Method Article

Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila

DOI:

10.3791/64934

⸱

September 15th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1The School of Medicine, Southeast University, 2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 3The School of Life Science and Technology, Southeast University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming

to:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport przedstawia nową procedurę przygotowania próbki do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila. Metoda ta jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu z metodą tradycyjną i jest szczególnie przydatna w analizie ultrastrukturalnej połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ) stało się cennym systemem modelowym w dziedzinie neuronauki. Zastosowanie mikroskopii konfokalnej w Drosophila NMJ umożliwia naukowcom uzyskanie informacji synaptycznych, obejmujących zarówno dane ilościowe dotyczące obfitości synaps, jak i szczegółowy wgląd w ich morfologię. Jednak rozproszony rozkład i ograniczony zasięg widzenia TEM stanowią wyzwanie dla analizy ultrastrukturalnej. Niniejsze badanie wprowadza innowacyjną i wydajną metodę przygotowania próbki, która przewyższa konwencjonalne podejście. Procedura rozpoczyna się od umieszczenia metalowej siatki u podstawy płaskodennej butelki lub probówki, a następnie umieszczenia utrwalonych próbek larw na siatce. Nad próbkami umieszcza się dodatkową siatkę, upewniając się, że są one umieszczone między dwoma siatkami. Utrwalone próbki są dokładnie odwadniane i infiltrowane przed przystąpieniem do procedury zatapiania. Następnie zatapianie próbek w żywicy epoksydowej odbywa się w sposób płaski, co pozwala na przygotowanie mięśni do ułożenia i przekroju. Korzystając z tych kroków, wszystkie mięśnie larw Drosophila można uwidocznić pod mikroskopem świetlnym, co ułatwia późniejsze pozycjonowanie i cięcie. Nadmiar żywicy usuwa się po zlokalizowaniu6 i 7 mięśnia segmentów ciałaA2 i A3. Wykonuje się seryjne ultracienkie cięcie 6. lub 7. mięśnia.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia elektronowa to jedna z najbardziej idealnych metod badania ultrastruktury materiałów biologicznych, która może wizualnie i dokładnie pokazać wewnętrzną strukturę komórek na poziomie nanoskali1. Jednak ze względu na złożoność procesu przygotowania próbki i wysokie koszty, mikroskopia elektronowa nie jest tak popularna jak mikroskopia lekka. Ostatnie postępy w technikach mikroskopii elektronowej doprowadziły do znacznej poprawy jakości obrazu, co zbiegło się w czasie ze znacznym zmniejszeniem związanego z tym obciążenia pracą. W związku z tym mikroskopia elektronowa odegrała ważną rolę w rozwoju wiedzy naukowej w różnych dziedzinach

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Metoda przygotowania próbki z transmisyjnej mikroskopii elektronowej użyta w tym artykule została opisana wcześniej16. Należy zauważyć, że dobór odczynników i dostosowanie dawkowania są konieczne w zależności od próbki. W procesie przygotowania próbki stosuje się wiele toksycznych odczynników chemicznych, dlatego operator musi podjąć pewne środki ochronne, takie jak noszenie odzieży ochronnej i rękawic oraz praca pod wyciągiem.

1. Procedura preparacji, utrwalania i umieszczania

  1. Rozwarstwienie
    1. Wypreparuj wędrujące larwy późno w trzecim stadium w roztworze Jana i uzyskaj ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ściana ciała larwy Drosophila składa się z 30 rozpoznawalnych włókien mięśniowych ułożonych w regularny wzór i wygląda jak cienki plasterek po rozbiorze i utrwaleniu21(Rysunek 1A). Próbka pozostaje płaska podczas procesu odwadniania ze względu na obecność metalowych oczek (Rysunek 1B, C). Mięsień ciała larwy jest zakopany w cienkiej płytce wykonanej z żywicy epoksydowej ( Rysunek 1D-G

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki larw Drosophila mają tendencję do zwijania się podczas odwodnienia, ponieważ próbki są cienkie, co utrudnia dokładne zlokalizowanie połączenia nerwowo-mięśniowego, zwiększając w ten sposób trudność i nakład pracy związany z przygotowaniem próbki. Tradycyjnym ulepszeniem jest skrócenie próbki7, ale próbki nadal były zwinięte w różnym stopniu.

W naszej metodzie występują dwa kluczowe etapy: po pierwsze, próbki pozostają płaskie przez cały proces odwadniani.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Natural Science Foundation of China Grant 32070811, oraz Southeast University (China) Analysis Test Fund 11240090971. Dziękujemy Laboratorium Mikroskopii Elektronowej i Centrum Analizy Morfologicznej, Szkoła Medyczna, Uniwersytet Południowo-Wschodni, Nankin, Chiny.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-epoksypropanSHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTDJYJ 037-2015Środek penetrujący
Drosophila ZapasyBloomingtonbrakWszystkie szczepy kontrolne Drosophila typu dzikiego użyte w tych badaniach to W1118 i były hodowane zgodnie ze standardowymi metodami hodowli
Probówki szklane z płaskim dnemHaimen Chenxing Sprzęt eksperymentalny Firma brakProbówki szklane płaskodenne (butelka) z korkiem z gąbki (lub korkiem do butelki)
Sieciownik K4M  Agar ScientificCat# 1924BŻywice do zatapiania oparte są na formule wysoce usieciowanego akrylanu i metakrylanu 
Żywica K4M (monomer B)  Agar ScientificLot # 631557Monomer żywicy
Folia poliwinylowaHaimen Chenxing Sprzęt eksperymentalny Firma brakPrzezroczysta folia polietylenowa jest najlepsza, grubość około 0,2 mm
SPI Chem DDSASPISpI#02827-AFDodecenyl Bezwodnik bursztynowy
SPI-Chem DMP-30 EpoksydSPI02823-DAAkcelerator
SPI-Chem NMASPI SpI#02828-AFHardner do żywicy epoksydowej
SPI-PON 812 EpoksydowejSPISPI#0259-ABMonomer
żywicySiatka stalowa Sklep ogrodniczy Yuhuiyuan (online)noneSiatka miedziana lub ze stali nierdzewnej
Transmisyjna mikroskopia elektronowaHitachi H-765011416692Wszystkie siatki (na których zebrano próbki) zabarwiono cytrynianem ołowiu i obserwowano pod transmisyjną mikroskopią elektronową.
Ultracienki mikrotomLeica UC7 ultracienkimikrotom 595915Wszystkie operacje cięcia są wykonywane na ultracienkim mikrotomie Leica UC7 za pomocą noża diamentowego

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
  2. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Me....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Neuromuscular JunctionTransmission Electron MicroscopySample PreparationUltra Thin SectioningEpoxy Resin EmbeddingConfocal MicroscopyMuscle PositioningMetal Mesh TechniqueLarval Body WallSynaptic Structure

Related Articles