Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i utrzymywanie indukowanych przez naczelnych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z moczu

DOI:

10.3791/64922

⸱

28 lipca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, 3Hakubi Center, Kyoto University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół opisuje metodę izolacji, ekspansji i przeprogramowania ludzkich i nieludzkich komórek pochodzących z moczu naczelnych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), a także instrukcje dotyczące konserwacji nowo wygenerowanych iPSC bez konieczności dostarczania pokarmu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Międzygatunkowe podejście do badania pluripotencjalnych komórek macierzystych naczelnych i ich pochodnych jest kluczowe dla lepszego zrozumienia molekularnych i komórkowych mechanizmów choroby, rozwoju i ewolucji. Aby zwiększyć dostępność indukowanych przez naczelnych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), w artykule przedstawiono nieinwazyjną metodę generowania ludzkich i innych naczelnych z komórek pochodzących z moczu oraz ich utrzymania przy użyciu metody hodowli bez karmienia.

Próbka moczu może być pobrana z niesterylnego środowiska (np. klatki zwierzęcia) i potraktowana koktajlem antybiotykowym o szerokim spektrum działania podczas pierwotnej hodowli komórek, aby skutecznie zmniejszyć zanieczyszczenie. Po namnażaniu się komórek pochodzących z moczu, iPSC są generowane za pomocą zmodyfikowanej metody transdukcji dostępnego na rynku systemu wektorów wirusa Sendai. Pierwsze kolonie iPSC mogą być widoczne już po 5 dniach, a najwcześniej po 10 dniach. Rutynowe pasażowanie grudek z bezenzymatycznym buforem dysocjacyjnym wspiera pluripotencję generowanych iPSC przez ponad 50 pasaży.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Porównania genomiczne naczelnych ludzkich i niebędących ludźmi (NHP) są kluczowe dla zrozumienia naszej historii ewolucyjnej i ewolucji cech specyficznych dla człowieka1. Ponadto porównania te pozwalają na wnioskowanie o funkcji poprzez identyfikację konserwatywnych sekwencji DNA2, np. w celu nadania priorytetu wariantom związanym z chorobą3. Porównania fenotypów molekularnych, takich jak poziomy ekspresji genów, mają kluczowe znaczenie dla lepszej interpretacji porównań genomowych i odkrycia, na przykład, komórkowych różnic fenotypowych. Co więcej, mają one - podobnie jak porównania na poziomie DNA - potencjał do wnioskowania o znaczeniu funkcjonalnym, a tym samym do lepszej interpretacji istotnych z medycznego punktu widzenia zmian u ludzi4. Włączenie kompleksowych molekularnych danych fenotypowych do tych badań porównawczych wymaga odpowiednich zasobów biologicznych (tj. komórek ortologicznych różnych gatunków). Jednak względy etyczne i praktyczne utrudniają lub uniemożliwiają dostęp do takich porównywalnych komórek, zwłaszcza w trakcie opracowywania. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pozwalają na generowanie takich niedostępnych typów komórek in vitro5,6, są eksperymentalnie dostępne i były używane do porównań z naczelnymi6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Aby wygenerować iPSC, należy zdobyć podstawowe komórki, które mają zostać przeprogramowane. Komórki wyizolowane z moczu mają tę zaletę, że można je nieinwazyjnie pobrać od naczelnych i że można je łatwo przeprogramować, prawdopodobnie ze względu na ich profile molekularne podobne do komórek macierzystych15. Warunki hodowli niezbędne do utrzymania iPSC naczelnych są równie ważne jak przeprogramowanie; Klasycznie rzecz biorąc, hodowla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych wymagała niezdefiniowanej, opartej na surowicy pożywki i kohodowli mysich fibroblastów embrionalnych - tak zwanych komórek żywicielskich - które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i rusztowania dla embrionalnych komórek macierzystych (ESC)16. Od czasu opracowania chemicznie zdefiniowanych i wolnych od karmy systemów hodowli17,18, obecnie dostępne na rynku są różne opcje pożywek i matryc hodowlanych iPSC. Jednak większość z tych warunków hodowli została zoptymalizowana pod kątem ludzkich ESC i iPSC, a zatem może działać gorzej w hodowli NHP iPSC. W tym protokole wideo podajemy instrukcje dotyczące generowania i utrzymywania ludzkich i NHP iPSC pochodzących z hodowli komórek moczowych.

Od czasu pierwszego doniesienia o generowaniu iPSC przez wymuszoną ekspresję zdefiniowanych czynników w fibroblastach w 2006 roku, metoda ta została zastosowana do wielu różnych typów komórek różnego pochodzenia19,20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31,32. Wśród nich w sposób całkowicie nieinwazyjny można pozyskać tylko komórki pochodzące z moczu. Opierając się na wcześniej opisanym protokole przez Zhou et al.33, można izolować i namnażać komórki z moczu naczelnych nawet z niesterylnych próbek, uzupełniając antybiotyki o szerokim spektrum działania15. Warto zauważyć, że komórki pochodzące z moczu pobrane za pomocą tego protokołu wykazują wysoki potencjał do wytwarzania iPSC w krótszym czasie (kolonie stają się widoczne w ciągu 5-15 dni) niż konwencjonalne przeprogramowanie fibroblastów (20-30 dni, z naszego doświadczenia) i przy wystarczająco wysokim wskaźniku sukcesu. Te komórki pochodzące z moczu zostały sklasyfikowane jako mieszana populacja komórek podobnych do mezenchymalnych komórek macierzystych i komórek nabłonka pęcherza moczowego, co spowodowało wysoką wydajność przeprogramowania15.

Oprócz różnic w komórkach pierwotnych, metody przeprogramowania do generowania iPSC również różnią się w zależności od celu użycia. Konwencjonalne procedury przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych przeprowadzono poprzez nadekspresję czynników przeprogramowujących za pomocą wektorów retrowirusowych lub lentiwirusowych, co pozwoliło na integrację egzogennego DNA w genomie5,34,35. Aby utrzymać genomowo wygenerowane iPSC w stanie nienaruszonym, naukowcy opracowali szeroką gamę systemów nieintegracyjnych - wektor PiggyBac z akcyzą36,37, wektor epizodyczny38,39, nieintegrujące wektory wirusowe, takie jak Sendai virus40 i adenovirus41, transfekcja mRNA42, transfekcja białka43,44, oraz leczenie związkami chemicznymi45. Ze względu na wydajność i łatwość obsługi, w tym protokole stosowane są wektory przeprogramowania oparte na wirusie Sendai. Zakażenie komórek pierwotnych przeprowadza się w 1-godzinnej hodowli zawiesinowej komórek i wirusów przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 5 przed posiewem. Ten zmodyfikowany krok może zwiększyć prawdopodobieństwo kontaktu między powierzchniami komórek a wirusami, w porównaniu z konwencjonalną metodą, w której wirusy są dodawane bezpośrednio do przylegającej hodowli komórkowej, a tym samym dać więcej kolonii iPSC15.

Przenikanie ludzkich i NHP pluripotencjalnych komórek macierzystych może odbywać się poprzez pasaż kępowy i pasażowanie jednokomórkowe. Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) jest ekonomicznym środkiem chelatującym, który wiąże jony wapnia i magnezu, a tym samym zapobiega adhezyjnej aktywności kadheryny i integryny. EDTA jest również stosowany jako łagodny, selektywny odczynnik dysocjacyjny, ponieważ niezróżnicowane komórki odrywają się przed komórkami zróżnicowanymi z powodu różnych cząsteczek adhezyjnych. Całkowita dysocjacja indukuje masywną śmierć komórek iPSC naczelnych poprzez hiperaktywację miozyny za pośrednictwem hiperaktywacji miozyny za pośrednictwem Rho/Rho-bound coiled-coil zawierającej kinazę białkową (Rho / Rock). Dlatego uzupełnienie pożywki hodowlanej inhibitorem Rho/Rock jest niezbędne w eksperymentach, które wymagają pojedynczych komórek w zawiesinie46,47. W tym protokole zalecamy pasażowanie brył jako rutynową metodę pasażowania i zalecamy pasażowanie pojedynczych komórek tylko wtedy, gdy jest to konieczne, np. gdy wymagane jest zasiewanie określonej liczby komórek lub podczas podklonowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta eksperymentalna procedura została zatwierdzona przez właściwą komisję etyczną ds. eksperymentów na ludziach (20-122, Ethikkommission LMU München). Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.
UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentów z próbkami ludzkimi i NHP należy uzyskać zgodę odpowiedniej komisji etycznej. Wszystkie procedury eksperymentalne muszą być wykonywane zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Każdy z poniższych kroków powinien być wykonywany techniką sterylną w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie składy i pożywek znajdują się w tabeli uzupełniającej S1. Upewnij się, że wszystkie podłoża są ogrzane do temperatury pokojowej (22 °C) przed dodaniem do komórek. Każdy etap wirowania powinien być wykonywany w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Izolacja komórek z próbek moczu

UWAGA: Upewnij się, że ludzcy dawcy są wolni od ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) i wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). W przypadku NHP upewnij się, że potencjalni dawcy/komórki są wolne od specyficznych patogenów-wirusa B (BV), małpiego wirusa niedoboru odporności (SIV), małpiego betaretrowirusa (SRV) i małpiego wirusa limfotropowego limfocytów T (STLV).

  1. Przygotować 12-dołkową płytkę pokrytą żelatyną, dodając 500 μl 0,2% żelatyny na dołek i rozprowadzić płyn, przesuwając płytkę. Umieścić w temperaturze 37 °C na co najmniej 30 minut przed potrzebą.
  2. Próbki moczu ludzkiego należy pobrać do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. W przypadku naczelnych należy zebrać mocz z podłogi pomieszczenia dla zwierząt za pomocą strzykawki.
    UWAGA: Udowodniono, że objętość 5 ml moczu jest wystarczająca do wyizolowania co najmniej jednej kolonii w 42% prób. Jednak zaleca się użycie większej objętości ~ 50 ml moczu, aby zwiększyć szansę na odizolowanie kolonii. Próbki moczu NHP należy pobierać tak świeże, jak to możliwe, najlepiej natychmiast po oddaniu moczu. Przechowywanie próbek moczu w temperaturze 4 °C przez 4 godziny nie miało negatywnego wpływu na wskaźnik powodzenia protokołu, ale nie badano dłuższych okresów przechowywania.
  3. Odwirować probówkę zawierającą mocz o stężeniu 400 × g przez 10 minut i ostrożnie zassać supernatant, pozostawiając w probówce około 1 ml.
  4. Zawiesić osad w pozostałym 1 ml płynu. Zawiesiny należy zebrać w jednej probówce, jeśli zebrano wiele probówek moczu.
  5. Przemyć komórki, dodając do probówki 10 ml buforu do przemywania moczu (patrz tabela uzupełniająca S1) zawierającego 2,5 μg/ml amfoterycyny i ostrożnie wymieszać zawiesinę za pomocą pipety serologicznej.
  6. Odwirować probówkę o stężeniu 200 × g przez 10 minut i ostrożnie zassać supernatant, pozostawiając w probówce około <0,2 ml.
  7. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pierwotnego podłoża moczu (patrz tabela uzupełniająca S1) zawierającego 0,5 μg/ml amfoterycyny na 50 ml początkowo przetworzonego moczu (zawiesić w 1 ml, nawet jeśli przetworzono mniej niż 50 ml moczu).
  8. Odessać żelatynę ze studzienek (przygotowanych w kroku 1.1) i wprowadzić na płytkę 1 ml zawiesiny z etapu 1.7 do jednego dołka na płytce 12-dołkowej. Powtórz dla tylu dołków, ile chcesz, lub dla tylu mililitrów dostępnej zawiesiny.
    Opcjonalnie: Aby uniknąć zanieczyszczenia pochodzącego z niehigienicznego pobierania próbek, należy dodać 100 μg/ml odczynnika przeciwdrobnoustrojowego do komórek od tego momentu, aż do pierwszego przejścia.
  9. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  10. Dodawać 1 ml pierwotnej pożywki moczu na dołek dziennie do 5 dnia, bez usuwania istniejącego podłoża.
  11. W 5 dniu należy odessać 4 ml pożywki z płytki, pozostawiając około 1 ml pożywki. Dodać 1 ml pożywki REMC (patrz tabela uzupełniająca S1) do studzienki, aby uzyskać mieszaninę 1:1 z nową pożywką hodowlaną.
  12. Codziennie zastępuj połowę pożywki pożywką REMC, aż pojawią się pierwsze kolonie (Rysunek 1A, B). Dlatego należy usunąć 1 ml starej pożywki i dodać 1 ml świeżej pożywki REMC do dołka.

2. Ekspansja komórek moczowych

UWAGA: Pasaż komórek moczu powinien być przeprowadzony zanim hodowla osiągnie 90% zbieżności.

  1. Przygotować żądaną ilość pokrytych żelatyną płytek 12-dołkowych, jak podano w kroku 1.1.
  2. Odessać starą pożywkę i umyć komórki, dodając 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco.
  3. Odessać DPBS i dodać 300 μl 0,5x enzymu dysocjacyjnego rozcieńczonego DPBS. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
  4. Dodać 700 μl pożywki REMC, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Delikatnie odpipetować zawiesinę za pomocą pipety P1000, aż do dysocjacji komórek na pojedyncze komórki.
  5. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować probówkę o stężeniu 200 × g przez 5 minut.
  6. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki REMC.
  7. Policz komórki za pomocą licznika komórek (hemocytometru lub automatycznego licznika komórek).
  8. W celu namnażania komórek moczowych należy umieścić 1,5 × 104 do 3 × 104 komórki w 1 ml pożywki REMC na jednej 12-dołkowej płytce pokrytej 0,2% żelatyną.
  9. Wykonuj kolejne zmiany pożywki co drugi dzień, aż kultura osiągnie zbieżność 80%-90%. Dlatego odessać starą pożywkę i dodać 1 ml świeżej pożywki REMC.

3. Generowanie iPSC przez infekcję wektorem wirusa Sendai

UWAGA: Aby zapoznać się z przebiegiem procedury przeprogramowywania, zobacz Rysunek 2A. Komórki moczowe używane do przeprogramowania powinny być tak młode, jak to możliwe, ale niezwykła utrata wydajności przeprogramowania nie jest obserwowana przed pasażem 4. Zestaw do przeprogramowania wirusa Sendai musi być używany w obiekcie BL-2. Z wirusami należy obchodzić się w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym i zawsze używać odpowiedniego sprzętu ochronnego, aby zapobiec narażeniu błony śluzowej.

  1. Przygotować 12-dołkową płytkę pokrytą matrycą błony podstawnej, dodając 500 μl matrycy membrany podstawnej na studzienkę i rozprowadzić płyn, przesuwając płytkę. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę i zastąpić matrycę błony podstawnej 900 μl pożywki REMC. Przechowywać płytkę w temperaturze 37 °C do czasu użycia.
  2. Szybko rozmrozić elementy zestawu do przeprogramowania Sendai w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Wymieszać wirusy Sendai (policistroniczny KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC i KLF4) o MOI 5 i dodać pożywkę REMC do 100 μl. Użyć równania (1):
    Obliczanie wzoru na objętość wirusa, metoda MOI, równanie do zastosowań w badaniu komórek.
    UWAGA: Ponieważ miano wirusa różni się w zależności od partii, zawsze sprawdzaj miano w certyfikacie analizy dostarczonym przez producenta.
    Opcjonalnie: Wirusa Sendai należy dodatkowo użyć białka zielonej fluorescencji (GFP) jako pozytywnej kontroli wydajności transdukcji. W tym celu przygotuj dodatkowe 3,5 ×10 4 komórek w osobnej probówce podczas kroku 3.3.
  3. W celu dysocjacji komórek moczowych wykonaj kroki 2.2-2.4. Policz komórki za pomocą licznika komórek i przenieś 7 × 104 komórek moczowych do probówki o pojemności 1,5 ml.
  4. Odwirować probówkę o masie 200 × g przez 5 minut i ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Zawiesić osad w 100 μl mieszaniny SeV przygotowanej w kroku 3.2. Inkubować probówkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu zakażenia zawiesiną.
  5. Zawiesinę należy umieścić na 12-dołkowych płytkach pokrytych matrycą membrany podstawnej, które zostały przygotowane w kroku 3.1. Rutynowo płytka 1 × 104 i 2,5 × 104 komórki na studzienkę w duplikatach.
  6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zastąp pożywkę 1 ml świeżej pożywki REMC 24 godziny po transdukcji i w 3 dniu.
  7. W 5 dniu po transdukcji zmienić pożywkę na pożywkę do wytwarzania PSC (patrz tabela uzupełniająca S1), a następnie zmieniać pożywkę co drugi dzień. Dlatego usuń starą pożywkę i dodaj 1 ml pożywki do generacji PSC na studzienkę.
    UWAGA: Pojawienie się pierwszych kolonii może potrwać do 15 dni.
  8. Wybieraj pojedyncze kolonie iPSC, gdy wielkość kolonii przekracza 1 mm. Aby to zrobić, zeskrob i ostrożnie zbierz pojedynczą kolonię za pomocą pipety p10 pod mikroskopem. Przenieść kolonię do nowego dołka z 12-dołkowej płytki pokrytej matrycą błony podstawnej zawierającą 750 μl pożywki hodowlanej PSC.
    Opcjonalnie: Przepłukanie płytki za pomocą DPBS i traktowanie przez 1 minutę 0,5 mM EDTA przed pobraniem może wesprzeć solidną hodowlę dalszych kroków. Jeśli komórki mają być hodowane przez dłuższy czas, aby poczekać na późniejsze pojawienie się kolonii, nie należy wykonywać tego etapu leczenia EDTA.
  9. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 z późniejszymi zmianami pożywki co drugi dzień, jak stwierdzono w sekcji 4 protokołu. Gdy pobrana kolonia osiągnie średnicę 2 mm, kontynuuj rutynowe pasażowanie iPSC, jak wyjaśniono w sekcji 5 protokołu.

4. Średnia zmiana

UWAGA: Pożywka powinna być zmieniana co drugi dzień, dopóki kolonie nie osiągną wystarczająco dużych rozmiarów, aby można było je przekazać.

  1. Odessać starą pożywkę i dodać 750 μl świeżej pożywki na płytkę 12-dołkową. Aby zmienić pożywkę na inny rodzaj, należy ją wymienić co najmniej 1 dzień po pasażu.

5. Przejście

UWAGA: Komórki powinny zostać przepuszczone, gdy kolonie iPSC osiągną wystarczająco duży rozmiar (średnica > 2 mm), lub gdy kolonie mają się ze sobą zetknąć. Rutynowo iPSC można dzielić mniej więcej co 5 dni. Użyj pasażowania brył (krok 5.1) do rutynowej konserwacji i pasażowania pojedynczych komórek (krok 5.2) do eksperymentów, w których potrzebna jest określona liczba komórek. W przypadku, gdy iPSC znacznie się różnią, zbieranie kolonii (krok 5.3) może pomóc w poprawie czystości kultur.

  1. Pasażowanie grudek
    1. Przygotować 12-dołkową płytkę pokrytą matrycą błony podstawnej, dodając 500 μl matrycy membrany podstawnej na studzienkę i rozprowadzić płyn, przesuwając płytkę. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę. Zastąp matrycę błony podstawnej 500 μl pożywki hodowlanej PSC i przechowuj płytkę w temperaturze 37 °C do czasu użycia.
    2. Odessać pożywkę z hodowanych komórek i przemyć komórki, ostrożnie dodając 500 μl DPBS. Usunąć DPBS i dodać 500 μl 0,5 mM EDTA do studzienki.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2-5 minut, aż kolonie zaczną się odłączać. Uważnie obserwuj komórki pod mikroskopem.
    4. Kiedy krawędzie kolonii zaczną się odklejać i staną się widoczne przerwy między komórkami (Rysunek 3A), usuń EDTA i ostrożnie dodaj 500 μl DPBS.
      UWAGA: Zawsze pipetuj do bocznej ścianki studzienki i nigdy bezpośrednio na komórki, aby nie odłączyć komórek od płytki.
    5. Zassać DPBS i przepłukać studzienkę 500 μl pożywki hodowlanej PSC za pomocą pipety p1000. Pipetuj w górę i w dół 1x-5x, aby rozproszyć kolonie w grudki o odpowiedniej wielkości (Rysunek 3A). Nie pipetować zbyt mocno.
      UWAGA: Jeśli iPSC zostaną przypadkowo odpipetowane w zbyt dużej ilości, dodaj 10 μM inhibitora skały Y-27632 do podłoża. Może to zwiększyć przeżywalność, ponieważ iPSC nie są w stanie przetrwać jako pojedyncze komórki.
    6. Przenieś 1/10-1/50 zawiesiny grudek komórek do nowych studzienek. Stosunek zależy od zbiegu studzienki przed podziałem, pożądanej gęstości wysianych komórek i preferencji klonalnej iPSC.
    7. Rozprowadź grudki równomiernie w studzience, kilkakrotnie delikatnie przesuwając talerz do przodu iz powrotem. Inkubować płytkę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C, aby grudki się związały.
    8. Zastąp pożywkę 750 μl pożywki hodowlanej PSC, jeśli zaobserwuje się wiele pływających martwych komórek; w przeciwnym razie dodaj 250 μl pożywki PSC. Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.
      UWAGA: Wymiana pożywki po 30 minutach ma kluczowe znaczenie, szczególnie w przypadku niestabilnych linii komórkowych (np. NHP).
    9. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni, aż kolonie urosną wystarczająco duże, aby można było je przejść. W przypadku średniej zmiany postępuj zgodnie z krokiem 4 protokołu.
  2. Pasażowanie jednokomórkowe
    1. Przygotować płytkę hodowlaną pokrytą matrycą błony podstawnej, jak podano w kroku 5.1.1, z dodatkiem 10 μM Y-27632 do pożywki PSC.
      Opcjonalnie: Dodaj 10 μM Y-27632 do komórek na 1-3 godziny przed pasażem, aby zwiększyć przeżywalność wrażliwych linii komórkowych.
    2. Odessać pożywkę i przemyć komórki, dodając 500 μl DPBS. Usunąć DPBS i dodać 300 μl roztworu oddzielającego do studzienek.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut. Gdy pod mikroskopem zaobserwuje się wystarczające oderwanie komórek, dodać 700 μl pożywki hodowlanej PSC lub DPBS.
    4. Pipetuj w górę i w dół 5-10 razy za pomocą pipety p1000, aż komórki zostaną zdysocjowane na pojedyncze komórki. Nie należy pipetować zbyt mocno, aby zapobiec uszkodzeniu komórek.
    5. Przenieść zawiesinę komórkową do 15 ml probówki zawierającej co najmniej 2 ml DPBS w celu rozcieńczenia roztworu oddzielającego.
    6. Odwirować probówkę o stężeniu 200 × g przez 5 minut i całkowicie odessać roztwór, nie naruszając osadu komórkowego.
    7. Zawiesić osad w 500 μl pożywki hodowlanej PSC uzupełnionej 10 μM Y-27632.
    8. Policz komórki i zasiej 5 000-7 000 komórek na 12-dołkową płytkę pokrytą matrycą błony podstawnej, przygotowaną w kroku 5.2.1.
      UWAGA: Jeśli potrzebny jest inny numer komórki, zmień odpowiednio na większą lub mniejszą studzienkę.
    9. Inkubować płytkę przez co najmniej 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , aby komórki mogły się zjednoczyć.
    10. Zastąp pożywkę 750 μL pożywki hodowlanej PSC + 10 μM Y-27632, jeśli zaobserwowano wiele martwych komórek; w przeciwnym razie dodaj 250 μL + 10 μM Y-27632.
      UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, szczególnie w przypadku niestabilnych linii komórkowych (np. NHP).
    11. Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.
    12. Zmień pożywkę na pożywkę hodowlaną PSC bez Y-27632 1 do 2 dni po poszczepieniu, aby umożliwić komórkom ponowne wyświetlanie klasycznej morfologii kolonii (Ryc. 3B).
    13. Zmieniaj podłoże co 2 dni, aż kolonie urosną wystarczająco duże. W przypadku zmiany medium postępuj zgodnie z sekcją 4 protokołu.
  3. Pasażowanie iPSC przez pobieranie kolonii
    1. Przygotować 12-dołkowe 12-dołkowe pokryte matrycą membrany podstawnej, jak podano w kroku 5.1.1.
    2. Odessać pożywkę i przemyć komórki, ostrożnie dodając 500 μl DPBS. Usunąć DPBS i dodać 500 μl 0,5 mM EDTA do studzienki.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 1-3 minuty i obserwować komórki pod mikroskopem, aż na granicach będzie widoczne oderwanie się kolonii.
    4. Usunąć EDTA i ostrożnie dodać 500 μl DPBS. Odessać płyn przed powolnym dodawaniem 500 μl pożywki hodowlanej PSC do dołka, bez odłączania komórek.
    5. Użyj pipety p200, aby wybrać żądaną kolonię pod mikroskopem, bez pobierania zróżnicowanych komórek. Aby to zrobić, delikatnie podrap kolonię, jednocześnie pobierając podłoże zawierające komórki.
    6. Przenieść każdą pobraną kolonię do jednego dołka pokrytego matrycą membrany podstawnej, jak przygotowano w kroku 5.3.1. Zdysocjuj komórki na małe grudki za pomocą pipety p1000, pipetując komórki 2-5 razy.
    7. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , pozwalając na połączenie się grudek.
    8. Zastąp pożywkę 750 μl pożywki PSC, jeśli zaobserwuje się wiele pływających martwych komórek; w przeciwnym razie dodaj 250 μl pożywki PSC.
      UWAGA: Wymiana pożywki po 30 minutach ma kluczowe znaczenie, szczególnie w przypadku niestabilnych linii komórkowych (np. NHP).
    9. Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.
    10. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni, aż kolonie urosną wystarczająco duże, aby można było je przejść. W tym celu należy postępować zgodnie z sekcją 4 protokołu.

6. Zamrażanie komórek moczowych i iPSC do długotrwałego przechowywania

UWAGA: Rutynowo, iPSC są zamrażane jako grudki w pożywce do zamrażania komórek bez liczenia. Pipetowanie powinno być ograniczone do minimum, aby uniknąć dysocjacji na pojedyncze komórki. W przypadku komórek moczowych rutynowo zamraża się 1,5 × 104 do 3 × 104 komórek na probówkę, co pozwala użytkownikowi na rozmrożenie jednej probówki bezpośrednio w jednym dołku 12-dołkowej płytki bez konieczności wykonywania kolejnego etapu liczenia.

  1. Przygotuj 5 ml DPBS w probówce o pojemności 15 ml.
  2. W celu zamrożenia komórek moczowych należy postępować zgodnie z krokami 2.2-2.4 protokołu. W celu zamrożenia komórek iPS należy postępować zgodnie z krokami 5.1.2–5.1.5 protokołu przekazywania grup.
  3. Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml przygotowanej w kroku 6.1. W celu zamrożenia komórek moczowych należy odliczyć 10 μl zawiesiny komórkowej za pomocą hemocytometru. Odwirować komórki przez 5 minut w stężeniu 200 × g i całkowicie odessać supernatant.
  4. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 400 μl pożywki do zamrażania komórek na probówkę i rozprowadzić komórki do żądanej ilości krioprobówek.
  5. Natychmiast przenieść krioprobówki do temperatury -80 °C. Zamrożone probówki przenieść do zamrażarki o temperaturze -150 °C lub ciekłego azotu 1 dzień po zamrożeniu w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

7. Rozmrażanie komórek moczowych i iPSC

  1. Do rozmrożenia komórek moczowych należy przygotować żądaną ilość 12-dołków pokrytych żelatyną, jak podano w kroku 1.1 protokołu. W przypadku iPSC należy przygotować 12-dołkowe płytki pokryte matrycą membrany podstawnej, jak podano w kroku 5.1.1. W obu przypadkach nie należy wymieniać matrycy na medium.
  2. Przygotować probówkę o pojemności 15 ml zawierającą 4 ml DPBS i przechowywać ją w temperaturze 37 °C.
  3. Szybko umieścić zamrożoną fiolkę z komórkami w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu rozmrożenia, aż pojawi się kawałek pływającego lodu.
    UWAGA: Przetrzyj krioprobówkę etanolem przed i po inkubacji w łaźni wodnej, aby uniknąć zanieczyszczeń.
  4. Dodać 500 μl pożywki REMC dla komórek moczu lub 500 μl pożywki hodowlanej PSC dla iPSC do zawiesiny zawierającej lód i natychmiast przenieść zawiesinę do wstępnie podgrzanej probówki o pojemności 15 ml przygotowanej w kroku 7.2.
  5. Odwirować probówkę o masie 200 × g przez 5 minut i całkowicie odrzucić supernatant.
  6. W przypadku komórek moczowych zawiesić osad w 1 ml pożywki REMC. W przypadku iPSC ostrożnie ponownie zawiesić osad w 750 μl pożywki hodowlanej PSC. Należy unikać zbyt intensywnego pipetowania, aby grudki pozostały nienaruszone.
    Opcjonalnie: Uzupełnienie pożywki o 10 μM Y-27632 może pomóc w przetrwaniu iPSC po rozmrożeniu.
  7. Odessać matrycę z 12-dołkowych płytek przygotowanych w kroku 7.1 i ostrożnie przenieść zawiesinę komórek do studzienki.
  8. Umieścić płytkę na noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.
  9. Następnego dnia należy zastąpić pożywkę pożywką hodowlaną PSC, bez Y-27632 dla iPSC i REMC dla komórek moczowych.
  10. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.
  11. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni, aż komórki urosną wystarczająco duże, aby można je było przejść. W przypadku zmiany medium postępuj zgodnie z sekcją 4 protokołu.

8. Immunocytochemia

UWAGA: Barwienie immunologiczne przeciwciałami ukierunkowanymi na markery związane z pluripotencją, takie jak NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 i EpCAM, jest jednym z najczęściej stosowanych walidacji nowo generowanych iPSC. Więcej informacji na temat przeciwciał i rozcieńczeń można znaleźć w Tabeli materiałów.

  1. Umieść iPSC na 1-3 dni przed użyciem w odpowiedniej liczbie płytek 12-dołkowych. Odessać pożywkę, umyć komórki, dodając 500 μl DPBS i usunąć DPBS. Dodać 400 μl 4% paraformaldehydu (PFA) do dołka i utrwalić komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Usuń 4% PFA i umyj komórki 3x DPBS. Dodać 400 μl buforu blokującego do dołka i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze soczystej.
  3. Odessać bufor blokujący i dodać przeciwciała rozcieńczone w 400 μl buforu do rozcieńczania przeciwciał (ADB) do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez noc.
  4. Usuń ADB zawierający przeciwciała pierwszorzędowe i umyj komórki 3x DPBS.
  5. Odessać DPBS i dodać 400 μl przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych w ADB na studzienkę. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  6. Usuń ADB i umyj komórki 3x za pomocą DPBS. Dodać 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) rozcieńczonego w DPBS na studzienkę i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  7. Odessać roztwór DAPI i umyć komórkę 3x DPBS. Dodać 500 μl DPBS do obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas izolowania komórek z ludzkiego moczu i moczu NHP, bezpośrednio po izolacji można zidentyfikować różne typy komórek. Komórki płaskonabłonkowe, a także różne mniejsze okrągłe komórki, są wydalane z moczem; Mocz żeński zawiera znacznie więcej komórek płaskonabłonkowych niż mocz męski (Rysunek 1B - Dzień 0; Rysunek uzupełniający S1). Po 5 dniach hodowli w pierwotnym podłożu moczu można zobaczyć pierwsze przylegające komórki proliferujące (Rysunek 1A, B ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki iPS są cennymi typami komórek, ponieważ umożliwiają wytwarzanie niedostępnych w inny sposób typów komórek in vitro. Ponieważ materiały wyjściowe do przeprogramowania, na przykład fibroblasty, nie są łatwo dostępne dla wszystkich gatunków naczelnych, w niniejszej pracy przedstawiono protokół wytwarzania iPSC z komórek pochodzących z moczu. Komórki te można uzyskać w sposób nieinwazyjny, nawet z niesterylnych próbek moczu naczelnych, poprzez uzupełnienie pożywki hodowlanej antybiotykami o szerokim spektrum...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez DFG EN 1093/5-1 (numer projektu 458247426). M.O. był wspierany przez JSPS Overseas Research Fellowship. Wszystkie figury zostały stworzone z BioRender.com. Cytometrię przepływową wykonano przy pomocy Core Facility Flow Cytometry w Centrum Biomedycznym w Monachium. Chcielibyśmy podziękować Makoto Shida i Tomoyo Muto z ASHBi, Uniwersytetu w Kioto, za wsparcie w zakresie filmowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Accumax™ roztwór do odłączania komórek (Roztwór odłączający)Sigma-AldrichSCR006
Amfoterycyna B RoztwórMerckA2941-100ML
Przeciwciało myszy anty-ludzkie TRA-1-60 Stem Cell Technologies60064Rozcieńczenie: 1/200
Przeciwciało sprzężone z PE anty-ludzkie TRA-1-60 Miltenyi Biotec130-122-965Rozcieńczenie: 1/50
Bambanker™ (Medium do zamrażania komórek)Nippon GeneticsBB01
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
Płytka wielodołkowa do hodowli komórkowych, 12-dołkowa CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Countess™ II automatyczny licznik komórekThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoKing® Probówki 1,5 mL z kodem kreskowym 2D (Cryotubes)Sued-Laborbedarf52 95-0213Do zamrażania można używać różnych rodzajów krioprobówek. Probówki z kodami kreskowymi 2D mają tę zaletę, że informacje o próbce mogą być przechowywane w bazie danych z unikalnymi informacjami o probówkach.
CytoTune&handel; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (Wirus GFP Sendai)Thermo Fisher ScientificA16519
CytoTune™-iPS 2.0 Zestaw do przeprogramowania wirusa Sendai (Zestaw do przeprogramowania wirusa Sendai)Thermo Fisher ScientificA16518
DAPI 4',6-diamidyno-2'-fenyloindolowy dichlorowodorekSigma-Aldrich10236276001
DMEM High GlukozaTH. GeyerL0102
DMEM/F12 w L-glutaminieFisher Scientific15373541
Przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwciało wtórne, Alexa Fluor™ 488Thermo Fisher ScientificA-21202Rozcieńczenie: 1/500
Przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor™ 594Thermo Fisher ScientificA-21207Rozcieńczenie: 1/500
DPBS bez wapnia bez magnezuTH. GeyerL0615-500
Rekombinowane poliklonalne przeciwciało królika EpCAM (22 HCLC)Thermo Fisher Scientific710524Rozcieńczenie: 1/500
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Carl RothCN06.3
Falcon Tube 15 ml stożkowe dnoGreiner BIO-ONE188271-N
Falcon Tube 50 ml stożkowe dnoGreiner BIO-ONE227261
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, Brazylia (FBS)Thermo Fisher Scientific10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo 
Żelatyna ze skóry wieprzowejSigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex&handel; Matryca membrany podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu bez LDEV, z kwalifikacją hESC,Thermo Fisher ScientificA1413301
GlutaMAX™ SuplementThermo Fisher Scientific35050038
Inkubator CO2 Heracell™ 240iFisher Scientific16416639
Heraeus HeraSafe Szafa bezpieczeństwaKendro51017905
Human EGF, premium klasaMiltenyi Biotec130-097-749
ImageJ FidżiWersja 2.9.0
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)Thermo Fisher Scientific11140035
Probówka do mikrowirowania PP, 1,5 mlNerbe Plus04-212-1000
Mikroskop Nikon eclipse TE2000-SNikonTE2000-S
Mysie przeciwciało anty-alfa-FetoproteinoweR& Systemy DMAB1368Rozcieńczenie: 1/100
Mysie przeciwciało anty-alfa-aktynowe mięśni gładkichR& Systemy DMAB1420Rozcieńczenie: 1/100
Mysie przeciwciało anty-beta-III tubulinyR& Systemy DMAB1195Rozcieńczenie: 1/100
mTeSR™ 1STEMCELL Technolgies85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb Technologia sygnalizacji komórkowej4903SRozcieńczenie: 1/400
Normocure™ (Odczynnik przeciwdrobnoustrojowy)Invivogenant-noc
Oct-4 Przeciwciało królika Technologia sygnalizacji komórkowej2750SRozcieńczenie: 1/400
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich441244-1KG
Penicylina-Streptomycyna (10.000 U/ml) (PS)Thermo Fisher Scientific 15140122Mieszanka penicyliny-streptomycyny zawiera 100 U/ml penicyliny i 100 &mikro; g/ml Streptomycyny.
Rekombinowany ludzki FGF-basicPeproTech100-18B
Rekombinowany ludzki PDGF-ABPeproTech100-00AB
Wirówka stołowa z chłodzeniemSIGMA 4-16KS
Podłoże nabłonkowe nabłonka nerekATCCPCS-400-030
Zestaw do wzrostu komórek nabłonka nerkiATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mysi mAb # 4900Technologia sygnalizacji komórkowej4900SRozcieńczenie: 1/400
SSEA4 (MC813) MAb myszyNEB4755SRozcieńczenie: 1/500
StemFit® Basic02Nippon Genetics3821.00Produkcja tej pożywki została przerwana, zamiast tego należy użyć StemFit Basic04CT dla ludzkich linii komórkowych lub StemFit Basic03 dla naczelnych innych niż ludzie.
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-50ML
TrypLE&handel; Wybierz enzym (1x), bez czerwieni fenolowej (enzym dysocjacyjny)Thermo Fisher Scientific12563011
Kąpiel wodna Precyzja GP 05Thermo Fisher ScientificTSGP05
Y-27632, sól dichlorowodorku (inhibitor skały)BiozolBYT-ORB153635
BuforAby zapoznać się z kompozycją, patrz suplement tabela S1
Bufor blokującySkład patrz tabela uzupełniająca S1
PożywkaSkład patrz tabela uzupełniająca S1
PożywkaSkład patrz tabela uzupełniająca S1
Pożywka hodowlana PSCSkład patrz tabela uzupełniająca S1
Pożywka wytwarzająca PSCSkład znajduje się w tabeli uzupełniającej S1
BuforW celu zapoznania się ze składem zob. tabela uzupełniająca S1
663441 do rozcieńczania przeciwciał REMC pierwotna moczu Skład patrz tabela uzupełniająca S1 Pożywka PSC do przemywania moczu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
  2. Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
  3. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
  4. Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
  7. Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
  8. Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214(2017).
  9. Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
  10. Gallego Romero,, I,, et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103(2015).
  11. Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312(2018).
  12. Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361(2022).
  13. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  14. Dannemann, M., Gallego Romero,, I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
  15. Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516(2021).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  17. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  18. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  19. Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
  20. Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
  21. Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
  22. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  23. Park, I. -H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  24. Loh, Y. -H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
  25. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  26. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
  27. Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
  28. Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
  29. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  30. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  31. Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
  32. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  33. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  34. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  35. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
  36. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  37. Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
  38. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  39. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  40. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  41. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  42. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  43. Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
  44. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  45. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  46. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  47. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  48. Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
  49. Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432(2014).
  50. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  51. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
  52. Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
  53. Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
  54. Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

indukowane pluripotencjalne kom rki macierzyste naczelnychkom rki pochodz ce z moczuhodowla bez kom rek karmicielekreprogramowanie wirusem Sendaipasa owanie grudekmarkery pluripotencjicytometria przep ywowaimmunocytochemiar nicowanie w kierunku trzech listk w zarodkowych

Powiązane artykuły