Obecny protokół opisuje etapy oczyszczania i kolejne badania czterech różnych grzybów β-glukanów jako potencjalnych cząsteczek immunomodulujących, które wzmacniają właściwości przeciwnowotworowe mikrogleju przeciwko komórkom glejaka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i oczyszczanie β-glukanu grzybów jako strategia immunoterapii glejaka
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jednym z największych wyzwań w opracowywaniu skutecznych terapii przeciwko glejakowi jest pokonanie silnej supresji immunologicznej w mikrośrodowisku guza. Immunoterapia stała się skuteczną strategią odwracania odpowiedzi układu odpornościowego przeciwko komórkom nowotworowym. Makrofagi i mikroglej (GAM) związane z glejakiem są głównymi czynnikami napędzającymi takie scenariusze przeciwzapalne. W związku z tym wzmocnienie odpowiedzi przeciwnowotworowej w GAM może stanowić potencjalną terapię wspomagającą w leczeniu pacjentów z glejakiem. W tym duchu cząsteczki β-glukanu grzybów są od dawna znane jako silne modulatory odporności. Opisano ich zdolność do stymulowania wrodzonej aktywności immunologicznej i poprawy odpowiedzi na leczenie. Te cechy modulujące są częściowo przypisywane ich zdolności do wiązania się z receptorami rozpoznawania wzorców, które, co ciekawe, są silnie wyrażane w GAM. W związku z tym praca ta koncentruje się na izolacji, oczyszczaniu, a następnie stosowaniu β-glukanów grzybów w celu wzmocnienia odpowiedzi rakobójczej mikrogleju na komórki glejaka. Mysie linie komórkowe glejaka (GL261) i mikrogleju (BV-2) są wykorzystywane do testowania właściwości immunomodulujących czterech różnych β-glukanów grzybów ekstrahowanych z grzybów intensywnie stosowanych w obecnym przemyśle biofarmaceutycznym: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus i Ganoderma lucidum. Aby przetestować te związki, przeprowadzono testy kostymulacji w celu zmierzenia wpływu wstępnie aktywowanej pożywki kondycjonowanej mikroglejem na proliferację i aktywację apoptozy w komórkach glejaka.
Wprowadzenie
Pomimo pojawienia się nowych osiągnięć w dziedzinie neuroonkologii, oczekiwana długość życia pacjentów z glejakiem pozostaje niewielka. Złoty standard terapii przeciwko nowotworom mózgu opiera się na połączeniu chirurgii, radioterapii i chemioterapii. Jednak w ciągu ostatniej dekady immunoterapia stała się potężną strategią leczenia różnych rodzajów raka1. W związku z tym możliwość wykorzystania odpowiedzi immunologicznej organizmu przeciwko komórkom nowotworowym stała się ostatnio czwartym filarem onkologii.
Od dawna wiadomo, że jednym z największych wyzwań w tej dziedzinie jest pokonanie silnej immunosupresji wystę....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Cztery różne warianty grzybów opisane w tym protokole zostały uzyskane z komercyjnego źródła (zobacz Tabelę Materiałów).
1. Izolacja β-glukanów grzybów
- Ekstrakcja i izolacja rozpuszczalnych polisacharydów grzybowych
UWAGA: Rozpuszczalne polisacharydy grzybowe (SMP) otrzymano zgodnie z procedurą schematycznie pokazaną w Rysunek 1.- Delikatnie opłucz świeże owocniki P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus i G. lucidum (około 2,000 g/grzyb) w wodzie destylowanej pięć razy.
- Wysuszyć owocniki w temperaturze 50....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Skuteczne oczyszczanie β-glukanów
Masę MP, SMP i SβG otrzymanych z owocników P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum i H. erinaceus po procesie ekstrakcji i oczyszczania zestawiono w Tabeli 1. Podstawowy skład (całkowite węglowodany, β-glukany i białka) MP, SMP i SβG otrzymanych z grzybów przedstawiono w Tabeli 2. Wyniki te pokazują, że zastosowany protokół pozwolił na odzyskanie dużej ilości białek w SMP. Jednakże obróbka enzymatyczna.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W pracy opisano zastosowanie dobrze znanych technik do skutecznego izolowania, oczyszczania i charakteryzowania zawartości SβG z czterech różnych grzybów. Wyniki pokazały, że po ekstrakcji SMP gorącą wodą, uzyskanych z P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum i H. erinaceus, a następnie leczeniu hydrolitycznym α-amylazą, glukozydazą i proteazą, zawartość α-glukanu i białka została zmniejszona, co znacznie wzbogaciło ilość czystych SβGs.
Mimo to zaobserwowaliśmy, .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie ma sprzecznych interesów, które można by zadeklarować.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować dr Vasiliki Economopoulos za jej wewnętrzny skrypt do pomiaru sygnału fuluorescencji w ImageJ. Chcielibyśmy również podziękować CITIUS (Uniwersytet w Sewilli) i całemu personelowi za wsparcie podczas demonstracji. Prace te były wspierane przez hiszpański FEDER I + D + i-USE, US-1264152 z Uniwersytetu w Sewilli oraz Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szkiełka 8-dołkowe | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Piec suszący na powietrzu | J.P. Selecta S.A., Hiszpania | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Dania | proteaza | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Młyn ostrzowy | Retsch, Niemcy | SM100 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | MERK, Niemcy | A9418 | |
| Membrana rurkowa celulozowa | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Wirówka | MERK, Niemcy | Eppendorf, 5810R | |
| Kolokacja plugginsów | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Niemcy | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Dania | Dekstran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´ s zmodyfikowany Eagle´ s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- amylaza/glukoamylaza) | Novozymes, Dania | ||
| Surowica bydlęca płodu | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| spektrometu FT-IR | Bruker-Vertex, Szwajcaria | VERTEX 70v | |
| Oprogramowanie do | tworzenia wykresów i analizyGraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| System H2SO4 | |||
| HPLC | Waters Corp, Milford, MA, USA | Inkubator HPLC | |
| Eppedorf | Galaxy 170S | ||
| Spektrometr masowy | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyd | MERK, Niemcy | P6148 | |
| Penicylina/streptomycyna | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH-metr | Crison, Barcelona, Hiszpania | Basic 20 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Królik Rozszczepiony Kaspaza-3 (Asp175) | Przeciwciało Abcam, Wielka Brytania | ab243998 | |
| Szczur Ki-67 Monoklonalny | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Parownik obrotowy | Bü chi Ibé rica S.L.U., Hiszpania | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrożelowa liniowa kolumna do filtracji żelowej (300 mm x 7,8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| Spektrofotometr UV | Amersham Bioscience, Wielka Brytania | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Łaźnia wodna | J.P. Selecta S.A., Hiszpania | ||
| System mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 7 DUO. | Zeiss, Niemcy | ||
| β-glukan Zestaw testowy | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Irlandia | K-BGLU | |
| β-glukany | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Dostarczono cztery warianty grzybów |
Bibliografia
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Fr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
beta-glukan grzybowyoczyszczanie beta-glukanuimmunoterapia glejaka wielopostaciowegoaktywacja mikroglejumikrośrodowisko nowotworuchromatografia żelowawysokosprawna chromatografia cieczowatransformata Fouriera w spektroskopii podczerwieniekstrakcja polisacharydów z grzybówpożywka warunkująca mikroglej
