 x 106 komórek/ml. Resuspenduj CD34+ frakcje w 40 µL buforu barwiącego, a następnie przenieść komórki do probówek o pojemności 1,5 ml.

2. Barwienie przeciwciałami

UWAGA: Barwienie przeciwciałami można dostosować do potrzeb eksperymentalnych. Tylko frakcje CD34+ podlegają barwieniu przeciwciałami; frakcje CD34- są wykorzystywane jako kontrola pojedynczego barwienia dla kombinacji barwników podziału komórkowego (frakcje CV, VC, CF i VI). Poniższy panel jest dostosowany do detekcji czterech typów HSPC: hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC), progenitorów wielopotencjalnych (MPP), lymphoid-primed multipotent progenitors (LMPP) oraz hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC)12. Przedstawiono jednak identyfikację HSC i MPP. Wymagany czas: 75 min.

  1. Przygotować barwienia pojedyncze do barwienia powierzchniowego, wykorzystując koraliki do kompensacji. Wymieszać koraliki negatywne oraz koraliki z Immunoglobuliną G (IgG) w stosunku 1:1, tak aby całkowita objętość odpowiadała 20 µL x liczbę markerów powierzchniowych (np. 120 µL, jeśli panel barwienia zawiera sześć przeciwciał).
  2. Rozdzielić po 20 µL koralików do oddzielnych probówek 1,5 mL dla każdego markera. Do odpowiedniej probówki dodać objętość odpowiadającą czynnikowi rozcieńczenia dla każdego przeciwciała (np. jeśli czynnik rozcieńczenia wynosi 1:20, dodać 1 µL).
  3. W celu zabarwienia komórek CD34+, przygotować mieszaninę główną (master mix) przeciwciał12, zgodnie z Tabelą 1. Wymieszać przeciwciała w jednej probówce 0,5 mL. Do każdego z czterech wariantów CD34+ dodać 7 µL mieszaniny głównej przeciwciał.
  4. Inkubować koraliki do kompensacji oraz próbki CD34+ w temperaturze 4° C przez co najmniej 30 min.
    UWAGA: Czas inkubacji musi zostać dostosowany do specyfikacji technicznej przeciwciał użytych do barwienia.
  5. Podczas inkubacji przygotować płytkę 96-dołkową z dnem okrągłym do sortowania, dodając 100 µL pożywki do hodowli komórkowej do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej.
    UWAGA: Pozostawić puste dołki H8-H12.
  6. Oznakować probówki polipropylenowe 5 mL dla kontroli barwienia powierzchniowego (5, z użyciem koralików), kontroli barwników podziału komórkowego (4, z użyciem frakcji CD34-) oraz próbek CD34+ (4).
  7. Po zakończeniu inkubacji wyprać komórki i koraliki 1 mL buforu do barwienia. Przenieść całą objętość do probówek polipropylenowych 5 mL. Wirować probówki przez 5 min przy 300 x g, a następnie odessać nadsącz, nie naruszając osadu.
  8. Resuspendować komórki w buforze do barwienia, używając około 500 µL dla koralików i komórek CD34+ oraz 1 mL dla probówek CD34-.

Tabela 1: Szablon przygotowania mastermixu przeciwciał do eksperymentu sortowania komórek. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

3. Sortowanie komórek

UWAGA: Liczba posortowanych komórek może się różnić w zależności od całkowitej dostępnej liczby komórek. W protokole podano minimalną liczbę komórek dla każdej kontroli. Czas wymagany (dla jednej płytki): 100 min.

  1. Otwórz szablon eksperymentu lub ustaw nowy eksperyment. Utwórz jedną próbkę i wiele probówek, po jednej dla każdego warunku.
  2. Ustaw strategię bramkowania szczegółowo opisaną na Rysunku 1, tworząc sześć wykresów kropkowych. Najpierw zwizualizuj komórki na wykresie kropkowym FSC-A/SSC-A i dwukrotnie kliknij narzędzie bramkowania wielokątnego (polygon gating tool), aby wybrać populację o niskim rozproszeniu bocznym (Rysunek 1A). Na kolejnym wykresie kropkowym (FSC-A/FSC-H) kliknij prawym przyciskiem myszy na wykres i wybierz z menu rozwijanego bramkę „Cells”. Użyj tego samego narzędzia bramkowania, aby wybrać wąską populację na przekątnej między dwiema osiami (Rysunek 1B).
  3. Na trzecim wykresie kropkowym (APC vs. FSH-H) wyświetl populację „Single Cells” i bramkuj komórki ujemne pod kątem ekspresji linii APC (Lin) (Rysunek 1C). Na czwartym wykresie (CFSE vs. CTV) wyświetl populację „Lin-” i utwórz cztery oddzielne bramki, po jednej dla każdej kombinacji barwników (Rysunek 1D).
    UWAGA: Bramki te muszą być wąskie, aby wybrać tylko niewielką frakcję jednorodnie zabarwionych komórek.
  4. Użyj piątego i szóstego wykresu (APC-Cy7 vs. BV650 oraz PE-Cy7 vs. PE), aby zidentyfikować interesujące progenitorów. W piątym wykresie szeroko bramkuj populację CD34+CD38- oraz CD34+CD38+ (Rysunek 1E). Następnie wybierz populację CD34+CD38- na szóstym wykresie i narysuj trzy bramki zgodnie z Rysunkiem 1F.
  5. Uruchom analizę probówek z pojedynczym barwieniem zawierających koraliki kompensacyjne, klikając przycisk Acquire. Dostosuj napięcia fotopowielaczy (PMT) z menu rozwijanego Parameters, w szczególności dla barwników podziału komórkowego (między 104 a 105 w skali bieksponencjalnej).
  6. Dostosuj macierz kompensacji zgodnie z panelem użytym do sortowania, korzystając z karty Compensation. Zarejestruj co najmniej 5 000 zdarzeń w bramce koralików, klikając przycisk Record.
  7. Uruchom analizę frakcji CD34- i ponownie sprawdź macierz kompensacji. Zarejestruj co najmniej 10 000 zdarzeń w bramce pojedynczych komórek (single-cell gate).
  8. Uruchom analizę frakcji CD34+, rejestrując co najmniej 5 000 zdarzeń w bramce pojedynczych komórek. Dostosuj bramkę dla każdej kombinacji barwników, ustawiając wąską bramkę w celu wyboru jednorodnej populacji (Rysunek 1D). Podobnie dostosuj bramkowanie w celu wyboru HSCs i MPPs.
  9. Po zakończeniu analizy i zarejestrowaniu wszystkich probówek włóż płytkę do odpowiedniego uchwytu, po uprzednim przeprowadzeniu standardowej kalibracji Aria do sortowania na płytki 96-dołkowe. Zaleca się chłodzenie płytki.
  10. Przygotuj szablon sortowania na płytce zgodnie ze schematem przedstawionym w Tabeli 2, korzystając z układu sortowania (sort layout) eksperymentu. Dołki nazwane „CD34-” zawierają 5 000–10 000 komórek, posortowanych na bramce CF/CV/VC/VI. Dołki „Bulk” zawierają co najmniej 500 komórek, posortowanych na bramce CD34+CD38-. Wreszcie, dołki pojedynczych komórek zawierają tylko jedno zdarzenie na kombinację barwnika podziału komórkowego na dołek, czyli łącznie cztery zdarzenia na dołek.
    UWAGA: Populacje „Bulk” mogą być dostosowane do konkretnych podzbiorów progenitorów; nie sortuj mniej niż 500 komórek.
  11. Podczas sortowania postępuj w określonej kolejności, kończąc każdą kombinację barwnika podziału komórkowego przed przejściem do następnej. Na przykład zacznij od sortowania CD34- CF w trybie czystości yield. Kliknij przycisk acquire, a następnie przycisk sort.
  12. Po zakończeniu sortowania CD34- włóż probówkę CF CD34+. Uruchom akwizycję, a następnie kliknij przycisk sort, upewniając się, że zaznaczono 0/16/0 jako stopień czystości (purity grade). Na koniec posortuj interesujące komórki, jedną komórkę na dołek, w czystości single-cell, upewniając się, że zaznaczono opcję Index Sorting.
  13. Przejdź do następnej kombinacji barwników podziału komórkowego, powtarzając tę samą kolejność. Jako punkt odniesienia w Tabeli 2 znajduje się przykład posortowanej płytki.
    UWAGA: Funkcja index sorting generuje oddzielne pliki dla każdego posortowanego warunku.
  14. Po zakończeniu sortowania wyeksportuj pliki w formacie .fcs 3.0. Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, z 5% CO2. Komórki są hodowane przez wiele dni, zgodnie z planem eksperymentalnym, przez co najmniej 24 h26.

Tabela 2: Szablon 96-dołkowej płytki do sortowania komórek, opracowany na podstawie konkretnych wymagań dla następującej analizy cytometrycznej. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

4. Analiza danych z sortowania komórek

UWAGA: Aby zweryfikować jakość sortowania komórek, przed przejściem do kolejnych etapów niezbędna jest analiza danych FACS. Głównym rezultatem tego kroku jest utworzenie arkusza kalkulacyjnego zawierającego intensywności markerów dla każdej posortowanej pojedynczej komórki.

  1. Prześlij pliki .fcs 3.0 do oprogramowania analitycznego.
  2. Zweryfikuj ustawienia kompensacji użyte podczas sortowania komórek, korzystając z plików z pojedynczym barwieniem zarejestrowanych przed właściwym sortowaniem.
  3. Ustaw zaktualizowaną strategię bramkowania (gating), używając plików odpowiadających poszczególnym próbkom zbiorczym. Skopiuj i wklej te bramki do plików z sortowaniem indeksowanym.
  4. Sprawdź, czy komórki sortowane indeksowo znalazły się w wyznaczonej bramce. Jeśli niektóre posortowane komórki zostały błędnie obramowane, można je zidentyfikować poprzez eksport współrzędnych płytek zarejestrowanych podczas sortowania indeksowego, a następnie usunąć je w późniejszym etapie analizy.
  5. Wyeksportuj zdarzenia z plików sortowania indeksowego jako parametry skompensowane. Eksportuj je do plików .csv, zaznaczając opcje "scale values" oraz "compensated parameters". Pliki te powinny zostać wyeksportowane do folderu o nazwie "Exported files".
  6. Połącz wszystkie pliki w jeden plik .csv, używając skryptu zawartego w Supplemental File 1. Ustaw odpowiednią ścieżkę za pomocą funkcji "setwd". Wynikiem działania tego skryptu jest arkusz kalkulacyjny zawierający wszystkie zdarzenia z różnych bramek oraz względne intensywności dla wszystkich parametrów.

5. Po barwieniu przeciwciałami w kulturze

UWAGA: Tę część protokołu należy przeprowadzić w warunkach sterylnych; kilka odczynników jest wspólnych dla poprzednich etapów i musi pozostać sterylnych. Do analizy cytometrycznej należy użyć cytometru przepływowego z czytnikiem płytek. Pozwala to na przeprowadzenie barwienia bezpośrednio na płytce do hodowli tkankowej, co minimalizuje utratę komórek poprzez ograniczenie liczby etapów pipetowania i wirowania. Należy przygotować barwienia pojedyncze dla markerów powierzchniowych przy użyciu kulek kompensacyjnych, z wyjątkiem studzienek A1-A4, które reprezentują barwienia pojedyncze dla kolorów CF/CV/VC/VI i znajdują się już na płytce 96-dołkowej. Populacje masowe sortowane zgodnie z barwnikiem komórkowym pomagają w ustaleniu strategii bramkowania dla liczby podziałów oraz ogólnego bramkowania. Wymagany czas: 120 min.

  1. Przed rozpoczęciem protokołu należy zaznaczyć studzienki zawierające co najmniej jedną komórkę, sprawdzając płytkę pod mikroskopem odwróconym. Krok ten pozwala zoptymalizować ilość przeciwciał użytych do barwienia i przyspiesza procedurę.
  2. Przygotować mastermix przeciwciał zgodnie z Tabelą 3. Ze względu na znaczną liczbę operacji pipetowania, tabela uwzględnia błąd techniczny pipetowania, zawierając dodatkowe 5% objętości. Przeciwciała opisane w tabeli pozwalają na charakterystykę szeregu HSPC z próbek ludzkiej krwi pępowinowej12.
  3. Wirować płytkę przez 5 min przy 300 x g. Szybko odwrócić płytkę pod dygestorium nad ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadsącz.
  4. Dodać 8 µL buforu do barwienia do studzienek A1-A4. Do pozostałych studzienek dodać 8 µL mieszaniny.
  5. Wymieszać koraliki negatywne i koraliki kompensacyjne IgG w stosunku 1:1, do uzyskania całkowitej objętości równoznacznej z 120 µL. Rozdzielić po 20 µL do jednej probówki 1,5 mL na każdy marker. Dodać objętość przeciwciał odpowiadającą czynnikowi rozcieńczenia (np. jeśli czynnik rozcieńczenia wynosi 1:20, dodać 1 µL).
    UWAGA: Dostosować całkowitą objętość do liczby markerów użytych do barwienia (np. 100 µL, jeśli panel barwienia zawiera pięć przeciwciał).
  6. Inkubować płytkę oraz kontrole kompensacyjne do barwienia pojedynczego w temperaturze +4 °C przez co najmniej 30 min.
    ​UWAGA: Czas inkubacji musi być dostosowany do parametrów technicznych przeciwciał użytych do barwienia.
  7. Przemyć koraliki 1 mL buforu do barwienia. Przenieść całą objętość do wcześniej oznakowanych polipropylenowych probówek 5 mL. Wirować probówki przez 5 min przy 300 x g, a następnie usunąć nadsącz via aspiracja.
  8. Przemyć komórki na płytce, dodając 100 µL buforu do barwienia na studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej. Wirować płytkę przy 300 x g przez 5 min, a następnie szybko odwrócić płytkę pod dygestorium nad ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadsącz.
  9. Resuspendować komórki w 85 µL buforu do barwienia, używając pipety wielokanałowej.
  10. Rozpocząć analizę na cytometrze przepływowym (Tryb akwizycji), używając dedykowanego szablonu i klikając custom. Ten spersonalizowany szablon uwzględnia cechy techniczne płytki 96-dołkowej z dnem okrągłym, w szczególności wymiary każdej studzienki (średnicę, głębokość i grubość). Sonda musi dotrzeć do dna studzienki, dlatego należy ustawić ją dokładnie w centrum studzienek A1 i H12.
  11. Po wybraniu interesujących fluoroforów z listy proponowanej przez oprogramowanie, ustawić konfigurację płytki zgodnie z szablonem płytki w Tabeli 2, skorygowanym o liczbę studzienek zawierających co najmniej jedną komórkę.
  12. Wybrać 100 µL jako limit objętości akwizycji. Zaznaczyć opcję mieszania . Ustawić szybkość akwizycji na maks. 1 µL/s, ponieważ niższa prędkość poprawia całkowitą objętość analizowaną na studzienkę.
  13. Dodać odpowiednie roztwory czyszczące i płuczące do studzienek H8-H12. Szablon w Tabeli 2 pozostawia konkretnie studzienki H8-H12 puste, ponieważ cytometr przepływowy musi przeprowadzić szereg cykli płukania na koniec analizy.
    UWAGA: Krok ten jest dostosowany do specyfiki użytego cytometru przepływowego.
  14. W sekcji wykresów i bramek (plots and gates) ustawić najpierw bramkę dla pojedynczych komórek, używając wykresu rozrzutu FSC-A/SSC-A, a następnie wykresu FSC-H/FSC-A. Stworzyć histogram dla każdego interesującego markera.
  15. Po potwierdzeniu ustawień przejść do sekcji Analiza . Najpierw przeanalizować barwienia pojedyncze, rejestrując nie mniej niż 5 000 zdarzeń (zakres optymalny: 5 000–15 000 zdarzeń), zarówno dla koralików kompensacyjnych, jak i frakcji barwionych CD34-. W razie potrzeby dostosować napięcia.
  16. Po zarejestrowaniu wszystkich barwień pojedynczych można rozpocząć właściwą akwizycję, klikając funkcję Akwizycja .

Tabela 3: Mastermix przeciwciał do eksperymentu cytometrii przepływowej, konkretnie do identyfikacji HSPC z ludzkiej krwi pępowinowej. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

6. Analiza danych z cytometrii przepływowej po hodowli

UWAGA: Opisana analiza danych jest specyficzna dla oprogramowania wymienionego w Tabeli materiałów. Głównym wynikiem jest wygenerowanie arkusza kalkulacyjnego zawierającego informacje o intensywności markerów powierzchniowych, liczbie podziałów i pokrewieństwie dla każdej analizowanej komórki. W tej części protokołu zawarto skrypt napisany w języku R, który jest niezbędny w tym procesie do wygenerowania końcowego arkusza analizy.

  1. Eksport pliki z cytometru przepływowego w formacie .fcs. Prześlij je do oprogramowania analitycznego, grupując je odpowiednio jako „pojedyncze barwienie”, „bulk” oraz „pojedyncza komórka”.
  2. Przygotować macierz kompensacyjną w oparciu o pliki z barwieniem pojedynczym, a następnie zastosować ją do dwóch pozostałych grup poprzez przeciągnij i upuść.
    UWAGA: W przypadku użycia narzędzia do automatycznej kompensacji należy ręcznie sprawdzić jakość przed dalszymi działaniami.
  3. Aby uzyskać reprezentatywne bramkowanie, należy połączyć dane z różnych studzienek z populacją ogólną (bulk) w jednym pliku. Krok ten pozwala szybko zidentyfikować nakładanie się dwóch kolorów (zazwyczaj CV i VC) lub inne anomalie, które w związku z tym powinny zostać wykluczone. Po kliknięciu w łączenie populacji opcja, zaznacz wszystko parametry niekompensowane z menu „parametry”, a następnie kliknij w konkatenacja.
  4. Prześlij skonsolidowany plik do obszaru roboczego, a następnie zastosuj macierz kompensacji. poprzez przeciągnij i upuść.
  5. Przygotować strategię bramkowania zdefiniowaną w Rycina 2 używając pliku skonsolidowanego. W bramce pojedynczych komórek wyświetl zdarzenia na wykresie rozrzutu z CFSE i CTV. Utwórz pierwszą bramkę o nazwie Labeled, obejmującą wszystkie cztery kolory i wykluczającą możliwą autofluorescencję (Rycina 2C). Następnie należy wyznaczyć bramki dla każdego koloru z osobna.
  6. Komórki znakowane CV i VC wymagają wartości przekształconej, biorąc pod uwagę, że kolor jest wynikiem sygnałów CFSE i CTV. Dwa skoordynowane sygnały są zatem obracane w skali logarytmicznej o 45°aby umożliwić przebieg rozcieńczenia podziałowego równolegle do osi x. Przetransformowaną wartość tę wyznacza się ręcznie, klikając Narzędzia, a następnie Wyznaczenie parametruWklej następujący wzór do wzór pudełko:
    Równanie parametrów logarytmicznych z wykorzystaniem \(\sqrt{2}/2\); analiza wyrażenia matematycznego.
    UWAGA: Równanie26 zakłada, że CFSE i CTV są parametrami 03 i 17.
  7. Aby prawidłowo zwizualizować ten nowy parametr o nazwie Derived Parameter, należy ustawić oś liniową w zakresie od ok. 3 do 7, klikając w Oś opcje parametrów i ich wybór Dostosuj oś.
  8. Zastosuj bramkowanie dla każdego koloru oddzielnie w formie wykresu histogramu: dla CF i VI ustaw CFSE-A i CTV-A odpowiednio na osi X. W przypadku CV i VC ustaw nowo Parametr pochodny na osi x. Wyznacz bramki odpowiadające każdemu piku, zgodnie z przedstawionym w Rycina 3.
  9. Zastosuj bramkowanie do każdej pojedynczej studni z jedną komórką. Upewnij się, że pochodna wartość parametru została dodana do każdej analizowanej studni. Ręcznie zweryfikuj każdą bramkę kolorystyczną dla każdej studni, aby wykryć zdarzenia błędnie przypisane do danego piku. Przykłady bramkowania przedstawiono w Rycina 4.
  10. Po zakończeniu analizy i zweryfikowaniu wszystkich studni, należy wybrać wszystkie bramki CF/CV/VC/VI, które zawierają co najmniej jedną komórkę. Eksport je jako pliki .csv, zaznaczając opcje „wartości skali„ i „parametry skompensowane. Pliki te są eksportowane do folderu o nazwie „Wyeksportowane pliki".
  11. Połącz wszystkie pliki w jeden plik .csv, korzystając ze skryptu R w Plik uzupełniający 1Należy pamiętać o ustawieniu odpowiedniej ścieżki za pomocą funkcji „setwd”. Wynikiem działania tego skryptu jest arkusz kalkulacyjny zawierający wszystkie różne zdarzenia wyselekcjonowane za pomocą bramkowania oraz względne intensywności dla wszystkich parametrów.
  12. Otwórz arkusz kalkulacyjny i zmień nazwy kolumn dla każdego parametru, na przykład używając następujących nazw: CFSE, CTV, CD90, CD123, CD45RA, CD34, CD38. Nazwy te posłużą do zidentyfikowania progów bramkowania, aby prawidłowo przypisać tożsamość każdej komórce.
  13. Dodaj sześć kolumn o nazwach „Well”, „Condition”, „Color”, „Generation”, „Original_cell” oraz „Culture_time”. Zmienne te są zdefiniowane eksperymentalnie i są wnioskowane z każdego wiersza:
    eksport_A10 CD34 + PBS_CV_Szczyt 1.csv.1 = A10 (dołek), CD34+ (Komórka_oryginalna), PBS (Warunek), CV (Kolor), Szczyt_1 (Generacja).
  14. Wyeksportuj studzienki zbiorcze (bulk wells), aby określić wartości progowe dla bramkowania: wyeksportuj skompensowaną populację docelową (np. CD34+CD38-) jako pliki .csv, zaznaczając opcje „wartości skaliiparametry skompensowaneWyeksportuj te pliki do folderu o nazwie „Wyeksportowane pliki".
  15. Aby wyznaczyć próg dla CD38, należy zidentyfikować najwyższą wartość liczbową dla tego parametru. I odwrotnie, aby wyznaczyć próg dla CD34, należy zidentyfikować najniższą wartość liczbową dla tego parametru. Powtórz tę procedurę dla wszystkich interesujących parametrów.
    UWAGA: W analizie przedstawionej w protokole marker CD45RA jest używany zarówno do identyfikacji LMPP w populacji CD34+CD38- bramkowanie i CMP/GMP w komórkach CD34+CD38+ bramkę. Oznacza to, że dla tego markera należy wyznaczyć dwie różne wartości progowe.
  16. Skopiuj i wklej wartości progowe do pliku Excel o nazwie „gating_matrix”. Plik ten jest zorganizowany zgodnie z Tabela 4oraz umożliwia analizę wielu niezależnych eksperymentów. Bardzo ważne jest, aby każdą kolumnę nazwać dokładnie według następującego schematu: XXYYMMDD_xxh, gdzie XX oznacza dwie inicjały operatora, YY dwie ostatnie cyfry roku, MM miesiąc, DD dzień, a xx punkt czasowy analizy.

Tabela 4: Macierz bramkowania dla przypisania losu komórek, przed analizą statystyczną.CD45h odnosi się do intensywności CD45RA dla bramkowania podzbioru HPC, natomiast CD45l odnosi się do intensywności CD45RA dla podzbiorów CD34+CD38-. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

7. Analiza statystyczna

UWAGA: Statystyczna analiza wygenerowanych danych odbywa się przy użyciu niestandardowego potoku analitycznego, napisanego w języku programowania Python (Plik uzupełniający 2, Plik uzupełniający 3 oraz Plik uzupełniający 4). Skrypt jest zorganizowany w trzech blokach: pierwszy służy do przetwarzania arkusza kalkulacyjnego, drugi do generowania mapy ciepła w celu wizualizacji danych, a ostatni do generowania wielu histogramów w celu analizy i testowania właściwości różnicowania i podziału.

  1. Zaczynając od bloku „0_process_data” (Plik uzupełniający 2), należy upewnić się, że w skrypcie poprawnie zdefiniowano ścieżki do gating_matrix oraz arkusza danych.
  2. Należy zdefiniować słownik „cell_cols”, aby przypisać odpowiednie losy komórek do każdej z nich. W tym konkretnym przypadku losami są HSCs, MPPs, LMPPs, wspólne progenitory mieloidalne (CMPs), progenitory granulocytowo-monocytowe (GMPs), progenitory megakariocytowo-erytroidalne (MEPs) oraz CD34-.
  3. Wykorzystując wartości progowe określone dla dołków zbiorczych (krok 6.16), należy zdefiniować funkcję „cell_class_exp_time”. Niezbędne jest zachowanie spójności w nazewnictwie kolumn, aby poprawnie zdefiniować te progi, używając tych samych nazw, które posłużyły do zdefiniowania każdej kolumny w kroku 6.12.
  4. Fenotypy komórek są definiowane w skrypcie za pomocą serii instrukcji „if-else”, w oparciu o progi wykryte podczas analizy cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Można wyświetlać różne fenotypy poprzez modyfikację tych instrukcji w celu uwzględnienia innych kombinacji markerów.
  5. Należy określić specyficzne warunki eksperymentalne za pomocą funkcji „cond_rule” (np. różne zabiegi eksperymentalne). Dla dostarczonego zbioru danych warunki noszą nazwy „GT” oraz „Diff”. Należy opisać dwa różne media hodowlane użyte do hodowli komórek. Informacje te zostaną wykorzystane przez blok „1_dot_plot” (Plik uzupełniający 3) do wykreślenia mapy ciepła.
  6. W bloku „2_bar_plot” (Plik uzupełniający 4) należy zdefiniować słownik „class_dct”, zawierający interesujące dyskretne losy komórek. Dla dostarczonego zbioru danych są to te same losy komórek, które opisano dla słownika „cell_cols”.
  7. Należy zdefiniować „conds” (warunki), „or_cells” (komórka oryginalna), „sym_labs” (etykiety symetrii) oraz „times” (punkt czasowy eksperymentu). Są to powtarzające się filtry niezbędne do wykresowania. W „conds” ponownie wprowadza się warunki zdefiniowane w „cond_rule”, „or_cells” to HSCs i MPPs, a „sym_labs” opisują typy podziałów.
  8. W bloku „2_bar_plot” można wykreślić komórki, które przeszły do podziału 6.
    UWAGA: Dostarczony zbiór danych zawiera komórki tylko do podziału 4, w związku z czym pojawi się komunikat o błędzie, ale nie uniemożliwia to działania skryptu.
  9. Ryciny wygenerowane przez skrypt można odnaleźć w folderze o nazwie „figures” jako pliki pdf. Pliki o nazwie „Test” reprezentują różne testy statystyczne wykonane dla odpowiadającego im histogramu.

Wyniki

Sortowanie FACS
Strategie bramkowania (gating) przedstawione w niniejszym protokole opierają się na powszechnie akceptowanych metodach12,30,31. W przypadku strategii bramkowania przedstawionej na Rysunku 1, materiałem wyjściowym są progenitorzy z krwi pępowinowej uprzednio oczyszczeni via magnetyczne wzbogacenie CD34+, co wyjaśnia znikomy odsetek komórek Lineage-dodatnich. Niezbędne jest zastosowanie wąskich bram dla czterech kombinacji barwników wewnątrzkomórkowych (np. CTV na rysunku), aby poprawić rozdzielczość pików podczas następującej analizy oraz aby wyznaczyć właściwą populację komórek (Rysunek 1D). W przypadku pokazanym na rysunku, bramki selekcjonują największą i najlepiej zdefiniowaną populację. Obecność wielu, blisko położonych populacji dla każdej kombinacji barwników podziału komórkowego nie jest w naszym doświadczeniu reprezentatywna dla różnic biologicznych. Może ona zamiast tego wskazywać na a) nieoptymalną procedurę barwienia lub b) dużą heterogenność (zwłaszcza w rozmiarze) w wyjściowej puli komórek. Nie jest to zaskakujące w przypadku materiału z krwi pępowinowej lub innych złożonych źródeł biologicznych (np. aspiratów szpiku kostnego, krwi obwodowej). Jeśli brama nie jest ściśle zdefiniowana, postępujące rozcieńczanie różnych kombinacji barwników może prowadzić do zlewania się późniejszych pików, szczególnie w warunkach CV i VC (Rysunek 2D). Inną negatywną konsekwencją nieoptymalnego bramkowania jest brak możliwości efektywnego rozróżnienia poszczególnych pików po hodowli komórkowej, ponieważ heterogenna populacja wyjściowa może prowadzić do powstania niskich i rozmytych pików.

Analiza cytometrii przepływowej; schematy sortowania komórek; opisane osie FSC, SSC, APC; markery CD34, CD38.
Rysunek 1: Strategia bramkowania dla sortowania komórek. (A) FSC-A względem SSC-A, w celu wykluczenia debris i komórek zanieczyszczających. (B) FSC-A względem FSC-H, w celu wykluczenia dubletów i skupisk komórek. (C) Lin względem FSC-H, w celu wykluczenia komórek Lin+. (D) CTV względem CFSE, aby jednoznacznie zidentyfikować komórki zabarwione kombinacjami barwników CF, CV, VC i VI. Bramki powinny być na tyle rygorystyczne, aby objąć jednorodną populację. (E) CD34 względem CD38, w celu oddzielenia ograniczonych progenitorów CD34+CD38+ (zwanych również HPCs) od komponentu multipotentnego CD34+CD38-. (F) CD45RA względem CD90, z populacji CD34+CD38-, w celu rozróżnienia między najmniej dojrzałymi progenitorami wzbogaconymi w HSC (CD90+CD45RA-), LMPP (CD90midCD45RA+) a bardziej zdeterminowanymi MPP (CD90-CD45RA-). (G) Indeks posortowanych zdarzeń, przedstawiony tutaj pod kątem kombinacji barwników komórkowych oraz (H) ekspresji markerów powierzchniowych CD90 i CD45RA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza cytometrii przepływowej po hodowli komórkowej
Dane przedstawione na Rycini 2 są reprezentatywne dla ludzkich HSCs z krwi pępowinowej, utrzymywanych w hodowli przez 72 h w obecności wielu cytokin zdolnych do wspierania szerokiej gamy progenitorów i prekursorów mieloidalnych. Panele od 2A do 2D przedstawiają bramkowanie niezbędne do ustalenia pokrewieństwa każdej z poszczególnych komórek, natomiast panele od 2E do 2G umożliwiają fenotypowanie komórkowe. Zmniejszona obecność MEPs na rycinie jest prawdopodobnie wynikiem warunków hodowli zastosowanych w tym reprezentatywnym eksperymencie (Rycina 2F). Zastosowanie innych cytokin i warunków hodowli zmienia względny procent każdego podzbioru, podobnie jak wybór różnych komórek wyjściowych do eksperymentu.

Wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej przedstawiające populacje komórek znakowane CFSE i CTV, z wyróżnieniem podzbiorów komórek CD34 CD38.
Rycina 2: Strategia bramkowania dla analizy cytometrycznej. (A) FSC-A względem SSC-A w celu wykluczenia debris i komórek zanieczyszczających. (B) FSC-A względem FSC-H w celu wykluczenia dubletów i agregatów komórkowych. (C) CTV względem CFSE; bramka Labeled pozwala na wykluczenie zdarzeń autofluorescencyjnych, które mogłyby wpłynąć na rozdzielczość danych. (D) CTV względem CFSE. Niezwykle ważne jest rygorystyczne bramkowanie czterech populacji na podstawie rozcieńczeń barwnika podziałów komórkowych. (E) CD34 względem CD38 w celu rozróżnienia prekursorów zdeterminowanych (CD34-), ograniczonych progenitorów (HPC) (CD34+CD38+) oraz niedojrzałych progenitorów (CD34+CD38-). (F) CD45RA względem CD123 w celu rozróżnienia trzech typów ograniczonych progenitorów: CMP (CD123+CD45RA-), MEP (CD123-CD45RA-) oraz GMP (CD123+CD45RA+). (G) CD45RA względem CD90 z populacji CD34+CD38- w celu identyfikacji HSCs, LMPPs oraz MPPs. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Etapy definiowania i przypisywania pików (Rycina 3 i Rycina 4) są kluczowymi aspektami protokołu i wymagają zdefiniowania rygorystycznych bramek (gates). Dla definicji piku (Rycina 3) niezbędne jest co najmniej 1 000 zdarzeń, aby identyfikacja była wiarygodna. W związku z tym korzystne może być wyizolowanie większej liczby komórek podczas etapu sortowania komórek do studzienek typu „Bulk”. Rycina 4 przedstawia cztery przykłady pojedynczych studzienek zawierających wiele rodzin. Rycina ta wyjaśnia znaczenie bramkowania z Ryciny 2D i Ryciny 3, szczególnie w odniesieniu do identyfikacji każdej rodziny i każdego piku. Rycina 4A ilustruje prosty przykład, w którym wszystkie komórki w bramce CF znajdują się bardzo blisko siebie i mogą zostać łatwo przypisane do jednego piku. Rycina 4C pokazuje inny przykład rodziny rozłożonej jednoznacznie na dwa wyraźnie oddzielone piki, co jest wyraźnie widoczne na histogramie na Rycynie 4D. Rycina 4E,G ujawniają znaczenie rygorystycznego bramkowania opartego na dużej liczbie zdarzeń; obie pokazują kilka zdarzeń, które są bliskie, ale znajdują się poza bramkami dla kombinacji barwników. Zdarzenia te mogłyby zostać błędnie włączone do bramek VI i CF, gdyby opierano się wyłącznie na analizie pojedynczej studzienki. Na koniec Rycina 4F,H przedstawiają dwa różne przykłady rodzin rozproszonych na wielu pikach: jeden przykład z dwoma pikami o podobnej intensywności (Rycina 4F) oraz jeden z dwoma pikami o różnej intensywności (Rycina 4H).

Histogramy cytometrii przepływowej; analiza danych CFSE, CTV; piki wskazują stadia proliferacji komórek.
Rysunek 3: Definicja pików dla analizy cytometrii przepływowej. (A-D) Piki powinny być definiowane przy rejestracji co najmniej 500 zdarzeń, aby zapewnić dobrą reprezentację każdego pojedynczego piku. (A) Histogram dla intensywności CFSE-A. Można zidentyfikować kilka pików, z których każdy odpowiada innej populacji dzielących się komórek. (B,C) Histogramy dla intensywności parametru pochodnego, reprezentującego mieszaninę CFSE-CTV, odpowiednio CV (B) i VC (C). (D) Histogram dla intensywności CTV-A. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza cytometryczna, wykresy rozrzutu CFSE i CTV, identyfikacja populacji komórek, wizualizacja danych.
Rycina 4: Przypisanie piku. (A,B) Dla tej studzienki można wykryć tylko jeden pik, w bramce CF. (C,D) W tej studni można wykryć dwa piki o niemal równej intensywności, w bramce VI. Piki są dobrze rozdzielone. (E,F) W tej studni można wykryć dwa piki o zbliżonej intensywności, w bramce VI. Uwzględniono jedynie zdarzenia w bramce, zgodnie ze strategią opracowaną dla studni zbiorczych. (G-H) W tej studni można wykryć dwa piki o różnej intensywności, w bramce CF. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Reprezentacja danych i testy statystyczne
Rysunek 5 przedstawia różne typy reprezentacji danych z dwóch oddzielnych eksperymentów, oba przeprowadzonych po 72 h hodowli komórkowej. Komórki HSC i MPP były hodowane w dwóch różnych mediach hodowlanych, które miały na celu zmianę właściwości podziału i różnicowania komórek. Media te nazwano „Diff” (Differentiation – różnicowanie)32 oraz „GT”33; pierwsze promuje różnicowanie mieloidalne i erytroidalne, ponieważ zawiera erytropoetynę (EPO) oraz czynnik stymulujący kolonie granulocytowo-monocytarne (GM-CSF), natomiast drugie zostało opracowane w kontekście klinicznych badań nad terapią genową, z celem utrzymania i namnożenia wysokiego odsetka HSPC. Rysunek 5A to reprezentatywna mapa ciepła dla warunku „Diff”, przedstawiająca różnorodne rodziny komórek, zarówno pod kątem ich losów, jak i podziałów. Na tej mapie ciepła każdy wiersz reprezentuje pojedynczą rodzinę, każdy kwadrat pojedynczą komórkę, a kolumny grupują wszystkie komórki znajdujące się w tym samym pokoleniu (np. komórki w 2. pokoleniu podzieliły się co najmniej dwukrotnie). Można wyróżnić rodziny wysoce homogeniczne, składające się z jednego typu komórek i wykazujące tę samą liczbę podziałów (np. rodzina nr 63) oraz rodziny heterogeniczne, obejmujące trzy typy komórek w obrębie dwóch pokoleń (np. rodzina nr 84). Ponieważ wskaźnik odzyskiwania komórek dla tej analizy wynosi około 70%, rzadko obserwuje się rodziny kompletne, definiowane jako takie, w których odzyskano wszystkie komórki, potencjalnie w różnych pokoleniach (np. rodzina składająca się z jednej komórki w 1. pokoleniu i dwóch komórek w 2. pokoleniu) (oznaczone znakiem kratki obok numeru ID na Rysunku 5A). Istnieje wiele wyjaśnień niepełnej detekcji, które mogą być techniczne (problem z barwieniem, utrata komórek wynikająca z protokołu) lub biologiczne (śmierć komórek i/lub apoptoza). Ograniczenia techniczne można pokonać, stosując analizator zaprojektowany w celu zmniejszenia objętości martwej związanej z pojedynczą próbką oraz wykonując barwienie komórek bezpośrednio w płytce hodowlanej, aby zminimalizować pipetowanie objętości. Z kolei ortogonalne metody określania poziomu śmierci komórek (np. poprzez eksperymenty z obrazowaniem żywych komórek) mogą pomóc w odróżnieniu czynników technicznych i biologicznych prowadzących do niepełnej detekcji.

Rysunek 5Bi pokazuje, jak wizualizować wpływ warunków hodowli na skład typów komórek, analogicznie do wykonania analizy bulk. W tym przypadku warunek Diff sprzyja powstaniu większej liczby losów komórkowych oraz wyższemu odsetkowi komórek CD34+ (zdefiniowanych jako wszystkie typy komórek z wyjątkiem CD34-). Przedziały ufności zostały obliczone w skrypcie via podstawowy bootstrap, przy użyciu 250 000 zestawów danych z bootstrapu34. Warto zauważyć, że wszystkie pozostałe histogramy na Rysunku 5 prezentują przedziały ufności obliczone w ten sam sposób. Tabela 5 podsumowuje wszystkie informacje dotyczące liczby rodzin oraz liczby komórek w każdym pokoleniu.

Rysunek 5Bii graficznie przedstawia wyniki testów statystycznych przeprowadzonych w skrypcie „2_bar_plot”. Formalny opis ram statystycznych jest dostępny26. W skrócie, ramy te umożliwiają testowanie hipotez statystycznych przy założeniu, że komórki z tej samej rodziny są od siebie zależne (założenie to jest samo w sobie testowalne), w przeciwieństwie do statystyki klasycznej, która wymagałaby niezależności między wszystkimi obserwowanymi komórkami. W konkretnym przypadku przedstawionym na rysunku, test statystyczny weryfikuje hipotezę, że wybory losu komórkowego MPPs, mierzone jako częstości różnych typów komórek obecnych w hodowli, są niezależne od zastosowanych warunków hodowli komórkowej. Najpierw statystyka testu G jest wykorzystywana do oceny rozbieżności między częstościami typów komórek z różnych mediów hodowlanych (dla przykładu w Bii statystyka ta jest reprezentowana przez czerwony słupek). Następnie przeprowadzana jest randomizacja danych poprzez permutację, polegająca na zamianie całych rodzin komórek między dwoma warunkami hodowli. Ma to na celu zachowanie zależności między komórkami spokrewnionymi rodzinnie, przy jednoczesnym utrzymaniu liczby rodzin w każdym zbiorze zgodnie z danymi oryginalnymi. Statystyka testu G jest obliczana z zrandomizowanego zbioru danych. Wartości niebieskie przedstawione w 5Bii to statystyka testu G dla 250 000 permutacji. Na koniec obliczana jest wartość p, aby ocenić stopień, w jakim oryginalny zbiór danych odbiega od rozkładu zbiorów permutowanych. W tym przykładzie oryginalna statystyka znacząco odbiega od rozkładu, co skutkuje małą wartością p i tym samym odrzuceniem hipotezy, że los komórkowy MPPs jest niezależny od warunków hodowli.

Rycina 5C przedstawia procent rodzin komórek w zależności od maksymalnej generacji, aby zbadać, jak różne warunki wpływają na podziały komórkowe w obrębie pojedynczej rodziny. Wykres ten pokazuje, że po 72 h komórki hodowane w warunkach Diff wykonują większą liczbę podziałów niż komórki w warunkach GT. Przedstawiono liczbę maksymalnych generacji dla każdej rodziny, zatem rodzina, w której występują komórki z generacji 1 i 2, jest uznawana za generację 2. Do statystycznego sprawdzenia niezależności między podziałami komórkowymi a warunkami hodowli można zastosować ten sam model statystyczny, który wykorzystano w Rycini 5B.

Rysunek 5D analizuje rodzaj symetrii/asymetrii pierwszego podziału dla różnych typów komórek przodków (HSCs lub MPPs). Dla pełnych rodzin komórek w pokoleniu 1 – jedynym pokoleniu, w którym można jednoznacznie ustalić, że dwie komórki potomne są komórkami siostrzanymi – można zdefiniować cztery różne typy symetrii/asymetrii: etykieta „Sym Undiff” opisuje rodziny, w których obie komórki potomne zachowują fenotyp komórki macierzystej. „Sym Diff” oznacza, że obie komórki potomne mają ten sam fenotyp, który różni się od fenotypu komórki macierzystej. „Asym Undiff” oznacza, że tylko jedna komórka potomna zachowuje fenotyp komórki macierzystej. Wreszcie, „Asym Diff” opisuje rodziny, w których obie komórki potomne mają różne fenotypy i żadna z nich nie jest taka sama jak komórka macierzysta. Aby uzyskać odpowiednią moc statystyczną w ocenie tych symetrycznych/asymetrycznych losów, wskazane jest przeprowadzenie analizy MultiGen we wczesnych punktach czasowych, aby zaobserwować więcej rodzin, których potomstwo znajduje się w pokoleniu 1.

Na koniec, Rycina 5E przedstawia procentowy udział typów komórek w funkcji liczby podziałów, aby uzyskać wgląd w progresję wzorca różnicowania w kolejnych podziałach. Na przykład dane przedstawione na rycinie sugerują, że komórki przechodzą w stan CD34-, przy czym ponad 50% wykrytych komórek w tej klasie występuje już po trzech podziałach. Ponadto można wywnioskować, że MPPs nie preferują podziałów prowadzących do samoodnowienia, ponieważ tylko niewielki procent komórek zachowuje pierwotny fenotyp. Niektóre z tych wniosków można następnie zweryfikować, korzystając z ram statystycznych przedstawionych na poprzednich rycinach.

Schemat generowania klonów, wykresy rozkładu typów komórek, analiza różnicowania MPP.
Rysunek 5: Przykład reprezentacji danych dla jednego eksperymentu trwającego 72 h z użyciem HSPC z krwi pępowinowej. (A) Mapy ciepła dla wybranego zestawu danych (HSC, w medium „Diff”, po 72 h hodowli). Wykresy przedstawiają wszystkie pojedyncze komórki (kwadraty) zgodnie z ich pokrewieństwem (wiersze), liczbą wykonanych podziałów (kolumny, nazwane generacjami) oraz fenotypem (kolory). (Bi) Histogram porównujący proporcje typów komórek w potomstwie komórek HSC i MPP pomiędzy warunkiem GT a warunkiem Diff. (Bii) Wykres przedstawia testy statystyczne wykonane w skrypcie „2_bar_plot” dla MPP po 72 h hodowli, porównujące koktajle cytokinowe „Diff” i „GT”. Wartość eksperymentalna jest wyświetlana na czerwono, a wartości wygenerowane poprzez 250 000 permutacji na niebiesko. W prawym górnym rogu wskazano wartość p. testu G wraz z liczbą rodzin użytych do testu. (C) Histogram porównujący procent rodzin (łącznie 314 rodzin) w każdej generacji (oznaczonej kolorami) dla HSC i MPP w zależności od warunków hodowli. Przedziały ufności obliczono na podstawie 250 000 zestawów danych metodą bootstrap. (D) Histogram przedstawiający typ symetrii/asymetrii pomiędzy losem komórek potomnych dla rodzin z dwiema komórkami w generacji 1: Sym Undiff (obie komórki potomne zachowują fenotyp komórki macierzystej), Sym Diff (obie komórki potomne mają ten sam fenotyp, który różni się od fenotypu komórki macierzystej), Asym Undiff (tylko jedna komórka potomna zachowuje fenotyp komórki macierzystej) oraz Asym Diff (obie komórki potomne mają różne fenotypy i żadna z nich nie przypomina komórki macierzystej). (E) Histogramy wkładu typów komórek zaklasyfikowanych według generacji dla MPP hodowanych z koktajlem „Diff”; n = 204 komórki i 97 rodzin. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 5: Opis liczby rodzin i komórek analizowanych dla każdego warunku eksperymentalnego (komórka macierzysta i pożywka hodowlana). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Test MultiGen jest wysokoprzepustowym, łatwym do wykonania i niedrogim badaniem, które odegrało istotną rolę w badaniu limfocytów23,24,35 oraz mysich komórek krwiotwórczych26,27. Przedstawiamy tutaj nowy rozwój tej metody, który pozwala na rozszyfrowanie ex vivo wczesnej fazy determinacji ludzkich HSPC na poziomie pojedynczych komórek przy użyciu krótkoterminowej hodowli (Rycina 6). Systemy hodowli pojedynczych komórek ex vivo są zazwyczaj stosowane do oceny długoterminowego losu HSPC w procesie przekształcania się w dojrzałe komórki, jednak niektóre ścieżki różnicowania zachodzą wcześniej niż inne36, co może potencjalnie zniekształcać analizę w stronę mniejszej liczby możliwych losów. Ponadto systemy hodowli te zazwyczaj pomijają informacje o podziałach podczas determinacji losu komórki. Wykazano, że pierwsze etapy determinacji mogą zachodzić już na początku hodowli, czasami bez podziału26,37, co sprawia, że krótkoterminowa hodowla i śledzenie podziałów są niezbędne do badania wczesnej determinacji losu. Poprzez jednoczesne śledzenie losu, podziałów i pokrewieństwa, test ten pozwala zrozumieć rolę pierwszego podziału i decyzji o losie komórki w ludzkich HSPC. Dzięki temu badaniu możliwe jest określenie, po ilu podziałach zachodzi proces determinacji, jaka jest równowaga między samoodnawianiem a różnicowaniem dla tych wczesnych progenitorów oraz w jaki sposób właściwości te są dziedziczone w kolejnych generacjach. Z naszej wiedzy jest to jedyny test pozwalający na tego typu pomiary dla ludzkich HSPC z rozdzielczością pojedynczej komórki. Ponadto, stosując różne kombinacje barwników do podziałów komórkowych, zwiększyliśmy przepustowość analizy, co czyni ten test cennym narzędziem do szybkiego generowania dużych zbiorów danych. Kombinacje barwników pozwalają śledzić kilka rodzin w tych samych dołkach, zwiększając liczbę komórek dostępnych do analizy w hodowli krótkoterminowej. Liczbę kombinacji można potencjalnie zwiększyć jeszcze bardziej via dodanie innych barwników (np. barwnika żółtego) lub zmianę stosunku CFSE do CTV. Jednakże ogranicza to liczbę innych parametrów, które można analizować.

Schemat procesu sortowania komórek: barwienie barwnikami, barwienie przeciwciałami, analiza danych, analiza statystyczna.
Rycina 6: Schematyczne przedstawienie protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Aby pomyślnie przeprowadzić analizę, ze względu na dużą liczbę dołków oraz niewielką liczbę komórek do analizy, konieczne jest wykonanie analizy cytometrycznej na analizatorze wyposażonym w czytnik płytek. Nowa generacja analizatorów stołowych jest szczególnie dostosowana do tego testu, ponieważ większość z nich posiada mniejszą objętość martwą, co redukuje procent strat komórek. Gwarantuje to z kolei wyższą wydajność w odzyskiwaniu całej zawartości każdego dołka, co przekłada się na szacowaną wydajność w zakresie 70%26. Oszacowanie utraty komórek podczas akwizycji w cytometrii przepływowej jest kluczowe dla analizy każdej pojedynczej rodziny. Na przykład, przy założeniu braku śmierci komórek i zliczeniu liczby podziałów, możliwe jest oszacowanie liczby komórek dla każdej rodziny. Niemniej jednak, zaleca się przeprowadzenie eksperymentów potwierdzających, w szczególności w celu oszacowania śmierci komórek w testowanych warunkach hodowli oraz eksperymentalnego pomiaru wskaźnika odzysku przy użyciu określonej liczby komórek.

Jednym z kluczowych etapów tego protokołu jest przypisanie pików. Jak już wspomniano, dobra jakość rozkładu pików jest silnie zależna od wyizolowania bardzo wąskich pików podczas sortowania komórek. Niemniej jednak, przypisanie prawidłowej liczby podziałów wyłącznie na podstawie rozkładu jest wciąż trudne. Ponieważ sortowanie komórek i analiza cytometrii przepływowej są wykonywane na dwóch różnych urządzeniach, bezpośrednie porównanie intensywności każdego sygnału nie jest możliwe, w związku z czym może być trudno określić, czy pierwszy pik zaobserwowany po prawej stronie histogramu to pik 0 czy pik 1. W tym zakresie możliwe jest kilka rozwiązań; jednym ze sposobów jest przeprowadzenie eksperymentu ortogonalnego w celu dokładnego zmierzenia liczby podziałów wykonanych przez te komórki (np. obrazowanie żywych komórek). Inną możliwością jest po prostu policzenie liczby komórek w studzience pod odwróconym mikroskopem w świetle przechodzącym przed przeprowadzeniem analizy cytometrii przepływowej. Pozwoli to wywnioskować średnią liczbę podziałów (przy założeniu braku śmierci komórek). Ostatecznie, rozwiązaniem post-hoc w celu przypisania pików jest wykrycie nietypowej liczby „rodzin niemożliwych”; rodziny te składają się z większej niż możliwa liczby komórek na generację (np. pięć komórek w generacji 2 lub dwie komórki w generacji 1 i jedna komórka w generacji 2). Możliwość wykluczenia rodzin niemożliwych jest zakodowana w etapie analizy statystycznej i flaguje taką rodzinę jako niemożliwą. Jeśli częstotliwość występowania tych błędów jest zbyt wysoka, można zasadnie założyć, że przypisanie pików wymaga rewizji.

W niniejszym protokole przedstawiono kilka przykładów reprezentacji i analizy danych dla przeprowadzonego testu, ponieważ stało się to niezbędnym etapem w generowaniu i interpretacji dużych zbiorów danych38. Pierwszym przykładem jest mapa ciepła (heatmap) przedstawiająca całość wszystkich analizowanych komórek, uporządkowanych według rodzin. Jest to wydajne narzędzie do badania ogólnych właściwości danych i wyciągania potencjalnych wniosków: czy rodziny składają się z wielu typów komórek, czy mają tendencję do homogeniczności składu? Czy rodziny obejmują wiele pokoleń, czy dzielą się głównie taką samą liczbą razy? Ta analiza eksploracyjna musi zostać następnie uzupełniona o bardziej specyficzne wykresy i testy statystyczne. Można ją wykorzystać do ilościowej oceny symetrycznego i asymetrycznego determinowania losu komórek, różnicowania bez podziału, równowagi między samoodnawianiem a różnicowaniem oraz liczby podziałów dla określonego losu determinacji. Podczas planowania eksperymentu kluczowe jest dostosowanie czasu hodowli komórek do rodzaju stawianego pytania; na przykład w przypadku dwóch pierwszych pytań (równowaga symetryczna/asymetryczna oraz różnicowanie bez podziału), zaplanowanie bardzo krótkich etapów hodowli pozwala na izolację dużej liczby rodzin, które wykonały tylko jeden podział lub nie dzieliły się wcale26. Z kolei dłuższe eksperymenty umożliwiają zbadanie liczby podziałów wymaganych do konkretnej determinacji komórkowej, ponieważ pozwalają na pobranie próbek rodzin na różnych etapach różnicowania. Niemniej jednak metoda ta nie jest przeznaczona do hodowli długoterminowych (2-3 tygodnie), ponieważ rozcieńczanie barwnika komórkowego nie pozwala na dokładne śledzenie więcej niż siedmiu lub ośmiu podziałów22. W konsekwencji narzędzie to jest dostosowane głównie do badania wczesnej determinacji progenitorów krwiotwórczych i nie służy do wyciągania wiarygodnych wniosków na temat długoterminowych właściwości różnicowania tych komórek.

Ramy statystyczne opracowano specjalnie do analizy tego typu danych w oparciu o koncepcję permutacji26. Było to konieczne ze względu na zaobserwowaną zależność rodzinną w rozkładzie typów komórek oraz w liczbie wykonanych podziałów. Innymi słowy, komórki należące do tej samej rodziny z większym prawdopodobieństwem wykazują podobne fenotypy i dzielą się taką samą liczbę razy. Choć szczegółowa analiza wykracza poza zakres niniejszej pracy, dostarczony zestaw testów statystycznych powinien być wystarczający do oceny różnych warunków.

Podsumowując, niniejszy protokół stanowi wartościowe narzędzie do oceny dynamiki komórkowej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych ex vivo w sposób szybki i niedrogi. Dzięki swojej elastyczności i wszechstronności w zakresie punktów czasowych, warunków hodowli oraz analizowanych typów HSPCs, pozwala on na testowanie różnych warunków eksperymentalnych. Jako analiza oparta na cytometrii przepływowej, może zostać wdrożona w większości laboratoriów i nie wymaga rozległej wiedzy wstępnej, co czyni ją odpowiednią metodą do badań przesiewowych i eksperymentów pilotażowych.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów istotnego dla tej pracy. Grantodawcy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu pracy do publikacji.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować członkom Institut Curie Flow Facility za pomoc w przygotowaniu eksperymentów z cytometrią przepływową. Pragniemy również podziękować za wkład pozostałych członków Zespołu Perié w liczne dyskusje. Dziękujemy dr Julii Marchingo i prof. Philowi Hodgkinowi (Walter i Eliza Hall Institute of Medical Research) za podzielenie się swoim protokołem multipleksowania barwników podziału komórkowego na limfocytach. Dziękujemy biobankowi krwi pępowinowej szpitala Saint Louis za udostępnienie zasobów biologicznych niezbędnych do opracowania tego protokołu. Badanie było wspierane przez grant ATIP-Avenir z CNRS i Bettencourt-Schueller Foundation (dla L.P.), granty z Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (dla L.P. i A.D.), Idex Paris-Science-Lettres Program (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (dla L.P.), Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, dla L.P.) oraz grant ITMO MIIC (21CM044, dla L.P.). Oprócz finansowania z Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 ERC StG 758170-Microbar (do L.P.), A.D. otrzymało stypendium od Fondation de France.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek polipropylenowych 1,5 mlvWR87003-294
Probówki polipropylenowe 15 mlvWR734-0451
probówki polipropylenowe 50 mlvWR734-0448
96-dołkowa płytka hodowlana z dnem w kształcie litery U Falcon353077
Anti-human Lin APCThermo Fisher22-7776-72Rozcieńczenie 1/40
ARIA IIIBDMożna zastąpić dowolnym sorterem FACS zdolnym do sortowania pojedynczych komórek na 96-dołkowej płytce
Ester boksyfluoresceiny sukcynimidylowej (CFSE)Life TechnologiesC34570
Ślad komórek Fioletowy (CTV) Life TechnologiesC34571
Koraliki kompensacyjne BD552843
Dulbecco" s zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)Life Technologies11320033
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Thermo ScientificJ62948-36Przygotuj roztwór 0,5 M w sterylizowanej wodzie
Blok FC Fc1.3216BD564220Rozcieńczenie 1/50
Płodowa surowica bydlęca (FBS)DutscherS1900-500CBatch S00CH
FlowJo v10.8.1BD
Mysz anty-ludzka CD10 PerCP-5.5, klon HI10aBiolegend312216Rozcieńczenie 1/20
Mysz anty-ludzka CD123 BUV395, klon 7G3BD564195Rozcieńczenie 1/15
Mysz anty-ludzka CD34 APC-Cy7, klon 581Biolegend343513Rozcieńczenie 1/40
Mysz anty-ludzka CD38 BV650, klon HB7Biolegend356620Rozcieńczenie 1/40
Mysz anty-ludzka CD45RA AF700, klon HI100BD560673Rozcieńczenie 1/20
Mysz anty-ludzka CD45RA PE-Cy7, klon HI100BD560675Rozcieńczenie 1/20
Mysz anty-ludzka CD90 PE, klon 5E10Biolegend328110Rozcieńczenie 1/20
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) 1XLife Technologies10010001
Python
R
Sterylne stożkowe rurki polipropylenowe 12x75 mmFalcon
ZE5 BioradMożna zastąpić dowolnym analizatorem cytometrii przepływowej wyposażonym w czytnik płytek
Laboratory przygotowany
Pożywkahodowli komórkowych Zależy od konkretnego eksperymentu. Codziennie przygotowuj świeże i przechowuj w temperaturze +4 stopni; C do czasu użycia
DMEM + 10% FBSMoże być przechowywany w sterylnych warunkach, w temperaturze +4 ° C do 1 roku. Aby przygotować 500 ml, dodaj 50 ml FBS do 450 ml DMEM
PBS 1X + EDTA 0,1%Może być przechowywany w sterylnych warunkach, w temperaturze pokojowej, do 1 roku. Aby przygotować 500 ml, dodaj 3,42 ml EDTA 0,5 M do 500 ml PBS 1X
BuforMoże być przechowywany w sterylnych warunkach, w temperaturze +4 & deg; C do 1 roku. Aby przygotować 500 ml, dodaj 2 ml EDTA 0,5 M i 1 ml FBS do 500 ml PBS 1X
do do barwienia

Bibliografia

  1. Ginhoux, F., Yalin, A., Dutertre, C. A., Amit, I. Single-cell immunology: Past, present, and future. Immunity. 55 (3), 393-404 (2022).
  2. Ke, M., Elshenawy, B., Sheldon, H., Arora, A., Buffa, F. M. Single cell RNA-sequencing: A powerful yet still challenging technology to study cellular heterogeneity. Bioessays. 44 (11), 2200084(2022).
  3. Regev, A., et al. The human cell atlas. Elife. 6, 27041(2017).
  4. Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  5. Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
  6. Loughran, S. J., Haas, S., Wilkinson, A. C., Klein, A. M., Brand, M. Lineage commitment of hematopoietic stem cells and progenitors: insights from recent single cell and lineage tracing technologies. Experimental Hematology. 88, 1-6 (2020).
  7. Perié, L., Duffy, K. R. Retracing the in vivo haematopoietic tree using single-cell methods. FEBS Letters. 590 (22), 4068-4083 (2016).
  8. Yu, V. W. C., et al. Epigenetic memory underlies cell-autonomous heterogeneous behavior of hematopoietic stem cells. Cell. 167 (5), 1310-1322 (2016).
  9. Ganuza, M., et al. Lifelong haematopoiesis is established by hundreds of precursors throughout mammalian ontogeny. Nature Cell Biology. 19 (10), 1153-1163 (2017).
  10. Naik, S. H., Schumacher, T. N., Perié, L. Cellular barcoding: A technical appraisal. Experimental Hematology. 42 (8), 598-608 (2014).
  11. Quek, L., et al. Genetically distinct leukemic stem cells in human CD34 − acute myeloid leukemia are arrested at a hemopoietic precursor-like stage. The Journal of Experimental Medicine. 213 (8), 1513-1535 (2016).
  12. Karamitros, D., et al. Single-cell analysis reveals the continuum of human lympho-myeloid progenitor cells. Nature Immunology. 19 (1), 85-97 (2018).
  13. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  14. Delaney, C., et al. Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution. Nature Medicine. 16 (2), 232-236 (2010).
  15. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  16. Guo, B., Huang, X., Lee, M. R., Lee, S. A., Broxmeyer, H. E. Antagonism of PPAR-γ 3 signaling expands human hematopoietic stem and progenitor cells by enhancing glycolysis. Nature Medicine. 24 (3), 360-367 (2018).
  17. Vannini, N., et al. The NAD-booster nicotinamide riboside potently stimulates hematopoiesis through increased mitochondrial clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
  18. Gupta, R., et al. Nov/CCN3 enhances cord blood engraftment by rapidly recruiting latent human stem cell activity. Cell Stem Cell. 26 (4), 527-541 (2020).
  19. Horwitz, M. E., et al. Omidubicel vs standard myeloablative umbilical cord blood transplantation: results of a phase 3 randomized study. Blood. 138 (16), 1429-1440 (2021).
  20. Weinreb, C., Rodriguez-Fraticelli, A., Camargo, F. D., Klein, A. M. Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation. Science. 367 (6479), 3381(2020).
  21. Loeffler, D., Schroeder, T. Understanding cell fate control by continuous single-cell quantification. Blood. 133 (13), 1406-1414 (2019).
  22. Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. Journal of Visualized Experiments. (70), e4287(2012).
  23. Marchingo, J. M., et al. T-cell stimuli independently sum to regulate an inherited clonal division fate. Nature Communications. 7, 13540(2016).
  24. Horton, M. B., et al. Multiplexed division tracking dyes for proliferation-based clonal lineage tracing. Journal of Immunology. 201 (3), 1097-1103 (2018).
  25. Lehmann, E. L., Romano, J. P., Casella, G. Testing statistical hypotheses. , Springer. New York. 784(2005).
  26. Tak, T., et al. HSPCs display within-family homogeneity in differentiation and proliferation despite population heterogeneity. Elife. 10, 360624(2021).
  27. Sommerkamp, P., et al. Mouse multipotent progenitor 5 cells are located at the interphase between hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 137 (23), 3218-3224 (2021).
  28. Kato, K., Radbruch, A. Isolation and characterization of CD34+ hematopoietic stem cells from human peripheral blood by high-gradient magnetic cell sorting. Cytometry. 14 (4), 384-392 (1993).
  29. Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
  30. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  31. Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
  32. Laurenti, E., et al. CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).
  33. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151(2013).
  34. Davison, A. C., Hinkley, D. V. Bootstrap Methods and their Application. , Cambridge University Press. (1997).
  35. Horton, M. B., et al. Lineage tracing reveals B cell antibody class switching is stochastic, cell-autonomous, and tuneable. Immunity. 55 (10), 1843-1855 (2022).
  36. Notta, F., et al. Distinct routes of lineage development reshape the human blood hierarchy across ontogeny. Science. 351 (6269), 2116(2016).
  37. Grinenko, T., et al. Hematopoietic stem cells can differentiate into restricted myeloid progenitors before cell division in mice. Nature Communications. 9 (1), 1898(2018).
  38. Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: Helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

hematopoetyczne komórki progenitoroweśledzenie podziałów komórkowychanaliza pojedynczych komórekocena losów komórekkomórki CD34+status różnicowaniasortowanie komórekanaliza pokrewieństwasymetryczne określanie losu komórki
Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.