Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie i utrzymywanie indukowanych przez naczelnych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z moczu

5.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64922

⸱

28 lipca 2023

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, 3Hakubi Center, Kyoto University

W tym artykule

Podsumowanie

Obecny protokół opisuje metodę izolacji, ekspansji i przeprogramowania ludzkich i nieludzkich komórek pochodzących z moczu naczelnych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), a także instrukcje dotyczące konserwacji nowo wygenerowanych iPSC bez konieczności dostarczania pokarmu.

Streszczenie

Międzygatunkowe podejście do badania pluripotencjalnych komórek macierzystych naczelnych i ich pochodnych jest kluczowe dla lepszego zrozumienia molekularnych i komórkowych mechanizmów choroby, rozwoju i ewolucji. Aby zwiększyć dostępność indukowanych przez naczelnych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), w artykule przedstawiono nieinwazyjną metodę generowania ludzkich i innych naczelnych z komórek pochodzących z moczu oraz ich utrzymania przy użyciu metody hodowli bez karmienia.

Próbka moczu może być pobrana z niesterylnego środowiska (np. klatki zwierzęcia) i potraktowana koktajlem antybiotykowym o szerokim spektrum działania podczas pierwotnej hodowli komórek, aby skutecznie zmniejszyć zanieczyszczenie. Po namnażaniu się komórek pochodzących z moczu, iPSC są generowane za pomocą zmodyfikowanej metody transdukcji dostępnego na rynku systemu wektorów wirusa Sendai. Pierwsze kolonie iPSC mogą być widoczne już po 5 dniach, a najwcześniej po 10 dniach. Rutynowe pasażowanie grudek z bezenzymatycznym buforem dysocjacyjnym wspiera pluripotencję generowanych iPSC przez ponad 50 pasaży.

Wprowadzenie

Porównania genomiczne naczelnych ludzkich i niebędących ludźmi (NHP) są kluczowe dla zrozumienia naszej historii ewolucyjnej i ewolucji cech specyficznych dla człowieka1. Ponadto porównania te pozwalają na wnioskowanie o funkcji poprzez identyfikację konserwatywnych sekwencji DNA2, np. w celu nadania priorytetu wariantom związanym z chorobą3. Porównania fenotypów molekularnych, takich jak poziomy ekspresji genów, mają kluczowe znaczenie dla lepszej interpretacji porównań genomowych i odkrycia, na przykład, komórkowych różnic fenotypowych. Co więcej, mają one - podobnie jak porównania na poziomie DNA - potencjał do wnioskowania o znaczeniu funkcjonalnym, a tym samym do lepszej interpretacji istotnych z medycznego punktu widzenia zmian u ludzi4. Włączenie kompleksowych molekularnych danych fenotypowych do tych badań porównawczych wymaga odpowiednich zasobów biologicznych (tj. komórek ortologicznych różnych gatunków). Jednak względy etyczne i praktyczne utrudniają lub uniemożliwiają dostęp do takich porównywalnych komórek, zwłaszcza w trakcie opracowywania. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pozwalają na generowanie takich niedostępnych typów komórek in vitro5,6, są eksperymentalnie dostępne i były używane do porównań z naczelnymi6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Aby wygenerować iPSC, należy zdobyć podstawowe komórki, które mają zostać przeprogramowane. Komórki wyizolowane z moczu mają tę zaletę, że można je nieinwazyjnie pobrać od naczelnych i że można je łatwo przeprogramować, prawdopodobnie ze względu na ich profile molekularne podobne do komórek macierzystych15. Warunki hodowli niezbędne do utrzymania iPSC naczelnych są równie ważne jak przeprogramowanie; Klasycznie rzecz biorąc, hodowla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych wymagała niezdefiniowanej, opartej na surowicy pożywki i kohodowli mysich fibroblastów embrionalnych - tak zwanych komórek żywicielskich - które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i rusztowania dla embrionalnych komórek macierzystych (ESC)16. Od czasu opracowania chemicznie zdefiniowanych i wolnych od karmy systemów hodowli17,18, obecnie dostępne na rynku są różne opcje pożywek i matryc hodowlanych iPSC. Jednak większość z tych warunków hodowli została zoptymalizowana pod kątem ludzkich ESC i iPSC, a zatem może działać gorzej w hodowli NHP iPSC. W tym protokole wideo podajemy instrukcje dotyczące generowania i utrzymywania ludzkich i NHP iPSC pochodzących z hodowli komórek moczowych.

Od czasu pierwszego doniesienia o generowaniu iPSC przez wymuszoną ekspresję zdefiniowanych czynników w fibroblastach w 2006 roku, metoda ta została zastosowana do wielu różnych typów komórek różnego pochodzenia19,20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31,32. Wśród nich w sposób całkowicie nieinwazyjny można pozyskać tylko komórki pochodzące z moczu. Opierając się na wcześniej opisanym protokole przez Zhou et al.33, można izolować i namnażać komórki z moczu naczelnych nawet z niesterylnych próbek, uzupełniając antybiotyki o szerokim spektrum działania15. Warto zauważyć, że komórki pochodzące z moczu pobrane za pomocą tego protokołu wykazują wysoki potencjał do wytwarzania iPSC w krótszym czasie (kolonie stają się widoczne w ciągu 5-15 dni) niż konwencjonalne przeprogramowanie fibroblastów (20-30 dni, z naszego doświadczenia) i przy wystarczająco wysokim wskaźniku sukcesu. Te komórki pochodzące z moczu zostały sklasyfikowane jako mieszana populacja komórek podobnych do mezenchymalnych komórek macierzystych i komórek nabłonka pęcherza moczowego, co spowodowało wysoką wydajność przeprogramowania15.

Oprócz różnic w komórkach pierwotnych, metody przeprogramowania do generowania iPSC również różnią się w zależności od celu użycia. Konwencjonalne procedury przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych przeprowadzono poprzez nadekspresję czynników przeprogramowujących za pomocą wektorów retrowirusowych lub lentiwirusowych, co pozwoliło na integrację egzogennego DNA w genomie5,34,35. Aby utrzymać genomowo wygenerowane iPSC w stanie nienaruszonym, naukowcy opracowali szeroką gamę systemów nieintegracyjnych - wektor PiggyBac z akcyzą36,37, wektor epizodyczny38,39, nieintegrujące wektory wirusowe, takie jak Sendai virus40 i adenovirus41, transfekcja mRNA42, transfekcja białka43,44, oraz leczenie związkami chemicznymi45. Ze względu na wydajność i łatwość obsługi, w tym protokole stosowane są wektory przeprogramowania oparte na wirusie Sendai. Zakażenie komórek pierwotnych przeprowadza się w 1-godzinnej hodowli zawiesinowej komórek i wirusów przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 5 przed posiewem. Ten zmodyfikowany krok może zwiększyć prawdopodobieństwo kontaktu między powierzchniami komórek a wirusami, w porównaniu z konwencjonalną metodą, w której wirusy są dodawane bezpośrednio do przylegającej hodowli komórkowej, a tym samym dać więcej kolonii iPSC15.

Przenikanie ludzkich i NHP pluripotencjalnych komórek macierzystych może odbywać się poprzez pasaż kępowy i pasażowanie jednokomórkowe. Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) jest ekonomicznym środkiem chelatującym, który wiąże jony wapnia i magnezu, a tym samym zapobiega adhezyjnej aktywności kadheryny i integryny. EDTA jest również stosowany jako łagodny, selektywny odczynnik dysocjacyjny, ponieważ niezróżnicowane komórki odrywają się przed komórkami zróżnicowanymi z powodu różnych cząsteczek adhezyjnych. Całkowita dysocjacja indukuje masywną śmierć komórek iPSC naczelnych poprzez hiperaktywację miozyny za pośrednictwem hiperaktywacji miozyny za pośrednictwem Rho/Rho-bound coiled-coil zawierającej kinazę białkową (Rho / Rock). Dlatego uzupełnienie pożywki hodowlanej inhibitorem Rho/Rock jest niezbędne w eksperymentach, które wymagają pojedynczych komórek w zawiesinie46,47. W tym protokole zalecamy pasażowanie brył jako rutynową metodę pasażowania i zalecamy pasażowanie pojedynczych komórek tylko wtedy, gdy jest to konieczne, np. gdy wymagane jest zasiewanie określonej liczby komórek lub podczas podklonowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejsza procedura eksperymentalna została zatwierdzona przez właściwą komisję etyki ds. eksperymentów na ludziach (20-122, Ethikkommission LMU München). Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.
UWAGA: Przed rozpoczęciem eksperymentów z wykorzystaniem próbek pochodzących od ludzi i NHP należy uzyskać zgodę odpowiedniej komisji etycznej. Wszystkie procedury eksperymentalne muszą być wykonywane zgodnie z właściwymi wytycznymi i przepisami. Każdy z poniższych etapów należy przeprowadzić z zachowaniem technik sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Składy wszystkich buforów i mediów znajdują się w Tabeli uzupełniającej S1. Przed dodaniem do komórek należy upewnić się, że wszystkie media zostały ogrzane do temperatury pokojowej (22 °C). Każdy etap wirowania należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Izolacja komórek z próbek moczu

OSTRZEŻENIE: Należy upewnić się, że dawcy ludzcy są wolni od wirusa niedoboru odporności u ludzi (HIV), wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) oraz wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). W przypadku naczelnych (NHPs) należy upewnić się, że potencjalni dawcy/komórki są wolni od specyficznych patogenów: wirusa B (BV), małpiego wirusa niedoboru odporności (SIV), małpiego betaretrowirusa (SRV) oraz małpiego limfotropowego wirusa limfocytów T (STLV).

  1. Przygotować płytkę 12-dołkową pokrytą żelatyną, dodając 500 µL 0,2% żelatyny do każdego dołka, a następnie rozprowadzić płyn poprzez poruszanie płytką. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 min przed użyciem.
  2. Pobrać próbki ludzkiego moczu do stożkowych probówek o pojemności 50 mL. W przypadku naczelnych pobierać mocz z podłoża pomieszczenia zwierzęcego za pomocą strzykawki.
    UWAGA: Wykazano, że objętość 5 mL moczu jest wystarczająca do wyizolowania co najmniej jednej kolonii w 42% prób. Zaleca się jednak stosowanie większej objętości (~50 mL moczu), aby zwiększyć szansę na wyizolowanie kolonii. Mocz od NHP należy pobierać jak najświeższy, najlepiej bezpośrednio po oddaniu moczu. Przechowywanie próbek moczu w temperaturze 4 °C przez 4 h nie miało negatywnego wpływu na skuteczność protokołu, jednak nie testowano dłuższego czasu przechowywania.
  3. Wirować probówkę z moczem z prędkością 400 × g przez 10 min, a następnie ostrożnie odessać nadsącz, pozostawiając w probówce około 1 mL.
  4. Resuspendować osad w pozostałym 1 mL płynu. Jeśli pobrano mocz do wielu probówek, połączyć zawiesiny w jednej probówce.
  5. Przemyć komórki, dodając do probówki 10 mL buforu do przemywania moczu (patrz Supplementary Table S1) zawierającego 2,5 µg/mL amfoterycyny, a następnie ostrożnie wymieszać zawiesinę za pomocą pipety serologicznej.
  6. Wirować probówkę z prędkością 200 × g przez 10 min, a następnie ostrożnie odessać nadsącz, pozostawiając w probówce mniej niż <0,2 mL.
  7. Resuspendować osad komórkowy w 1 mL podstawowego medium do moczu (patrz Supplementary Table S1) zawierającego 0,5 µg/mL amfoterycyny na każde 50 mL początkowo przetworzonego moczu (resuspendować w 1 mL, nawet jeśli przetworzono mniej niż 50 mL moczu).
  8. Odessać żelatynę z dołków (przygotowanych w kroku 1.1) i nanieść 1 mL zawiesiny z kroku 1.7 do jednego dołka płytki 12-dołkowej. Powtórzyć czynność dla tylu dołków, ile jest wymagane lub dla dostępnej objętości zawiesiny w mililitrach.
    Opcjonalnie: Aby uniknąć kontaminacji wynikającej z niehigienicznego pobierania próbek, od tego momentu aż do pierwszego pasażu dodawać do komórek 100 µg/mL odczynnika przeciwdrobniczego.
  9. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
  10. Codziennie dodawać 1 mL podstawowego medium do moczu do każdego dołka aż do 5. dnia, bez usuwania istniejącego medium.
  11. W 5. dniu odessać z płytki 4 mL medium, pozostawiając około 1 mL. Dodać 1 mL medium REMC (patrz Supplementary Table S1) do każdego dołka, aby uzyskać mieszaninę nowym medium do hodowli w stosunku 1:1.
  12. Codziennie wymieniać połowę medium na medium REMC do momentu pojawienia się pierwszych kolonii (Figure 1A, B). W tym celu usunąć 1 mL starego medium i dodać 1 mL świeżego medium REMC do każdego dołka.

2. Ekspansja komórek moczowych

UWAGA: Pasażowanie komórek moczu należy przeprowadzić przed osiągnięciem przez kulturę 90% konfluencji.

  1. Przygotować żądaną liczbę płytek 12-dołkowych pokrytych żelatyną, zgodnie z opisem w kroku 1.1.
  2. Odssać zużyte pożywkę i przemyć komórki, dodając 1 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS).
  3. Odssać DPBS i dodać 300 µL enzymu dysocjującego w stężeniu 0.5x, rozcieńczonego w DPBS. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 min.
  4. Dodać 700 µL pożywki REMC, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Delikatnie pipetować zawiesinę za pomocą pipety P1000, aż komórki zostaną zdysocjowane do postaci pojedynczych komórek.
  5. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki 15 mL i odwirować w temperaturze 200 × g przez 5 min.
  6. Ostrożnie odessać nadsącz i zawiesić osad w 1 mL pożywki REMC.
  7. Policzyć komórki za pomocą licznika komórek (hemocytometru lub automatycznego licznika komórek).
  8. W celu namnożenia komórek moczu, wysiać od 1.5 × 104 do 3 × 104 komórek w 1 mL pożywki REMC do jednego dołka płytki 12-dołkowej pokrytej 0.2% żelatyną.
  9. Dokonywać kolejnych wymian pożywki co drugi dzień, aż kultura osiągnie 80%-90% konfluencji. W tym celu odessać zużytą pożywkę i dodać 1 mL świeżej pożywki REMC.

3. Generowanie iPSC poprzez infekcję wektorem wirusa Sendai

UWAGA: Schemat procedury reprogramowania przedstawiono na Rysunku 2A. Komórki moczu wykorzystywane do reprogramowania powinny być jak najmłodsze, jednak znaczący spadek wydajności reprogramowania nie jest obserwowany przed 4. pasażem. Zestawu do reprogramowania wirusem Sendai (Sendai Virus Reprogramming Kit) należy używać w laboratorium poziomu BSL-2. Wirusy należy obsługiwać w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, zawsze stosując odpowiedni sprzęt ochronny w celu uniknięcia kontaktu z błonami śluzowymi.

  1. Przygotować płytkę 12-dołkową powleczoną macierzą błony podstawnej, dodając 500 µL macierzy błony podstawnej do każdego dołka, a następnie rozprowadzić ciecz poprzez poruszanie płytką. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 h, a następnie zastąpić macierz błony podstawnej 900 µL pożywki REMC. Przechowywać płytkę w temperaturze 37 °C do czasu użycia.
  2. Szybko rozmrozić składniki zestawu Sendai Reprogramming Kit w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Wymieszać wirusy Sendai (policystroniczne KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC oraz KLF4) z MOI wynoszącym 5 i uzupełnić pożywką REMC do objętości 100 µL. Skorzystać z równania (1):
    Wzór na objętość wirusa do obliczenia MOI, przedstawiony jako równanie matematyczne do użytku laboratoryjnego.
    UWAGA: Ponieważ miana wirusów różnią się między partiami, należy zawsze sprawdzić miano w certyfikacie analizy dostarczonym przez producenta.
    Opcjonalnie: Jako kontrolę pozytywną wydajności transdukcji można dodatkowo zastosować wirusa Sendai z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). W tym celu w kroku 3.3 należy przygotować dodatkowo 3,5 × 104 komórek w osobnej probówce.
  3. W celu dysocjacji komórek moczu należy postępować zgodnie z krokami 2.2-2.4. Policzyć komórki za pomocą licznika komórek i przenieść 7 × 104 komórek moczu do probówki 1,5 mL.
  4. Wirować probówkę z prędkością 200 × g przez 5 min, a następnie ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego. Resuspender osad w 100 µL mieszaniny SeV przygotowanej w kroku 3.2. Inkubować probówkę przez 1 h w temperaturze 37 °C w celu infekcji w zawiesinie.
  5. Wysiać zawiesinę na płytki 12-dołkowe powleczone macierzą błony podstawnej, przygotowane w kroku 3.1. Standardowo wysiać 1 × 104 i 2,5 × 104 komórek na dołek w powtórzeniach.
  6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Wymienić pożywkę na 1 mL świeżej pożywki REMC 24 h po transdukcji oraz w 3. dniu.
  7. W 5. dniu po transdukcji zmienić pożywkę na pożywkę do generowania PSC (patrz Supplementary Table S1), z późniejszymi zmianami pożywki co drugi dzień. W tym celu usunąć starą pożywkę i dodać 1 mL pożywki do generowania PSC na dołek.
    UWAGA: Pojawienie się pierwszych kolonii może zająć do 15 dni.
  8. Wyizolować poszczególne kolonie iPSC, gdy rozmiar kolonii przekroczy 1 mm. Aby to zrobić, zeskrobać i ostrożnie zebrać pojedynczą kolonię za pomocą pipety p10 pod mikroskopem. Przenieść kolonię do nowego dołka płytki 12-dołkowej powleczonej macierzą błony podstawnej zawierającego 750 µL pożywki do hodowli PSC.
    Opcjonalnie: Przepłukanie płytki DPBS i potraktowanie przez 1 min 0,5 mM EDTA przed izolacją może wspomóc stabilną hodowlę w kolejnych etapach. Jeśli komórki mają być hodowane dłużej w oczekiwaniu na kolonie pojawiające się później, nie należy przeprowadzać tego etapu traktowania EDTA.
  9. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 z późniejszymi zmianami pożywki co drugi dzień, zgodnie z opisem w sekcji 4 protokołu. Gdy wyizolowana kolonia osiągnie średnicę 2 mm, kontynuować rutynowe pasażowanie iPSC, zgodnie z opisem w sekcji 5 protokołu.

4. Wymiana pożywki

UWAGA: Pożywkę należy wymieniać co drugi dzień, aż kolonie urosną do rozmiaru umożliwiającego pasażowanie.

  1. Odessać stare pożywkę i dodać 750 µL świeżej pożywki na dołek płytki 12-dołkowej. Aby zmienić rodzaj pożywki, należy ją wymienić co najmniej 1 dzień po pasażowaniu.

5. Pasażowanie

UWAGA: Komórki należy pasażować, gdy kolonie iPSC osiągną odpowiednią wielkość (średnica > 2 mm) lub gdy kolonie zaczną się ze sobą stykać. Rutynowo iPSC można dzielić w przybliżeniu co 5 dni. Do rutynowego utrzymania hodowli należy stosować pasażowanie klastrami (krok 5.1), a do eksperymentów wymagających określonej liczby komórek – pasażowanie pojedynczych komórek (krok 5.2). W przypadku znacznego różnicowania się iPSC, selekcja pojedynczych kolonii (krok 5.3) może pomóc w zwiększeniu czystości kultur.

  1. Pasażowanie w formie grudek (clump-passaging)
    1. Przygotować płytkę 12-dołkową pokrytą macierzą błony podstawnej, dodając 500 µL macierzy błony podstawnej na dołek, a następnie rozprowadzić ciecz poprzez poruszanie płytką. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 h. Zastąpić macierz błony podstawnej 500 µL pożywki do hodowli PSC i przechowywać płytkę w temperaturze 37 °C do momentu użycia.
    2. Odssać pożywkę z hodowanych komórek i wypłukać komórki, ostrożnie dodając 500 µL DPBS. Usunąć DPBS i dodać do dołka 500 µL 0,5 mM EDTA.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 2-5 min, aż kolonie zaczną się odrywać. Uważnie obserwować komórki pod mikroskopem.
    4. Gdy krawędzie kolonii zaczną się odklejać, a między komórkami pojawią się widoczne przerwy (Rycina 3A), usunąć EDTA i ostrożnie dodać 500 µL DPBS.
      UWAGA: Zawsze pipetować o ściankę boczną dołka, nigdy bezpośrednio na komórki, aby nie doprowadzić do ich oderwania od płytki.
    5. Odssać DPBS i wypłukać dołek 500 µL pożywki do hodowli PSC za pomocą pipety p1000. Pipetować w górę i w dół 1-5 razy, aby rozbić kolonie na grudki o odpowiedniej wielkości (Rycina 3A). Nie pipetować zbyt intensywnie.
      UWAGA: Jeśli iPSC zostaną przypadkowo zbyt mocno spipetowane, dodać do pożywki 10 µM inhibitora Rock Y-27632. Może to zwiększyć przeżywalność, ponieważ iPSC nie są w stanie przeżyć jako pojedyncze komórki.
    6. Przenieść 1/10-1/50 zawiesiny grudek komórkowych do nowych dołków. Stosunek ten zależy od konfluencji dołka przed podziałem, pożądanej gęstości wysiewanych komórek oraz preferencji klonalnych iPSC.
    7. Rozprowadzić grudki równomiernie w dołku, delikatnie poruszając płytką w przód i w tył kilka razy. Inkubować płytkę przez co najmniej 30 min w temperaturze 37 °C, aby grudki mogły się przytwierdzić.
    8. Zastąpić pożywkę 750 µL pożywki do hodowli PSC, jeśli zaobserwowano wiele pływających martwych komórek; w przeciwnym razie dodać 250 µL pożywki do hodowli PSC. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
      UWAGA: Wymiana pożywki po 30 min jest kluczowa, szczególnie w przypadku niestabilnych linii komórkowych (np. NHPs).
    9. Wymieniać pożywkę co 2-3 dni, aż kolonie urosną do rozmiarów umożliwiających pasażowanie. W celu wymiany pożywki postępować zgodnie z krokiem 4 protokołu.
  2. Pasażowanie pojedynczych komórek (single-cell passaging)
    1. Przygotować płytkę hodowlaną pokrytą macierzą błony podstawnej, zgodnie z opisem w kroku 5.1.1, dodając 10 µM Y-27632 do pożywki do hodowli PSC.
      Opcjonalnie: Dodać 10 µM Y-27632 do komórek na 1-3 h przed pasażowaniem, aby zwiększyć przeżywalność wrażliwych linii komórkowych.
    2. Odssać pożywkę i wypłukać komórki, dodając 500 µL DPBS. Usunąć DPBS i dodać do dołków 300 µL roztworu do odrywania komórek.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5-10 min. Gdy pod mikroskopem zaobserwuje się wystarczające oderwanie komórek, dodać 700 µL pożywki do hodowli PSC lub DPBS.
    4. Pipetować w górę i w dół 5-10 razy za pomocą pipety p1000, aż komórki zostaną zdysocjowane do pojedynczych komórek. Nie pipetować zbyt intensywnie, aby zapobiec uszkodzeniu komórek.
    5. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki 15 mL zawierającej co najmniej 2 mL DPBS w celu rozcieńczenia roztworu do odrywania.
    6. Wirować probówkę z prędkością 200 × g przez 5 min i całkowicie odessać roztwór, nie naruszając osadu komórkowego.
    7. Resuspender osad w 500 µL pożywki do hodowli PSC uzupełnionej o 10 µM Y-27632.
    8. Policzyć komórki i wysiać 5 000-7 000 komórek na płytkę 12-dołkową pokrytą macierzą błony podstawnej, przygotowaną w kroku 5.2.1.
      UWAGA: Jeśli wymagana jest inna liczba komórek, odpowiednio zmienić wielkość dołka na większy lub mniejszy.
    9. Inkubować płytkę przez co najmniej 30 min w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2, aby komórki mogły się przytwierdzić.
    10. Zastąpić pożywkę 750 µL pożywki do hodowli PSC + 10 µM Y-27632, jeśli zaobserwowano wiele martwych komórek; w przeciwnym razie dodać 250 µL + 10 µM Y-27632.
      UWAGA: Krok ten jest krytyczny, szczególnie dla niestabilnych linii komórkowych (np. NHPs).
    11. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
    12. Zmienić pożywkę na pożywkę do hodowli PSC bez Y-27632 od 1 do 2 dni po podziale, aby umożliwić komórkom ponowne uzyskanie klasycznej morfologii kolonii (Rycina 3B).
    13. Wymieniać pożywkę co 2 dni, aż kolonie urosną do odpowiedniej wielkości. W celu wymiany pożywki postępować zgodnie z sekcją 4 protokołu.
  3. Pasażowanie iPSC poprzez wycinanie kolonii (colony picking)
    1. Przygotować dołki 12-dołkowe pokryte macierzą błony podstawnej zgodnie z opisem w kroku 5.1.1.
    2. Odssać pożywkę i wypłukać komórki, ostrożnie dodając 500 µL DPBS. Usunąć DPBS i dodać do dołka 500 µL 0,5 mM EDTA.
    3. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej (RT) przez 1-3 min i obserwować komórki pod mikroskopem, aż na brzegach będzie widoczne oderwanie kolonii.
    4. Usunąć EDTA i ostrożnie dodać 500 µL DPBS. Odssać ciecz przed powolnym dodaniem do dołka 500 µL pożywki do hodowli PSC, bez odrywania komórek.
    5. Używając pipety p200, pobrać pożądaną kolonię pod mikroskopem, unikając zbierania komórek zróżnicowanych. Aby to zrobić, delikatnie zeskrobać powierzchnię kolonii podczas pobierania pożywki zawierającej komórki.
    6. Przenieść każdą pobraną kolonię do jednego dołka pokrytego macierzą błony podstawnej, przygotowanego w kroku 5.3.1. Zdysocjować komórki na małe grudki za pomocą pipety p1000, pipetując komórki 2-5 razy.
    7. Inkubować płytkę przez 30 min w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2, pozwalając grudkom się przytwierdzić.
    8. Zastąpić pożywkę 750 µL pożywki do hodowli PSC, jeśli zaobserwowano wiele pływających martwych komórek; w przeciwnym razie dodać 250 µL pożywki do hodowli PSC.
      UWAGA: Wymiana pożywki po 30 min jest krytyczna, szczególnie dla niestabilnych linii komórkowych (np. NHPs).
    9. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
    10. Wymieniać pożywkę co 2-3 dni, aż kolonie urosną do rozmiarów umożliwiających pasażowanie. W celu wykonania tej czynności postępować zgodnie z sekcją 4 protokołu.

6. Zamrażanie komórek moczu i iPSC w celu długoterminowego przechowywania

UWAGA: Rutynowo iPSC są mrożone w postaci agregatów w medium do mrożenia komórek bez ich odliczania. Należy ograniczyć pipetowanie do minimum, aby uniknąć dysocjacji do pojedynczych komórek. W przypadku komórek moczu rutynowo mrozi się od 1,5 × 104 do 3 × 104 komórek na probówkę, co pozwala użytkownikowi na rozmrożenie jednej probówki bezpośrednio w jednym dołku płytki 12-dołkowej bez konieczności ponownego odliczania.

  1. Przygotować 5 mL DPBS w probówce 15 mL.
  2. W przypadku zamrażania komórek moczu należy postępować zgodnie z krokami 2.2-2.4 protokołu. W przypadku zamrażania iPSC należy postępować zgodnie z krokami 5.1.2-5.1.5 protokołu pasażowania skupisk (clump passaging).
  3. Przenieść zawiesinę do probówki 15 mL przygotowanej w kroku 6.1. W przypadku zamrażania komórek moczu odmierzyć 10 µL zawiesiny komórkowej i policzyć komórki przy użyciu hemocytometru. Wirować komórki przez 5 min przy 200 × g, a następnie całkowicie odessać nadsącz.
  4. Resuspendować osad komórkowy w 400 µL medium do zamrażania komórek na probówkę, a następnie rozdzielić komórki do odpowiedniej liczby krioprobówek.
  5. Niezwłocznie przenieść krioprobówki do temperatury -80 °C. W celu długoterminowego przechowywania, 1 dzień po zamrożeniu w -80 °C, przenieść zamrożone probówki do zamrażarki -150 °C lub do ciekłego azotu.

7. Rozmrażanie komórek moczu oraz iPSC

  1. W celu rozmrożenia komórek moczowych przygotować odpowiednią liczbę płytek 12-dołkowych powlekonych żelatyną, zgodnie z opisem w kroku 1.1 protokołu. W przypadku iPSC przygotować płytki 12-dołkowe powlekone matrycą błony podstawnej, zgodnie z opisem w kroku 5.1.1. W obu przypadkach nie należy wymieniać matrycy na medium.
  2. Przygotować probówkę 15 mL zawierającą 4 mL DPBS i przechowywać ją w temperaturze 37 °C.
  3. Zamrożoną fiolkę z komórkami szybko umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu rozmrożenia, aż do momentu pojawienia się widocznego kawałka pływającego lodu.
    UWAGA: Przed i po inkubacji w łaźni wodnej należy przetrzeć krioprobówkę etanolem, aby uniknąć kontaminacji.
  4. Do zawiesiny zawierającej lód dodać 500 µL medium REMC (dla komórek moczowych) lub 500 µL medium hodowlanego PSC (dla iPSC), a następnie natychmiast przenieść zawiesinę do podgrzanej wcześniej probówki 15 mL przygotowanej w kroku 7.2.
  5. Wirować probówkę z prędkością 200 × g przez 5 min, a następnie całkowicie odpipermitować nadsącz.
  6. W przypadku komórek moczowych resuspender osad w 1 mL medium REMC. W przypadku iPSC ostrożnie resuspender osad w 750 µL medium hodowlanego PSC. Należy unikać nadmiernego pipetowania, aby zachować nienaruszone agregaty komórkowe.
    Opcjonalnie: Suplementacja medium 10 µM Y-27632 może wspomóc przeżywalność iPSC po rozmrożeniu.
  7. Odssać matrycę z płytek 12-dołkowych przygotowanych w kroku 7.1 i ostrożnie przenieść zawiesinę komórkową do dołków.
  8. Płytkę inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.
  9. Następnego dnia wymienić medium na medium hodowlane PSC (bez Y-27632 dla iPSC) lub na REMC dla komórek moczowych.
  10. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w inkubatorze.
  11. Wymieniać medium co 2-3 dni, aż komórki urosną do rozmiaru umożliwiającego pasażowanie. W celu wymiany medium należy postępować zgodnie z sekcją 4 protokołu.

8. Immunocytochemia

UWAGA: Immunobarwienie z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko markerom związanym z pluripotencją, takim jak NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 oraz EpCAM, jest jedną z najpowszechniej stosowanych metod walidacji nowo wygenerowanych iPSC. Dalsze informacje na temat przeciwciał i ich rozcieńczeń znajdują się w Tabeli Materiałów.

  1. Wysiać iPSCs na odpowiednią liczbę płytek 12-dołkowych od 1 do 3 dni przed użyciem. Odessać medium, przemyć komórki, dodając 500 µL DPBS, a następnie usunąć DPBS. Dodać 400 µL 4% paraformaldehydu (PFA) do każdego dołka i utrwalić komórki przez 15 min w RT.
  2. Usunąć 4% PFA i przemyć komórki 3x DPBS. Dodać 400 µL buforu blokującego do każdego dołka i inkubować płytkę przez 30 min w RT.
  3. Odessać bufor blokujący i dodać do każdego dołka przeciwciała rozcieńczone w 400 µL buforu do rozcieńczania przeciwciał (ADB). Inkubować płytkę przez noc w 4 °C.
  4. Usunąć ADB zawierający przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć komórki 3x DPBS.
  5. Odessać DPBS i dodać 400 µL przeciwciał wtórnych rozcieńczonych w ADB do każdego dołka. Inkubować płytkę przez 1 h w RT w ciemności.
  6. Usunąć ADB i przemyć komórki 3x DPBS. Dodać do każdego dołka 1 µg/mL 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) rozcieńczonego w DPBS i inkubować przez 3 min w RT.
  7. Odessać roztwór DAPI i przemyć komórki 3x DPBS. Dodać 500 µL DPBS w celu przeprowadzenia obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podczas izolowania komórek z moczu ludzi i NHP można zidentyfikować różne typy komórek bezpośrednio po izolacji. Wraz z moczem wydalane są komórki płaskie, a także różne mniejsze komórki obłe; mocz kobiet zawiera znacznie więcej komórek płaskich niż mocz mężczyzn (Rycyna 1B - dzień 0; Rycina uzupełniająca S1). Po 5 dniach hodowli w podstawowym medium do moczu można zaobserwować pierwsze adherentne komórki proliferujące (Rycina 1A,B 

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Komórki iPS są cennymi typami komórek, ponieważ umożliwiają wytwarzanie niedostępnych w inny sposób typów komórek in vitro. Ponieważ materiały wyjściowe do przeprogramowania, na przykład fibroblasty, nie są łatwo dostępne dla wszystkich gatunków naczelnych, w niniejszej pracy przedstawiono protokół wytwarzania iPSC z komórek pochodzących z moczu. Komórki te można uzyskać w sposób nieinwazyjny, nawet z niesterylnych próbek moczu naczelnych, poprzez uzupełnienie pożywki hodowlanej antybiotykami o szerokim spektrum...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez DFG EN 1093/5-1 (numer projektu 458247426). M.O. był wspierany przez JSPS Overseas Research Fellowship. Wszystkie figury zostały stworzone z BioRender.com. Cytometrię przepływową wykonano przy pomocy Core Facility Flow Cytometry w Centrum Biomedycznym w Monachium. Chcielibyśmy podziękować Makoto Shida i Tomoyo Muto z ASHBi, Uniwersytetu w Kioto, za wsparcie w zakresie filmowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Accumax™ roztwór do odłączania komórek (Roztwór odłączający)Sigma-AldrichSCR006
Amfoterycyna B RoztwórMerckA2941-100ML
Przeciwciało myszy anty-ludzkie TRA-1-60 Stem Cell Technologies60064Rozcieńczenie: 1/200
Przeciwciało sprzężone z PE anty-ludzkie TRA-1-60 Miltenyi Biotec130-122-965Rozcieńczenie: 1/50
Bambanker™ (Medium do zamrażania komórek)Nippon GeneticsBB01
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
Płytka wielodołkowa do hodowli komórkowych, 12-dołkowa CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Countess™ II automatyczny licznik komórekThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoKing® Probówki 1,5 mL z kodem kreskowym 2D (Cryotubes)Sued-Laborbedarf52 95-0213Do zamrażania można używać różnych rodzajów krioprobówek. Probówki z kodami kreskowymi 2D mają tę zaletę, że informacje o próbce mogą być przechowywane w bazie danych z unikalnymi informacjami o probówkach.
CytoTune&handel; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (Wirus GFP Sendai)Thermo Fisher ScientificA16519
CytoTune™-iPS 2.0 Zestaw do przeprogramowania wirusa Sendai (Zestaw do przeprogramowania wirusa Sendai)Thermo Fisher ScientificA16518
DAPI 4',6-diamidyno-2'-fenyloindolowy dichlorowodorekSigma-Aldrich10236276001
DMEM High GlukozaTH. GeyerL0102
DMEM/F12 w L-glutaminieFisher Scientific15373541
Przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwciało wtórne, Alexa Fluor™ 488Thermo Fisher ScientificA-21202Rozcieńczenie: 1/500
Przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor™ 594Thermo Fisher ScientificA-21207Rozcieńczenie: 1/500
DPBS bez wapnia bez magnezuTH. GeyerL0615-500
Rekombinowane poliklonalne przeciwciało królika EpCAM (22 HCLC)Thermo Fisher Scientific710524Rozcieńczenie: 1/500
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)Carl RothCN06.3
Falcon Tube 15 ml stożkowe dnoGreiner BIO-ONE188271-N
Falcon Tube 50 ml stożkowe dnoGreiner BIO-ONE227261
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, Brazylia (FBS)Thermo Fisher Scientific10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo 
Żelatyna ze skóry wieprzowejSigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex&handel; Matryca membrany podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu bez LDEV, z kwalifikacją hESC,Thermo Fisher ScientificA1413301
GlutaMAX™ SuplementThermo Fisher Scientific35050038
Inkubator CO2 Heracell™ 240iFisher Scientific16416639
Heraeus HeraSafe Szafa bezpieczeństwaKendro51017905
Human EGF, premium klasaMiltenyi Biotec130-097-749
ImageJ FidżiWersja 2.9.0
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)Thermo Fisher Scientific11140035
Probówka do mikrowirowania PP, 1,5 mlNerbe Plus04-212-1000
Mikroskop Nikon eclipse TE2000-SNikonTE2000-S
Mysie przeciwciało anty-alfa-FetoproteinoweR& Systemy DMAB1368Rozcieńczenie: 1/100
Mysie przeciwciało anty-alfa-aktynowe mięśni gładkichR& Systemy DMAB1420Rozcieńczenie: 1/100
Mysie przeciwciało anty-beta-III tubulinyR& Systemy DMAB1195Rozcieńczenie: 1/100
mTeSR™ 1STEMCELL Technolgies85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb Technologia sygnalizacji komórkowej4903SRozcieńczenie: 1/400
Normocure™ (Odczynnik przeciwdrobnoustrojowy)Invivogenant-noc
Oct-4 Przeciwciało królika Technologia sygnalizacji komórkowej2750SRozcieńczenie: 1/400
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich441244-1KG
Penicylina-Streptomycyna (10.000 U/ml) (PS)Thermo Fisher Scientific 15140122Mieszanka penicyliny-streptomycyny zawiera 100 U/ml penicyliny i 100 &mikro; g/ml Streptomycyny.
Rekombinowany ludzki FGF-basicPeproTech100-18B
Rekombinowany ludzki PDGF-ABPeproTech100-00AB
Wirówka stołowa z chłodzeniemSIGMA 4-16KS
Podłoże nabłonkowe nabłonka nerekATCCPCS-400-030
Zestaw do wzrostu komórek nabłonka nerkiATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mysi mAb # 4900Technologia sygnalizacji komórkowej4900SRozcieńczenie: 1/400
SSEA4 (MC813) MAb myszyNEB4755SRozcieńczenie: 1/500
StemFit® Basic02Nippon Genetics3821.00Produkcja tej pożywki została przerwana, zamiast tego należy użyć StemFit Basic04CT dla ludzkich linii komórkowych lub StemFit Basic03 dla naczelnych innych niż ludzie.
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-50ML
TrypLE&handel; Wybierz enzym (1x), bez czerwieni fenolowej (enzym dysocjacyjny)Thermo Fisher Scientific12563011
Kąpiel wodna Precyzja GP 05Thermo Fisher ScientificTSGP05
Y-27632, sól dichlorowodorku (inhibitor skały)BiozolBYT-ORB153635
BuforAby zapoznać się z kompozycją, patrz suplement tabela S1
Bufor blokującySkład patrz tabela uzupełniająca S1
PożywkaSkład patrz tabela uzupełniająca S1
PożywkaSkład patrz tabela uzupełniająca S1
Pożywka hodowlana PSCSkład patrz tabela uzupełniająca S1
Pożywka wytwarzająca PSCSkład znajduje się w tabeli uzupełniającej S1
BuforW celu zapoznania się ze składem zob. tabela uzupełniająca S1
663441 do rozcieńczania przeciwciał REMC pierwotna moczu Skład patrz tabela uzupełniająca S1 Pożywka PSC do przemywania moczu

Bibliografia

  1. Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
  2. Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
  3. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
  4. Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
  7. Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
  8. Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214(2017).
  9. Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
  10. Gallego Romero,, I,, et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103(2015).
  11. Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312(2018).
  12. Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361(2022).
  13. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  14. Dannemann, M., Gallego Romero,, I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
  15. Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516(2021).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  17. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  18. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  19. Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
  20. Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
  21. Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
  22. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  23. Park, I. -H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  24. Loh, Y. -H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
  25. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  26. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
  27. Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
  28. Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
  29. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  30. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  31. Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
  32. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  33. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  34. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  35. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
  36. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  37. Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
  38. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  39. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  40. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  41. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  42. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  43. Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
  44. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  45. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  46. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  47. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  48. Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
  49. Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432(2014).
  50. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  51. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
  52. Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
  53. Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
  54. Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

indukowane pluripotencjalne kom rki macierzyste naczelnychkom rki pochodz ce z moczuhodowla bez kom rek karmicielekreprogramowanie wirusem Sendaipasa owanie grudekmarkery pluripotencjicytometria przep ywowaimmunocytochemiar nicowanie w kierunku trzech listk w zarodkowych
Wytwarzanie i utrzymywanie indukowanych przez naczelnych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z moczu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.