Method Article

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

DOI:

10.3791/64923

⸱

February 17th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Center for Human Technology, Italian Institute of Technology (IIT), 2Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology (IEO), 3Department of Biology and Biotechnologies ‘Charles Darwin’, Sapienza University of Rome

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje białko-RNA regulują ekspresję genów i funkcje komórkowe na poziomie transkrypcyjnym i potranskrypcyjnym. Z tego powodu identyfikacja partnerów wiążących interesujące nas RNA pozostaje bardzo ważna dla odkrycia mechanizmów stojących za wieloma procesami komórkowymi. Jednak cząsteczki RNA mogą wchodzić przejściowo i dynamicznie w interakcje z niektórymi białkami wiążącymi RNA (RBP), zwłaszcza z białkami niekanonicznymi. W związku z tym bardzo potrzebne są ulepszone metody izolowania i identyfikowania takich RBP.

Aby skutecznie i ilościowo zidentyfikować białkowych partnerów znanej sekwencji RNA, opracowaliśmy metodę opartą na ściąganiu i charakterystyce wszystkich oddziałujących białek, zaczynając od całkowitego ekstraktu białkowego z komórki. Zoptymalizowaliśmy ściąganie białka za pomocą biotynylowanego RNA wstępnie załadowanego na kulki pokryte streptawidyną. Jako dowód słuszności koncepcji zastosowaliśmy krótką sekwencję RNA, o której wiadomo, że wiąże białko TDP-43 związane z neurodegeneracją i negatywną kontrolę o innym składzie nukleotydów, ale tej samej długości. Po zablokowaniu kulek drożdżowym tRNA, załadowaliśmy biotynylowane sekwencje RNA na kulki streptawidyny i inkubowaliśmy je z całkowitym ekstraktem białkowym z komórek HEK 293T. Po inkubacji i kilku etapach mycia w celu usunięcia niespecyficznych spoiw, eluowaliśmy oddziałujące białka roztworem o wysokiej zawartości soli, kompatybilnym z najczęściej stosowanymi odczynnikami do oznaczania ilościowego białek oraz z przygotowaniem próbki do spektrometrii mas. Określiliśmy ilościowo wzbogacenie TDP-43 w pull-down wykonanym ze znanym spoiwem RNA w porównaniu z kontrolą ujemną za pomocą spektrometrii mas. Użyliśmy tej samej techniki do zweryfikowania selektywnych oddziaływań innych białek, które obliczeniowo przewidywano jako unikalne spoiwa naszego RNA będącego przedmiotem zainteresowania lub naszej kontroli. Na koniec zwalidowaliśmy protokół za pomocą western blot poprzez wykrycie TDP-43 za pomocą odpowiedniego przeciwciała.

Ten protokół pozwoli na badanie białkowych partnerów interesującego RNA w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, pomagając odkryć unikalne i nieprzewidywalne interakcje białko-RNA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka wiążące RNA (RBP) okazały się kluczowymi graczami w transkrypcyjnej i potranskrypcyjnej regulacji genów, ponieważ biorą udział w procesach takich jak splicing mRNA, lokalizacja komórkowa RNA, translacja, modyfikacja i degradacja1,2,3. Takie interakcje między dwiema makrocząsteczkami są wysoce skoordynowane, precyzyjnie zrównoważone i niezbędne do tworzenia węzłów funkcjonalnych i przetwórczych. Różnice lub rozregulowania w obrębie tych węzłów mogą potencjalnie zakłócić precyzyjnie regulowane sieci białko-RNA i są coraz częściej związane z różnymi chorobami ludzkimi, w tym rakiem4,5 i zaburzeniami neurodegeneracyjnymi6,7,8. Interakcje między cząsteczkami RNA a ich partnerami wiążącymi białka mogą być albo stabilne i łatwe do walidacji eksperymentalnej, albo wysoce dynamiczne, przejściowe i trudniejsze do scharakteryzowania.

W ostatnich latach podjęto intensywne wysiłki w celu zrozumienia tych interakcji. Wśród najbardziej uznanych metod, testy ściągania białek (PD) są prawdopodobnie najbardziej cenionymi i powszechnie stosowanymi podejściami do rozwikłania głównych graczy tworzących kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP) i inne sieci interakcji białko-RNA3,9,10. PD obejmują szeroki wachlarz technik informacyjnych, takich jak immunoprecypitacja RNA (RIP)11,12 lub białka (CLIP)13,14 interesującego go. Niektóre z tych protokołów RNA-PD wykorzystują znane RNA jako przynętę dla białek15, najczęściej wykorzystując znaczniki o wysokim powinowactwie, takie jak biotyna. W tym przypadku partnerzy interakcji biotynylowanego RNA mogą być wykryci poprzez zakotwiczenie RNA na kulkach pokrytych streptawidyną, co umożliwia skuteczną izolację RNP. Głównymi ograniczeniami tych podejść jest zwykle konstrukcja biotynylowanych sond i testowanie ich zdolności do wiązania białek docelowych. W tym celu przydatne może być oparcie się na opublikowanych danych CLIP interesującego białka, jeśli są dostępne, ponieważ ujawniają one z dużą precyzją krótkie regiony RNA, które odpowiadają pikom interakcji z docelowym białkiem13,16. Te same regiony mogą być wykorzystane do opracowania sond dla PD. Alternatywną metodą projektowania takich przynęt RNA może być systematyczna ewolucja ligandów przez wykładnicze wzbogacanie (SELEX)17, które umożliwiają projektowanie aptamerów poprzez selekcję in vitro, zaczynając od obszernej randomizowanej biblioteki i poprzez serię cykli optymalizacyjnych sterowanych PCR. Jednak SELEX jest złożony i czasochłonny, a końcowe wyniki w dużym stopniu zależą od początkowej biblioteki. Aby wybrać przynętę RNA do użycia w przedstawionym tutaj protokole, zastosowano jeszcze inne podejście, polegające na użyciu przynęty RNA zaprojektowanej de novo za pomocą mocy obliczeniowej algorytmu catRAPID, który przewiduje preferencyjne wiązanie danego białka w stosunku do określonych sekwencji RNA18,19,20.

Przedstawiony tutaj protokół jest wersją RNA-PD zoptymalizowaną do elucji określonych partnerów białkowych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, bez użycia detergentów, środków denaturujących lub wysokich temperatur. Opiera się na nano-superparamagnetycznych kulkach kowalencyjnie pokrytych wysoce oczyszczoną streptawidyną i zastosowaniu specyficznego biotynylowanego RNA zaprojektowanego in silico jako przynęty. Protokół ten zapewnia szybką i wydajną metodę izolowania partnerów wiążących biotynylowane cząsteczki RNA w warunkach natywnych, oferując potencjał dla szerokiego zakresu dalszych zastosowań. Do przetestowania tego protokołu użyto 10-nukleotydowej jednoniciowej sekwencji aptamerowej RNA, wcześniej zaprojektowanej do wiązania białka TAR DNA wiążącego białko 43 (TDP-43) z wysokim powinowactwem i swoistością20. Począwszy od lizatów komórkowych HEK 293T, interakcje biotynylowanego aptameru RNA zidentyfikowano za pomocą analizy spektrometrii mas wykonanej na próbkach odłączonych od przynęty RNA przy użyciu buforu hipertonicznego. Analiza ta potwierdziła pomyślną identyfikację i kwantyfikację TDP-43 jako preferowanego spoiwa.

Ten protokół umożliwia udaną identyfikację interaktorów białkowych przy użyciu tylko krótkiego, zsyntetyzowanego in vitro oligonukleotydu RNA. Co więcej, zastosowanie zaprojektowanych in silico aptamerów RNA jako sond PD21,22 gwarantuje specyficzność dla celów przy znacznie obniżonych kosztach.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ogólne metody i materiał

  1. Przygotować odpowiednią pożywkę dla wybranej hodowli komórek ssaków i przed użyciem podgrzać ją w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
  2. Przygotuj wymagany materiał z wyprzedzeniem, zgodnie z opisem w Tabeli materiałów. Autoklaw wyrobów szklanych, wyrobów z tworzyw sztucznych i zapasów buforowych.
  3. Przygotować zgodnie z opisem w tabeli 1. Dostosuj pH roztworów podstawowych za pomocą stężonego HCl lub NaOH przed rozcieńczeniem składników do ich końcowych objętości.

2. Przygotowanie linii komórkowej ssaków

  1. Hoduj komórki HEK 293T w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 μg/ml roztworu penicyliny/streptomycyny. Inkubować je w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze wyposażonym w 5% CO2 . Rutynowo dziel komórki.
  2. Przed odłączeniem przepłucz komórki roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) w takiej ilości, aby pokryć powierzchnię uprawy.
  3. Usuń PBS i dodaj ultracienką warstwę roztworu trypsyny-EDTA.
  4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze wyposażonym w 5% CO2 przez 5 minut lub do momentu odłączenia komórek (pod mikroskopem powinny wyglądać na rozproszone).
  5. Rozcieńczyć roztwór trypsyny-EDTA dziesięciokrotnie, dodając cały DMEM, aby go dezaktywować i policzyć komórki.
  6. Płytka 1,5 x 105 komórek/ml na płytkach 6-dołkowych, biorąc pod uwagę dwie studzienki / stan do przetestowania.
  7. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2,
    UWAGA: Zapoznaj się z instrukcjami producenta, aby dowiedzieć się, jaki rodzaj pożywki i suplementu jest odpowiedni dla linii komórkowej. Również ilość i czas inkubacji trypsyny-EDTA zależą od linii komórkowej. Niektóre typy komórek rosną szybciej/wolniej niż to, co zostało zgłoszone w tym protokole; Dlatego należy wcześniej przetestować stężenie siewu.

3. Całkowite zbiory białka

  1. Usuń pożywkę z dołków, w których rosną komórki.
  2. Umyj każdą studzienkę z płytek 6-dołkowych 1 ml PBS.
  3. Wyrzuć PBS.
  4. Przesunąć płytki na lodzie i albo przejść do kroku 3.5, albo zamrozić suche płytki w temperaturze -80 °C, aby ułatwić lizę.
  5. Dodać 200 μl buforu do lizy do każdej studzienki.
  6. Użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć i rozbić komórki.
  7. Przenieś ekstrakt komórkowy pochodzący z dwóch studzienek do tej samej probówki o pojemności 1,5 ml.
  8. Umieść probówkę z ekstraktem białkowym na lodzie na 30 minut.
  9. Odwirować lizaty komórkowe przy 17 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Przenieść każdy supernatant do wstępnie schłodzonej probówki.
    UWAGA: Zaleca się łącznie 106-10 7 komórek dla każdego stanu PD. Liza komórek i zbieranie białka powinny być przeprowadzane za pomocą lodowatych. Inhibitory proteazy należy dodać do buforu do lizy, aby zapobiec degradacji białek.

4. Oznaczanie stężenia białka

  1. Przygotować odczynnik Bradford, zgodnie ze wskazaniami producenta, rozcieńczając go pięciokrotnie wdH2O.
  2. Rozprowadzić 1 ml odczynnika w kuwecie o średnicy 1 cm, dodać 1 μl próbki i wymieszać przez odwrócenie.
  3. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut.
  4. Odczytać absorbancję przy 595 nm.
  5. Obliczyć objętość ekstraktu białkowego odpowiadającą 1,5 mg białek i doprowadzić wszystkie próbki do końcowej objętości 600 μl za pomocą buforu do lizy.
  6. Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.
    UWAGA: Można zastosować dowolną inną metodę oznaczania stężenia białka, zgodnie z zaleceniami dotyczącymi kompatybilności buforu. W każdym przypadku bufor do lizy powinien być używany jako ślepa próba. Wiele odczynników nie jest kompatybilnych z ditiotreitolem (DTT). Zaleca się dodawanie DTT lub innych środków redukujących dopiero po ilościowym określeniu białka (DTT do końcowego stężenia 1 mM).

5. Przygotowanie koralików

  1. Wymieszaj kulki w buforze do przechowywania, przesuwając rurkę.
  2. Obliczyć 100 μl pożywki/próbki zawiesiny i umieścić objętość w stojaku magnetycznym.
  3. Pranie koralików
    1. Usuń roztwór do przechowywania i umyj kulki, dodając 1 ml buforu/probówki do lizy i odwróć ją ręcznie.
    2. Wyjmij bufor za pomocą stojaka magnetycznego.
    3. Powtórz krok prania.
    4. Dodać objętość buforu do lizy równą początkowej objętości pożywki szlamowej, wymieszać, przesuwając probówkę i równomiernie dozować pożywkę do tylu probówek o pojemności 1,5 ml, ile jest próbek.
  4. Blokowanie ściegów
    1. Usunąć bufor za pomocą stojaka magnetycznego i dodać 600 μl 0,25 mg/ml roztworu tRNA drożdży przygotowanego w buforze do lizy.
    2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na obracającym się kole.
    3. Usuń roztwór tRNA za pomocą stojaka magnetycznego.
    4. Dodać 600 μl buforu do lizy i przemyć, mieszając ręcznie.
    5. Powtórz etap mycia i wyrzuć bufor.

6. Ładowanie koralików

  1. Przygotować 200 μg oligonukleotydu RNA w 600 μl buforu do lizy dla każdej probówki zawierającej początkowe 100 μl pożywki zawiesinowej (teraz zablokowane kulki).
  2. Dodaj oligo do koralików i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, obracając się.
  3. Usuń roztwór, dodaj 600 μl buforu do lizy i umyj kulki dwukrotnie, obracając probówki przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Odrzuć buffer.
    UWAGA: Nigdy nie wiruj koralików, ale zamiast tego przesuwaj. O ile nie jest to konieczne, należy ograniczyć liczbę etapów pipetowania. Jeśli to możliwe, używaj pociętych końcówek o pojemności 1 ml. Ilość zawiesiny perełek/próbki zależy od zdolności wiązania kulek i wyjściowej ilości wszystkich białek. Jeśli przewiduje się, że oligonugo RNA ma znaczną ilość struktury drugorzędowej, zalecamy najpierw denaturację go w temperaturze 80 °C przez 10 minut, a następnie powolne schładzanie w temperaturze pokojowej lub ponowne składanie przez inkubację w temperaturze 30 °C przez 1 godzinę. Sugeruje się odzyskanie oligonugo RNA po załadowaniu kulkami i określenie pozostałego stężenia, w celu optymalizacji ilości wymaganej do obciążenia i oceny możliwości ponownego wykorzystania RNA.

7. Wiązanie białek na koralikach

UWAGA: Od teraz, jeśli to możliwe, wykonuj kroki w temperaturze 4 °C.

  1. Weź 5% objętość z 600 μl roztworu białkowego i zachowaj go jako INPUT (IN) do dalszej analizy (1,5 mg białek rozpuszcza się w 600 μL, więc 5% odpowiada 30 μL i 75 μg białek).
  2. Dodaj pozostałą mieszankę białkową do każdej tubki załadowanych kulek i pozostaw na noc do powolnego obracania w temperaturze 4 °C.

8. Mycie spoiw niespecyficznych

  1. Usuń niezwiązaną frakcję za pomocą stojaka magnetycznego. Zaoszczędź 5% objętości i oznacz ją jako FLOWTHROUGH (FT) (niezwiązana objętość wynosi ok. 600 μL, więc ponownie zachowaj 30 μL do dalszej analizy).
  2. Dodać 1 ml buforu myjącego 1 do kulek i pozostawić na 5 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Odrzuć bufor.
  4. Powtórz kroki 8.2 i 8.3.
  5. Dodać 1 ml buforu myjącego 2 do kulek i pozostawić na 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Odrzucić supernatant.

9. Elucja specyficznych spoiw

  1. Dodać 100 μl buforu elucyjnego 1 lub buforu elucyjnego 2 do kulek.
  2. Wymieszać ręcznie, trzepiąc i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umieścić probówki w termomikserze i energicznie wstrząsać przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
  4. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i zbierz eluowaną frakcję do czystej probówki.
  5. Szybko odkręć kulki za pomocą wirówki stołowej, aby zmaksymalizować odzysk eluatu.
  6. Zaoszczędź 5% całkowitej objętości ELUATU (EL) do dalszych analiz (całkowita objętość wynosi 100 μL, więc oddziel 5 μL do innej probówki).
  7. W razie potrzeby stężenie białka można oznaczyć jak w sekcji 4, stosując bufor elucyjny jako ślepą próbę.
    UWAGA: Zaleca się powstrzymanie się od dodawania DTT do buforu elucyjnego do czasu określenia stężenia białka. Jeśli oznaczanie ilościowe białka nie jest wymagane lub jeśli dostępne są zestawy do oznaczania ilościowego białek kompatybilne z czynnikiem redukującym, do buforu elucyjnego można dodać 1 mM DTT od samego początku. W tym protokole badano zarówno bufor elucyjny 1 (zawierający 1 M NaCl), jak i bufor elucyjny 2 (zawierający 2 M NaCl). Nie zaobserwowano różnicy w wydajności elucji białka docelowego przy zwiększonej sile jonowej, ale zaleca się przetestowanie obu warunków przed ustaleniem najodpowiedniejszego buforu. Jeżeli wysoka zawartość soli w buforze elucyjnym stanowi ograniczenie dla dalszej analizy, bardzo mała ilość detergentów w buforze elucyjnym pozwala na wymianę buforową. Alternatywnie eluat można rozcieńczyć, aby osiągnąć pożądane stężenie soli.

10. Identyfikacja spoiw białkowych za pomocą spektrometrii mas

  1. Wytrącanie acetonu
    1. Zagęścić eluowane białka, rozcieńczając je czterokrotnie w zimnym (-20 °C) acetonie.
    2. Przeprowadzić wir i inkubować probówkę w temperaturze -20 °C przez noc.
    3. Wirować z prędkością 17 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Delikatnie usunąć sklarowany osad i pozostawić aceton do odparowania, aż do całkowitego wyschnięcia osadu.
  2. Trawienie białek w roztworze
    1. Rozpuścić osad białkowy, dodając 50 μl buforu denaturacyjnego.
    2. Dodać DTT do końcowego stężenia 5 mM, umożliwiając redukcję białka przez 30 minut w temperaturze 55 °C.
    3. Schłodzić próbki w temperaturze pokojowej i przeprowadzić reakcję alkilacji białek, dodając jodoacetamid (IAA) w stężeniu 10 mM przez 15 minut.
    4. Roztrawić białka przy użyciu odpowiedniego enzymu (trypsyna, LysC) i inkubować próbki przez noc w temperaturze 37 °C.
    5. Zatrzymaj trawienie, dodając 1 μl 10% kwasu trifluorooctowego (TFA).
    6. Oczyść i skoncentruj peptydy na niestandardowej mikrokolumnie C18 z odwróconą fazą, jak opisano wcześniej19.
    7. Peptydy elute z końcówki C18 za pomocą buforu B.
    8. Usunąć składnik organiczny za pomocą wirówki próżniowej i ponownie zawiesić peptydy w 5 μl 0,1% kwasu mrówkowego do dalszej analizy.
      UWAGA: Alternatywnie, trawienie białek można przeprowadzić "na kulkach" natychmiast po umyciu niespecyficznych spoiw (kroki 8.1-8.6), co przyspiesza działanie protokołu. Zaleca się jednak przetestowanie skuteczności enzymu działającego "na kulkach" unieruchomionych białek w porównaniu ze standardowym trawieniem w roztworze, w celu zagwarantowania optymalnego pokrycia eksperymentalnych sekwencji białek.
  3. Chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas w tandemie (LC-MS/MS)
    1. Podłączyć kolumnę analityczną (faza stacjonarna C18) i utrzymywać ją w temperaturze 45 °C podczas pracy.
    2. Podłączyć kolumnę do wylotu sześcioportowego zaworu obrotowego pompy LC za pomocą kapilarnego złącza doszczelnego (20 μm x 550 mm) w konfiguracji jednokolumnowej.
    3. Dostosuj ustawienia LC w następujący sposób:
      1. Załadować peptydy pod kontrolowanym ciśnieniem (980 barów) do buforu A.
      2. Zastosuj gradient buforu B 5%-20% przy 300 nL/min przez 59 minut, a następnie gradient bufora B 20%-30% w ciągu 15 minut i gradient bufora B 30%-65% przez 5 minut.
      3. Dodać etap płukania, zwiększając stężenie buforu B do 95% w ciągu 5 minut oraz 5-minutowy etap izokratyczny przy 95% buforze B.
    4. Używaj spektrometru mas w trybie akwizycji zależnej od danych (DDA), aby automatycznie przełączać się między zdarzeniami MS i MSMS.
    5. Zdefiniuj liczbę pętli równą 15 przy użyciu wartości docelowej automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) wynoszącej 3 x 106 i 1 x 105 odpowiednio dla zdarzeń MS i MSMS.
    6. Ustaw maksymalny dozwolony czas akumulacji jonów na 20 ms dla MS o rozdzielczości 60 K i 100 ms dla MSMS o rozdzielczości 15 K.
    7. Przeprowadzić eksperyment fragmentacji o wysokiej dysocjacji zderzeń (HCD) przy użyciu znormalizowanej energii zderzenia wynoszącej 28% z dynamicznym czasem wykluczenia wynoszącym 20 s.
    8. Obsługuj parametry źródła w następujący sposób:
      Napięcie natrysku: 1,7 kV
      Napięcie kapilary: 275 °C
      Nie stosuje się ani osłony, ani gazu pomocniczego
      UWAGA: W tym protokole analiza spektrometrii mas (MS) ultra-wysokosprawnej chromatografii cieczowej (UHPLC) została specjalnie przeprowadzona przy użyciu konfiguracji LC z pojedynczą kolumną, sprzężoną z hybrydowym potrójnym kwadrupolowym instrumentem orbitrapowym (Tabela materiałów). Można stosować inne systemy LCMS, ale zalecana jest adaptacja parametrów.
  4. analiza danych
    1. Użyj przycisku Załaduj, aby zaimportować pliki RAW.
    2. Zdefiniuj nazwy eksperymentów, klikając przycisk Ustaw eksperyment
      3. .
    3. Wprowadź sekcję parametrów specyficznych dla grupy, aby określić wszystkie parametry związane z identyfikacją:
      Enzym używany do trawienia: Trypsyna / P
      Brakujące dekolty: do trzech
      Poprawiono modyfikację: Carbamidomethylation
      Zmienna modyfikacja: N-acetyl (białko), utlenianie (M)
    4. Przekaż zaktualizowany plik FASTA, dostępny w publicznych bazach danych, takich jak UniprotKB.
    5. Określ poprawne reguły analizy zgodnie ze źródłem wybranej bazy danych.
    6. Zdefiniuj wartość współczynnika fałszywych odkryć (FDR) = 1 zarówno dla białek, jak i peptydów.
    7. Dodaj opcję kwantyfikacji bez etykiety (LFQ) na karcie Kwantyfikacja bez etykiety.
    8. Utrzymuj minimalny współczynnik LFQ na poziomie dwóch.
      UWAGA: W tym miejscu opisujemy analizę danych za pomocą MaxQuant24 i Perseus software25 w celu przeprowadzenia kwantyfikacji białek i późniejszej analizy statystycznej. Analizę danych można jednak przeprowadzić za pomocą dowolnej innej dostępnej na rynku lub bezpłatnej metody bioinformatycznej. FDR jest szacowany przy użyciu podejścia opartego na bazie danych typu target-decoy26. Wskaźnik FDR peptydów i białek równy 0,01 oznacza, że oczekuje się, że zidentyfikowane peptydy i białka będą zawierać 1% wyników fałszywie dodatnich.
  5. analiza statystyczna
    1. Załaduj plik proteingroups.txt, aby przeprowadzić analizę statystyczną na poziomie białka.
    2. Zdefiniuj wartości LFQ jako kolumny główne.
    3. Usuń "odwrócenie" i "zanieczyszczenia", filtrując wiersze na podstawie kolumny kategorii.
    4. Użyj wierszy adnotacji kategorii, aby pogrupować różne warunki eksperymentalne.
    5. Zmniejsz macierz danych, wybierając liczbę prawidłowych wartości w każdej z wcześniej zdefiniowanych grup.
    6. Wybierz test statystyczny, który lepiej odpowiada warunkom eksperymentalnym (tj. test t, test dla wielu prób ANOVA).
    7. Określ punkt odcięcia dla istotnych wskazówek za pomocą obliczeń opartych na FDR. Zazwyczaj zarówno 0,01, jak i 0,05 są akceptowane jako progi dla skorygowanej wartości p.
    8. Wizualizacja wyników analiz różnicowych w oparciu o statystyki testu t przy użyciu reprezentacji wykresu wulkanu.
    9. Wyeksportuj końcową macierz w formacie .txt w celu dalszej edycji tabeli wyników końcowych.
      UWAGA: Folder konfiguracyjny zawiera plik FASTA z białkami, takimi jak keratyny, które są uważane za powszechne zanieczyszczenia w globalnych eksperymentach proteomicznych, które są oznaczone znakiem + w tabeli wyjściowej. W niniejszym badaniu, przy dwóch warunkach próby, do analizy statystycznej stosuje się test t.

11. Walidacja wyników przez western blot

  1. Przygotowanie próbki
    1. Dodać odpowiednią objętość 4x bufora ładującego próbkę do każdej podwielokrotności IN, FT i EL.
    2. Gotować próbki przez 5 minut w temperaturze 95°C.
    3. Szybkie wirowanie w celu odzyskania odparowanej próbki z górnej części probówek.
  2. SDS-PAGE i transfer żelu
    1. Załaduj próbki na 4%-12% denaturujący żel poliakrylamidowy.
    2. Uruchom żel z buforem działającym MES SDS przez 1,5 godziny przy napięciu 120 V.
    3. Przenieś żel na membranę nitrocelulozową za pomocą półsuchej kasety transferowej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Zalecamy 10-minutowy transfer przy napięciu 15 V.
  3. Detekcja immunologiczna
    1. Zablokuj błonę 10% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając.
    2. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe przygotowane w 5% BSA do TBST, zgodnie z instrukcjami producenta. Pozostawić na noc w temperaturze 4 °C lub na 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem.
    3. Umyj membranę trzykrotnie TBST, za każdym razem przez 5 minut.
    4. Dodać przeciwciało drugorzędowe przygotowane w TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod wpływem mieszania.
    5. Umyj membranę trzykrotnie TBST, za każdym razem przez 5 minut.
    6. Wizualizacja wyników za pomocą blot imager.
      UWAGA: Do wykrywania TDP-43, znanego spoiwa naszego RNA, użyto rekombinowanego króliczego przeciwciała monoklonalnego i pozostawiono z błoną na noc w temperaturze 4 °C. Jako przeciwciało drugorzędowe zastosowano peroksydazę chrzanową IgG (HRP) przeciwko królikowi, ale działało również przeciwciało fluorescencyjne drugorzędowe. Aby uwidocznić przeciwciała na błonie, błonę inkubowano z substratem Clarity Western ECL przez 1 minutę, a następnie obrazowano za pomocą systemu obrazowania ChemiDoc.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zweryfikować poprawność proponowanego protokołu, przedstawione tutaj eksperymenty PD zostały przeprowadzone za pomocą biotynylowanego aptameru RNA zaprojektowanego in silico w celu specyficznego wiązania TDP-4320. Ten RNA wiąże swoje białko docelowe z wysokim powinowactwem wiązania (Kd = 90 nM)20. Tutaj ten RNA, o sekwencji 5'-CGGUGUUGCU-3', jest określany nazwą "+RNA". Jako kontrolę ujemną zastosowano odwrotną komplementarną sekwencję +RNA, która jest tutaj nazywana "-RNA". Jego sekwencja to 5'-AGCAACACCG-3'. -RNA wykazuje znacznie mniejsze powinowactwo wiązania do TDP-43 (Kd = 1,5 μM)19. Na potrzeby opisanego tutaj protokołu te oligonukleotydy RNA zostały zakupione sprzężone z cząsteczką biotyny, aby umożliwić wiązanie się z kulkami streptawidyny. +RNA zakupiono z biotyną-TEG na końcu 3', który zawiera 15-atomowy dystans glikolu trietylenowego między biotyną a grupą fosforanową kwasu nukleinowego; -RNA zamiast tego miało biotynę na końcu 5', sprzężoną z kwasem nukleinowym za pośrednictwem łącznika amino-C6. Jeśli jednak konstrukcja przynęty RNA jest solidna i tak długo, jak nie ma strukturalnej lub chemicznej interferencji między łącznikiem a RNA, można zastosować inne pozycje koniugacji biotyny i inne długości łącznika.

Znajomość tożsamości głównego białka, które miało zostać znalezione związane z sondą +RNA po PD, umożliwiło walidację protokołu poprzez identyfikację TDP-43 w eluacie, przy użyciu zarówno spektrometrii mas (MS), jak i western blot (WB) (Rysunek 1).

Analiza MS została przeprowadzona na czterech powtórzeniach PD wykonanych przy użyciu +RNA lub -RNA (Rysunek 2). Identyfikacja interaktomów +RNA i -RNA wykracza poza zakres tego protokołu, jednak podawane są pewne wyniki, które potwierdzają dokładność protokołu. Warto zauważyć, że wykreślenie znacznie wzbogaconych białek na wykresie wulkanu ujawniło, że całkowita zawartość białka i wzbogacone białka wyluzowane z +RNA były znacznie wyższe niż te, które zostały odzyskane z -RNA (Rysunek 2). Oznacza to, że pomimo tej samej długości i zawartości strukturalnej (liniowej), +RNA może ustanowić większą liczbę specyficznych oddziaływań, które są zatrzymywane aż do etapu elucji przy wysokiej zawartości soli. Jest prawdopodobne, że -RNA zamiast tego ustanawia większą liczbę niespecyficznych kontaktów, które są zakłócane podczas etapów prania. Zgodnie z oczekiwaniami, TDP-43 został zidentyfikowany jako unikalny interaktor klasy +RNA20; średnia kwantyfikacja bez znacznika (LFQ) dla czterech powtórzeń PD wykonanych z +RNA wynosi 31,96 ± 0,56, podczas gdy białko nie jest identyfikowane wśród interaktorów -RNA. Ponadto, spośród wszystkich unikalnych interaktorów +RNA, stwierdzono, że TDP-43 jest najobficiej wzbogaconym białkiem.

Aby dokładniej zweryfikować protokół, wewnętrzny algorytm catRAPID18,19 został wykorzystany do obliczeniowego przewidywania, które inne białka specyficznie zwiążą się z +RNA lub -RNA. W szczególności wyniki interakcji dla +RNA i -RNA z białkami tworzącymi ludzki proteom zostały obliczone przy użyciu funkcji "skłonności do interakcji" catRAPID, zgodnie z definicją w naszej poprzedniej pracy27. Wśród białek ocenianych z dużą pewnością przewidywano, że HNRNPH3 wiążą się selektywnie +RNA (+wynik interakcji RNA = 1,01; wynik interakcji -RNA = 0,21), a PCBP2 oddziałuje specyficznie z -RNA (+wynik interakcji RNA = -0,5; -wynik interakcji RNA = 0,31) (Figura 3A). Ponadto przewidywano, że białko RBM41 będzie promiskuityczne dla obu oligonukleotydów RNA (+wynik interakcji RNA = 0,4; -wynik interakcji RNA = 0,39) (Figura 3A). Analiza MS rzeczywiście potwierdziła obecność HNRNPH3 i PCBP2 w PD odpowiednio +RNA i -RNA, podczas gdy stwierdzono, że RBM41 oddziałuje z oboma (Figura 3B).

WB został użyty do wykrycia obecności TDP-43 w celu dalszego potwierdzenia wyników oraz podczas optymalizacji protokołu (Rysunek 4). W opisanej tutaj procedurze pobrano różne próbki na różnych etapach. Próbka wejściowa (IN) składała się z całkowitej ilości białek rozcieńczonych w buforze do lizy. Przepływ (FT) uzyskano po całonocnej inkubacji całkowitych białek z kulkami streptawidyny wstępnie pokrytymi biotynylowanym RNA, reprezentującym frakcję białek, które nie wiązały RNA. Wreszcie, eluat (EL) zawierał wszystkie białka, które rozpoznawały w szczególności badany RNA, ponieważ między etapami FT i EL trzy etapy płukania solą 150 mM i 0,1% trytonem-X powinny były usunąć najsłabsze interakcje.

Dla każdej replikacji, ta sama ilość (5% v/v) IN, FT i EL została uruchomiona równolegle na SDS-PAGE i wybarwiona przeciwciałem anty-TDP-43 (Rysunek 4). W przypadku +RNA prążek TDP-43 zaobserwowano w IN i EL, co wskazuje, że białko obecne od początku w całkowitym ekstrakcie białkowym jest zatrzymywane przez +RNA podczas etapów płukania i jest eluowane dopiero na końcu buforem o wysokiej zawartości soli. TDP-43 był również obecny w IN dla -RNA, jednak prążek odpowiadający białku jest również widoczny w FT, co wskazuje, że ten RNA nie wiąże TDP-43. Brak pasma TDP-43 w EL potwierdza ten wynik.

Podczas optymalizacji protokołu, elucja białek specyficznie związanych z sekwencjami RNA była badana zarówno za pomocą buforu elucyjnego zawierającego 1 M NaCl (EB1), jak i buforu elucyjnego z 2 M NaCl (EB2) (Rysunek 4). Eluaty uzyskane za pomocą któregokolwiek z EB porównano na SDS-PAGE i osuszono przeciwciałem anty-TDP-43. Uzyskane obrazy zostały następnie przeanalizowane za pomocą ImageJ28 w celu ilościowego określenia wszelkich różnic w ilości TDP-43 eluowanej za pomocą dwóch. Ogólnie rzecz biorąc, nie zaobserwowano żadnej znaczącej różnicy i doszliśmy do wniosku, że w tych testach sól 1 M wystarczy, aby zakłócić nawet najsilniejsze interakcje białko-RNA.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki przedstawione tutaj dla MS i WBs pokazują, że ten protokół jest skuteczny w wychwytywaniu interaktorów białkowych danego RNA w specyficzny sposób i że umożliwia elucję w zgodnych z dalszą analizą.

figure-results-1
Rysunek 1: Szkic eksperymentalnego rurociągu użytego w proponowanym protokole. (A) Biotynylowany oligonukleotyd RNA jest przygotowywany w buforze do lizy w odpowiednim stężeniu. (B) Magnetyczne kulki streptawidyny są myte, blokowane drożdżowym tRNA i ładowane biotynylowanym RNA. (C) Do mieszaniny kulek i RNA dodaje się całkowity ekstrakt białkowy pochodzący z hodowlanych linii komórkowych ssaków. (D) Przeprowadza się wielokrotne mycie w celu usunięcia niespecyficznych interakcji. (E) Specyficzne interaktory białkowe są odłączane od RNA za pomocą roztworu hipertonicznego. (F) Tożsamość interaktorów jest ujawniana za pomocą spektrometrii mas, a konkretne przypadki są weryfikowane za pomocą western blot. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analityczna strategia bezznacznikowej kwantyfikacji białek na podstawie MS. (A) Wypłukane białka są wytrącane w zimnym acetonie przez noc. Białka są następnie denaturowane i przeprowadza się trawienie w roztworze. Peptydy proteolityczne są zagęszczane i odsalane. (B) Peptydy są analizowane za pomocą LC-MS/MS przy użyciu "podejścia typu shotgun". (C) Przetwarzanie i analiza surowych danych odbywa się odpowiednio przy użyciu oprogramowania MaxQuant i Perseus. (D) Statystycznie istotne wzbogacone białka są wyświetlane na wykresie wulkanu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Korelacja między przewidywanymi skłonnościami do interakcji a eksperymentalnie ustalonymi interakcjami +RNA i -RNA. (A) wyniki interakcji catRAPID w odniesieniu do HNRNPH3, PCBP2 i RBM41, wskazujące na preferencyjne wiązanie HNRNPH3 dla +RNA i PCBP2 dla -RNA, podczas gdy przewiduje się, że RBM41 bezkrytycznie wiąże obie sekwencje RNA. (B) Średnie z kwantyfikacji bez znaczników określone za pomocą analizy spektrometrii mas z pull-downów przeprowadzonych z +RNA i -RNA. Analiza potwierdza, że HNRNPH3 wiąże wyłącznie +RNA, PCBP2 wiąże wyłącznie -RNA, a RBM41 wiąże oba w równym stopniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Western blot walidacja obecności/braku TDP-43 wśród interaktorów wybranych sekwencji RNA. Błona WB została potraktowana przeciwciałem anty-TDP-43. IN = wejście; FT = przepływowy; EL (EB1) = elucja z buforem elucyjnym 1; EL (EB2) = elucja z buforem elucyjnym 2; znak "+" oznacza próbki pochodzące z pull-down przeprowadzonego za pomocą +RNA; znak "-" oznacza próbki pochodzące z pull-down przeprowadzonego za pomocą -RNA; Tor 1 zawiera drabinkę białkową. TDP-43 jest oznaczony strzałką. WB wskazuje, że TDP-43 znajduje się wśród interaktorów +RNA, ale nie wśród interaktorów -RNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Nazwa buforaKompozycja
10x Bufor Transferowy250 mM tris, 1,92 M glicyny, 1% SDS, 20% metanolu. Rozcieńczyć 10 razy przed użyciemPD
20X MES SDS uruchomiony bufor1 M MES, 1 M tris, 2% SDS , 20 mM EDTA. Dostosuj pH do 7,3. Rozcieńczyć 20 razy przed użyciem
4x Bufor ładowania próbki0,25 M zasada Tris, 0,28 M SDS, 40% glicerol, 20% 2-merkaptoetanol, 4 mg/ml błękit bromfenolowy
Bufor elucji 120 mM fosforan pH 7,5, 1 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT (do dodania po kwantyfikacji)
Bufor elucji 220 mM fosforan pH 7,5, 2 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT (do dodania po kwantyfikacji)
Bufor do lizy10 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT i inhibitory proteazy
Sól fizjologiczna buforowana trisem z Tween-201 M Tris-HCl pH 7,4, 3 M NaCl, 2,0% Tween-20
Bufor mycia 110 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton TM X-100, 1 mM DTT i inhibitory proteazy
Bufor mycia 2 25 mM Hepes pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT i inhibitory proteazy
Bufor A 0,1% kwas mrówkowy MS
Bufor B 60% acetonitryl, 0,1% kwas mrówkowy
Bufor denaturacji 8M mocznik, 50 mM Tris-HCl

Tabela 1: PD i MS. Nazwy i skład stosowanych w doświadczeniach typu pull-down (PD) lub w analizie metodą spektrometrii mas (MS).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta przedstawia optymalizację protokołu PD przeprowadzonego z biotynylowanymi oligonukleotydami RNA w celu wychwycenia ich interaktorów białkowych. Opisany tutaj protokół jest prosty do wykonania, wymaga niewielkiej ilości materiału i daje wysoce wiarygodne wyniki. Co ważne, najbardziej nowatorskie aspekty tego protokołu polegają na użyciu przynęty RNA zaprojektowanej w pełni in silico i specyficznej dla docelowego białka oraz elucji wszystkich białek związanych z przynętą RNA poprzez bezpośrednie zakłócenie ich interakcji z roztworem o wysokiej zawartości soli, a nie poprzez dysocjację streptawidyny od biotyny za pomocą detergentu i obróbki w wysokiej temperaturze.

Protokół ten wykorzystuje siłę wiązania między biotyną a streptawidyną29,30. Zgodnie z wybranymi kulkami streptawidyny, obciążenie biotynylowanym RNA musi zostać przetestowane i określone ilościowo przed kontynuowaniem. Ponadto trójwymiarowe fałdowanie RNA może wpływać na wydajność ładowania kulek, ponieważ może ograniczać ekspozycję biotyny na streptawidynę. Blokowanie kulek za pomocą niebiotynylowanego tRNA poprawia czystość wyników poprzez ograniczenie niespecyficznych interakcji z kulkami. Bufor ładujący i bufor elucyjny muszą być wybrane w zależności od dalszych zastosowań. W tym przypadku zaproponowano bardzo łagodne warunki, odpowiednie dla większości zastosowań i opracowane w celu zachowania potencjalnych kompleksów białkowych. Metoda ta jest jednak wysoce elastyczna; użytkownik może wybrać dowolną linię komórkową i dowolny rozmiar RNA, a także może zdecydować się na powtórzenie protokołu po złożeniu / rozwinięciu RNA, aby określić wpływ struktury na właściwości wiązania.

Innym oryginalnym aspektem tego protokołu jest wykorzystanie narzędzi predykcyjnych in silico w celu zapewnienia poprawności wyników20. Wiedza z wyprzedzeniem, które białka powinny zostać zidentyfikowane jako interaktory interesującego RNA, daje bezprecedensową przewagę w walidacji technicznych aspektów protokołu. Na przykład, korzystając z prostej analizy WB, możliwe jest zweryfikowanie obecności znanego docelowego białka w próbkach pochodzących z różnych etapów protokołu przed przystąpieniem do analizy MS, która wymaga specjalistycznego oprzyrządowania i jest bardziej kosztowna. Ponadto niedawno doniesiono o metodzie wykorzystania catRAPID20, wewnętrznego algorytmu przewidywania białka-RNA, do zaprojektowania de novo RNA specyficznego dla białka docelowego. Do niedawna jedynym dostępnym sposobem projektowania aptamerów DNA/RNA dla białka docelowego było podejście SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)31. Metoda in silico pozwala na znacznie szybsze i tańsze projektowanie aptamerów RNA.

Główne ograniczenia tej metody związane są z koniecznością pracy w i narzędziach wolnych od nukleaz. Ponadto, jeżeli uważa się za konieczne potwierdzenie in vitro wiązania między RNA zaprojektowanym de novo a białkiem docelowym przed PD, białko musi zostać wyprodukowane i oczyszczone, a wiązanie określone za pomocą metod biofizycznych. Jest to ograniczenie, które jest wspólne z produkcją przeciwciał monoklonalnych.

Pomimo tych drobnych problemów, wiarygodne metody mapowania interakcji RNA-białko, takie jak ta przedstawiona tutaj, mogą przybliżyć naukowców do odkrycia sieci makromolekularnych i złożonych głównych aktorów wielu mechanizmów fizjologicznych i patologicznych, takich jak te związane z rakiem, kardiomiopatiami, cukrzycą, infekcjami mikrobiologicznymi oraz zaburzeniami genetycznymi i neurodegeneracyjnymi.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować grupie badawczej prof. Tartaglii i dr Cuomo za zaoferowane wsparcie. E.Z. otrzymała dofinansowanie ze stypendium MINDED programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji w ramach umowy grantowej Marie Skłodowska-Curie nr 754490.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych VWR10861-554OGNIWA
Skrobaki do komórekBIOSIGMA 10153KOMÓRKI
Dulbecco′ s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Średni  (DMEM)Thermo Fisher Scientfic11995065CELLS
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, BrazyliaThermo Fisher Scientfic10500064CELLS
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS, Waltham, MA)Thermo Fisher Scientfic14190169CELLS
Trypsyna (0,25%), czerwień fenolowaThermo Fisher Scientfic15050065CELLS
Anty-królik IgG chrzan peroksydaza (HRP)Cellsignal7070PD
Biotynylowane RNAEurofinsNiestandardowe oligonukleotydy RNAPD
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9418PD
Clarity Western ECL Substrat, 500 mlBiorad1705061PD
cKompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazyMerck - Sigma Aldrich5056489001PD
NuPAGE 4 do 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini żel białkowy, 10-dołkowyInvitrogenNP0321BOX
PD Rekombinowane przeciwciało anty-TDP43Abcamab109535PD
Kwas rybonukleinowy, transfer z drożdży piekarskich (S.  cerevisiae)Merck - Sigma AldrichR5636-1MLPD
Streptavidin Mag SepharoseMerck - Sigma AldrichGE28-9857-99PD
Trans-Blot Turbo RTA Mini 0,2 i mikro; m Zestaw transferowy PVDFBiorad1704272PD
AcetonThermo Fisher Scientfic022928.K2
MS C18 wkładThermo Fisher Scientfic13-110-018MS
Dithiothreitol  (umowa o unikaniu podwójnego opodatkowania)Kolumny HPLC Thermo Fisher Scientfic20290MS
EASY-SprayThermo ScientificES902MS
jodoacetamid (IAA) Sigma Aldrich S.r.l.I6125MS
Lys-C/TrypsinPromegaV5073MS
Kwas trifluorooctowy (TFA)Thermo Fisher Scientfic28904MS
MocznikThermo Fisher ScientficJ75826. A7MS
strong>Equipment
ChemiDoc system obrazowaniaBio-RadCELLS
Dyna Mag -2 , Stojak magnetycznyInkubator C0
3Thermo ScientificPD
PROTEAN II XI CELL, zasilacz do aplikacji PAGEBio-RadPD
Koło obrotowe, rotator SB3StuartPD
Zestaw do kąpieli wodnej pod kątem 37 stopni; SystemVWRPD
XCell SureLock Mini-CellThermoFisher ScientificMS
Easy-nLC 1200 UHPLCThermo ScientificMS
MS
strong>SoftwareVersion
MaxQuant2.0.3.0MS
Perseus1.6.14.0MS
<<sub>2 z płaszczem wodnym Invitrogen CELLS CELLS Forma Series elektroforezy C Q exactive Spektrometr masowy Thermo Scientific <

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. RNA-binding proteins in human genetic disease. Nature Reviews Genetics. 22 (3), 185-198 (2021).">Gebauer, F., Schwarzl, T., Valcárcel, J., Hentze, M. W. RNA-binding proteins in human genetic disease. Nature Reviews Genetics. 22 (3), 185-198 (2021).
  2. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).">Hentze, M. W., Castello, A., Schwarzl, T., Preiss, T. A brave new world of RNA-binding proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 327-341 (2018).
  3. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).">Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
  4. RNA and disease. Cell. 136 (4), 777-793 (2009).">Cooper, T. A., Wan, L., Dreyfuss, G. RNA and disease. Cell. 136 (4), 777-793 (2009).
  5. RNA-binding proteins in tumor progression. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 90(2020).">Qin, H., et al. RNA-binding proteins in tumor progression. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 90(2020).
  6. Disruption of RNA metabolism in neurological diseases and emerging therapeutic interventions. Neuron. 102 (2), 294-320 (2019).">Nussbacher, J. K., Tabet, R., Yeo, G. W., Lagier-Tourenne, C. Disruption of RNA metabolism in neurological diseases and emerging therapeutic interventions. Neuron. 102 (2), 294-320 (2019).
  7. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. Journal of Genetics and Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).">Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. Journal of Genetics and Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
  8. Dysregulation of RNA binding protein aggregation in neurodegenerative disorders. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 89(2017).">Maziuk, B., Ballance, H. I., Wolozin, B. Dysregulation of RNA binding protein aggregation in neurodegenerative disorders. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 89(2017).
  9. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (5), 1557-1562 (2006).">Zielinski, J., et al. In vivo identification of ribonucleoprotein-RNA interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (5), 1557-1562 (2006).
  10. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118(2021).">Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118(2021).
  11. Analysis of RNA-protein networks with RNP-MaP defines functional hubs on RNA. Nature Biotechnology. 39 (3), 347-356 (2021).">Weidmann, C. A., Mustoe, A. M., Jariwala, P. B., Calabrese, J. M., Weeks, K. M. Analysis of RNA-protein networks with RNP-MaP defines functional hubs on RNA. Nature Biotechnology. 39 (3), 347-356 (2021).
  12. In-cell identification and measurement of RNA-protein interactions. Nature Communications. 10 (1), 5317(2019).">Graindorge, A., et al. In-cell identification and measurement of RNA-protein interactions. Nature Communications. 10 (1), 5317(2019).
  13. The future of cross-linking and immunoprecipitation (CLIP). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (8), 032243(2018).">Ule, J., Hwang, H. W., Darnell, R. B. The future of cross-linking and immunoprecipitation (CLIP). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (8), 032243(2018).
  14. Identification of RNA-protein interaction networks using PAR-CLIP. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (2), 159-177 (2012).">Ascano, M., Hafner, M., Cekan, P., Gerstberger, S., Tuschl, T. Identification of RNA-protein interaction networks using PAR-CLIP. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (2), 159-177 (2012).
  15. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biology. 15 (1), 203(2014).">McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biology. 15 (1), 203(2014).
  16. Analysis of CLIP and iCLIP methods for nucleotide-resolution studies of protein-RNA interactions. Genome Biology. 13 (8), (2012).">Sugimoto, Y., et al. Analysis of CLIP and iCLIP methods for nucleotide-resolution studies of protein-RNA interactions. Genome Biology. 13 (8), (2012).
  17. SELEX methods on the road to protein targeting with nucleic acid aptamers. Biochimie. 154, 132-155 (2018).">Bayat, P., et al. SELEX methods on the road to protein targeting with nucleic acid aptamers. Biochimie. 154, 132-155 (2018).
  18. CatRAPID omics v2.0: Going deeper and wider in the prediction of protein-RNA interactions. Nucleic Acids Research. 49, 72-79 (2021).">Armaos, A., Colantoni, A., Proietti, G., Rupert, J., Tartaglia, G. G. CatRAPID omics v2.0: Going deeper and wider in the prediction of protein-RNA interactions. Nucleic Acids Research. 49, 72-79 (2021).
  19. CatRAPID omics: A web server for large-scale prediction of protein-RNA interactions. Bioinformatics. 29 (22), 2928-2930 (2013).">Agostini, F., et al. CatRAPID omics: A web server for large-scale prediction of protein-RNA interactions. Bioinformatics. 29 (22), 2928-2930 (2013).
  20. Probing TDP-43 condensation using an in silico designed aptamer. Nature Communications. 13 (1), 3306(2022).">Zacco, E., et al. Probing TDP-43 condensation using an in silico designed aptamer. Nature Communications. 13 (1), 3306(2022).
  21. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42 (2), 13(2014).">Leppek, K., Stoecklin, G. An optimized streptavidin-binding RNA aptamer for purification of ribonucleoprotein complexes identifies novel ARE-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42 (2), 13(2014).
  22. Recent advances in aptamer discovery and applications. Molecules. 24 (5), 941(2019).">Zhang, Y., Lai, B. S., Juhas, M. Recent advances in aptamer discovery and applications. Molecules. 24 (5), 941(2019).
  23. UniProt: the Universal Protein Knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Research. 51, 523-531 (2023).">UniProt Consortium. UniProt: the Universal Protein Knowledgebase in 2023. Nucleic Acids Research. 51, 523-531 (2023).
  24. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).">Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  25. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).">Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  26. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).">Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  27. Predicting protein associations with long noncoding RNAs. Nature Methods. 8 (6), 444-445 (2011).">Bellucci, M., Agostini, F., Masin, M., Tartaglia, G. G. Predicting protein associations with long noncoding RNAs. Nature Methods. 8 (6), 444-445 (2011).
  28. A new background subtraction method for Western blot densitometry band quantification through image analysis software. Journal of Immunological Methods. 457, 1-5 (2018).">Gallo-Oller, G., Ordoñez, R., Dotor, J. A new background subtraction method for Western blot densitometry band quantification through image analysis software. Journal of Immunological Methods. 457, 1-5 (2018).
  29. RNA proximity labeling: A new detection tool for RNA-protein interactions. Molecules. 26 (8), 2270(2021).">Weissinger, R., Heinold, L., Akram, S., Jansen, R. P., Hermesh, O. RNA proximity labeling: A new detection tool for RNA-protein interactions. Molecules. 26 (8), 2270(2021).
  30. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).">Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
  31. Development of DNA aptamers using cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).">Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O'Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Binding ProteinsProtein RNA InteractionsBiotinylated RNA Pull DownStreptavidin BeadsMass SpectrometryWestern BlotHEK 293T CellsProtein Complex IsolationTDP 43 DetectionRNA Oligonucleotide

Related Articles