Rozwój szczepów gatunków Leishmania z konstytutywną ekspresją eGFP

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodologię używaną do generowania szczepów L. panamensis i L. donovani wyrażających gen eGFP jako stabilny zintegrowany transgen za pomocą systemu pLEXSY. Transfekowane pasożyty klonowano poprzez ograniczenie rozcieńczenia, a klony o najwyższej intensywności fluorescencji u obu gatunków wybrano do dalszego wykorzystania w testach przesiewowych leków.

Streszczenie

Pasożyty pierwotniaków z rodzaju Leishmania powodują leiszmaniozę, chorobę o zmiennych objawach klinicznych, która dotyka miliony ludzi na całym świecie. Zakażenie L. donovani może prowadzić do śmiertelnej choroby trzewnej. W Panamie, Kolumbii i Kostaryce L. panamensis jest odpowiedzialny za większość zgłoszonych przypadków leiszmaniozy skórnej i śluzówkowej. Badanie dużej liczby kandydatów na leki za pomocą dostępnych do tej pory metodologii jest dość trudne, biorąc pod uwagę, że są one bardzo pracochłonne przy ocenie aktywności związków przeciwko wewnątrzkomórkowym formom pasożyta lub przy wykonywaniu testów in vivo. W niniejszej pracy opisano pokolenie szczepów L. panamensis i L. donovani z konstytutywną ekspresją genu kodującego wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP) zintegrowane z locus kodującym 18S rRNA (ssu). Gen kodujący eGFP uzyskano z komercyjnego wektora i amplifikowano za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu jego wzbogacenia i dodania miejsc restrykcyjnych dla enzymów BglII i KpnI. Amplikon eGFP wyizolowano przez oczyszczanie w żelu agarozowym, wytrawiono enzymami BglII i KpnI, a następnie podwiązano do wektora ekspresyjnego Leishmania pLEXSY-sat2.1 wcześniej strawionego tym samym zestawem enzymów. Wektor ekspresyjny ze sklonowanym genem rozmnożono w E. coli, oczyszczono, a obecność insertu zweryfikowano za pomocą PCR kolonii. Oczyszczony plazmid poddano linearyzacji i użyto do transfekcji pasożytów L. donovani i L. panamensis. Integracja genu została zweryfikowana metodą PCR. Ekspresję genu eGFP oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Pasożyty fluorescencyjne klonowano poprzez ograniczenie rozcieńczenia, a klony o najwyższej intensywności fluorescencji wybrano za pomocą cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

Pasożyty pierwotniaków z rodzaju Leishmania wywołują leiszmaniozę, chorobę o szerokim zakresie objawów klinicznych. Choroba ta jest powszechna w 98 krajach, a jej roczna zapadalność szacowana jest na 0,9 do 1,6 miliona przypadków¹. Gatunki Leishmania, które są chorobotwórcze dla ludzi, dzielą się na dwa podrodzaje, a mianowicie L. (Leishmania) i L. (Viannia). Zakażenie niektórymi gatunkami należącymi do L. Podrodzaj (Leishmania), taki jak L. donovani i L. infantum, może powodować leiszmaniozę trzewną (VL), która jest śmiertelna, jeśli nie jest leczona

Protokół

Aby utrzymać sterylność próbek, wszystkie kroki związane z hodowlą pasożytów powinny być wykonywane wewnątrz kaptura o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2) lub zgodnie z lokalnymi przepisami BHP. Graficzne podsumowanie tego protokołu można znaleźć w Rysunek 1.

Rysunek 1: Schemat podsumowania protokołu generowania pasożytów L. panamensis i L. donovani z ekspresją eGFP przy użyciu rodzi....

Wyniki

Po zbudowaniu konstruktu pLEXSY-eGFP i przekształceniu kompetentnych komórek E. coli, kolonie zawierające konstrukt z insertem eGFP wygenerują produkt o wartości około 859 punktów bazowych po przeprowadzeniu PCR kolonii opisanego w sekcji 1.2 (Rysunek 3A). Całkowite trawienie oczyszczonego plazmidu z dodatnich kolonii za pomocą SwaI powinno dać dwa charakterystyczne fragmenty w elektroforezie żelowej, fragment 2,9 kbp, który jest częścią wektora PLEXSY zawierającą wszystkie niezbędne.......

Dyskusja

Zalety i wady różnych genów reporterowych badano u kilku pasożytniczych pierwotniaków. Wśród nich GFP i eGFP są wewnętrznie fluorescencyjne i umożliwiają łatwą kwantyfikację i obrazowanie. Aktywność fluorescencyjną tych białek można wykryć przy minimalnej manipulacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, fluorymetrii lub cytometrii przepływowej. Przeprowadzono niewiele badań nad generowaniem L wykazującego ekspresję GFP. (Viannia), pomimo wykazanej odporności GFP i ich pochodnych jako genów reporterow.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96 dołków Mikropłytki	Corning	CLS3340	Płaskie dno przezroczyste, polistyren, sterylne, pokrywka
Agaroza	Sigma-Aldrich	A4718
Sól sodowa ampicyliny	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra, odpowiednia do hodowli komórkowych
BglII enzym restrykcyjny	New England BioLabs	R0144S	2,000 jednostek. 10,000 jednostek/ml
Kolby do hodowli komórkowych	Corning	CLS430168	Powierzchnia 25 cm2, szyjka skośna, nakrętka (uszczelka korkowa)
System obrazowania	ChemiDoc Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	Niedostępne
D-(+)-Glukoza	Sigma-Aldrich	G7021	proszek, Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowej, odpowiedni do hodowli komórek owadów, odpowiedni do hodowli komórek roślinnych, ≥ 99,5%
Płodowa surowica bydlęca	Sigma-Aldrich	F7524
Bufor ładujący żel	Sigma-Aldrich	G2526	Szybkość migracji różni się w zależności od składu żelu. Rozcieńczyć próbką w stosunku 1:3 do 1:6 przed załadowaniem.
System elektroporacji Gene Pulser Xcell	Bio-Rad	1652660	System składa się z jednostki głównej, dwóch modułów dodatkowych, przedłużacza pojemności (moduł CE) i kontrolera impulsów (moduł PC) oraz komory kuwety ShockPod.
Kuwety do elektroporacji Gene Pulser/MicroPulser	Bio-Rad	1652086	opakowanie 50 szt., 0,2 cm– szczelinowa sterylna kuweta do elektroporacji, do użytku z systemami Gene Pulser i MicroPulser, dla ssaków i innych komórek eukariotycznych
Roztwór gentamycyny	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg / ml w wodzie dejonizowanej, ciecz, 0,1 μ m filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
HEPES roztwór	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7,0-7,6, sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
Mikroskop odwrócony	Olympus	IXplore Standard
KpnEnzym restrykcyjny HF	New England BioLabs	R3142S	4 000 jednostek. 20 000 jednostek/ml
bulion LB z agarem	Sigma-Aldrich	L3147	Wysoce referencyjne, bogate w składniki odżywcze pożywki w proszku do wzrostu drobnoustrojów z agarem, odpowiednie do regularnych  E.coli  kultura.
Rosół LB	Sigma-Aldrich	L2542	Płynna pożywka do wzrostu mikroorganizmów
Mini-Sub Cell GT Poziomy system elektroforezy	Bio-Rad	1640300	Mini poziomy system elektroforezy, zawiera grzebienie 8- i 15-dołkowe, 7 cm x 10 cm Przezroczysta taca
UV pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	Ekspresja mRNA eGFP połączona z 1 powtórzeniem tandemowym sekwencji 50-zasadowej
Zestaw ekspresyjny pLEXSYcon2.1	Jena Bioscience	EGE-1310sat	Zawiera integracyjny konstytutywny wektor ekspresyjny pLEXSY-sat2.1. Dobór antybiotyków transfektantów z Nourseothricin (NTC, clonNAT). Zawiera wszystkie startery do diagnostycznych PCR i sekwencjonowania.
Chlorek potasu	Millipore	529552	klasa biologii molekularnej - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222	do 15 μ g plazmidu gotowego do transfekcji z 3 ml hodowli.
Schneider′ s Pożywka dla owadów	Sigma-Aldrich	S0146	Pożywka używana w naszym laboratorium do hodowli Leishmania.
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S3014	do biologii molekularnej, DNazy, RNazy i proteazy, nie wykryto, ≥ 99% (miareczkowanie)
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	RDD038	BioReodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych, odpowiedni do hodowli komórek owadów, ≥ 99,0%, sypki,
enzym restrykcyjny	New England BioLabs	R0604S	2 000 jednostek. 10 000 jednostek/ml
Filtry strzykawkowe	Corning	CLS431212	membrana z regenerowanej celulozy, średnica 4  mm, wielkość porów 0,2  μ m
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096	System termocyklera, zawiera 96-dołkowy termocykler, przewód zasilający, pierścień podtrzymujący rurkę
Ligaza DNA T4	Promega	M1801	Łączy dwie nici DNA ze spójnymi lub końcami
Bufor Tris-Boran-EDTA	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent, odpowiedni do elektroforezy, 10& razy koncentrat
Wizard Genomic DNA Zestaw do oczyszczania	Promega	A1120
Wizard SV Żel i system czyszczenia PCR	Promega	A9285
XL10-Gold Ultrakompetentne ogniwa	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr, 10 x 0,1 mL. Zawiera gen oporności na kanamycynę na episomie F', do niezwykle wymagającego klonowania wektorów odpornych na chloramfenikol. Sprawność: > 5 x 10 9 transformantów/&mikro; g pUC18 DNA.