Arytmie są bardzo powszechne i klinicznie bardzo istotne; Jednak obecne leczenie pozostaje w dużej mierze niewystarczające, ponieważ większość strategii terapeutycznych koncentruje się tylko na objawach, a nie na mechanizmach przyczynowych arytmii. W związku z tym pilnie potrzebne jest lepsze zrozumienie złożonych mechanizmów chorobowych, aby opracować nowatorskie, innowacyjne i przyczynowe metody leczenia.
Celem obecnego zbioru metod JoVE jest dostarczenie bezstronnego i zróżnicowanego zestawu protokołów pozwalających na kompleksowe zbadanie różnych aspektów arytmogenezy.
Zmieniona homeostaza wapnia jest jedną z cech charakterystycznych arytmogenezy, ale pozostaje trudna do zbadania, ponieważ należy wziąć pod uwagę wiele aspektów, z których każdy wymaga określonych technik do zbadania 1,2. W tym zbiorze metod Tomsits i wsp. zapewniają protokół, który umożliwia izolację kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych od tej samej myszy oraz jednoczesne badanie zarówno prądu wapniowego typu L, jak i stanów przejściowych wapnia3. W ten sposób protokół ten umożliwia naukowcom badanie zaburzeń związanych z wapniem w bardziej globalny sposób i jednoczesne zmniejszenie liczby zwierząt, co stanowi znaczącą poprawę naukową i etyczną.
Niemniej jednak łatanie izolowanych komórek pozostaje złożonymi, pracochłonnymi i niskoprzepustowymi eksperymentami4. Aby rozwiązać ten problem, Seibertz i in. przedstawili protokół wykorzystujący barwnik wrażliwy na napięcie do pomiaru potencjałów czynnościowych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych5. Ponieważ technika ta nie wymaga intensywnego szkolenia (jak w przypadku zaciskania krosówek) i może być stosowana przy użyciu stosunkowo taniej konfiguracji eksperymentalnej, protokół ten ma szerokie zastosowanie.
Oprócz kardiomiocytów ważną rolę w elektrofizjologii odgrywają również inne typy komórek (np. fibroblasty lub makrofagi) 6,7,8. Aby zbadać efekty specyficzne dla typu komórki w układzie przewodzenia, Xia i in. zapewniają przewodnik krok po kroku, jak zidentyfikować węzeł zatokowy (SAN) i węzeł przedsionkowo-komorowy (AVN) u myszy 9,10, a następnie mikrodysekcję i fluorescencyjne sortowanie komórek aktywowanych (FACS) w celu wyizolowania i zbadania makrofagów9 lub obrazowania immunofluorescencji w całości. Pozwala to na identyfikację różnych typów komórek, ocenę trójwymiarowej struktury oraz badanie ekspresji białek specyficznych dla danego typu komórki w obrębie SAN/AVN10.
Co więcej, zapisy z matrycą wieloelektrodową (MEA) mogą być wykonywane na takich preparatach do montażu całościowego, jak przedstawione przez Kumara i wsp.11. Metoda ta jest doskonałym uzupełnieniem obecnie stosowanych technik, ponieważ jest stosunkowo szybka i prosta, a także zapewnia doskonałą rozdzielczość przestrzenną. Umożliwia interwencje farmakologiczne i może być łatwo stosowany do innych określonych obszarów serca (np. AVN).
Autonomiczny układ nerwowy odgrywa istotną rolę w elektrofizjologii12,13,14 i istnieją strategie leczenia, takie jak sympatektomia 15,16,17,18 lub ablacja zwojów serca19. Niemniej jednak podstawy mechanistyczne są nadal w dużej mierze nieznane, zwłaszcza że struktury anatomiczne autonomicznego układu nerwowego nie są łatwo dostępne u myszy. W tym wydaniu Scherschel i in. przedstawiają protokół, który umożliwia identyfikację i rozwarstwienie zwojów gwiaździstych u myszy w celu zbadania ekspresji genów i białek w różnych typach komórek20. Pozwoli to na badanie nowych aspektów przebudowy autonomicznej.
Studiowanie elektrofizjologii na poziomie komórkowym ma kluczowe znaczenie dla zbadania podstawowych mechanizmów. Jednak badania in vivo na modelach zwierzęcych są nadal potrzebne, aby potwierdzić wyniki badań komórkowych i potwierdzić (pato)fizjologiczne znaczenie zidentyfikowanych struktur docelowych21. Myszy są najczęściej stosowane, ale szczególnie pokolenie myszy transgenicznych jest złożone. W tym wydaniu Shimura i in. prezentują protokół wykorzystujący edycję genów CRISPR-Cas9 do szczegółowego badania złożonych ról regulacyjnych obciętych białek i ich skutków in vivo. W tym celu stworzyli transgeniczny model myszy z pojedynczą mutacją punktową w genie GJA1 kodującym koneksynę-43. Powoduje to wyrażenie regularne pełnej długości Cx43, ale zredukowane wyrażenie obciętego Cx4322.
Jednym z głównych ograniczeń badań in vivo jest konieczność znieczulania zwierząt podczas eksperymentów, co może wpływać na różne parametry elektrofizjologiczne, a tym samym może nie odzwierciedlać "prawdziwej" sytuacji23,24. Z drugiej strony urządzenia telemetryczne pozwalają na badanie obudzonych i swobodnie poruszających się myszy przez długie okresy od kilku tygodni do miesięcy25,26. Rötzer i wsp. opisują, w jaki sposób wszczepić urządzenia telemetryczne do jednoczesnego rejestrowania tętna i ciśnienia krwi u myszy, co w szczególności umożliwia badanie autonomicznego układu nerwowego i wrażliwości barorefleksu27.
Chociaż urządzenia telemetryczne są bardzo potężnymi narzędziami, pozostaje poważne wyzwanie: jak analizować te duże zestawy danych. Aby rozwiązać ten problem, Tomsits i wsp. opracowali protokół do analizy telemetrycznych zapisów EKG w ustandaryzowany sposób półautomatyczny28. Postępując zgodnie z ich protokołem, naukowcy mogą uzyskać podstawowe parametry EKG (np. tętno lub interwał PR) i przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku indywidualnie zdefiniowanych arytmii (np. pauzy, tachykardii). Co ważne, omawiają również wyzwania i pułapki związane z rejestrowaniem i analizą telemetrycznego EKG, w tym pewne wskazówki dotyczące poprawy jakości sygnału.
Nowo opracowane urządzenia medyczne, takie jak protezy zastawek, są dokładnie testowane na modelach zwierzęcych przed ich zastosowaniem u ludzi29. Jednak badania na zdrowych zwierzętach mogą nie przekładać się idealnie na pacjentów, zwłaszcza tych, którzy przeszli wcześniej operację 30,31. Aby przezwyciężyć takie ograniczenia, Grab i in. zapewniają protokół drukowania 3D indywidualnych, specyficznych dla pacjenta modeli serca32. Ich modele są elastyczne i przypominają właściwości biomechaniczne, a także cechy hemodynamiczne podobne do ludzkich pacjentów; Modele te umożliwiają nauczanie lekarzy, testowanie nowatorskich procedur lub urządzeń interwencyjnych oraz planowanie zindywidualizowanych strategii leczenia, zwłaszcza u pacjentów o złożonej anatomii.
Protokoły zawarte w tym zbiorze metod JoVE pomogą wielu badaczom w badaniu elektrofizjologii i arytmii. Główną zaletą tej kolekcji jest to, że zapewnia ulepszenia i innowacje dla tradycyjnych technologii, ale także demonstruje nowatorskie podejścia do badania różnych aspektów arytmogenezy. Zbiór ten pomoże zatem poszerzyć naszą wiedzę na temat tych złożonych chorób i ostatecznie opracować innowacyjne terapie dla pacjentów z arytmią.