Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja stresu replikacyjnego w komórkach raka jajnika za pomocą immunofluorescencji jednoniciowego DNA

DOI:

10.3791/64920

⸱

10 lutego 2023

 ,  , 
1Division of Oncology, Department of Medicine, Siteman Cancer Center, Washington University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę opartą na immunofluorescencji, która pozwala na ilościowe określenie poziomów jednoniciowego DNA w komórkach. Ta skuteczna i powtarzalna metoda może być wykorzystana do badania stresu replikacyjnego, powszechnej cechy w kilku nowotworach jajnika. Dodatkowo test ten jest kompatybilny z automatycznym potokiem analizy, co dodatkowo zwiększa jego wydajność.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stres związany z replikacją jest cechą charakterystyczną wielu nowotworów jajnika. Stres replikacyjny może pochodzić z wielu źródeł, w tym pęknięć dwuniciowych, konfliktów transkrypcji-replikacji lub amplifikowanych onkogenów, co nieuchronnie prowadzi do powstania jednoniciowego DNA (ssDNA). Kwantyfikacja ssDNA stanowi zatem okazję do oceny poziomu stresu replikacyjnego w różnych typach komórek i w różnych warunkach lub zabiegach uszkadzających DNA. Pojawiające się dowody sugerują również, że ssDNA może być predyktorem odpowiedzi na leki chemioterapeutyczne, które mają na celu naprawę DNA. W tym miejscu opisujemy szczegółową metodologię opartą na immunofluorescencji do ilościowego oznaczania ssDNA. Metodologia ta polega na znakowaniu genomu analogiem tymidyny, a następnie wykrywaniu analogu na chromatynie w oparciu o przeciwciała w warunkach niedenaturujących. Odcinki ssDNA można uwidocznić jako ogniska pod mikroskopem fluorescencyjnym. Liczba i intensywność ognisk bezpośrednio korelują z poziomem ssDNA obecnego w jądrze. Opisujemy również zautomatyzowany potok do ilościowego określania sygnału ssDNA. Metoda jest szybka i powtarzalna. Co więcej, prostota tej metodologii sprawia, że jest ona podatna na zastosowania o wysokiej przepustowości, takie jak badania przesiewowe leków i genetyki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomowe DNA jest często narażone na wielokrotne ataki z różnych endogennych i egzogennych źródeł1. Częstość uszkodzeń endogennych bezpośrednio koreluje z poziomami produktów ubocznych przemiany materii, takich jak reaktywne formy tlenu lub aldehydy, które są z natury wyższe w wielu typach nowotworów, w tym w raku jajnika2,3. Konieczne jest, aby uszkodzenia DNA zostały skutecznie rozwiązane; W przeciwnym razie może sprzyjać zmianom genotoksycznym, a w konsekwencji mutagenezie. Zdolność komórek do naprawy zmian genotoksycznych zależy od funkcjonalności bezbłędnych szlaków naprawy DNA i skutecznej regulacji progresji cyklu komórkowego w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Warto zauważyć, że wiele nowotworów jajnika ma funkcjonalnie inaktywujące mutacje w p53, a zatem mają wadliwy punkt kontrolny G1/S, co prowadzi komórki do inicjacji replikacji DNA pomimo obecności nienaprawionych zmian genomowych4,5. Stopień uszkodzenia DNA w raku jajnika jest dodatkowo spotęgowany przez obserwację, że ponad 50% surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości (HGSOC) ma defekty rekombinacji homologicznej za pośrednictwem BRCA1 i BRCA2, bezbłędnego szlaku naprawy DNA, a około 20% ma amplifikację w genie CCNE1, który przedwcześnie wpycha komórki G1 do fazy S6. Razem wysoka częstotliwość endogennych uszkodzeń DNA, wadliwe punkty kontrolne i nieprawidłowo działające szlaki naprawcze wykładniczo zwiększają akumulację zmian genomowych w raku jajnika. Zmiany te mogą stanowić przeszkodę w postępie krytycznych procesów komórkowych, takich jak replikacja i transkrypcja DNA. Jak omówiono poniżej, takie przeszkody katalizują wytwarzanie jednoniciowego DNA (ssDNA) w komórkach.

Podwójna helisa DNA jest kluczowa dla ochrony genomu przed wieloma procesami mutaginnymi, takimi jak spontaniczne depurination i depryryminacja, aktywność deaminaz cytozynowych i oksydacyjne uszkodzenia DNA1,7. W przeciwieństwie do tego, ssDNA jest bardzo podatne na te zdarzenia mutacyjne. Wiele procesów zachodzących w komórkach może prowadzić do powstania ssDNA (Ryc. 1). Należą do nich:

(i) Zatrzymanie maszynerii replikacji DNA: Prowadzi to do rozłączenia helikazy DNA i polimerazy, pozostawiając odcinki ssDNA8,9.

(ii) Zatrzymanie maszynerii transkrypcyjnej: Uporczywe zatrzymanie polimerazy RNA prowadzi do generowania trójniciowych hybrydowych struktur DNA/RNA zwanych R-loopami. Tworzenie pętli R odsłania przemieszczone, nietranskrybowane DNA jako pojedynczą nić10.

(iii) End-resection DNA: Inicjacja naprawy ukierunkowanej na homologię wymaga wytworzenia 3' ssDNA, aby katalizować poszukiwanie sekwencji homologicznej11.

(iv) D-loop: Inwazja nici podczas rekombinacji homologicznej może spowodować przemieszczenie nici komplementarnej bez matrycy, co skutkuje ssDNA12.

(v) Przerwy sprzężone z replikacją: Podczas replikacji DNA, synteza opóźnionych nici odbywa się w sposób nieciągły, w wyniku czego najpierw generowane są fragmenty Okazaki, a następnie ligowane. Opóźnienie lub defekt w przetwarzaniu fragmentów Okazaki może również skutkować powstawaniem ssDNA. Wreszcie, jeśli widełki replikacyjne na nici wiodącej napotkają zmianę powodującą zahamowanie, polimerazę DNA i prymazę, PRIMPOL może ponownie zagruntować syntezę w dalszej części, pozostawiając lukę w ssDNA po13,14.

Najwyraźniej większość tych zdarzeń ma miejsce, gdy maszyneria replikacji DNA napotyka uszkodzenia genomowe lub podczas naprawy sprzężonej z replikacją, co sugeruje, że większe uszkodzenia DNA prowadzą do zwiększenia poziomu ssDNA. Ponieważ wiele z tych zdarzeń jest związanych z replikacją, tworzenie ssDNA jest uważane za marker "stresu replikacyjnego" w komórkach15,16.

Tutaj opisujemy test, który może być użyty do wiarygodnego ilościowego określenia ssDNA w komórkach. Prostota, odtwarzalność i korzyści kosztowe tego podejścia sprawiają, że można je wykorzystać do oceny odpowiedzi replikacyjno-stresowej w komórkach. Nowe badania wykazały, że poziom ssDNA może być również predyktorem odpowiedzi na chemioterapię, taką jak inhibitory enzymów PARP1/2, ATR i kinaza Wee117,18,19,20,21. Inhibitory te są stosowane w schemacie leczenia kilku HGSOCs22. Dlatego test ten może być również przydatnym narzędziem do przewidywania odpowiedzi chemioterapeutycznych w komórkach raka jajnika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Linia komórkowa raka jajnika, OVCAR3, została użyta w tych krokach, ale ten protokół ma szerokie zastosowanie do wielu innych linii komórkowych, w tym tych pochodzących ze źródeł innych niż jajnikowe. Schemat protokołu jest pokazany w Rysunek 2.

1. Powlekanie komórek

  1. Wykonaj szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną.
    1. Dodać autoklawizowane szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z roztworem poli-L-lizyny i umieścić na kołysce na 15 minut.
    2. Odessać roztwór do kaptura do hodowli tkankowej. Umyj szkiełka nakrywkowe, dodając sterylną wodę i umieść probówkę zawierającą szkiełka nakrywkowe z powrotem na bujaku na 5 minut. Powtórz ten krok prania trzy razy.
    3. Rozprowadź powlekane szkiełka nakrywkowe na sterylnym naczyniu i odessaj pozostałą wodę. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowych przez 1 godzinę lub do momentu, gdy nie pozostaną żadne kropelki wody. Po wyschnięciu zamknij naczynie parafilmem i umieść w temperaturze 4 °C.
  2. Umieścić jedno szkiełko nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną w każdym dołku płytki 24-dołkowej. Stosowanie szkiełek nakrywkowych z polilizyny ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia odklejaniu się komórek od szkiełek nakrywkowych na etapie przed ekstrakcją.
  3. Trypsynizuj komórki OVCAR3, gdy osiągną 70%-80% konfluencji.
    1. Aby wytrypsynizować 10-centymetrowe naczynie hodowlane, które jest zlewające się w 70%-80%, odessać pożywkę z płytki i przemyć 5-7 ml PBS.
    2. Odessać PBS, dodać 1 ml 0,25% trypsyny i umieścić naczynie w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 8-10 minut lub do momentu, gdy komórki oderwą się od dna płytki.
    3. Zebrać komórki z 5-10 ml pożywki i dodać do stożkowej probówki.
    4. Policz komórki ręcznie za pomocą hemocytometru, stosując standardowe procedury.
  4. Rozcieńczyć 25 000 komórek/ml i dodać 1 ml komórek na szkiełkach nakrywkowych z poli-L-lizyny umieszczonych w dołkach płytek 24-dołkowych. Dla każdej innej linii komórkowej określ liczbę tak, aby komórki zlewały się w około 70%-80% po trzech podwojeniach populacji.
  5. Hoduj komórki w pożywce hodowlanej w standardowych warunkach.

2. Pulsujące komórki z IdU

  1. Aby komórki prawidłowo rozprzestrzeniły się na szkiełkach nakrywkowych, wystarczy jedno podwojenie populacji. Po jednym podwojeniu populacji, pulsuj komórki 10 μM 5-jodo-2'-deoksyurydyną (IdU) (patrz Tabela materiałów na temat odtwarzania IdU) dla dwóch kolejnych podwojeń populacji.
    UWAGA: Próbowaliśmy różnych analogów tymidyny, w tym bromodeoksyurydyny (BrdU), 5-chloro-2′-deoksyurydyny (CIdU) i IdU. Spośród trzech analogów, IdU zapewnia najlepszy stosunek sygnału do szumu. Obrazy porównawcze komórek pulsujących trzema różnymi analogami są pokazane na Rysunek 3. Zalecamy stosowanie dwóch kontroli ujemnych: (i) próbki pulsacyjnej bez IdU oraz (ii) kontroli bez przeciwciał pierwotnych. Jeśli konieczne jest oszacowanie powstawania ssDNA w związku z danym leczeniem, zalecamy dodanie leku po pierwszej rundzie podwojenia IdU.
  2. Po pulsowaniu z IdU przez dwa podwojenia populacji, zbierz komórki do obrazowania.
    1. Zastąp podłoże lodowatym 0,5% PBSTx (PBS + 0,5% Triton X-100) na lodzie przez 5 minut. Ten etap wstępnej ekstrakcji pomaga uwolnić białka cytoplazmatyczne i niezwiązane z chromatyną, pozostawiając nienaruszone białka związane z chromatyną. Niektóre linie komórkowe mogą łatwo odkleić się podczas wstępnej ekstrakcji. W takim scenariuszu można użyć 0,5% buforu CSK (10 mM PIPES (pH 6,8), 100 mM NaCl, 300 mM sacharozy, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA i 0,5% Triton X-100).

3. Fiksacja

  1. Odessać PBSTx i inkubować przez 15 minut z 3% PFA (tabela materiałów) w temperaturze pokojowej, a następnie trzy do czterech płukań 1x PBS. Stałe ogniwa można utrzymywać w temperaturze 4 °C do czasu podjęcia dalszych kroków.
    UWAGA: PFA jest wysoce toksyczny i rakotwórczy. Unikać kontaktu ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Wykonaj wszystkie czynności z PFA w dygestoriach i odpowiednio zutylizuj materiały.

4. Przepuszczalność i blokowanie

  1. Po utrwaleniu należy przepuszczać komórki za pomocą 0,5% PBSTx na lodzie przez 5 minut. Użyj wystarczającej objętości, aby pokryć całe szkiełko nakrywkowe (zwykle od 500 μl do 1 ml).
  2. Umyj komórki trzy do czterech razy 0,2% PBST (1X PBS + 0,2% Tween-20) w temperaturze pokojowej. Jeden ml PBST wystarcza do umycia każdej studzienki. Wykonuj pranie tyłem do siebie bez żadnych inkubacji.
  3. Zassać PBST i zablokować próbki za pomocą 5% BSA (Tabela Materiałów) wykonanej w 1x PBS (bufor blokujący) na 30 minut w temperaturze pokojowej.

5. Barwienie immunologiczne przeciwciałem IdU

  1. Do barwienia immunologicznego przygotuj wilgotną komorę (mokry ręcznik papierowy na płaskim dnie Tupperware). Przykryj pokrywkę płytki 24-dołkowej parafilmem, umieść w wilgotnej komorze i połóż szkiełka nakrywkowe na pokrywie płytki.
  2. Przygotuj pierwszorzędowe przeciwciało myszy anty-BrdU (tabela materiałów), rozcieńczając je w stosunku 1:200 w buforze blokującym z kroku 4.2.Wcześniej wykazano, że przeciwciało anty-BrdU wykrywa IdU.
  3. Dodać 60 μl rozcieńczenia przeciwciał IdU na wierzch szkiełek nakrywkowych. Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    1. Alternatywnie, należy użyć mniejszej ilości roztworu przeciwciał, jeśli szkiełka nakrywkowe zostaną odwrócone na kroplę (20-25 μl) roztworu przeciwciał o rozcieńczeniu 1:200 pipetowaną na parafilm. Zmniejsza to również prawdopodobieństwo wyschnięcia roztworu podczas inkubacji.
  4. Po 1 h inkubacji odessać przeciwciało pierwszorzędowe. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytce 24-dołkowej i umyj je czterokrotnie 0,2% PBST.
  5. W przypadku przeciwciała wtórnego należy użyć tej samej wilgotnej komory, która została opisana w kroku 5.1. Rozcieńczyć sprzężone przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszom (tabela materiałów) w buforze blokującym (1:200). Dodać 60 μl przeciwciała drugorzędowego do szkiełek nakrywkowych i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę. To przeciwciało drugorzędowe jest wrażliwe na światło.
  6. Odessać przeciwciało wtórne. Umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytce 24-dołkowej i przemyj czterokrotnie 0,2% PBST.
  7. Oznacz szkiełka mikroskopowe i zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach za pomocą nośnika montażowego DAPI (tabela materiałów). Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. 24-godzinna inkubacja jest zalecana, jeśli podłoże montażowe wymaga utwardzenia lub utwardzenia.
    UWAGA: Preparaty można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem pod mikroskopem fluorescencyjnym. Reprezentatywny obraz jest pokazany w Rysunek 4.

6. Automatyczna kwantyfikacja ognisk IdU

UWAGA: Siła tego testu polega na możliwości zautomatyzowania analizy w celu szybkiej i efektywnej kwantyfikacji. Przedstawiamy tutaj zautomatyzowany potok analizy, który można wykorzystać do ilościowego określenia ognisk IdU w danym polu obrazu. Ważne jest, aby wszystkie zdjęcia w ramach danego eksperymentu były wykonane przy tych samych ustawieniach ekspozycji; W przeciwnym razie kwantyfikacja nie będzie wiarygodna. Wartościowe może być również włączenie niebarwionej kontroli jako kontroli negatywnej, przynajmniej po raz pierwszy w tym eksperymencie (Rysunek 5). Poniższy protokół jest specyficzny dla oprogramowania do analizy ogólnej sieciowej usługi informacyjnej, ale te same zasady można również zastosować do innego oprogramowania komercyjnego.

  1. Na karcie Widok przejdź do pozycji Formanty analizy | Eksplorator analiz. Spowoduje to otwarcie nowego okna bocznego o nazwie Eksplorator analizy. Kliknij Utwórz nowy | Analiza ogólna 3. Spowoduje to otwarcie oprogramowania do tworzenia schematów blokowych Eksploratora analiz.
  2. Przejdź do zakładki Źródła i przeciągnij polecenie Kanały z menu po lewej stronie do obszaru roboczego. Dwa kanały dla ognisk DAPI i IdU automatycznie pojawią się jako pola binarne (pokazane w Rysunek 5 jako pola z czerwonymi konturami).
  3. Przejdź do karty Przetwarzanie wstępne i przeciągnij polecenie Kontrast lokalny z menu po lewej stronie do obszaru roboczego. Połącz kontrast lokalny z kanałem ognisk IdU. Z karty Segmentacja przeciągnij polecenie Threshold (po jednym dla każdego kanału).
  4. Połącz każdy kanał z poleceniem Threshold. Aby wyeliminować wszelkie jądra na obramowaniu obrazu, przejdź do zakładki Przetwarzanie binarne, przeciągnij polecenie Touching Borders i połącz się z progiem DAPI.
  5. Scal dane z dwóch kanałów za pomocą polecenia Agreguj elementy podrzędne na karcie Pomiar. Zdefiniuj kanał DAPI jako nadrzędny (A), a kanał ognisk jako podrzędny (B). Z menu rozwijanego w poleceniu Agreguj elementy podrzędne wybierz opcję, że element podrzędny znajduje się wewnątrz elementu nadrzędnego. Ten krok pomaga policzyć liczbę ognisk (potomnych) na jądro (rodzica).
    1. Aby wyeksportować dane w formacie tabelarycznym, kliknij polecenie Modyfikuj kolumny na karcie Zarządzanie danymi. Z menu rozwijanego w poleceniu Modify Columns (Modyfikuj kolumny) wybierz DAPI-ID (pomaga to przypisać unikalny numer do każdego jądra na danym obrazie) i IdU count (podaje liczbę ognisk IdU w każdym jądrze). Aby wyeksportować dane w formacie CSV, użyj polecenia Tabela do pliku CSV na karcie Odwołanie. GA3 można teraz zapisać z opisowym tytułem.
  6. W celu analizy otwórz obraz w oprogramowaniu.
    1. Otwórz kartę Eksplorator analizy, tak jak w kroku 6.1, i znajdź nowo utworzony GA3. Kliknij dwukrotnie plik GA3, co otworzy nowe okno o nazwie GA3 Wizard, w którym można ustawić próg dla kanałów DAPI i IdU.
    2. Za pomocą suwaka w oknie ustaw minimalny i maksymalny próg dla każdego kanału, a tym samym zdefiniuj sygnał. Dobra wartość progowa to taka, w której granice dla każdego jądra i ogniska IdU są wyraźnie określone. Po spełnieniu wartości progowych zachowaj te liczby do analizowania wszystkich plików w danym eksperymencie.
    3. Kliknij przycisk Uruchom, aby uzyskać liczbę ognisk IdU/na jądro.
      UWAGA: Oprogramowanie generuje tabelę ognisk dla każdego jądra, która może być następnie wykorzystana do dowolnych celów graficznych (Rysunek 5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne obrazy i kwantyfikacja ognisk IdU z jąder pochodzących z komórek nieleczonych i komórek traktowanych 0,5 mM hydroksymocznikiem przez 24 godziny są pokazane w Rysunek 4. Oba jądra są barwione i możliwe do zidentyfikowania w kanale DAPI. Analiza tych obrazów polega na ilościowym określeniu liczby ognisk w każdym jądrze. Liczba ognisk jest proporcjonalna do stopnia naprężenia replikacyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak wspomniano w protokole, cenne jest uwzględnienie kilku eksperymentalnych kontroli kontrolnych, aby upewnić się, że test działa. Należą do nich próbka bez IdU, a także próbka bez przeciwciał pierwotnych. Obie kontrole ujemne powinny dać komórki, które są barwione przez DAPI, ale nie zawierają sygnału IdU.

W oparciu o warunki eksperymentalne i zastosowane linie komórkowe, mogą być potrzebne różne rozcieńczenia przeciwciał w celu uzyskania najlepszego sygnału fluorescencyjnego. Zbyt duża iloś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PV jest wspierane przez Inaugural Pedal the Cause Grant przez Alvin J. Siteman Cancer Center poprzez The Foundation for Barnes-Jewish Hospital, Pilot Research Grant od Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research, Cancer Research Grant od Mary Kay Ash Foundation i V-Foundation. NR jest wspierany przez grant szkoleniowy NIH Cell and Molecular Biology T32 dla Washington University w St. Louis.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3% Paraformaldehyd (PFA)Fisher Scientific NC017959510 g sacharozy + 100 ml 10X PBS + woda, aby uzyskać objętość do 925 ml. Dodaj 75 ml 40% PFA bez metanolu, wymieszaj i przygotuj porcje 50 ml przed przechowywaniem
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza; C
5-jodo-2'-deoksyurydyna (IdU)Sigma AldrichI7125-5GMW = 354,10 g/mol. Dla zapasu 10 mM: rozpuścić 3,541 mg IdU w 1 ml 1 N ciekłym amoniaku
Przechowywanie: Przechowywane w temperaturze -20 stopni; C
Przeciwciało anty-BrdUBD Biosciences347580Przechowywanie: Przechowywać w 4 stopniach; C
Przeciwciało przeciw myszom Alexa Fluor Plus 488Thermo ScientificA32766Światłoczułe - przechowywać w ciemności
Przechowywanie: Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma AldrichA7906-100GWytwarzane przez dodanie określonej masy do objętości PBS
Przechowywanie: Przechowywać w 4 stopniach; C
Okrągłe szkło osłonowe Mikroskopia elektronowa Nauki72230-01
Oprogramowanie NIS GA3 Nikon 
Pożywka wzrostowa OVCAR3ATCCHTB-161: RPMI uzupełniona L-glutaminą, 0,01 mg/ml insuliny bydlęcej; płodowa surowica bydlęca do końcowego stężenia 20% i 1X Pen Strep
Przechowywanie: Zamrażanie Pożywki: pożywka wzrostowa + 5% DMSO i przechowywane w temperaturze -80 & stopni; C
Roztwór poli-L-lizynySigma AldrichP4832-50MLPrzechowywanie: Przechowywać w 4 stopniach; C
ProLong Diamond Anti Blaknięcie Mountant z DAPIThermo ScientificP36962Przechowywanie: Przechowywać w 4 stopniach; C
Trypsin-EDTA, 0,25%Genesee Scientific25-510Przechowywanie: Przechowywać w 4 stopniach; C
Woda, sterylnie filtrowanaSigma AldrichW3500-6X500MLPrzechowywanie: Przechowywać w 4 stopniach; Z
77010604

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
  2. Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer. Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).
  3. Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity. Journal of Ovarian Research. 11, 50(2018).
  4. Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature communications. 8, 1093(2017).
  5. Kroeger, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
  6. Patch, A. -M., et al. Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer. Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).
  7. Alexandrov, L. B., et al. The repertoire of mutational signatures in human cancer. Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).
  8. Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint. Genes & Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).
  9. Toledo, L. I., et al. ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA. Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).
  10. Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability. Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).
  11. Cejka, P., Symington, L. S. DNA end resection: Mechanism and control. Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).
  12. Kowalczykowski, S. C. An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410(2015).
  13. Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
  14. Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
  15. Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: An essential regulator of genome integrity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).
  16. Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
  17. Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
  18. Xu, H., et al. CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models. Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394(2021).
  19. Konstantinopoulos, P. A., et al. A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer. Nature Communications. 12, 5574(2021).
  20. Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase. Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).
  21. Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
  22. da Costa, A. A. B. A., et al. Targeting replication stress in cancer therapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).
  23. Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: Single-stranded DNA's first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
  24. Bhat, K. P., Cortez, D. RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).
  25. Maréchal, A., Zou, L. RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response. Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza immunofluorescencyjnauszkodzenia DNAznakowanie analogami tymidynywysokoprzepustowe przesiewanieszlaki naprawy DNAbarwienie przeciwcia amimikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły