Method Article

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

DOI:

10.3791/64927

⸱

March 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele myszy mogą być użytecznymi narzędziami do badania biologii nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Ustalono, że u myszy może rozwinąć się szereg patologii RPE. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu wyjaśnienia i ilościowego określenia patologii RPE u myszy za pomocą światła, elektronów transmisyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest wyniszczającym zaburzeniem siatkówki w starzejących się populacjach. Powszechnie uważa się, że dysfunkcja nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) jest kluczowym zdarzeniem patobiologicznym w AMD. Aby zrozumieć mechanizmy, które prowadzą do dysfunkcji RPE, naukowcy mogą wykorzystać modele mysie. Wcześniejsze badania wykazały, że u myszy mogą rozwijać się patologie RPE, z których niektóre obserwuje się w oczach osób, u których zdiagnozowano AMD. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu oceny patologii RPE u myszy. Protokół ten obejmuje przygotowanie i ocenę przekrojów siatkówki za pomocą mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, a także płaskich mocowań RPE za pomocą mikroskopii konfokalnej. Szczegółowo opisujemy typowe typy mysich patologii RPE obserwowanych za pomocą tych technik oraz sposoby ich ilościowego określania za pomocą bezstronnych metod testów statystycznych. Jako dowód słuszności koncepcji używamy tego protokołu fenotypowania RPE do ilościowego określenia patologii RPE obserwowanych u myszy z nadekspresją białka transbłonowego 135 (Tmem135) i starzejących się myszy C57BL / 6J typu dzikiego. Głównym celem tego protokołu jest przedstawienie standardowych metod fenotypowania RPE wraz z bezstronnymi ocenami ilościowymi dla naukowców wykorzystujących mysie modele AMD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest powszechną chorobą powodującą ślepotę, która dotyka populacje powyżej 55 roku życia1. Wielu badaczy uważa, że dysfunkcja w obrębie nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) jest wczesnym i kluczowym zdarzeniem patobiologicznym w AMD2. RPE to monowarstwa spolaryzowanych komórek, której zadaniem jest utrzymanie homeostazy sąsiadujących fotoreceptorów i naczyniówek krwionośnych3. Istnieje wiele modeli do badania mechanizmów związanych z chorobą w RPE, w tym modele hodowli komórkowych4,5 i myszy6,7,8. Niedawny raport opisał ustandaryzowane protokoły i kryteria kontroli jakości dla modeli hodowli komórkowych RPE4, ale żaden raport nie próbował ustandaryzować fenotypowania RPE w modelach mysich. W rzeczywistości w wielu publikacjach na temat mysich modeli AMD brakuje pełnego opisu RPE lub ilościowego określenia patologii RPE w nich. Ogólnym celem tego protokołu jest przedstawienie standardowych metod fenotypowania RPE wraz z bezstronnymi ocenami ilościowymi dla naukowców korzystających z mysich modeli AMD.

Poprzednie publikacje odnotowały obecność kilku patologii RPE u myszy za pomocą trzech technik obrazowania. Na przykład mikroskopia świetlna pozwala naukowcom zobaczyć ogólną morfologię mysiej siatkówki (Rysunek 1A) i wykryć patologie RPE, takie jak przerzedzenie RPE, wakuolizacja i migracja. Przykładem przerzedzania RPE w modelu myszy AMD jest odchylenie wysokości RPE od odpowiednich kontrolek (Rysunek 1B). Wakuolizację RPE można podzielić na dwie oddzielne kategorie: mikrowakuolizację (Rysunek 1C) i makrowakuolizację (Rysunek 1D). Mikrowakuolizację RPE podsumowuje się obecnością wakuoli w RPE, które nie wpływają na jego całkowitą wysokość, podczas gdy makrowakuolizacja jest wskazywana przez obecność wakuoli, które wystają do zewnętrznych segmentów fotoreceptorów. Migrację RPE wyróżnia się ogniskowym agregatem pigmentu nad monowarstwą RPE w przekroju siatkówki (Rysunek 1E). Należy zauważyć, że migrujące komórki RPE w oczach dawcy AMD wykazują immunoreaktywność na markery komórek odpornościowych, takie jak klaster różnicowania 68 (CD68)9, i mogą reprezentować komórki odpornościowe pochłaniające szczątki RPE lub RPE ulegające transdyferencjacji9. Inna technika obrazowania, zwana transmisyjną mikroskopią elektronową, może pozwolić naukowcom na wizualizację ultrastruktury RPE i jego błony podstawnej (Rysunek 2A). Ta technika może zidentyfikować dominujący depozyt sub-RPE u myszy, znany jako podstawowy depozyt laminarny (BLamD) (Rysunek 2B)10. Wreszcie, mikroskopia konfokalna może ujawnić strukturę komórek RPE poprzez obrazowanie płaskich mocowań RPE (Rysunek 3A). Ta metoda może wykryć dysmorfię RPE, odchylenie RPE od klasycznego kształtu plastra miodu (Rysunek 3B). Może również wykrywać wielojądrowość RPE, obecność trzech lub więcej jąder w komórce RPE (Rysunek 3C). Aby zapoznać się z podsumowaniem typów patologii RPE obecnych w obecnych modelach myszy AMD, odsyłamy badaczy do tych przeglądów z literatury6,7.

Badacze badający AMD powinni być świadomi zalet i wad używania myszy do badania patologii RPE przed protokołem fenotypowania. Myszy są korzystne ze względu na ich stosunkowo krótką żywotność i opłacalność, a także możliwość manipulacji genetycznej i farmakologicznej. Myszy wykazują również zmiany zwyrodnieniowe RPE, w tym migrację RPE, dysmorfię i wielojądrowość, które obserwuje się w oczach dawcy AMD11,12,13,14,15,16,17; sugeruje to, że podobne mechanizmy mogą leżeć u podstaw rozwoju tych patologii RPE u myszy i ludzi. Istnieją jednak kluczowe różnice, które ograniczają przekładalność badań na myszach na ludzkie AMD. Po pierwsze, myszy nie mają plamki żółtej, anatomicznie odrębnego obszaru ludzkiej siatkówki niezbędnego do ostrości wzroku, który jest preferencyjnie dotknięty w AMD. Po drugie, niektóre patologie RPE u myszy, takie jak ścieńczenie RPE i wakuolizacja, zwykle nie są obserwowane w oczach dawcy AMD18. Po trzecie, u myszy nie rozwijają druzy, co jest cechą charakterystyczną patologii AMD19. Druzy to złogi zawierające lipidy i białka z bardzo małą ilością białek błony podstawnej, które tworzą się między blaszką podstawną RPE a wewnętrzną warstwą kolagenową błony Brucha (BrM)19. Druzy różnią się od BLamD, powszechnego depozytu sub-RPE u myszy, zarówno pod względem składu, jak i lokalizacji anatomicznej. BLamD to zależne od wieku i stresu nieprawidłowości wzbogacone w macierz zewnątrzkomórkową, które tworzą się między blaszką podstawną RPE BrM a podstawnymi fałdami klasy RPE20. Co ciekawe, BLamD mają podobny skład białkowy i wygląd zarówno u myszy, jak i u ludzi6,10,21. Ostatnie prace sugerują, że BLamD mogą działać w patobiologii AMD, wpływając na progresję AMD do późniejszych stadiów18,22; w związku z tym złogi te mogą reprezentować chory RPE w siatkówce myszy. Wiedza na temat tych korzyści i ograniczeń ma kluczowe znaczenie dla naukowców zainteresowanych przełożeniem wyników badań na myszach na AMD.

W tym protokole omawiamy metody przygotowania oczu do światła, transmisji elektronów i mikroskopii konfokalnej w celu wizualizacji patologii RPE. Opisujemy również, jak w sposób bezstronny określić ilościowo patologie RPE do badań statystycznych. Jako dowód słuszności koncepcji wykorzystujemy protokół fenotypowania RPE do zbadania strukturalnych patologii RPE obserwowanych u myszy z nadekspresją białka transbłonowego 135- (Tmem135) i starzejących się myszy C57BL / 6J typu dzikiego (WT). Podsumowując, naszym celem jest opisanie metodologii fenotypowania w celu scharakteryzowania RPE w modelach myszy AMD, ponieważ obecnie nie ma dostępnych standardowych protokołów. Naukowcy zainteresowani badaniem i ilościowym określaniem patologii fotoreceptorów lub naczyniówki, które są również dotknięte w mysich modelach AMD, mogą nie uznać tego protokołu za przydatny w swoich badaniach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Wisconsin-Madison i są zgodne z Oświadczeniem Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych.

1. Ocena mysiego RPE za pomocą mikroskopii świetlnej

  1. Przygotuj bufor utrwalający o końcowym stężeniu 2% paraformaldehydu i 2% aldehydu glutarowego w temperaturze pokojowej (RT) w szklanej butelce.
    UWAGA: Ten protokół wymaga co najwyżej 14 ml buforu utrwalającego na mysz.
    UWAGA: Paraformaldehyd i aldehyd glutarowy są substancjami niebezpiecznymi. Podczas pracy z tymi substancjami należy postępować zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi.
  2. Przygotować system perfuzyjny z zasilaniem grawitacyjnym na chłonnym podkładzie do perfuzji serca w dygestoriach (rysunek uzupełniający 1A).
    1. Umieścić 40 ml buforu utrwalającego w cylindrze strzykawki systemu perfuzyjnego (rysunek uzupełniający 1B).
    2. Obrócić zawór, aż znajdzie się równolegle do przewodu rurowego, aby umożliwić przepływ bufora przez przewód rurowy (rysunek uzupełniający 1C). Przepłucz linię buforem, aż wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte z linii.
    3. Przekręć zawór, aż będzie prostopadły do przewodu rurowego, aby zapobiec przepływowi bufora do przewodu rurowego (rysunek uzupełniający 1D).
      UWAGA: System perfuzyjny jest teraz gotowy do użycia.
  3. Poddaj mysz eutanazji, umieszczając ją w komorze na dwutlenek węgla (CO2) i pozwól, aby CO2 wpłynęło do komory z natężeniem przepływu 30% objętości komory na minutę. Gdy mysz przestanie oddychać, pozwól CO2 przepływać do komory przez co najmniej 1 minutę. Sprawdź, czy mysz jest martwa, zanim przejdziesz do następnego kroku.
    UWAGA: Eutanazja poprzez wstrzyknięcie środków farmakologicznych może być stosowana w tym protokole jako alternatywa dla wdychania CO2 .
  4. Wykonaj perfuzję serca na uśpionej myszy.
    1. Przenieś mysz na płytką tacę w pobliżu systemu perfuzyjnego z brzuchem skierowanym do góry. Spryskaj brzuch 70% etanolem (EtOH).
    2. Wykonaj cztery nacięcia, aby odsłonić jamę brzuszną (rysunek uzupełniający 2A).
      1. Wykonaj 5 cm dolne cięcie za pomocą zakrzywionych nożyczek i kleszczy przez skórę i ścianę brzucha po najdalszej lewej stronie myszy, która znajduje się bezpośrednio pod klatką piersiową.
      2. Przystąp do wykonania 3-centymetrowego przyśrodkowego cięcia przez skórę i ścianę brzucha myszy, które zaczyna się od górnej części dolnego cięcia.
      3. Wykonaj kolejne 5 cm dolne cięcie na końcu przyśrodkowego cięcia przez skórę i ścianę brzucha po najdalszej prawej stronie myszy bezpośrednio pod klatką piersiową.
      4. Wykonaj kolejne 3 cm nacięcie przyśrodkowe, aby usunąć płat skóry brzucha za pomocą zakrzywionych kleszczy.
    3. Przeciąć przeponę i mostek, aby odsłonić serce (rysunek uzupełniający 2B).
      UWAGA: Uważaj, aby nie naciąć serca, tętnic i żył. Nacinanie ich doprowadzi do nieefektywnej perfuzji serca.
    4. Włóż igłę miernika do lewej komory serca. Przekręć zawór, aż znajdzie się równolegle do przewodu rurowego. Przetnij prawy przedsionek zakrzywionymi nożyczkami, aby umożliwić wydostanie się krwi i utrwalacza z serca (rysunek uzupełniający 2C).
    5. Pozwól, aby 10 ml buforu utrwalającego wniknęło do myszy przez co najmniej 1-2 minuty lub do momentu, gdy wątroba stanie się blada i krew nie będzie wypływać z prawego przedsionka. Po zakończeniu perfuzji przekręć zawór, aż będzie prostopadły do przewodu rurowego, aby zatrzymać przepływ bufora.
  5. Wyłuszczenie oczu myszy po perfuzji serca.
    1. Wyjmij mysz z płytkiej tacki i umieść mysz na chłonnym podkładzie w dygestorium. Ustaw głowę myszy tak, aby lewe oko było skierowane w stronę eksperymentatora, a prawe oko było poza zasięgiem wzroku. Opisz górną stronę oka za pomocą barwnika do znakowania tkanek.
    2. Delikatnie dociśnij kciukiem i palcem wskazującym wokół oczodołu, aby spowodować wysunięcie oka z oczodołu (rysunek uzupełniający 3A).
    3. Weź zakrzywione nożyczki i przytrzymaj je ostrzem pod kątem 30° od oczodołu. Kontynuuj cięcie wokół oka zakrzywionymi nożyczkami pod kątem 30° (rysunek uzupełniający 3B).
      UWAGA: Można wyciąć nadmiar tkanki z oczodołu, aby zachować integralność gałki ocznej.
    4. Zdejmij gałkę oczną z głowy za pomocą zakrzywionych kleszczy i umieść ją na chłonnym podkładzie. Naciąć rogówkę ostrzem skalpela numer 11 i umieścić oko zakrzywionymi kleszczami w mikroprobówce o pojemności 2 ml z 2 ml buforu utrwalającego. Oznacz mikroprobówkę o pojemności 2 ml identyfikatorem myszy i "po lewej", aby wskazać lewe oko.
      UWAGA: Nacięcie w rogówce pozwala utrwalaczowi łatwo wniknąć w oko, aby lepiej je zachować.
    5. Powtórz kroki 1.5.1-1.5.4 dla prawego oka.
  6. Pozostawić oczy do inkubacji w buforze utrwalającym przez noc na wytrząsarce w pomieszczeniu o temperaturze 4 ° Celsjusza (C), z prędkością 75 obrotów na minutę (obr./min).
  7. Zastąp bufor utrwalający 2 ml soli fizjologicznej z 1x buforem fosforanowym (PBS). Inkubuj oczy w 1x PBS przez 10 minut na wytrząsarce przy RT i 75 obr./min. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  8. Oczyść i wypreparuj oczy, aby wygenerować tylne segmenty.
    UWAGA: Tylny segment to gałka oczna myszy z siatkówką nerwową, RPE, naczyniówką i twardówką bez rogówki, tęczówki i soczewki.
    1. Umieścić oko na szalce Petriego wypełnionej 1x PBS pod mikroskopem preparacyjnym (Rysunek Uzupełniający 4A).
    2. Delikatnie podnieś tłuszcz i mięśnie z gałki ocznej za pomocą kleszczyków z cienką końcówką. Ostrożnie przyciąć tłuszcz i mięśnie nożyczkami do mikropreparowania w kierunku równoległym do gałki ocznej, aż gałka oczna będzie miała jednolity niebieskawo-kolor (rysunek uzupełniający 4B).
      UWAGA: Nie tnij w kierunku prostopadłym, ponieważ uszkodzi to gałkę oczną. Ponadto, jeśli barwnik znakujący tkanki odpadnie podczas przetwarzania, natychmiast ponownie opisz górną stronę gałki ocznej.
    3. Umieść kleszcze z cienką końcówką w miejscu nakłucia rogówki. Przeciąć na obwodzie rogówki, zaczynając od miejsca nakłucia, nożyczkami do mikropreparowania, aby usunąć rogówkę i tęczówkę z gałki ocznej (rysunek uzupełniający 4C).
    4. Weź kleszcze z cienką końcówką i delikatnie wyjmij soczewkę z gałki ocznej, aby uzyskać tylny segment (rysunek uzupełniający 4D).
    5. Umieść tylny segment z powrotem w mikroprobówce o pojemności 2 ml z 2 ml 1x PBS. Tylny segment należy przechowywać w lodówce o temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Tylne segmenty mogą pozostawać w 1x PBS w temperaturze 4 °C przez wiele tygodni przed dalszą obróbką.
  9. Powtórz kroki 1.3-1.8, aby przygotować oczy od innych myszy biorących udział w badaniu.
  10. Przetwórz i osadź jeden z tylnych segmentów każdej myszy w parafinie w celu przekrojenia. Upewnij się, że górna strona tylnego segmentu znajduje się na górze.
    UWAGA: Autorzy polegają na laboratorium Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) Uniwersytetu Wisconsin-Madison (UW) w celu wykonania tych zadań. Poniżej znajdują się opublikowane protokoły wykorzystujące podobną metodę przetwarzania i osadzania parafiny23,24.
  11. Przytnij i pokrój każdy blok parafiny, aby uzyskać przekrój siatkówki o grubości 5 μm, który obejmuje głowę nerwu wzrokowego, a także cztery dodatkowe sekcje siatkówki o grubości 5 μm, które są oddalone od siebie o 250 μm. Oznacz slajdy identyfikatorem myszy i numerem seryjnym sekcji (np. 1, 2, 3, 4 lub 5). Przechowuj slajdy w pudełku na slajdy.
    UWAGA: Autorzy korzystają z usług laboratorium UW TRIP w zakresie sekcji parafinowych. Poniżej znajdują się opublikowane protokoły wykorzystujące podobną metodę podziału parafiny25,26.
  12. Wybarwić szkiełka zawierające skrawki siatkówki hematoksyliną i eozyną (H&E). Protokół barwienia H&E można znaleźć na rysunku uzupełniającym 5.
    UWAGA: Wszystkie etapy procedury barwienia H&E muszą być wykonane w dygestorium.
  13. Zbierz zszyte obrazy wybarwionych H&E odcinków siatkówki za pomocą skali za pomocą mikroskopu świetlnego przy 20-krotnym powiększeniu.
  14. Określ ilościowo grubość RPE na obrazach siatkówki zawierających głowę nerwu wzrokowego dla każdej próbki.
    1. Pobierz i otwórz program Fiji ImageJ. Przeciągnij wszystkie zszyte obrazy siatkówki zawierające głowę nerwu wzrokowego na pasek zadań Fiji ImageJ. Sprawdź, czy skala obrazu jest skalibrowana w μm, a nie w pikselach.
      UWAGA: Skala obrazu znajduje się w lewym górnym rogu okna zawierającego obraz siatkówki w programie Fiji ImageJ. Jeśli skala jest ustawiona w pikselach, zapoznaj się z instrukcją obsługi programu Fiji ImageJ, aby przekonwertować piksele na μm.
    2. Zaznacz co 300 μm odstęp na każdym obrazie od krawędzi głowy nerwu wzrokowego do końca siatkówki (ora serrata). Kliknij ikonę Prosto na pasku zadań Fiji ImageJ. Kliknij i przeciągnij linię od krawędzi głowy nerwu wzrokowego w kierunku ora serrata o długości 300 μm. Kliknij narzędzie Pędzel na pasku zadań Fiji ImageJ i kliknij koniec linii 300 μm, aby ją zaznaczyć.
    3. Zmierz grubość RPE w każdym zaznaczonym interwale. Kliknij ikonę Prosto na pasku zadań Fiji ImageJ. Kliknij i przeciągnij linię od góry do dołu RPE (Rysunek uzupełniający 6). Kliknij Analizuj > mierz na pasku menu Fiji ImageJ, aby uzyskać grubość RPE.
    4. Przenieś pomiary grubości RPE do arkusza kalkulacyjnego i oznacz kolumnę zawierającą pomiary za pomocą identyfikacji myszy. Oznacz dodatkową kolumnę "Oznaczony interwał" i wprowadź odległość od wartości nerwu wzrokowego (tj. 300, 600, 900 itd.)
      UWAGA: Pierwszy zmierzony odstęp odpowiada odległości 300 μm od nerwu wzrokowego, drugi zmierzony odstęp odpowiada odległości 600 μm i tak dalej.
  15. Określ ilościowo częstość występowania patologii RPE na podstawie obrazów siatkówki dla każdej próbki.
    1. Otwórz program Fiji ImageJ.
    2. Otwórz aplikację Cell Counter w programie Fiji ImageJ. Kliknij Wtyczki > Analizuj licznik komórek > pasku menu Fiji ImageJ. Przeciągnij obraz siatkówki na pasek zadań Fiji ImageJ i kliknij Zainicjuj w oknie Licznik komórek.
    3. Policz liczbę patologii RPE na odcinek siatkówki za pomocą aplikacji Cell Counter. Kliknij Typ 1 w obszarze Liczniki, a następnie kliknij wszystkie zdarzenia mikrowakuolizacji na obrazku. Kliknij Typ 2 w obszarze Liczniki, a następnie kliknij wszystkie zdarzenia makrowakuolizacji na obrazku. Kliknij pozycję Typ 3 w obszarze Liczniki, a następnie kliknij wszystkie poszczególne zdarzenia migracji na obrazie.
    4. Przenieś liczby patologii RPE do arkusza kalkulacyjnego. Oznacz wiersze za pomocą mikrowakuolizacji, makrowakuolizacji lub migracji, a kolumnę z identyfikacją myszy.
    5. Powtórz kroki 1.15.2-1.15.4 dla innych obrazów próbki. Uśrednij liczbę patologii RPE na próbkę i podziel przez pięć, aby obliczyć częstość występowania każdej patologii RPE dla próbki w arkuszu kalkulacyjnym.
  16. Przeprowadź analizę statystyczną grubości RPE w każdym interwale i częstości występowania patologii RPE, aby określić, czy istnieją znaczące różnice między grupami w badaniu.

2. Ocena mysiego RPE za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

  1. Pozostałe tylne segmenty powstałe po krokach 1,5-1,9 przeciąć na pół przez górny znak na dwie części za pomocą żyletki. Ponownie oznacz górną stronę przeciętych tylnych segmentów barwnikiem do znakowania tkanek. Oddziel podzielone tylne segmenty na nowe mikroprobówki o pojemności 2 ml zawierające 2 ml 1x PBS i identyfikację myszy.
    UWAGA: Tylny segment myszy jest zbyt duży, aby można go było przetworzyć w jednym kawałku i musi zostać przecięty na pół w celu przetwarzania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
  2. Przepłukać tkanki 2 ml 0,1 M buforu kakodylowego o pH 7,2. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na stole. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
  3. Zastąp 0,1 M bufor kakodylanu 2 ml 2% tetratlenku osmu (OsO4) rozcieńczonym w 0,1 M buforze kakodylowym. Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej w dygestorium.
    UWAGA: OsO4 jest substancją trującą. Podczas pracy z OsO4 należy postępować zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi.
  4. Płukać tkanki 2 ml 0,1 M buforu kakodylowego przez 10 minut w temperaturze pokojowej w dygestorium. Powtórz ten krok raz.
  5. Odwodnić tkanki stopniowanymi rozcieńczeniami EtOH w zakresie od 50% do 100% przy temperaturze pokojowej w dygestorium. Protokół procedury odwodnienia znajduje się na rysunku uzupełniającym 7.
  6. Usuń 100% EtOH z tkanek i dodaj 2 ml tlenku propylenu do tkanek. Inkubować w temperaturze pokojowej w dygestorium przez 15 minut. Usuń tlenek propylenu z tkanek i dodaj 2 ml świeżego tlenku propylenu do tkanek. Inkubować w temperaturze pokojowej w dygestorium przez 15 min.
    UWAGA: Tlenek propylenu jest substancją toksyczną. Podczas pracy z tlenkiem propylenu należy postępować zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi.
  7. Usuń tlenek propylenu z tkanek i dodaj 2 ml mieszaniny tlenku propylenu i żywicy w stosunku 1:1 do tkanek. Pozostawić na noc pod odkurzaczem w dygestoriach w RT.
    UWAGA: Żywica jest substancją niebezpieczną dla ludzi. Podczas pracy z żywicą należy postępować zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi laboratorium.
  8. Zastąp mieszaninę 1:1 tlenku propylenu i żywicy z tkanek 2 ml czystej żywicy. Pozostaw na noc pod odkurzaczem w dygestoriach w RT .
  9. Zanurz tkanki w żywicy. Umieść etykietę z identyfikacją myszy w ołówku i kroplę żywicy w formie. Umieść tkankę na kropli żywicy. Napełnij formę żywicą i umieść pod próżnią na 1 godzinę przy temperaturze RT w dygestorium.
  10. Zmień położenie etykiet i próbek za pomocą kleszczyków z cienką końcówką, tak aby tylna strona tylnej części muszli ocznej znajdowała się na górze. Pozostaw formę na noc w temperaturze 65 °C w piekarniku pod wyciągiem.
  11. Wyjmij foremki z piekarnika. Pozwól foremkom ostygnąć do RT na blacie. Usuń bloki z foremek.
    UWAGA: Bloki są teraz gotowe do przycinania.
  12. Uformuj bloki żywicy za pomocą żyletki, aby utworzyć trapez. Przytnij bloki żywicy za pomocą mikrotomu, aż będzie widoczna głowa nerwu wzrokowego. Za pomocą noża diamentowego należy wycinać półcienkie odcinki z bloków żywicy o grubości 0,5 μm.
    UWAGA: Poniżej znajduje się opublikowany protokół dotyczący sekcji mikrotomów27. W razie potrzeby można pobrać półcienkie skrawki o grubości 0,5 μm z bloków żywicy i wybarwić je w celu oceny integralności próbki.
  13. Wytnij ultracienki fragment o grubości 70 nm z każdego przyciętego bloku za pomocą ultramikrotomu. Zbierz ultracienki przekrój o grubości 70 nm na cienkiej siatce miedzianej o oczkach 400. Umieść siatkę w pudełku do przechowywania siatki i oznacz miejsce identyfikatorem myszy.
    UWAGA: Oto opublikowany protokół dotyczący sekcji ultramikrotomu28.
  14. Kratki należy barwić 2% octanem uranylu przez 5 minut, a następnie 3,5% roztworem cytrynianu ołowiu przez 5 minut w temperaturze pokojowej w dygestorium.
    UWAGA: Octan uranylu i cytrynian ołowiu są substancjami niebezpiecznymi. Podczas pracy z tymi substancjami należy postępować zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi.
  15. Uzyskaj obrazy dla każdej próbki za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego przy powiększeniu 15 000x, gdzie linie siatki miedzianej przecinają RPE i BrM.
    UWAGA: Na sekcję powinno przypadać co najmniej 20 do 35 obrazów, a na próbkę od 40 do 70 obrazów.
  16. Określ ilościowo wysokości BLamD na obrazach dla próbek w badaniu.
    1. Otwórz program Fiji ImageJ. Przeciągnij wszystkie obrazy z sekcji próbki na pasek zadań Fiji ImageJ. Sprawdź, czy obrazy są skalibrowane w μm, a nie w pikselach.
    2. Zmierz wysokość BLamD na obrazach. Kliknij ikonę Prosty na pasku zadań Fiji ImageJ. Kliknij i przeciągnij linię od blaszki sprężystej BrM do szczytu najwyższego osadu na obrazie (rysunek uzupełniający 8). Kliknij przycisk Analizuj > Zmierz na pasku menu Fiji ImageJ, aby uzyskać wysokość BLamD na obrazie.
      UWAGA: Jeśli na obrazie nie ma BLamD, narysuj linię od blaszki sprężystej BrM do blaszki podstawy RPE.
    3. Przenieś wysokości BLamD do arkusza kalkulacyjnego i etykiety z identyfikacją myszy.
  17. Oblicz skumulowane częstotliwości wysokości BLamD na genotyp i średnie wysokości BLamD na mysz w arkuszu kalkulacyjnym. Przeprowadź analizę statystyczną średnich wysokości BLamD, aby określić, czy istnieją znaczące różnice między grupami w badaniu.

3. Ocena mysiego RPE za pomocą mikroskopii konfokalnej

  1. Zbierz oczy od myszy. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z procedurą opisaną w kroku 1.3. Wyłuszczenie oczu za pomocą kroku 1.5. Umieść oczy za pomocą zakrzywionych kleszczyków w mikroprobówce o pojemności 2 ml z 2 ml 1x PBS i identyfikacją myszy.
    UWAGA: Nie należy przystosowywać myszy do ciemności, ponieważ interdigityzacja fotoreceptorów i procesów wierzchołkowych RPE pozwala na lepszą wizualizację RPE za pomocą mikroskopii konfokalnej.
  2. Natychmiast wyczyść i wypreparuj oczy myszy, aby wygenerować tylne muszle oczne myszy.
    UWAGA: Tylna muszla oczna różni się od tylnego segmentu, ponieważ nie zawiera siatkówki nerwowej.
    1. Przenieść oko na szalkę Petriego zawierającą 1x PBS pod mikroskopem preparacyjnym (rysunek uzupełniający 9A).
    2. Usuń tłuszcz i mięśnie z gałki ocznej, jak opisano w kroku 1.8.2 (rysunek uzupełniający 9B).
    3. Naciąć rogówkę gałki ocznej ostrzem skalpela numer 11. Usuń rogówkę i tęczówkę, jak opisano w kroku 1.8.3 (rysunek uzupełniający 9C).
    4. Wyciągnij obiektyw za pomocą kleszczyków z cienką końcówką. Weź dwa kleszczyki z cienką końcówką i delikatnie oddziel siatkówkę nerwową od tylnego segmentu.
    5. Ostrożnie przeciąć siatkówkę nerwową w głowie nerwu wzrokowego w celu usunięcia z tylnej muszli ocznej (rysunek uzupełniający 9D).
    6. Umieść tylną muszlę oczną w nowej mikroprobówce o pojemności 2 ml zawierającej 500 μl 1x PBS z identyfikacją myszy.
  3. Zamocować tylne muszle oczne metanolem (MeOH) (rysunek uzupełniający 10).
    UWAGA: Wykonanie kroku 3.3 zajmuje około 2 godzin i 40 minut.
    1. Dodaj 500 μl MeOH do tkanek. Inkubować na wytrząsarce z prędkością 75 obr./min przez 5 minut przy suchej smołce.
    2. Usunąć 500 μl roztworu z tkanek i dodać 500 μl MeOH. Inkubować przez 5 minut na wytrząsarce z prędkością 75 obr./min przez 5 minut przy suchej smołce. Powtórz ten krok jeszcze raz.
    3. Usuń cały roztwór z tkanek i dodaj 500 μl MeOH. Inkubować na wytrząsarce z prędkością 75 obr./min przez co najmniej 2 godziny w temperaturze RT.
      UWAGA: Jako alternatywę dla kroku 3.3.3, tylna muszla oczna może być inkubowana przez noc w MeOH na wytrząsarce z prędkością 75 obr./min w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C.
    4. Dodaj 500 μL 1x PBS do tkanek. Inkubować na wytrząsarce z prędkością 75 obr./min przez 5 minut przy suchej smołce.
    5. Usunąć 500 μl roztworu z tkanek i dodać 500 μl 1x PBS. Inkubować na wytrząsarce z prędkością 75 obr./min przez 5 minut przy smotylowanej smocie. Powtórz ten krok jeszcze raz.
    6. Usuń cały roztwór z tkanek i zastąp go 500 μl 1x PBS.
      UWAGA: Tkanki są w pełni utrwalone przez MeOH i mogą być przechowywane w lodówce o temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 miesiąc.
  4. Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne tylnych muszli ocznych, aby uwidocznić ścisłe połączenia i jądra RPE (rysunek uzupełniający 11).
    1. Usunąć 500 μl 1x PBS z próbek i dodać 100 μl rozcieńczonej 10% normalnej surowicy osła do 1x roztworu PBS. Inkubować na wytrząsarce z prędkością 75 obr./min przez 30 minut przy suchej smołce.
    2. Usunąć rozcieńczony 10% normalny roztwór surowicy osła z próbek i dodać 100 μl rozcieńczenia 1:50 poliklonalnego przeciwciała anty-Zonula Occludens-1 (ZO-1) w 1x PBS. Przenieść próbki do pomieszczenia o temperaturze 4 °C i inkubować przez noc na wytrząsarce z prędkością 75 obr./min.
    3. Usunąć rozcieńczenie przeciwciał z próbek i dodać 2 ml 1x PBS. Inkubować na wytrząsarce z prędkością 75 obr./min przez 10 minut przy wilgotności względnej. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
    4. Usuń 1x PBS z próbek. Dodać do próbek 100 μl dichlorowodorku 4',6-dichlorowodorku 4'-dimidyno-fenyloindolu (DAPI) w rozcieńczeniu 1:250 1:250 przeciwciała anty-króliczego IgG ze znacznikiem 488 fluoroforów i rozcieńczenia 1:250 dichlorowodorku 4',6-diamidyno-2'-fenyloindolu (DAPI) w 1x PBS. Przykryć próbki folią aluminiową i inkubować na wytrząsarce z prędkością 75 obr./min przez 2 godziny w temperaturze RT.
      UWAGA: Próbki muszą być całkowicie pokryte folią aluminiową, aby zapobiec fotowybielaniu.
    5. Usunąć rozcieńczenia przeciwciał i DAPI z próbek. Dodać 2 ml 1x PBS do próbek, ponownie przykryć folią aluminiową i inkubować na wytrząsarce z prędkością 75 obr./min przez 10 minut w temperaturze suchej masy. Powtórz ten krok jeszcze trzy razy.
      UWAGA: Ścisłe połączenia i jądra RPE są teraz odpowiednio w pełni oznakowane i wybarwione.
  5. Zamontuj tylne muszle oczne na szkiełkach mikroskopowych.
    1. Oznacz szkiełko mikroskopowe za pomocą identyfikatora myszy. Przenieś tylną muszlę oczną na szkiełko mikroskopowe pod mikroskopem preparacyjnym ze stroną naczyniówkową skierowaną w dół. Dodaj kroplę 1x PBS do tylnej muszli ocznej, aby zapobiec jej wysychaniu (Rysunek uzupełniający 12).
    2. Przetnij tylną muszlę oczną za pomocą ostrza skalpela numer 11 w czterech miejscach, które dadzą cztery ćwiartki odpowiadające kierunkom kardynalnym (tj. północ, wschód, południe i zachód). Przetrzyj nadmiar 1x PBS tkanką z obwodu tylnej muszli ocznej. Delikatnie spłaszcz tylną muszlę oczną za pomocą szczotki do włosów wielbłąda i kleszczyków z cienką końcówką (Rysunek uzupełniający 12).
      UWAGA: Powstały produkt jest teraz znany jako płaski uchwyt RPE.
    3. Dodaj kroplę podłoża montażowego do płaskiego uchwytu RPE i umieść na nim szkiełko nakrywkowe. Nałóż przezroczysty lakier do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe i pozostaw je do wyschnięcia na co najmniej 30 minut w temperaturze suchej w zamkniętej szufladzie. Umieść szkiełka w pojemniku na szkiełka i przechowuj je w lodówce o temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Uważaj, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza na płaskim uchwycie RPE. Płaskie mocowania RPE można zobrazować w ciągu 2 tygodni.
  6. Uzyskaj obraz każdego z czterech kwadrantów otaczających nerw wzrokowy płaskiego mocowania RPE pod mikroskopem konfokalnym przy 20-krotnym powiększeniu dla każdej próbki. Przykładowy obraz płaskiego montażu RPE można znaleźć na rysunku uzupełniającym 13A.
    UWAGA: Może być konieczne wykonanie obrazowania z-stack płaskich mocowań RPE, w których wykonywanych jest wiele obrazów i układanych w stos w celu skompensowania różnic wymiarowych płaskiego mocowania RPE.
  7. Prześledź ścisłe połączenia komórek RPE w każdym płaskim obrazie RPE. Przykład obrazu z płaskim montażem RPE ze śledzeniem można znaleźć na rysunku uzupełniającym 13B.
    1. Otwórz program Fiji ImageJ. Przeciągnij obraz RPE do montażu płaskiego na pasek zadań Fiji ImageJ. Sprawdź, czy obraz jest skalibrowany w mikrometrach, a nie w pikselach.
    2. Kliknij dwukrotnie ikonę narzędzia Pędzel nakładki na pasku zadań Fiji ImageJ, aby ustawić szerokość pędzla na 3, przezroczystość na 0 i kolor na czerwony. Kliknij przycisk Zamknij w oknie narzędzia Pędzel nakładki.
    3. Kliknij ikonę narzędzia Pędzel nakładki. Kliknij i przeciągnij na ciasne połączenia wszystkich komórek RPE, które znajdują się całkowicie w obrazie.
      UWAGA: W przypadku popełnienia błędu obrysowywania, kliknij dwukrotnie ikonę narzędzia Pędzel nakładki i kliknij pole Cofnij w oknie narzędzia Pędzel nakładki, aby usunąć błąd śledzenia z obrazu.
    4. Kliknij ikonę prostokąta na pasku zadań Fiji ImageJ. Kliknij na obrazek i przeciągnij po jego obwodzie. Kliknij przycisk Edytuj > wyczyść na pasku menu Fiji ImageJ, aby zachować obrysowane linie i usunąć z obrazu wszelkie kolory niebieski i zielony.
    5. Zapisz obraz śledzenia w odpowiedniej lokalizacji z identyfikacją myszy, lokalizacją kwadrantu (tj. północ, południe, wschód lub zachód) i sufiksem CP label.
      UWAGA: Nie zapisuj obrazu śledzenia RPE przed wykonaniem kroku 3.7.4.
  8. Oblicz obszary komórek RPE dla każdej próbki.
    1. Wyznacz lokalizację, w której zostaną zapisane pliki z analizy obszaru RPE, tworząc folder na ekranie pulpitu komputera. Wygeneruj podfoldery dla każdego obrazu śledzenia RPE i oznacz podfoldery identyfikatorem myszy, a także lokalizacją kwadrantu (tj. północ, południe, wschód lub zachód).
    2. Zainstaluj i otwórz program Cell Profiler29. Pobierz plik projektu Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Supplementary Coding File 1). Otwórz plik Calculator.cpproj obszaru Ikeda_RPE, klikając pozycję Plik > Otwórz projekt na pasku menu programu Cell Profiler.
    3. Przeciągnij jeden obraz śledzenia RPE do pola Obraz > Upuść tutaj pliki i foldery w oknie programu Cell Profiler.
    4. Wprowadź lokalizację folderu do programu Cell Profiler, który odpowiada obrazowi śledzenia RPE. Kliknij przycisk Ustawienia wyjściowe w lewym dolnym rogu okna programu Cell Profiler i wprowadź lokalizację folderu w polach tekstowych Domyślny folder wejściowy i Domyślny folder wyjściowy
      5. .
    5. Kliknij przycisk Analizuj obrazy w lewym dolnym rogu okna programu Cell Profiler. Po zakończeniu analizy na ekranie pojawi się okno Analiza zakończona. Kliknij przycisk OK w oknie Analiza zakończona.
      UWAGA: Ta czynność spowoduje wygenerowanie pliku csv i obrazu jpeg. Plik csv będzie zawierał obszary komórek RPE w obrazie trasowania. Obraz jpeg będzie odpowiadał obrazowi śledzenia RPE, gdzie każda komórka RPE będzie oznaczona numerem (rysunek uzupełniający 13C).
    6. Przenieś obszary RPE z pliku csv do arkusza kalkulacyjnego. Oznacz arkusz kalkulacyjny identyfikatorem myszy.
    7. Przeprowadź ankietę kontroli jakości danych, potwierdzając, że każdy obszar RPE w pliku csv łączy się z w pełni śledzoną komórką RPE na obrazie jpeg. Usuń z arkusza kalkulacyjnego wszystkie wartości, które nie odpowiadają w pełni obśledzonym komórkom RPE.
    8. Wróć do programu Cell Profiler. Kliknij prawym przyciskiem myszy nazwę obrazu śledzenia RPE w polu Upuść tutaj pliki i foldery i wybierz opcję Wyczyść listę, aby usunąć obraz z programu Cell Profiler.
    9. Powtórz kroki 3.8.3-3.8.8, aby obliczyć rozmiary RPE dla pozostałych trzech obrazów śladowych RPE próbki.
  9. Określ ilościowo średnie rozmiary komórek RPE dla każdej próbki w arkuszu kalkulacyjnym.
  10. Określ ilościowo gęstości komórek RPE dla każdej próbki w arkuszu kalkulacyjnym. Aby obliczyć gęstość komórek RPE, należy podzielić całkowitą liczbę komórek RPE na kwadrant przez całkowitą powierzchnię komórek RPE na kwadrant, która została wykryta przez program Cell Profiler. Określ średnią gęstości komórek RPE z czterech kwadrantów na próbkę.
  11. Określ ilościowo liczbę wielojądrowych komórek RPE na płaskie mocowanie RPE dla każdej próbki. Użyj aplikacji Cell Counter w programie Fiji ImageJ, zgodnie z opisem w krokach 1.15.1-1.15.3, aby policzyć liczbę komórek RPE z więcej niż trzema jądrami w czterech kwadrantach próbki.
  12. Przeprowadź analizę statystyczną średniej wielkości i gęstości komórek RPE, a także liczby wielojądrowych komórek RPE, aby określić, czy istnieją znaczące różnice między grupami w badaniu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ukończenie opisanego w tym artykule protokołu fenotypowania RPE dostarcza ilościowej analizy nieprawidłowości strukturalnych RPE powszechnie obserwowanych w mysich modelach AMD. Aby potwierdzić skuteczność tego protokołu, użyliśmy go u myszy, o których wiadomo, że wykazują patologie RPE, w tym myszy transgenicznych, które wykazują nadekspresję WT Tmem135 napędzanej przez promotor beta-aktyny kurczaka (Tmem135 TG)30 i starszych myszy C57BL/6J31,<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiliśmy protokół fenotypowania do oceny strukturalnych patologii RPE w modelach mysich. Opisaliśmy etapy wymagane do przetwarzania oczu dla różnych technik obrazowania, w tym mikroskopii świetlnej, elektronów transmisyjnych i konfokalnej, a także ilościowe określenie typowych patologii obserwowanych za pomocą tych metod obrazowania. Udowodniliśmy skuteczność naszego protokołu fenotypowania RPE, badając Tmem135 TG i 24-miesięczne myszy WT, ponieważ myszy te wykazują patologie RPE 3...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy tego protokołu nie ujawniają informacji i nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Satoshi Kinoshita i University of Wisconsin (UW) Translational Research Initiatives in Pathology laboratory (TRIP) za przygotowanie naszych tkanek do mikroskopii świetlnej. Ten rdzeń jest wspierany przez Wydział Patologii i Medycyny Laboratoryjnej UW, University of Wisconsin Carbone Cancer Center (P30 CA014520) oraz Biuro Dyrektora NIH (S10OD023526). Mikroskopię konfokalną wykonano w Zespole Biochemii UW Optical Core, który powstał przy wsparciu Zakładu Biochemii UW. Prace te były również wspierane przez granty z National Eye Institute (R01EY022086 dla A. Ikedy; R01EY031748 C. Bowesowi Rickmanowi; P30EY016665 do Zakładu Okulistyki i Nauk Wizualnych UW; P30EY005722 do Duke Eye Center; NIH T32EY027721 do M. Landowskiego; F32EY032766 do M. Landowskiego), Timothy William Trout Chairmanship (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); oraz nieograniczony grant z Research to Prevent Blindness (Duke Eye Center).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1 M Bufor kakodylowy pH7,2PolyScientiifc R& D CompanyS1619
100 Capacity Slide Box Dotego protokołu potrzebne są dwa (jeden dla H& Prowadnice barwione elektrycznie i jedna do płaskich mocowań RPE.)
100% etanol MDS Warehouse2292-CASEMoże być używany do wytwarzania rozcieńczonych roztworów etanolu w tym protokole.
1-kierunkowy kran odcinający, 2 żeńskie zamki LuerQosina11069
1x roztwór buforu fosforanowego (PBS)W tym protokole można użyć wstępnie przygotowanego 1x PBS. 
Mikroprobówki 2,0 mlGenesee Scientific 24-283-LR
24 Kapsułka do osadzania wnęki Substytut formyMikroskopia elektronowa Sciences70165
24-calowe rurki PVC z końcówkami LuerFisher ScientificNC1376778
400 Mesh Gilder Cienkie siatki z siatki kwadratowejMikroskopia elektronowa NaukiT400-Cu
95% etanoluMDS Magazyn2293-CASE
Chłonne podkłady z wodoodporną barierą dla wilgoci (23 cale na 24 cale)VWR56616-031
Regulowany 237 ml  Butelka z rozpylaczemVWR23609-182
Alexa Fluor488 Sprzężony osioł anty-królik IgG Thermo Fisher ScientificA-21206
Folia
BD Precyzyjny ślizg 19 Igła strzykawkiSigma-Aldrich 
Kleszcze paprociowe; Zakrzywiony; drobne ząbkowania krzyżowe; 4 "Długość, 1 mm Szerokość końcówkiRoboz Instrument chirurgicznyRS-5211Znany w tym protokole jako zakrzywione kleszcze.
Szczotka do włosów wielbłądaMikroskopia elektronowa Nauki65575-02
Komora
Przepływomierz
węgla Zbiornik
Zaciski przedłużające bolce Castaloy FisherScientific 05-769-7Q
Żeliwny stojak nośny w kształcie litery LFisher Scientific 11-474-207
proliferacji komórekDostępne do pobrania: https://cellprofiler.org/releases
Przezroczysty lakier do paznokciMikroskopia elektronowa Sciences72180
Szkiełka mikroskopowe Colorfrost LawendaVWR10118-956
Komputer
DAPISigma-AldrichD9542-5MG
destylowaną wodę H20z systemu oczyszczania Milli-Q.
Dumont Pęseta z cienką końcówką; Wzór #55Instrument chirurgiczny RobozRS-4984Znany w tym protokole jako kleszcze z cienką końcówką, a do tego protokołu potrzebne są 3 (dwa do sekcji i jeden do przetwarzania pod mikroskopem elektronowym).
Mikroskopia elektronowa Uchwyt siatkiMikroskopia elektronowa Nauki71147-01
EPON 815 Żywicznamikroskopia elektronowa Nauki14910
Epredia Mark-It Znakowanie tkanek Żółty barwnikFisher Scientific 22050460Podczas korzystania z tego barwnika do znakowania tkanek należy postępować zgodnie z protokołem producenta. 
Epredia Nośnik montażowyFisher Scientific22-110-610Służy do montażu H& E slajdy. 
Seria Fiber-Lite Mi-150 Illuminator, halogenowe źródło światła 150 wDolan-Jenner IndustriesMi-150Źródło światła do mikroskopu preparacyjnego.
Fiji ImageJdostępny do pobrania: https://imagej.net/downloads
Łącznik hakowy Flexaframe CastaloyThermo Scientific   14-666-18Q
Wyciąg
Aldehyd glutarowy 2,5% w buforze fosforanowym, pH 7,4, 32%Mikroskopia elektronowa Sciences16537-05
JEM-1400 Transmisyjny mikroskop elektronowy (JEOL) z kamerą
Laboratoryjna wytrząsarkastołowaDo tych eksperymentów potrzebne są dwa. Jeden powinien mieć temperaturę pokojową, a drugi powinien znajdować się w chłodni o temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Laserowe etykiety tagów kriogenicznychMikroskopia elektronowa Sciences77564-05
Mikroskopia elektronowacytrynianu ołowiuSciences 17800
Leica EM UC7Ultramikrotom
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlipsThermo Fisher Scientific22X22I24788001LSSzkiełka nakrywkowe należy stosować do płaskich mocowań RPE, ponieważ mają one podniesione krawędzie i są dostosowane do grubości RPE.
Mayer's HematoxylinVWR100504-406
McPherson-Vannas Micro Nożyczki sprężynowe do preparowaniaRoboz Instrument chirurgicznyRS-5600Znany w protokole jako nożyczki do mikropreparacji.
MetanolFisher Naukowy Myszy A412-4
Każdy model myszy AMD i jej odpowiednie elementy sterujące mogą działać z tym protokołem.
Nożyczki do mikro preparacji; Wersja standardowa; Zakrzywiony; Ostre punkty; 24 mm Długość ostrza; 4,5-calowyinstrument chirurgiczny RobozRS-5913Znany w tym protokole jako zakrzywione nożyczki.
Microsoft Excel
Stojaki
Mikroskop konfokalny
Normalna surowica osłaSouthernBiotech0030-01
Numer 11 Sterylne jednorazowe ostrza skalpelaVWR21909-380
Tetratlenek osmu Mikroskopia elektronowa Sciences19150
Paraformaldehyd, 32%Nauki o mikroskopii elektronowej15714-S
Ołówek
szalkę PetriegoVWR 21909-380
Końcówki do pipet Pipety
 
Poliklonalne przeciwciało anty-ZO-1Thermo Fisher Scientific402200
Mikroskopia elektronowatlenku propylenu20412
ŻyletkaVWR10040-386
Płytka taca do perfuzji
Shandon Eozyna Y AlkoholVWR89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip marker permanentnyZszywki642736
Stojak na suwaki do barwieniaGrainger49WF31
Kwadratowe szkiełka osłonoweFisher Scientific 12-541B
Naczynie do barwienia z pokrywąGrainger49WF30Potrzeba 15 do H& E procedura barwienia.
Jednorazowa strzykawka Luer-Slip 50 ml Target, wykonana w całości z tworzywa sztucznego Thermo Scientific S7510-50Używać wyłącznie cylindra strzykawki.
TimerFisher1464917
Octan uranyluMikroskopia elektronowa Sciences22400
Piec
Vectashield Montaż mediumVector LaboratoriesH-1000Służy do montażu płaskich mocowań RPE. 
XyleneFisher Naukowy 
MikroskopTen mikroskop ma możliwość generowania zszytych obrazów 20x. Jeśli mikroskop świetlny nie ma takiej pojemności, zrób zdjęcia całej siatkówki, które nieznacznie zachodzą na siebie. Użyj programu Adobe Photoshop, aby połączyć te obrazy. Zapoznaj się z instrukcjami programu Adobe Photoshop, aby uzyskać informacje na temat zszywania obrazów. 
Zeiss Stemi 2000 Mikroskop preparacyjnyMikroskopia elektronowa Nauki65575-02
aluminiowaZ192546eutanazji dwutlenku węgladwutlenkudwutlenku węglaProgram W protokole tym zastosowano Program CCD ORIUS (1000) o całkowitej długości na mikroprobówkiNikon A1RS na Sciences myszypróżniowy22050283 świetlny Zeiss Axio Imager 2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170(2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34(2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19(2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19(2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160(2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33(2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235(2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16(2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392(2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119(2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588(2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal Pigmented EpitheliumAge Related Macular DegenerationMouse ModelsRPE PathologiesLight MicroscopyTransmission Electron MicroscopyConfocal MicroscopyCardiac PerfusionRPE QuantificationMolecular Pathways

Related Articles