Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila

Podsumowanie

Ten raport przedstawia nową procedurę przygotowania próbki do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila. Metoda ta jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu z metodą tradycyjną i jest szczególnie przydatna w analizie ultrastrukturalnej połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila.

Streszczenie

Połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ) stało się cennym systemem modelowym w dziedzinie neuronauki. Zastosowanie mikroskopii konfokalnej w Drosophila NMJ umożliwia naukowcom uzyskanie informacji synaptycznych, obejmujących zarówno dane ilościowe dotyczące obfitości synaps, jak i szczegółowy wgląd w ich morfologię. Jednak rozproszony rozkład i ograniczony zasięg widzenia TEM stanowią wyzwanie dla analizy ultrastrukturalnej. Niniejsze badanie wprowadza innowacyjną i wydajną metodę przygotowania próbki, która przewyższa konwencjonalne podejście. Procedura rozpoczyna się od umieszczenia metalowej siatki u podstawy płaskodennej butelki lub probówki, a następnie umieszczenia utrwalonych próbek larw na siatce. Nad próbkami umieszcza się dodatkową siatkę, upewniając się, że są one umieszczone między dwoma siatkami. Utrwalone próbki są dokładnie odwadniane i infiltrowane przed przystąpieniem do procedury zatapiania. Następnie zatapianie próbek w żywicy epoksydowej odbywa się w sposób płaski, co pozwala na przygotowanie mięśni do ułożenia i przekroju. Korzystając z tych kroków, wszystkie mięśnie larw Drosophila można uwidocznić pod mikroskopem świetlnym, co ułatwia późniejsze pozycjonowanie i cięcie. Nadmiar żywicy usuwa się po zlokalizowaniu^{6 i 7 mięśnia} segmentów ciała_A2 i A₃. Wykonuje się seryjne ultracienkie cięcie 6. lub 7. mięśnia.

Wprowadzenie

Mikroskopia elektronowa to jedna z najbardziej idealnych metod badania ultrastruktury materiałów biologicznych, która może wizualnie i dokładnie pokazać wewnętrzną strukturę komórek na poziomie nanoskali¹. Jednak ze względu na złożoność procesu przygotowania próbki i wysokie koszty, mikroskopia elektronowa nie jest tak popularna jak mikroskopia lekka. Ostatnie postępy w technikach mikroskopii elektronowej doprowadziły do znacznej poprawy jakości obrazu, co zbiegło się w czasie ze znacznym zmniejszeniem związanego z tym obciążenia pracą. W związku z tym mikroskopia elektronowa odegrała ważną rolę w rozwoju wiedzy naukowej w różnych dziedzinach².

Drosophila to doskonały model zwierzęcy do wykonywania manipulacji genetycznych w celu precyzyjnej kontroli przestrzennej i czasowej ekspresji docelowych genów³. Poza tym Drosophila ma zalety krótkiego okresu wzrostu i łatwej hodowli w porównaniu z modelami ssaków; dlatego Drosophila jest szeroko stosowana w badaniach morfologicznych^4,5.

U larw Drosophila, bulony połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) są szeroko rozpowszechnione w mięśniach6^,7, a barwienie immunologiczne NMJ może łatwo dostarczyć informacji o ilości i morfologii synaps^8,9 . Butony NMJ znajdujące się^{w 6/}7 mięśniach segmentów_A2 i_A3 doskonale nadają się do badań ilościowych i morfologicznych przy użyciu mikroskopii świetlnej. Dzieje się tak ze względu na ich rozmiar i obfitość^10,11. Dlatego larwy Drosophila NMJ są uważane za użyteczny model do badań neurobiologicznych¹².

Jednak trudno jest obserwować ultrastrukturę NMJ przez TEM. Ponieważ okno skanowania transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest wąskie, trudno jest ustawić szeroko rozpowszechnione boutons¹³. Innym powodem jest to, że ściana ciała Drosophila jest podatna na zwijanie się podczas etapu dehydratacji alkoholowej w protokole przygotowania próbki⁷.

Tradycyjne badania zazwyczaj wybierały jako próbki bulony między 6 a 7 mięśniem segmentów A₂ i_{A 3} ze względu na ich obfitość i rozmiar^14,15. Szóstyⁱ siódmy mięsień segmentów_A2 i _A3 są większe niż inne mięśnie i zawierają więcej batutonów. Jednak, gdy próbki zostały przygotowane do mikroskopii elektronowej, utrwalone próbki miały tendencję do stawania się cienkimi i podatnymi na zwijanie się, co prowadziło do niewłaściwego ustawienia 6. i 7. mięśnia segmentów_A2 i_A3.

Niniejszym informujemy o nowej procedurze przetwarzania, która jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu do tradycyjnej metody przygotowania próbek7^,16, pozwalając próbkom pozostać płaskimi podczas późniejszego odwodnienia, ułatwiając tym samym lepsze umiejscowienie połączeń nerwowo-mięśniowych larw Drosophila.

Protokół

UWAGA: Metoda przygotowania próbki z transmisyjnej mikroskopii elektronowej użyta w tym artykule została opisana wcześniej¹⁶. Należy zauważyć, że dobór odczynników i dostosowanie dawkowania są konieczne w zależności od próbki. W procesie przygotowania próbki stosuje się wiele toksycznych odczynników chemicznych, dlatego operator musi podjąć pewne środki ochronne, takie jak noszenie odzieży ochronnej i rękawic oraz praca pod wyciągiem.

1. Procedura preparacji, utrwalania i umieszczania

1. Rozwarstwienie
   1. Wypreparuj wędrujące larwy późno w trzecim stadium w roztworze Jana i uzyskaj całą ścianę ciała w oparciu o standardowe procedury¹⁷. Przygotuj roztwór Jana w następujący sposób: 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 35 mM sacharozy, 5 mM HEPES, pH 7,4
      UWAGA: Ściana ciała larw Drosophila odnosi się do zewnętrznej powłoki lub powłoki stadium larwalnego muszki owocowej Drosophila. Obejmuje to naskórek, komórki naskórka i leżące poniżej tkanki, które tworzą egzoszkielet larwalny. Ściana ciała zapewnia wsparcie strukturalne i ochronę oraz służy jako bariera między ciałem larwy a środowiskiem zewnętrznym¹⁷.
2. Utrwalenie
   1. Utrwalać ścianę ciała larwy w komorze rozwarstwiającej w temperaturze 4 °C przez noc za pomocą utrwalacza. Aby przygotować utrwalacz, zmieszać 2% aldehydu glutarowego i 2% formaldehydu w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,4)
   2. Przepłukać próbki kilkakrotnie buforem kakodylanu sodu.
   3. Przygotować 1% OsO₄ w buforze kakodylowym. Utrwalić próbki w 1% OsO₄ przez 2 godziny, a następnie kilkakrotnie przepłukać w wodzie destylowanej.
      UWAGA: Podwójne utrwalenie aldehydami i OsO₄ zapewnia lepszą ochronę ultrastruktury komórkowej. Poza tym OsO₄ może zabarwić tkankę próbki, dzięki czemu kontrast między światłem a próbką jest bardziej widoczny¹⁸.
   4. Wybarwić próbki połączeń nerwowo-mięśniowych Drosophila 2% nasyconym octanem uranylu przez 2 godziny, a następnie kilkakrotnie przepłukać wodą dejonizowaną (Rysunek 1A).
3. Rozmieszczenie próbek
   1. Wytnij nożyczkami dwa okrągłe kawałki metalowej siatki o podobnej wielkości (wielkość porów 270 μm).
   2. Umieść wcześniej metalową siatkę (270 μm) u podstawy butelki z płaskim dnem.
   3. Umieść utrwalone próbki larw na siatce, a następnie umieść na nich kolejną siatkę, tak aby próbki zostały umieszczone między dwiema siatkami.

2. Odwodnienie

UWAGA W tym artykule zastosowano metodę odwadniania etanolu metodą gradientu.

1. Próbki należy odwadniać kolejno w rosnącym gradiencie stężeń etanolu (50%, 70%, 85%, 95% raz każda, 100% dwukrotnie), każda przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
2. Przepłukać próbki dwukrotnie tlenkiem propylenu w temperaturze pokojowej przez 5 minut za każdym razem (Rysunek 1C).

3. Infiltracja

UWAGA: Infiltracja jest jednym z niezbędnych kroków do przygotowania próbki TEM. Infiltracja pozwala na stopniową wymianę pożywki odwadniającej na pożywkę zatapiającą w próbce, aby umożliwić wypełnienie szczeliny komórki pożywką do zatapiania¹⁹.

1. Umieścić próbki w zmieszanym roztworze tlenku propylenu i żywicy epoksydowej w stosunku 1:1 i 1:2 przez 1 godzinę każda, a następnie czystą żywicę epoksydową przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.

4. Osadzanie

1. Przygotuj folię polietylenową i pokrój ją na duży kwadrat (około 5 × 5 cm) i małą pustą prostokątną podporę (około 2 × 2 cm). Przyklej mały kwadrat do dużego kwadratu.
2. Umieść wystarczającą ilość żywicy epoksydowej na środku dużego kwadratu.
3. Umieść próbki we wstępnie umieszczonej żywicy epoksydowej stroną mięśniową skierowaną do góry. Użyj stereoskopu.
4. Dodaj kilka kropli żywicy do próbek, a następnie przykryj je folią PE (nieco większą niż przekładka) (Rysunek 1D-E).
5. Polimeryzuj próbki w temperaturze odpowiednio 37 °C, 42 °C i 60 °C przez 24 godziny (Rysunek 1F).

5. Procedura podziału na sekcje

1. Usunąć nadmiar części ścianki ciała larwy ostrym ostrzem i zachować trapez, w tym segment A₂/A₃.
   UWAGA: Górna linia powinna znajdować się w pobliżu 13^{. mięśnia}, a linia bazowa powinna znajdować się z dala od próbki do żywicy epoksydowej. Wysokość między linią grzbietu a linią podstawową wynosi około 5-8 mm.
2. Usuń trapez z pozostałej części próbki i przyklej go do kapsułki wypełnionej żywicą za pomocą kleju A/B.
3. Potwierdź położenie 6 i 7 mięśnia segmentów A₂ i A₃ pod mikroskopem świetlnym (Rysunek 1G) i utrzymuj płaszczyznę styczną równoległą do 6 mięśnia.
4. Odciąć jedną piątą próbki wzdłuż dwóch stron segmentu A₃.
   UWAGA: Usuń większość 6. mięśnia i zachowaj 1/3 szerokości 7. mięśnia.
5. Za pomocą ultracienkiego mikrotomu przygotuj ultracienki fragment próbki, zaczynając od 6. mięśnia.
   UWAGA: Każdy plasterek ma grubość około 90 nm.
6. Dołącz jak najwięcej plasterków do każdej siatki miedzianej.
7. Wykonaj transmisyjną mikroskopię elektronową zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁶.

Wyniki

Ściana ciała larwy Drosophila składa się z 30 identyfikowalnych włókien mięśniowych ułożonych w regularny wzór i po sekcji oraz fiksacji przypomina cienki plaster²¹(Rysunek 1A). Próbka pozostaje płaska podczas procesu odwodnienia dzięki zastosowaniu metalowych siatek (Rysunek 1B, C). Mięśnie ciała larwy są zatopione w cienkiej płytce wykonanej z żywicy epoksydowej (Rysunek 1D...

Dyskusja

Próbki larw Drosophila mają tendencję do zwijania się podczas odwodnienia, ponieważ próbki są cienkie, co utrudnia dokładne zlokalizowanie połączenia nerwowo-mięśniowego, zwiększając w ten sposób trudność i nakład pracy związany z przygotowaniem próbki. Tradycyjnym ulepszeniem jest skrócenie próbki⁷, ale próbki nadal były zwinięte w różnym stopniu.

W naszej metodzie występują dwa kluczowe etapy: po pierwsze, próbki pozostają płaskie przez cały proces odwadniani...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,2-epoksypropan	SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD	JYJ 037-2015	Środek penetrujący
Drosophila Zapasy	Bloomington	brak	Wszystkie szczepy kontrolne Drosophila typu dzikiego użyte w tych badaniach to W1118 i były hodowane zgodnie ze standardowymi metodami hodowli
Probówki szklane z płaskim dnem	Haimen Chenxing Sprzęt eksperymentalny Firma	brak	Probówki szklane płaskodenne (butelka) z korkiem z gąbki (lub korkiem do butelki)
Sieciownik K4M	Agar Scientific	Cat# 1924B	Żywice do zatapiania oparte są na formule wysoce usieciowanego akrylanu i metakrylanu
Żywica K4M (monomer B)	Agar Scientific	Lot # 631557	Monomer żywicy
Folia poliwinylowa	Haimen Chenxing Sprzęt eksperymentalny Firma	brak	Przezroczysta folia polietylenowa jest najlepsza, grubość około 0,2 mm
SPI Chem DDSA	SPI	SpI#02827-AF	Dodecenyl Bezwodnik bursztynowy
SPI-Chem DMP-30 Epoksyd	SPI	02823-DA	Akcelerator
SPI-Chem NMA		SPI SpI#02828-AF	Hardner do żywicy epoksydowej
SPI-PON 812 Epoksydowej	SPI	SPI#0259-AB	Monomer
żywicySiatka stalowa	Sklep ogrodniczy Yuhuiyuan (online)	none	Siatka miedziana lub ze stali nierdzewnej
Transmisyjna mikroskopia elektronowa	Hitachi H-7650	11416692	Wszystkie siatki (na których zebrano próbki) zabarwiono cytrynianem ołowiu i obserwowano pod transmisyjną mikroskopią elektronową.
Ultracienki mikrotom	Leica UC7 ultracienki	mikrotom 595915	Wszystkie operacje cięcia są wykonywane na ultracienkim mikrotomie Leica UC7 za pomocą noża diamentowego