Artykuł metodologiczny

Zrozumienie wpływu bakteriofagów strefy umiarkowanej na ich lizogeny poprzez transkryptomikę

3.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64945

⸱

5 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences (IVES), University of Liverpool, 2School of Science, Engineering, and Environment, University of Salford

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół umożliwia ujawnienie wpływu profagów na ich gospodarzy. Kultury bakteryjne są synchronizowane w warunkach, które najlepiej wspierają stan lizogeniczny, ograniczając spontaniczną indukcję. RT-qPCR jednoznacznie odróżnia geny ograniczone do profagów i te niesprzężone z kontroli fagów od tych, które ulegają ekspresji podczas cyklu replikacji litycznej.

Streszczenie

Fagi o umiarkowanej temperaturze są zintegrowane jako profagi w większości genomów bakteryjnych. Niektóre profagi są tajemnicze i utrwalone w chromosomie bakteryjnym, ale inne są aktywne i mogą być wywołane do formy replikacyjnej spontanicznie lub przez ekspozycję na czynniki indukujące. Profagi są powszechnie kojarzone ze zdolnością do nadawania komórce gospodarza produkcji toksyn lub innych cech związanych ze zjadliwością. Nowsze badania wykazały, że mogą odgrywać znacznie większą rolę w zmianie fizjologii swoich gospodarzy. Opisana tutaj technika pozwoliła nam zbadać, w jaki sposób profagi wpływają na ekspresję genów w oportunistycznej bakterii Pseudomonas aeruginosa.

W tej pracy, wzrost dzikiego szczepu P. aeruginosa PAO1 został porównany z wzrostem izogenicznych lizogenów przenoszących różne kombinacje profagów z Liverpool Epidemic Strain (LES) LESB58. W hodowli lizogenu pewna część komórek bakteryjnych będzie wspierać replikację bakteriofagów litycznych (indukcja spontaniczna) z wysokim poziomem ekspresji na komórkę genów późnych fagów, takich jak te związane ze składaniem cząstek fagów, maskując w ten sposób niski poziom ekspresji genów związany z ekspresją genów ograniczoną lizogenem. Wpływ spontanicznej indukcji może zatem przesłonić ekspresję genów profagów w populacji lizogenu.

Eksperymenty profilowania wzrostu zostały wykorzystane do zidentyfikowania spontanicznej indukcji, która była minimalna we wczesnej fazie wzrostu wykładniczego. Badanie to opisuje, jak przygotować kultury próbek we wczesnej fazie wzrostu wykładniczego i jak ustawić odpowiednie kontrole pomimo niskiej liczby komórek. Protokoły te zapewniają wiarygodne i powtarzalne porównanie bakterii typu dzikiego i lizogenicznego w różnych warunkach, poprawiając w ten sposób profilowanie transkryptomiczne genomów profów i pomagając w identyfikacji wcześniej nierozpoznanych funkcji profagów.

Wprowadzenie

Ostatnio, terapia fagowa w walce z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe1 i edycja genów oparta na CRISPR-Cas2 wzbudziły ponowne zainteresowanie badaniami nad bakteriofagami. Również w tym przypadku postęp w biotechnologii umożliwił dokładniejsze zbadanie interakcji między bakteriami a fagami3. Jednak terapeutyczne zastosowanie fagów ("terapia fagowa") jest utrudnione przez obawy dotyczące fagów działających jako ruchome elementy genetyczne zdolne do poziomego przenoszenia genów wirulencji i oporności4. Rozległość "ciemnej materii"5 (geny o nieznanych funkcjach) jest zarówno niepokojąca, jak i kusząca. Ciemna materia jest uważana za lukę w naszym zrozumieniu biologii fagów i w dużej mierze niewykorzystane źródło narzędzi molekularnych i potencjalnych nowych terapii6. Rozwój wysokoprzepustowych technik sekwencjonowania, wraz z ulepszoną adnotacją genów7,8,9 i nowymi algorytmami składania peptydów10, poprawia wykrywanie, opis i funkcjonalne przewidywanie genów fagów. Jednak nauka jest nadal daleka od walidacji funkcji genów większości fagów w hodowli lub w świecie rzeczywistym.

Sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq) może globalnie mapować ekspresję genów podczas infekcji fagowej i znacznie poprawiło zrozumienie zarówno fagów, jak i elementów bakteryjnych zaangażowanych w cykle lityczne i lizogeniczne11,12. Podczas procesów lizogenicznych genomy fagów strefy umiarkowanej są integrowane z DNA bakterii, stając się profagami13. Globalne eksperymenty z profilowaniem ekspresji genów mogą być wykorzystane do identyfikacji genów ograniczonych do profagów, które są kodowane w genomach fagów strefy umiarkowanej, ale ulegają ekspresji tylko w stanie lizogenicznym11. Takie geny nie kodują białek strukturalnych fagów i nie biorą udziału w żadnych procesach infekcji fagowej. RNA-Seq może być wykorzystany do identyfikacji tych genów, które z większym prawdopodobieństwem wpływają na biologię bakteryjnego gospodarza, poprzez indukowanie wzmocnienia funkcji lub regulację istniejących genów bakteryjnych, co często umożliwia bakteriom przystosowanie się do zmieniającego się środowiska. W związku z tym można badać zdolność profagów do działania jako mikrobiologiczni władcy marionetek, kontrolując szereg funkcji bakteryjnych.

Istnieją dwie główne bariery dla skutecznej analizy ekspresji genów ograniczonych przez profagi. Po pierwsze, kluczową kwestią jest dostępność podatnych hostów. Z definicji profagi są już włączone do swojego specyficznego genomu gospodarza, więc trudno jest znaleźć podatnego żywiciela typu dzikiego, aby porównać globalną ekspresję genów w obecności i pod nieobecność profaga. Można to osiągnąć albo poprzez zakażenie de novo innego podatnego gospodarza, albo usunięcie profaga z oryginalnego izolatu typu dzikiego, bez zakłócania reszty genomu gospodarza. Druga bariera polega na niejednorodnym charakterze populacji lizogenicznych. Niektóre profagi ulegają degradacji poprzez mutację lub rekombinację, stając się "tajemnicze", co oznacza, że są utrwalone w określonym miejscu genomu bakteryjnego. Jednak inne profagi są "aktywne" i mogą być indukowane do replikacyjnego cyklu litycznego spontanicznie lub po ekspozycji na czynniki indukujące. W wielu hodowlach lizogenicznych szybkość spontanicznej indukcji oznacza, że część komórek bakteryjnych zawsze przechodzi replikację fagów litycznych14,15,16. Wysoki poziom ekspresji genów późnych fagów w tych populacjach maskuje niski poziom ekspresji genów związany z ekspresją genów ograniczoną lizogenem11,17. Odsetek lizogenów ulegających spontanicznej indukcji profagów może się różnić w zależności od stanu wzrostu, warunków wzrostu lub innych wyzwalaczy. Dlatego, aby zbadać wpływ profagów na lizogen, spontaniczne zdarzenia indukcji profagów muszą być zminimalizowane w jak największym stopniu poprzez optymalizację warunków wzrostu w celu faworyzowania stanu lizogenicznego.

To badanie informuje o pracach przygotowawczych wykonanych w celu zbadania wpływu zestawu współżyjących profagów z Liverpool Epidemic Strain (LES) Pseudomonas aeruginosa. Aktywne profagi zostały indukowane i wyizolowane z LES i wykorzystane do zakażenia modelowego szczepu gospodarza P. aeruginosa, PAO116,18,19. Całe genomy szczepu P. aeruginosa typu dzikiego, PAO1, i jego lizogenu, PAO1Φ2, zsekwencjonowano (na głębokości 30-krotnego pokrycia) w celu zapewnienia tożsamości szczepu typu dzikiego i potwierdzenia, że lizogen był izogenny. LES wiąże się ze zwiększoną zachorowalnością i śmiertelnością u pacjentów z mukowiscydozą, i LES phages19 zostały zasugerowane, aby pomóc w adaptacji do środowiska płuc mukowiscydozy16,19,20. Pomimo mocnych dowodów na to, że te profagi wpływają na biologię swojego gospodarza20,21, większość funkcji ich genów nie została jeszcze scharakteryzowana, a specyficzne mechanizmy interakcji są słabo poznane. Podejście transkryptomiczne może empirycznie odkryć funkcje genów profagów w kontrolowanym tle gospodarza. Ponieważ spontaniczna indukcja może wpływać na profile ekspresji, w tym artykule opisano, jak zoptymalizować warunki wzrostu, aby sprzyjać stanowi lizogenicznemu. Taka synchronizacja kultur może być zwalidowana za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia poziomów ekspresji kluczowych markerów genetycznych, które są związane z kluczowymi etapami replikacji fagów LES w PAO1. To samo podejście zostało wcześniej wykorzystane do zidentyfikowania ograniczonych profagami funkcji fagów toksyny Shiga, które wpływają na ruchliwość, oporność na kwasy i oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe u Escherichia coli11,17,21,22.

Protokół

1. Stworzenie selekcjonowalnego gospodarza wskaźnikowego (Rysunek 1)

UWAGA: Lizaty kultur fagowych mogą zawierać komórki zanieczyszczające pochodzące z pierwotnego gospodarza bakteryjnego. Zastosowanie szczepu wskaźnikowego opornego na antybiotyki pozwala na rozróżnienie szczepu wskaźnikowego od pierwotnego gospodarza bakteryjnego profaga. Użycie selekcjonowalnego szczepu wskaźnikowego umożliwia dokładne przeliczenie zakaźnych cząstek fagowych bez konieczności przeprowadzania etapów wirowania lub filtracji w celu usunięcia fagów z komórek lizogennych po etapach amplifikacji fagów. Selekcjonowalny szczep gospodarza wskaźnikowego skraca również czas i liczbę etapów przeliczania fagów, co pozwala na jednoczesne testowanie wielu warunków.

  1. Zidentyfikuj odpowiedni szczep gospodarza wskaźnikowego, który jest podatny na infekcję lityczną i lizogeniczną przez badany fag umiarkowany. Wykorzystano szczep laboratoryjny P. aeruginosa PAO118,20, który jest podatny na trzy fagi LES (LESΦ2, LESΦ3 oraz LESΦ4).
  2. Wybierz odpowiedni czynnik selekcyjny (w tym przypadku zastosowano ryfampicynę) i przeprowadź test rozcieńczeń w bulionie w celu określenia minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla gospodarza wskaźnikowego (MIC dla PAO1 wynosi 16 µg·mL−1 )23,24.
  3. Poddawaj kultury gospodarza wskaźnikowego sekwencyjnej ekspozycji na rosnące stężenia czynnika selekcyjnego w bulionie LB (lysogeny broth), zaczynając od wartości poniżej MIC (w tym przypadku 5 µg·mL−1), przez 18–24 h, w warunkach wytrząsania i w temperaturze 37 °C.
  4. Przenoś kulturę rosnącą przy najwyższym stężeniu w stosunku 1:100 (inakulum do medium) do dwukrotnie zwiększonych stężeń czynnika selekcyjnego (po 18–24 h w każdym etapie), aż do wystarczającego zwiększenia MIC. Szczep PAO1 stał się szczepem opornym na ryfampicynę (PAO1-RifR) przy stężeniu ryfampicyny 300 µg·mL−1.

2. Temporalne bezpośrednie zliczanie indukcji spontanicznej (Rysunek 2)

  1. Przygotować nocne kultury startowe lizogenu (np. lizogenu P. aeruginosa PAO1 zawierającego fagi LES) oraz gospodarza wskaźnikowego (PAO1-RifR), inokulując pojedynczą kolonię w 5 mL LB, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 180 rpm (przez 18–24 h).
  2. Przygotować świeże kultury lizogenu i gospodarza wskaźnikowego, inokulując nocne kultury w 100 mL LB w stosunku 1:100, i inkubować w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu (180 rpm).
    1. Monitorować wzrost lizogenu poprzez pomiar OD600 oraz liczbę komórek żywych metodą Milesa i Misry25. W tym celu co godzinę przez 8 h od momentu inokulacji pobierać próbkę o objętości 1 mL z każdej kultury lizogenu.
    2. Próbkę należy bezzwłocznie poddać rozcieńczeniom seryjnym poprzez dodanie 100 µL próbki do 900 µL odpowiedniego medium. Mocno wymieszać w wstrząsarze w maksymalnej prędkości, przy każdym rozcieńczeniu wymieniać końcówkę i kontynuować serię rozcieńczeń od 10−1 do 10−9.
    3. Nanieść po 10 µL wymaganych rozcieńczeń w trzech powtórzeniach na płytkę z agarem LB, pozostawić do wyschnięcia i inkubować w temperaturze 37 °C przez 18–24 h.
    4. Aby obliczyć liczbę żywych komórek bakteryjnych, należy wybrać rozcieńczenie z łatwo policzalną liczbą kolonii. Policzyć liczbę kolonii w każdej plamce, a następnie zastosować następujący wzór:
      Wzór na obliczanie CFU, CFU·mL⁻¹=średnia liczba kolonii×czynnik rozcieńczenia×100, metoda rozcieczeń seryjnych.
      UWAGA: W miarę wzrostu kultury lizogenu, w wyniku spontanicznej indukcji będą powstawać aktywne cząstki fagowe. Produkcja zakaźnych fagów oznacza, że transkryptom populacji lizogenu jest obecnie zanieczyszczony ekspresją genów związanych z litycznym cyklem replikacyjnym, wynikającą z sygnału litycznej replikacji faga i odpowiadającej mu reakcji komórki gospodarza. Dlatego ważne jest zidentyfikowanie stadium wzrostu, w którym stosunek komórek lizogennych do wolnych zakaźnych cząstek fagowych jest najwyższy, aby w jak największym stopniu ograniczyć szum transkrypcyjny w tle (generowany przez transkryptom faga litycznego) w zbiorze danych.
  3. Aby zliczyć zakaźne cząstki fagowe w każdej próbce czasowej, zaszczepić 5 mL sterylnego 0,4% agaru bakteriologicznego w LB (agar wierzchni) za pomocą 100 µL gospodarza wskaźnikowego w średniej fazie wzrostu wykładniczego (OD600: 0,4–0,5; w tym przypadku PAO1-RifR) w obecności odpowiedniego czynnika selekcyjnego (w tym przypadku 50 µg·mL−1 rifampicyny, ponieważ MIC gospodarza PAO1 wynosi tylko 16 µg·mL−1; patrz Tabela materiałów, wiersz 8 i wiersz 9)
    1. Nanieść 10 µL tego samego rozcieńczenia seryjnego (patrz krok 2.2.2) na zaszczepioną warstwę agaru wierzchniego, pozostawić do wyschnięcia, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 18–24 h.
    2. Aby obliczyć liczbę zakaźnych cząstek fagowych, należy wybrać rozcieńczenie z łatwo policzalną liczbą plaques. Policzyć liczbę plaques w każdej plamce.
      Wzór na obliczanie PFU; równanie testu plackowego do kwantyfikacji wirusów; laboratorium.
    3. Wyznaczyć czas/warunki, dla których spontaniczna indukcja na CFU (jednostkę tworzącą kolonię) jest minimalna, do dalszych kroków eksperymentalnych.

3. Przygotowanie nieindukowanych i indukowanych kultur lizogenów do ekstrakcji RNA (Rysunek 3)

  1. Przygotować świeżą kulturę nocną, szczepiąc pojedynczą kolonię lizogenu w 5 mL LB, i inkubować w 37 °C z wytrząsaniem (180 rpm) przez 18–24 h.
  2. Przeszczepić kulturę nocną do 80 mL LB w stosunku 1:100 w ośmiu kolbach o pojemności 250 mL.
  3. Pierwszą kolbę oznaczyć jako „nieindukowaną”, a pozostałe jako „indukowane”, wraz z punktami czasowymi, w których każda próbka powinna zostać zebrana (np. „indukowana t = 0”, „indukowana t = 10 min”, „indukowana t = 20 min” itd.; Rysunek 3).
  4. Po 90 min inkubacji, gdy OD600 wynosi od 0,1 do 0,2 lub w czasie minimalnej indukcji spontanicznej (patrz sekcja dyskusja), dodać 4 µL 1% lodowatego kwasu octowego (v/v) do kolby nieindukowanej (Rysunek 3).
    UWAGA: Ponieważ czynnik indukujący w tej pracy został przygotowany z użyciem 1% lodowatego kwasu octowego jako rozpuszczalnika, w kroku kontrolnym dodano samą taką samą ilość rozpuszczalnika. W zależności od przygotowania różnych induktorów można rozważyć alternatywne kontrole.
  5. Dodać 80 mL kultury z kolby nieindukowanej do 720 mL sterylnego LB i natychmiast dodać roztwór zatrzymujący (lodowaty 5% [v/v] fenol, pH 4,3, 95% [v/v] etanol) w objętości stanowiącej 20% objętości kultury (160 mL), a następnie inkubować na lodzie przez minimum 30 min, nie dłużej niż 2 h, aby ustabilizować transkrypty RNA12,26,27. Jest to próbka nieindukowana.
  6. Indukować pozostałe kultury w siedmiu kolbach 250 mL (Rysunek 3) za pomocą MIC odpowiedniego czynnika indukującego (w tym przypadku 25 mg·mL−1 norfloksacyny, przygotowanej w 1% lodowatym kwasie octowym [w/v], zastosowanej w końcowym stężeniu 1 µg·mL−1), dokładnie wymieszać i inkubować w 37 °C z wytrząsaniem przy 180 rpm przez 1 h.
    UWAGA: Krok ten wprowadzi kulturę lizogenu w bardziej skoordynowany stan replikacji litycznej. Większość komórek w kulturze rozpocznie lityczną produkcję infekcyjnych cząsteczek fagów.
  7. Umożliwić regenerację komórek poprzez dodanie 80 mL kultury z kolby indukowanej do 720 mL sterylnego LB, co skutecznie rozcieńczy czynnik indukujący. Zbierać komórki bakteryjne z każdej kolby co 10 min od czasu 0 do 1 h poprzez dodanie roztworu zatrzymującego, jak wspomniano w kroku 3.5.
    UWAGA: Roztwór zatrzymujący stabilizuje RNA do 2 h. Jednakże, aby zwiększyć stabilność próbek, wszystkie kolejne kroki należy przeprowadzać w 4 °C.
  8. Zebrać osad przez wirowanie przy 10 000 x g przez 15 min w 4 °C tak szybko, jak to możliwe, nie później niż 2 h po obróbce, aby uniknąć degradacji RNA.
  9. Odlać nadsącz i delikatnie resuspendować osady bakteryjne w pozostałej cieczy za pomocą automatycznej pipety z regulacją przed przeniesieniem każdej próbki do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.
  10. Wirować probówki w mikrocentryfudze z dużą prędkością (13 000 x g) w 4 °C przez 1 min i odlać pozostały nadsącz.
  11. Szybko zamrozić osady, zanurzając każdą zamkniętą probówkę w ciekłym azocie. Ułatwi to wydajną lizę komórek podczas ekstrakcji RNA.
  12. Dodać TRIzol (1 mL) do każdego zamrożonego osadu i homogenizować zawiesinę poprzez pipetowanie (nie używać vortexa). Przechowywać w −80 °C do czasu przeprowadzenia ekstrakcji RNA dla wszystkich próbek.
    UWAGA: Na tym etapie protokół można przerwać.
  13. Powtórzyć kroki 3.1–3.13 z użyciem trzech replikatów biologicznych.

4. Izolacja RNA z nieindukowanych i indukowanych kultur lizogennych

WAŻNE: Wszystkie te etapy należy przeprowadzać w środowisku wolnym od RNaz28. Blaty robocze należy przetrzeć 10% NaClO lub specjalistycznymi środkami dezaktywującymi RNazy. Sprzęt laboratoryjny powinien zostać poddany działaniu inhibitorów RNaz, na przykład poprzez traktowanie DEPC, a we wszystkich reakcjach należy stosować wodę wolną od nukleaz.

  1. rozmrozić na lodzie zamrożone pellety traktowane TRIzol z kroku 3.12, a następnie dodać 400 µL chloroformu klasy biologii molekularnej.
  2. Wymieszać zawartość probówek poprzez odwracanie przez 10 s, aby całkowicie zlizować wszystkie komórki (nie stosować vortexa). Następnie inkubować w temperaturze pokojowej (21 °C) przez 2–5 min.
  3. Oddzielić warstwę wodną od mieszaniny TRIzol/chloroform poprzez wirowanie w chłodzonej mikrowirówce stołowej w temperaturze 4 °C przy 13,000 x g przez 15 min.
  4. Zebrać fazę wodną (~ 500 µL, górna warstwa) za pomocą pipety 1,000 µL, uważając, aby nie naruszyć interfazy ani fazy organicznej (dolna warstwa). Przenieść do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
  5. Do oddzielonej fazy wodnej dodać 450 µL izopropanolu klasy biologii molekularnej, dokładnie wymieszać przez odwracanie (nie stosować vortexa) i inkubować w temperaturze pokojowej (21 °C) przez 30 min.
  6. Odzyskać RNA poprzez wirowanie w chłodzonej wirówce w temperaturze 4 °C przy 13,000 x g przez 30 min.
  7. Usunąć nadosad bez naruszania pelletu RNA i przemyć pellet dwukrotnie 800 µL 70 % etanolu przygotowanego w wodzie wolnej od nukleaz (nie pipetować w górę i w dół). Aby zapewnić stabilność pelletu RNA, powtórzyć etap wirowania przez 5 min po każdym przemyciu.
  8. Usunąć etanol i wysuszyć pellet na powietrzu.
    UWAGA: Ostrożnie odessać etanol wokół pelletu za pomocą mikrokońcówki 10 µL, a następnie wysuszyć pellet, odwracając probówkę na czystym papierze filtracyjnym. Pellet RNA powinien stać się bezbarwny, a jego krawędzie powinny wyglądać na pofalowane i być widoczne. Zbyt krótkie suszenie może pozostawić resztki etanolu, co może wpłynąć na kolejne etapy procesu, natomiast zbyt długie suszenie pelletu może utrudnić jego resuspensję.
  9. Resuspendować RNA w wodzie wolnej od nukleaz (50 µL), inkubując w temperaturze 65 °C na termomikserze z okresowym mieszaniem (co 30 s) przez łącznie 3–5 min.
    KRYTYCZNE: Grupa 2'- OH RNA jest w stanie katalizować autokatalityczne rozszczepienie nici RNA w wysokiej temperaturze powyżej 65 °C oraz przy wysokim pH. Temperatury poniżej 65 °C spowolnią resuspensję resztkowego DNA, ograniczając tym samym ilość DNA, która musi zostać strawiona na późniejszym etapie za pomocą DNazy I. W związku z tym utrzymanie temperatury 65 °C jest kluczowe dla uzyskania próbek najwyższej jakości.
    UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać, a próbki można przechowywać w temperaturze −80 °C.

5. Usuwanie zanieczyszczającego DNA z RNA poprzez traktowanie DNazą

  1. Aby usunąć zanieczyszczający DNA z całkowitego RNA przed syntezą pierwszej nici cDNA, do 10 μg całkowitego RNA należy dodać 0,1 objętości 10x buforu do DNazy oraz 1 μL enzymu DNazy. Delikatnie wymieszać zawartość probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  2. Resuspendować odczynnik do inaktywacji DNazy i dodać minimum 2 μL lub 10% objętości całkowitej objętości reakcji. Dobrze wymieszać i inkubować próbki przez 5 min w temperaturze pokojowej (21 °C) podczas redyspersji odczynnika do inaktywacji DNazy.
  3. Odwirować odczynniki DNazy w mikrowirówce stołowej przy 10 000 × g przez 1,5 min.
  4. Przenieść nadsącz zawierający RNA do nowej probówki, nie naruszając osadu.
    UWAGA: Jakość RNA należy sprawdzić za pomocą spektrofotometru UV w skali 1 μL oraz mikrofluidycznego analizatora kwasów nukleinowych zgodnie z instrukcjami producenta; oczyszczony całkowity RNA można przechowywać w temperaturze −80 °C. W przypadku qRT-PCR RNA można wykorzystać bezpośrednio na tym etapie. Dla bardziej czułych procesów następczych, takich jak sekwencjonowanie RNA, które wymagają rygorystycznej jakości próbek, aby kontynuować procedurę, stosunek A260/230 musi wynosić ε 2,0.
  5. Uzupełnić objętość roztworu RNA wolnego od DNA do 500 μL za pomocą wody wolnej od nukleaz.
  6. Dodać 50 μL wolnego od nukleaz 3 M octanu sodu (pH 5,3) oraz 495 μL izopropanolu. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    UWAGA: Ten krok spowoduje wytrącenie RNA.
  7. Odzyskać RNA poprzez wirowanie przy 13 000 x g i 4 °C przez 30 min.
  8. Przemyć osad RNA trzykrotnie lodowatym 70% etanolem, wirując próbki przy 13 000 x g i 4 °C przez 5 min po każdym przemyciu, aby całkowicie usunąć sole.
  9. Sprawdzić jakość RNA za pomocą spektrofotometru UV w skali 1 μL oraz mikrofluidycznego analizatora kwasów nukleinowych zgodnie z instrukcjami producenta; oczyszczony całkowity RNA można przechowywać w temperaturze −80 °C.
    UWAGA: W celu osiągnięcia standardów jakości RNA zastosowano wytyczne29. Jeśli stosunek A260/230 wynosi <2,0, należy powtórzyć kroki 5.5–5.9.

6. Analiza jakościowa i ilościowa RNA wolnego od DNazy

  1. Zweryfikuj skuteczność traktowania DNazą dla każdej próbki, przeprowadzając ilościowy PCR z użyciem starterów do 16S rRNA (Tabela 2) i 1 μg całkowitego RNA, oraz potwierdź, że nie powstał produkt amplifikacji.
    UWAGA: Idealnymi starterami do oceny zanieczyszczenia gDNA byłyby startery zaprojektowane tak, aby przyłączały się do połączeń intron-ekson lub regionów regulatorowych u prokariotów lub w miejscach transkrypcyjnie nieaktywnych30,31.
  2. Wyznacz liczbę integralności RNA (RIN) za pomocą mikrofluidalnego analizatora kwasów nukleinowych zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Do syntezy pierwszej nici należy używać próbek wykazujących RIN ≥ 9. Próbki o RIN < 9 należy odrzucić i powtórzyć etapy izolacji (1.1–5.4).
  3. Ilościowo określ stężenie całkowitego RNA, korzystając z zestawu do analizy HS RNA oraz fluorometru zgodnie z instrukcjami producenta.

7. Synteza pierwszej nici cDNA

  1. Przygotować mieszaninę starterów RNA dla każdej próbki, mieszając 1 μg całkowitego RNA z 1 μL losowych heksametrów (50 ng·μL−1) i 1 μL mieszaniny dNTP 10 mM. Następnie uzupełnić całkowitą objętość do 10 μL za pomocą wody wolnej od nukleaz.
  2. Inkubować reakcję w temperaturze 65 °C przez 5 min, a następnie umieścić na lodzie na 1 min.
  3. Przygotować mieszaninę do syntezy cDNA dla każdej próbki, dodając w podanej kolejności: 2 μL buforu RT 10x, 4 μL MgCl2 25 mM, 2 μL DTT 0,1 M, 1 μL inhibitora RNazy (40 U·μL−1) oraz 1 μL odczynnika do odwrotnej transkrypcji (200 U·μL−1).
  4. Dodać mieszaninę do syntezy cDNA do mieszaniny RNA/starterów. Delikatnie wymieszać i krótko odwirować próbki, aby zebrać składniki na dnie probówki.
  5. Przeprowadzić inicjację syntezy poprzez inkubację próbek przez 10 min w 25 °C, a następnie przez 50 min w 50 °C. Zakończyć reakcje poprzez inkubację w 85 °C przez 5 min, a następnie schłodzić na lodzie.
  6. Dodać 1 μL RNazy H do każdej probówki i inkubować w 37 °C przez 20 min, aby usunąć RNA z hybrydy DNA:RNA.
  7. Na koniec rozcieńczyć reakcję syntezy cDNA do całkowitej objętości 80 μL i przechowywać w temperaturze −80 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Procedurę można w tym miejscu przerwać.

8. Krzywa standardowa i ilościowa reakcja PCR (q-PCR) w celu określenia poziomów ekspresji genów markerowych wskazujących na różne etapy replikacji fagów

  1. Zidentyfikuj zestaw genów docelowych, które mogą służyć jako markery dla każdego etapu replikacji badanego faga. W naszym przypadku zostały one szczegółowo opisane w Tabeli 2.
  2. Namnóż każdy z genów docelowych z matrycowego DNA genomowego, używając odpowiednich starterów oraz metody PCR z następującymi warunkami amplifikacji: denaturacja wstępna w 95 °C przez 2 min; denaturacja w 95 °C przez 30 s; przyłączanie w optymalnej temperaturze przyłączania zależnie od starterów (tutaj zastosowano 58 °C) przez 30 s; elongacja w 72°C przez 1 min oraz finalna elongacja w 72 °C przez 5 min.
  3. Oczyść każdy amplikon za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, a następnie sklonuj je w wektorze do klonowania TA zgodnie z instrukcjami producenta. Zweryfikuj sekwencję każdego sklonowanego produktu metodą sekwencjonowania Sangera.
    UWAGA: Na tym etapie protokół można przerwać.
  4. Oblicz liczbę kopii dla poszczególnych plazmidów, korzystając z następującego równania20:
    Wzór na obliczanie liczby kopii DNA; równanie do badań i analiz w biologii molekularnej.
  5. Przygotuj matrycę standardową dla każdego genu markerowego poprzez rozcieńczenia seryjne DNA plazmidowego od 109 kopii/μL do 102 kopii/μL w sterylnej wodzie H2O bez nukleaz klasy molekularnej.
  6. Przeprowadź ilościową PCR zgodnie z instrukcjami producenta dla preferowanego systemu qPCR, używając 1 μL cDNA (z kroku 7.7) dla każdej próbki w trzech powtórzeniach, wraz z odpowiednimi standardami plazmidowymi w trzech powtórzeniach; reakcję PCR przeprowadź na płytce 96-dołkowej dla każdego celu.
  7. Przedstaw zależność logarytmu liczby kopii DNA (oś x) od progu cyklu (oś y, Ct), a następnie użyj odpowiedniej platformy, takiej jak Excel lub R, aby wykonać obliczenia regresji liniowej w celu wyznaczenia współczynnika determinacji (R2) oraz równania liniowego.
    UWAGA: Współczynnik determinacji powinien być wyższy niż 0,98.
  8. Oszacuj liczbę kopii dla każdego celu, korzystając z równania liniowego (y = mx + b) wyprowadzonego z regresji liniowej (krok 8.7), gdzie y jest szacowanym Ct; x to logarytm liczby kopii DNA; m to nachylenie prostej, które określa zmianę Ct w stosunku do liczby kopii DNA; a b to punkt przecięcia z osią y, reprezentujący szacowane Ct dla jednej kopii DNA32.
  9. Dla każdego genu markerowego oblicz wydajność amplifikacji PCR (E), wykorzystując parametry z regresji liniowej krzywej standardowej oraz następujące równanie, gdzie m jest nachyleniem wyznaczonym w kroku 8.7 i 8.8:
    Wzór na równowagę statyczną E=10(1/m), schemat równania do celów edukacji fizycznej.
  10. Zwaliduj wszystkie startery pod kątem ich wydajności procentowej, korzystając z następującego równania:
    UWAGA: Wydajność musi mieścić się w zakresie 90%–110%.
    Wzór na wydajność procentową: (E-1)x100, równanie matematyczne.
  11. Oblicz absolutną liczbę kopii DNA, korzystając z następującego wzoru:
    Wzór na absolutną liczbę kopii, E^(b-ct), do analizy ilościowej PCR.
    gdzie Ct (krok 8.8) to próg cyklu, b to punkt przecięcia (krok 8.8), m to nachylenie (krok 8.8), a E to wydajność amplifikacji PCR (krok 8.9).
    KRYTYCZNE: Przy porównywaniu amplifikacji dwóch lub więcej celów za pomocą q-PCR, wydajność PCR musi zostać obliczona dla każdego celu, aby móc porównać absolutne liczby kopii DNA.
  12. W niniejszym badaniu geny 16S rRNA, proC oraz rpoD zostały użyte jako ogólne kontrole wewnętrzne, a gyrB posłużył jako kontrola indukcji33,34,35.
    UWAGA: Wybierając kontrole wewnętrzne na podstawie danych z RNA-seq, najlepiej wybrać te, których poziomy ekspresji nie zmieniają się w testowanych warunkach. Staranny dobór odpowiednich kontroli jest zawsze istotny dla rzetelnej interpretacji wyników.

Wyniki

W niniejszej pracy wykorzystano bezpośrednie wyliczanie czasowe produkcji fagów z kultury lizogenu PAO1 LESΦ2 hodowanej w warunkach nieindukujących, aby określić wpływ spontanicznej indukcji LESΦ2. Gęstość fagów była najniższa, osiągając średnią wartość ~2,61 x 106 jednostek tworzących plaki (PFU)·mL−1 2 h po przesiewie do świeżego medium w wczesnej fazie wzrostu wykładniczego, co sugeruje, że stanem dominującym była lizogenia. Miano LESΦ2 szybko wzrosło do średniej wartości ~2,4 x 108 PFU·mL−1 w ciągu 4 h i osiągnęło najwyższą gęstość po 6 h (średnio ~5,83 x 109 PFU·mL−1; Rycina 4).

Minimalna indukcja spontaniczna była obserwowana podczas wczesnej fazy logarytmicznej wzrostu lizogenu (po 2 h). Jednak mierzalna obecność fagów w pożywce była wynikiem wielu wcześniejszych zdarzeń, w tym: pakowania kwasów nukleinowych do białkowych główek, składania białek w cząsteczki fagowe oraz ekspresji późnych genów fagowych, genów fazy środkowej i wczesnych regulatorowych genów fagowych. Istotne było uchwycenie zainfekowanych komórek przed wystąpieniem zdarzeń replikacyjnych związanych z fagiem; dlatego wybrano czas 90 min na wzrost kultury przed indukcją. Aby uchwycić profil ekspresji genów w próbkach lizogenu PAO1, LESΦ2, pobrano materiał z kultury przed indukcją oraz po indukcji w okresie 90 min, zgodnie z opisem w kroku 3.4. Ten punkt czasowy (90 min) przypada znacznie wcześniej niż wykrycie wysokiego poziomu spontanicznej indukcji rezydentowego profaga za pomocą testu plackowego z kroku 2.3.2. Ponieważ gęstość komórek bakteryjnych we wczesnej fazie wzrostu wykładniczego była niska, objętości kultur zwiększono do 800 mL, aby zapewnić wystarczającą ilość materiału do badań ekspresji genów. Próbki z kultury nieindukowanej i kultur indukowanych pobierano co 10 min, a następnie wyizolowano RNA w celu zmapowania profilu ekspresji kluczowych markerów lizogenii i replikacji litycznej podczas wzrostu bakterii. Całkowite RNA oczyszczono i zweryfikowano pod kątem braku genomowego DNA za pomocą analiz qPCR ukierunkowanych na gen 16S rRNA (krok 6.1). Próbki, które osiągnęły RIN ≥ 9, przeszły kontrolę jakości i zostały przekształcone w cDNA.

Przeanalizowano adnotowany genom LESΦ2 w celu zidentyfikowania genów znanych z udziału w lizogennych i litycznych cyklach replikacji fagów umiarkowanych. Zidentyfikowane geny wykorzystano następnie do walidacji qRT-PCR w celu profilowania ekspresji genów ograniczonych do cyklu lizogennego oraz genów związanych z cyklem litycznym w kulturach indukowanych i nieindukowanych. Ilościowo określono absolutną liczbę kopii DNA i przeprowadzono test znaków Wilcoxona przy użyciu programu R36, aby porównać poziomy ekspresji w kulturach nieindukowanych i indukowanych (Rysunek 5). Zaobserwowano wyraźny wzrost ekspresji genu cro (wczesnego markera replikacji litycznej) z poziomu ~2,31 x 109 kopii w kulturach nieindukowanych do ~3,02 x 1011 kopii 30 min po indukcji (test znaków Wilcoxona: p < 0,01). Podobnie białka O i białka P, które są markerami średniego etapu replikacji litycznej (a według przewidywań uczestniczą w replikacji genomu faga), wykazały również istotny wzrost ekspresji z ~1,74 x 108 do ~1,25 x 1010 kopii (test znaków Wilcoxona: p < 0,01) oraz z ~6,05 x 102 do ~5,68 x 105 kopii (test znaków Wilcoxona: p < 0,01), odpowiednio. Na koniec, strukturalne geny związane z ogonkiem wykorzystano jako późne markery litycznego cyklu replikacji. Ponownie zaobserwowano istotny wzrost ekspresji z ~2,31 x 106 kopii w kulturach nieindukowanych do ~4,38 x 108 kopii 30 min po indukcji (test znaków Wilcoxona: p < 0,01). Zatem dane z ilościowego RT-PCR potwierdziły, że ekspresja genów dobrze ugruntowanych markerów replikacji litycznej przebiegała zgodnie z oczekiwanym trendem, przy czym markery wczesne, średnie i późne wykazywały wielokrotnie różnicową ekspresję w przewidzianej kolejności (Rysunek 5). Ponieważ ekspresja markerów replikacji litycznej uległa zwiększeniu 30 min po regeneracji, punkt ten uznano za odpowiedni reprezentatywny moment czasowy do badania krajobrazu transkryptomicznego aktywnych fagów umiarkowanych i ich gospodarzy bakteryjnych podczas cyklu litycznego.

Zaobserwowaliśmy pewną ekspresję genów litycznych w warunkach bez indukcji, co potwierdza, że zawsze dochodzi do pewnej indukcji spontanicznej, nawet w zoptymalizowanych kulturach, w których liczba lizogenów jest reprezentowana przez najwyższy stosunek CFU do uwolnionych PFU we wczesnej fazie logarytmicznej. Oznacza to, że w danych transkryptomicznych zawsze będzie występował pewien poziom „szumu”, co podkreśla znaczenie starannie przygotowanych kontroli, w tym kultur indukowanych i nieindukowanych. Właściwy wybór genów kontroli wewnętrznej w celu określenia krotności zmian w ekspresji opiera się na dokładnej analizie danych transkryptomicznych w celu zidentyfikowania genów, które są wyrażane na tym samym poziomie zarówno w próbkach nieindukowanych, jak i indukowanych. Nasze wstępne wyniki sugerują, że rpoD był najbardziej wiarygodnym przetestowanym genem kontrolnym i wykazywał najstabilniejszą ekspresję (~1,71 x 105 kopii przed indukcją i ~3,33 x 105 kopii 30 min po indukcji; test znaków rang Wilcoxona: p = 0,3594) w porównaniu do rrn16S lub genów proC (Rysunek 5). Zmienność ekspresji kontroli wewnętrznych doprowadziła do pomiaru bezwzględnej liczby transkryptów. Dalsza analiza danych transkryptomicznych pomoże w wyborze odpowiednich kontroli wewnętrznych do późniejszej walidacji.

W naszym ćwiczeniu z profilowania genów wykorzystano gen cI, ponieważ jest on uznanym markerem lizogenii. W porównaniu do markerów replikacji litycznej, ekspresja genu cI była stosunkowo stabilna (Rycina 5), jednak liczba kopii tego genu w kulturach nieindukowanych była satysfakcjonująco wysoka w porównaniu do markerów replikacji litycznej. Dane te są zgodne z niskimi wartościami PFU w tych samych próbkach, co potwierdza, że wysoka ekspresja represora wiązała się z niższym poziomem produkcji fagów. Przedstawione tutaj dane wykazują, że ekspresja transkryptu cI dla tego konkretnego faga nie ulega istotnemu obniżeniu po indukcji, co ma miejsce w przypadku fagów Stx11,17. Aktywność represora jest zazwyczaj kontrolowana zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i potranslacyjnym, zatem gen represora może być transkrybowany, ale powstałe białko ulega natychmiastowemu autokatalitycznemu cięciu. Wymagane są dalsze eksperymenty w celu walidacji kontroli transkrypcyjnej i potranslacyjnej. Ponadto, na podstawie naszej krzywej wzorcowej, minimalna granica wykrywalności qPCR wydaje się wynosić ~102 kopii.

Łącznie wyniki uzyskane w testach płytkowych i za pomocą qRT-PCR potwierdzają słuszność naszej strategii hodowli i przygotowania próbek RNA w celu uzyskania dobrze kontrolowanego materiału wejściowego do eksperymentów RNA-Seq. Hodowle nieindukowane w wczesnej fazie wykładniczej wykazywały niski poziom spontanicznej indukcji i ekspresji genów litycznych, co sugeruje dominację lizogenii. Z kolei hodowle izolowane 30 min po indukcji wykazały znaczny wzrost ekspresji genów markerowych wskazujących na dominację replikacji litycznej.

Schemat eksperymentu z koncentracją rifampicyny przedstawiający probówki z narastającym żółtym zabarwieniem w ciągu 7 dni.
Rycina 1: Protokół tworzenia gospodarza wskaźnikowego opornego na rifampicynę (Utworzono w BioRender.com). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat rozcieńczeń seryjnych dla wyznaczania CFU i PFU; przedstawia kultury komórek lizogennych i wskaźnikowych.
Rycina 2: Projekt eksperymentalny dla wyznaczania PFU i CFU lizogenu z tej samej próbki. (Utworzono za pomocą BioRender.com) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat podwójnego procesu ekstrakcji RNA dla indukowanych i nieindukowanych kultur bakteryjnych z użyciem norfloksacyny.
Rycina 3: Schemat doświadczalny pobierania próbek z kultur indukowanych i nieindukowanych do izolacji RNA. (Utworzone w BioRender.com) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres wzrostu bakterii i interakcji z fagami; Log PFU mL⁻¹ w funkcji czasu (h); wyniki eksperymentalne.
Rycina 4: Czasowe wyliczanie indukcji spontanicznej. Czasowe wyliczanie produkcji spontanicznego profaga LES z wykorzystaniem PFU z lizogenu PAO1 Φ2 wraz z jednoczesnym CFU, n = 8 (dwie powtórzenia biologiczne i cztery techniczne); słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe. Ciemnoczerwone punkty wskazują CFU·mL−1 w LB; ciemnoniebieskie punkty wskazują PFU·mL−1 w LB. Spontaniczne uwalnianie zakaźnego faga φ2 przez lizogeny znajduje się na najniższym mierzalnym poziomie 2 h po inokulacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy pudełkowe pokazujące zmienność liczby kopii DNA w czasie w markerach genowych faga2; wynik eksperymentalny.
Rycina 5: Bezwzględna liczba kopii docelowych genów markerowych. Bezwzględna liczba kopii genów markerowych faga potwierdza przewidywane wzorce ekspresji, uzyskane za pomocą RT-qPCR, dla genów, których oczekuje się, że odgrywają istotną rolę w cyklach lizogennych i litycznych. Kropki reprezentują zarówno trzy powtórzenia biologiczne, jak i trzy techniczne (n = 9). (A) Czerwone pudełko reprezentuje marker lizogenii, cI; (B) zielony reprezentuje wczesny marker lityczny, cro; (C,D) niebieski reprezentuje środkowe markery lityczne, geny replikacji DNA; (E) purpurowy reprezentuje późny marker lityczny, geny strukturalne ogonka; (F–H) szary reprezentuje markery gospodarza, które zostały użyte jako kontrole wewnętrzne, a (I) biały reprezentuje gyrazę DNA B, która została użyta jako kontrola indukcji. Ciągłe poziome linie wskazują medianę rozkładu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Startery zaprojektowane w niniejszym badaniu. Podano sekwencje swoistych starterów dla genów markerowych i kontroli wewnętrznych wykorzystanych w niniejszym badaniu, wraz z odpowiadającymi im numerami dostępu NCBI. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Efektywność starterów użytych w niniejszym badaniu, obliczona na podstawie krzywej standardowej qPCR. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Stworzenie selektywnego gospodarza wskaźnikowego, wcześniej stosowanego w testach płytek miażdżycowych w celu dokładniejszego określenia ilościowego spontanicznej indukcji faga Stx z E. coli MC1061 37,38,39, opisano tutaj dla faga P. aeruginosa LESΦ2. Dodatkową zaletą tej interwencji jest skrócenie etapów i czasu przetwarzania próbki, umożliwiając w ten sposób jednoczesną ocenę wskaźników spontanicznej indukcji w warunkach wielu hodowli. Istnieje ryzyko powstania innych mutacji podczas tworzenia wariantów opornych na ryfampicynę40; Jednak w tej pracy wyewoluowany szczep został wykorzystany tylko jako gospodarz wskaźnikowy do wyliczania blaszek z kultur będących przedmiotem zainteresowania i nie został uwzględniony w analizie transkryptomicznej. Tak długo, jak selektywny szczep wskaźnikowy pozostaje równie podatny na infekcję przez faga będącego przedmiotem zainteresowania, nie ma obaw o inne nabyte mutacje. Niemniej jednak nie wykryto żadnych różnic w profilach polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych w analizie elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym (PFGE) PAO1WT i PAO1RIF (dane nie pokazane).

Przy wyborze komórek gospodarza rzadko można znaleźć szczep wskaźnikowy, który nie jest już siedliskiem profagów. Na przykład PAO1 jest siedliskiem nitkowatego profaga Pf4. Eksperymentalne kontrole w tym badaniu zostały zaprojektowane tak, aby móc bezpośrednio badać ekspresję genów określonych fagów (w tym przypadku LES profag 2) oraz wpływ tego faga na ekspresję genów bakteryjnych. W porównaniu transkryptów z PAO1 przenoszących LES profag 2 i pozbawionych LES profag 2 (zarówno lizogen, jak i nie-lizogen przenoszą endogenny Pf4), które służą jako kontrola wewnętrzna w celu wykluczenia wpływu Pf4 na gospodarza. Ponadto wykazano, że Pf4 zwykle nie powoduje lizy w komórce gospodarza41 i dlatego nie jest w stanie zakłócić wyników tych eksperymentów.

Powszechnie wiadomo, że staranna kontrola jakości ma zasadnicze znaczenie w przygotowaniu próbki do uzyskania istotnych danych omicznych42. Jednak, jak opisano wcześniej11, dokładna charakterystyka aktywności profagów w przygotowaniu kultur lizogenu do takich badań jest rzadko wykonywana. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nasze systematyczne protokoły przygotowania dobrze kontrolowanego i zoptymalizowanego zestawu kultur do badań transkryptomicznych, aby lepiej zbadać interakcje między bakteriami a fagami o umiarkowanej temperaturze. Synchronizacja populacji była kontrolowana przez poddanie kultury przez co najmniej cztery podwojenia przed potraktowaniem jej indukującym antybiotykiem norfloksacyną. Określając wartość MIC norfloksacyny dla szczepu w badaniu, mogliśmy upewnić się, że stężenie czynnika indukującego było nieco powyżej MIC dla leczenia "indukcyjnego". Leczone komórki rozcieńczono następnie w stosunku 1:10 w celu obniżenia stężenia norfloksacyny poniżej wartości MIC po 1 godzinie leczenia, aby umożliwić komórkom odzyskanie sił i zakończenie procesu replikacji faga, zakończonego lizą komórki i uwolnieniem zakaźnego potomstwa faga. Komórki wchodzą w cykl replikacji litycznej po bodźcu indukcyjnym dopiero wtedy, gdy stężenie norfloksacyny zostanie sprowadzone poniżej wartości MIC w okresie rekonwalescencji. W tym przypadku przekroczenie 1 μg·mL−1 norfloksacyny oznacza, że lek nie może być skutecznie rozcieńczony poniżej MIC, ponieważ MIC dla norfloksacyny dla PAO1 wynosi 0,19 μg·mL−1. Poziom rozcieńczenia induktora musi być zrównoważony z potrzebą odzysku lizogenu i utrzymania gęstości kultury w celu pobrania RNA. Omówione tutaj dane pokazują, że możliwa jest synchronizacja kultur w celu stworzenia próbek, w których dominuje lizogeniczność, zmniejszając w ten sposób szum spowodowany spontaniczną indukcją i umożliwiając wykrycie prawdziwych zmian w ekspresji genów spowodowanych lizogenią. Ponieważ stan lizogeniczny dominuje we wczesnej fazie wykładniczej wzrostu, kiedy gęstość komórek bakteryjnych jest niska, sugerujemy zwiększenie skali kultur w celu zebrania wystarczającej ilości RNA do kolejnych badań ekspresji genów, takich jak RNA-Seq.

Stosowanie norfloksacyny jako czynnika indukującego w celu zmuszenia kultur do cyklu litycznego jest dobrze opisane43,44; Wpłynie to jednak również na ekspresję innych genów bakteryjnych w tym procesie45,46. Aby temu zapobiec, biblioteki RNA z kontrolnych kultur typu dzikiego hodowanych w tych samych warunkach indukujących i nieindukujących powinny być włączone do eksperymentów RNA-Seq. Zastosowanie kontroli wewnętrznej i kluczowych genów markerowych do walidacji etapów replikacji fagów za pomocą qRT-PCR ma również kluczowe znaczenie dla dokładnych porównań. Ilościowe profilowanie RT-PCR nie może być interpretowane poprzez porównanie bezwzględnej liczby transkryptów dla każdego genu w różnych punktach czasowych; Liczy się kształt profilu. Po pierwsze, pobrano próbkę tylko jednego małego regionu w transkryptie dla dowolnego genu,więc nie wiadomo, czy jest to element krótkotrwały, czy długowieczny. Z pewnością mapowanie transkryptów RNA-Seq pokazuje, że gęstość danych mapowania zmienia się znacznie w zależności od długości genu. Po drugie, to kształt profilu ekspresji genów powinien być interpretowany dla genu markerowego związanego z cyklem litycznym lub lizogenicznym stylem życia, a nawet niesprzężonego z obwodami regulatorowymi fagów11. Spontaniczna indukcja jest prawdziwym problemem w hodowli lizogenu i zawsze będzie skutkować ekspresją genów związanych z cyklem litycznym. Jednak profilowanie pokazuje, że geny związane z cyklem replikacji litycznej są tłumione w swojej ekspresji przed indukcją (co najmniej dwa fałdy logarytmiczne) i regulowane w górę po indukcji.

Przeprowadzone wcześniej analizy transkryptomiczne interakcji fagów Stx z E. coli wspierają dokładne zrozumienie genów fagów zaangażowanych w utrzymanie lizogenii i wyzwalanie cyklu litycznego11,17. Obecnie fagi LES P. aeruginosa zostały opisane, ale ich kluczowe funkcje genów są mniej dobrze poznane. Badania transkryptomiczne umożliwią ponowną adnotację profagów LES i poprawią naszą wiedzę na temat genów zaangażowanych w cykl lizogeniczny i lityczny. Powiązanie sekwencji genów z funkcją stanowi główne wyzwanie w badaniach nad nowymi profagami, co dodatkowo podkreśla potrzebę dalszych badań w celu potwierdzenia funkcji genów fagów w celu wytworzenia lepszych narzędzi adnotacji47. Szersze zastosowanie i adaptacja protokołów oraz dodatkowych środków kontroli jakości szczegółowo opisanych w tym artykule wideo może pomóc w ujawnieniu różnych funkcji profagów, a tym samym w ulepszeniu potoków adnotacji i przekształceniu naszego rozumienia biologii fagów i bakterii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PAO16
LESB586
LES Fagiindukowane i oczyszczane z LESB58 przy użyciu norfloksacyny.To badanie
Bulion lizogeniczny (LB)Merck1.10285.500
LB AgarMerck1.10283.500
AgarAgar FisherA/1080/53
Top Agar0,4 g Agar + 2,5 g bulionu LB w 100 ml wody; autoklaw i użytkowanie.-
RyfampicynaSigma (Zapas: 50 mg/ml w metanolu- Dobrze wymieszać i użyć 0,22 mikro; m filtr do sterylizacji i przechowywania w -20° C do użycia)R3501
Lodowaty kwas octowyFisher 1% (v/v) w wodzie10060000
NorfloxacinSigma (Zapas: 25 mg / ml 1% lodowatego kwasu octowego - dobrze wymieszaj i użyj 0,22 i mikro; m filtr do sterylizacji i przechowywania w -20° C do czasu użycia; Aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, przechowuj jako małe porcje)N9890
Fenol nasycony buforem cytrynianowym pH 4,3SigmaP-4682
Biologia molekularna Etanol klasyFisher16695992
TRIzolInvitrogen12044977
ChloroformFisher11398187
IsopropanolFisher17150576
Beznukleazowy H2OInvitrogen10526945
10X TURBO DNaseAmbionAM1907
Zestaw Qubit RNA HS, BR ZestawInvitrogenQ10210
Zestaw Agilent RNA 6000 Nano ZestawAgilent5067-1511
SuperScriptIIIInvitrogen18080051
PCROdczynniki do qPCR Bioline Mytaq Red 2XBIO-25043
PCRSensifast SYBR Hi RoxBIO-92020
PCRi żelu Isolate II ZestawBIO-52060
TAZestaw do klonowania TA, z wektorem pCR 2.1, bez kompetentnych komórekK202040
System StepOne Real Time PCRThermo Fisher Scientific4376600
do syntezy pierwszej nici Odczynniki Zestaw do oczyszczania Zestaw do do klonowania i żelu

Bibliografia

  1. Lin, D. M., Koskella, B., Lin, H. C. Phage therapy: An alternative to antibiotics in the age of multi-drug resistance. World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics. 8 (3), 162-173 (2017).
  2. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New tools for genetic manipulations from bacterial immunity systems. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 209-228 (2015).
  3. Santos, S. B., Azeredo, J. Bacteriophage-based biotechnological applications. Viruses. 11 (8), 737(2019).
  4. Rodríguez-Rubio, L., Jofre, J., Muniesa, M. Is genetic mobilization considered when using bacteriophages in antimicrobial therapy. Antibiotics. 6 (4), 32(2017).
  5. Hatfull, G. F. Dark Matter of the biosphere: The amazing world of bacteriophage diversity. Journal of Virology. 89 (16), 8107-8110 (2015).
  6. Yukgehnaish, K., et al. PhageLeads: Rapid assessment of phage therapeutic suitability using an ensemble Machine Learning approach. Viruses. 14 (2), 342(2022).
  7. Seemann, T. Prokka: Rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 30 (14), 2068-2069 (2014).
  8. Arndt, D., et al. PHASTER: A better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Research. 44, W16-W21 (2016).
  9. Banerjee, S., et al. FINDER: An automated software package to annotate eukaryotic genes from RNA-Seq data and associated protein sequences. BMC Bioinformatics. 22 (1), 205(2021).
  10. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  11. Veses-Garcia, M., et al. Transcriptomic analysis of Shiga-toxigenic bacteriophage carriage reveals a profound regulatory effect on acid resistance in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8118-8125 (2015).
  12. Owen, S. V., et al. A window into lysogeny: revealing temperate phage biology with transcriptomics. Microbial Genomics. 6 (2), e000330(2020).
  13. Davies, E. V., Winstanley, C., Fothergill, J. L., James, C. E. The role of temperate bacteriophages in bacterial infection. FEMS Microbiology Letters. 363 (5), 015(2016).
  14. Livny, J., Friedman, D. I. Characterizing spontaneous induction of Stx encoding phages using a selectable reporter system. Molecular Microbiology. 51 (6), 1691-1704 (2004).
  15. Fogg, P. C. M., et al. Identification of multiple integration sites for Stx-phage Φ24B in the Escherichia coli genome, description of a novel integrase and evidence for a functional anti-repressor. Microbiology. 153 (12), 4098-4110 (2007).
  16. James, C. E., et al. Differential infection properties of three inducible prophages from an epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa. BMC Microbiology. 12, 216(2012).
  17. Riley, L. M., et al. Identification of genes expressed in cultures of E. coli lysogens carrying the Shiga toxin-encoding prophage Φ24B. BMC Microbiology. 12 (1), 42(2012).
  18. Stover, C. K., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
  19. Winstanley, C., et al. Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa. Genome Research. 19 (1), 12-23 (2009).
  20. Davies, E. V., et al. Temperate phages enhance pathogen fitness in chronic lung infection. The ISME Journal. 10 (10), 2553-2555 (2016).
  21. Allison, H. E. Stx-phages: drivers and mediators of the evolution of STEC and STEC-like pathogens. Future Microbiology. 2 (2), 165-174 (2007).
  22. Allison, H. E., et al. Immunity profiles of wild-type and recombinant Shiga-like toxin-encoding bacteriophages and characterization of novel double lysogens. Infection and Immunity. 71 (6), 3409-3418 (2003).
  23. Mori, N., et al. A peptide based on homologous sequences of the β-barrel assembly machinery component BamD potentiates antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (9), 2173-2181 (2012).
  24. Chojnacki, M., et al. A novel, broad-spectrum antimicrobial combination for the treatment of Pseudomonas aeruginosa corneal infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (10), e00777(2019).
  25. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. Epidemiology & Infection. 38 (6), 732-749 (1938).
  26. Srikumar, S., et al. RNA-seq brings new insights to the intra-macrophage transcriptome of Salmonella Typhimurium. PLoS Pathogens. 11 (11), e1005262(2015).
  27. Kröger, C., et al. The transcriptional landscape and small RNAs of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), E1277-E1286 (2012).
  28. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2019).
  29. Koetsier, G. A practical guide to analyzing nucleic acid concentration and purity with microvolume spectrophotometers. New England BioLabs Inc. , Available from: https://www.neb.com/-/media/nebus/files/application-notes/technote_mvs_analysis_of_nucleic_acid_concentration_and_purity.pdf?rev=c24cea043416420d84fb6bf7b554dbbb (2019).
  30. Saunders, N. A., Lee, M. A. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2013).
  31. Bustin, S. A. A-Z of Quantitative PCR. , International University Line. La Jolla, CA. (2004).
  32. Ruijter, J. M., et al. Efficiency correction is required for accurate quantitative PCR analysis and reporting. Clinical Chemistry. 67 (6), 829-842 (2021).
  33. Fothergill, J. L., Neill, D. R., Loman, N., Winstanley, C., Kadioglu, A. Pseudomonas aeruginosa adaptation in the nasopharyngeal reservoir leads to migration and persistence in the lungs. Nature Communications. 5 (1), 4780(2014).
  34. Huang, J., et al. Temperature-dependent expression of phzM and its regulatory genes lasI and ptsP in rhizosphere isolate Pseudomonas sp. strain M18. Applied and Environmental Microbiology. 75 (20), 6568-6580 (2009).
  35. Savli, H., et al. Expression stability of six housekeeping genes: a proposal for resistance gene quantification studies of Pseudomonas aeruginosa by real-time quantitative RT-PCR. Journal of Medical Microbiology. 52 (5), 403-408 (2003).
  36. Kassambara, A. rstatix: Pipe-Friendly Framework for Basic Statistical Tests. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=rstatix (2022).
  37. McDonald, J. E., et al. High-throughput method for rapid induction of prophages from lysogens and its application in the study of Shiga toxin-encoding Escherichia coli strains. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2360-2365 (2010).
  38. Smith, D. L., et al. Short-tailed Stx phages exploit the conserved YaeT protein to disseminate Shiga toxin genes among Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 189 (20), 7223-7233 (2007).
  39. James, C. E., et al. Lytic and lysogenic infection of diverse Escherichia coli and Shigella strains with a verocytotoxigenic bacteriophage. Applied and Environmental Microbiology. 67 (9), 4335-4337 (2001).
  40. Rees, V. E., et al. Characterization of hypermutator Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis in Australia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (4), e02538(2019).
  41. Li, Y., et al. Excisionase in Pf filamentous prophage controls lysis-lysogeny decision-making in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 111 (2), 495-513 (2019).
  42. Van Kampen, A. H. C., Moerland, P. D. Taking bioinformatics to systems medicine. Systems Medicine. 1386, 17-41 (2016).
  43. Matsushiro, A., Sato, K., Miyamoto, H., Yamamura, T., Honda, T. Induction of prophages of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 with norfloxacin. Journal of Bacteriology. 181 (7), 2257-2260 (1999).
  44. James, C. E., et al. Lytic activity by temperate phages of Pseudomonas aeruginosa in long-term cystic fibrosis chronic lung infections. The ISME Journal. 9 (6), 1391-1398 (2015).
  45. Shaw, K. J., et al. Comparison of the changes in global gene expression of Escherichia coli induced by four bactericidal agents. Microbial Physiology. 5 (2), 105-122 (2003).
  46. Long, H., et al. Antibiotic treatment enhances the genome-wide mutation rate of target cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), E2498-E2505 (2016).
  47. González-Tortuero, E., et al. VIGA: A sensitive, precise and automatic de novo VIral Genome Annotator. bioRxiv. , (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekspresja gen w profag wtranskryptomika lizogen windukcja spontanicznaPseudomonas aeruginosareplikacja litycznailo ciowy PCRintegralno RNAprofil wzrostucele terapeutyczne

Powiązane artykuły