Protokół został opracowany i przetestowany na 12 próbkach kości udowych otrzymanych z programu donacji ciał. Próbki pobrano na świeżo i przechowywano w temperaturze −20 °C w Laboratorium Biomechaniki i Implantów Uniwersytetu Flindersa (Tonsley, Australia Południowa, Australia). Przez cały czas trwania eksperymentu utrzymywano wilgotność kości. Darczyńcami były kobiety rasy kaukaskiej (w wieku 66-80 lat). Zgoda etyczna została uzyskana od Komitetu Etyki Badań Społecznych i Behawioralnych (SBREC) Uniwersytetu Flindersa (Projekt # 6380).
1. Planowanie przyrostu kroku obciążenia specyficznego dla próbki
- Przeprowadź skan preparatu kości udowej za pomocą klinicznego skanera CT, przyjmując grubość warstwy i rozmiar piksela w płaszczyźnie wynoszący około 0,5-0,7 mm. Krok ten może zostać wykonany przez doświadczonego radiologa w dowolnej publicznej placówce obrazowej z wykorzystaniem standardowych, zaprogramowanych protokołów obrazowania do wizualizacji kości.
- Wraz z preparatem zeskanuj fantom kalibracyjny do densytometrii CT z pięcioma znanymi stężeniami wodorofosforanu dipotasu (K2HPO4, zakres gęstości równoważnej od około 59 mg∙cm−3 do 375 mg∙cm−3).
- Wykonaj segmentację geometrii kości z obrazów klinicznego CT15, stwórz siatkę zesegmentowanej geometrii kości i przypisz izotropowe właściwości materiałowe element po elemencie do skalibrowanych wartości gęstości kości, korzystając z zależności między gęstością a modułem sprężystości opisanej przez Schileo i wsp.8. Zapisz siatkę do dalszej analizy w oprogramowaniu do analizy elementów skończonych. Każdy krok wykonaj zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dostarczonymi wraz z oprogramowaniem do segmentacji i analizy elementów skończonych.
- Zaimportuj siatkę do oprogramowania do analizy elementów skończonych. W pełni unieruchom dystalny koniec modelu o szerokości 3-6 mm. Przyłóż siłę nominalną 1 000 N, przywiedzioną o 8° względem osi trzonu kości udowej w płaszczyźnie czołowej i przechodzącą przez środek głowy kości udowej. Warunki obciążenia te naśladują statyczne zadanie stania na jednej nodze (orthoload.com).
- Rozwiąż model elementów skończonych za pomocą wbudowanego solvera PCG (tolerancja zbieżności: 1 x 10−7).
UWAGA: W tym przypadku użyto oprogramowania do analizy elementów skończonych ANSYS.
- Wygeneruj tabelę elementów zawierającą pierwszą i trzecią główną składową odkształcenia w centroidzie elementu, wykonując następujące polecenia:
/POST1
ETABLE,, EPTO1,1
ETABLE,, EPTO3,3
- Oblicz stosunek odkształcenia między pierwszą a trzecią główną składową odkształcenia w modelu a graniczną odkształceniem kości przy rozciąganiu (odkształcenie 0,73%) i ściskaniu (odkształcenie 1,04%)8 (Rysunek 1), wykonując następujące polecenia:
SMULT,RFT,EPTO1, ,1/0.0074,1,
SMULT, RFT,EPTO3, ,1/0.0104,1,
- Przeskaluj siłę nominalną przez szczytowy stosunek odkształcenia zarówno dla rozciągania, jak i ściskania, a następnie odrzuć większą z tych dwóch wartości, aby uzyskać szacunkowe obciążenie prowadzące do złamania. Przyjmij przyrost obciążenia jako 1/4 obliczonego obciążenia krytycznego1.

Rysunek 1: Obliczanie obciążenia krytycznego. Mapa odkształceń z analizy elementów skończonych, równania stosowane do przeliczenia siły nominalnej na obciążenie krytyczne (po lewej) oraz schemat obciążania przedstawiający kość udową (środek po prawej), dystalną czaszę aluminiową (góra po prawej) i polietylenową gniazdową przekładkę naciskową (dół po prawej). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
2. Przygotowanie zestawu z preparatem kości udowej (Rysunek 2)
- Wyjmij preparat z zamrażarki (−20 °C).
- Rozmrażaj w temperaturze pokojowej (RT) przez 24 h, utrzymując preparat w wodoszczelnym worku plastikowym owiniętym materiałem absorbującym nasączonym roztworem fizjologicznym w celu zachowania wilgotności kości.
- Odetnij trzon kości udowej w odległości 180 mm od proksymalnej głowy kości udowej.
- Wycentruj głowę kości udowej na osi pionowej przyrządu do wyrównywania, dopasowując wklęsłe gniazdo naciskowe z polietylenu (Rycina 2D) i głowę kości udowej.
- Wyrównaj płaszczyznę zawierającą szyjkę kości udowej i oś trzonu z płaszczyzną czołową (Rycina 2).
- Obróć oś trzonu do 8° przywodzenia, tak aby oś pionowa reprezentowała orientację siły reakcji stawu biodrowego podczas statycznego stania na jednej nodze (Rycina 2).
- Przygotuj cement stomatologiczny zgodnie z instrukcjami producenta.
- Zanurz dystalny koniec preparatu w aluminiowym kubku do osadzania o głębokości 55 mm, wypełniając go cementem stomatologicznym. Odczekaj co najmniej 30 min do pełnego utwardzenia cementu.
- Przechowuj zmontowany preparat w temperaturze −20 °C.

Rysunek 2: Przyrząd do wyrównania. Zdjęcie frontalne (lewo) i boczne (prawo) przyrządu do wyrównania przedstawiające (A) ramę, (B) aluminiowy kubek do zatapiania, (C) syntetyczny model kości udowej oraz (D) sferycznie kształtowane gniazdo naciskowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
3. Montaż stopnia sprężania
UWAGA: Wymiary zewnętrzne stopnia kompresji to 245 mm średnicy, 576 mm wysokości i masa 14 kg, z wyłączeniem próbki. Stopień kompresji składa się z dwóch głównych części: komory kompresyjnej oraz siłownika, które są montowane w następujący sposób:
- Komora kompresyjna
- Zamontuj polietylenowe gniazdo ciśnieniowe (średnica 104 mm, wysokość 60 mm) na dnie aluminiowego cylindra (średnica 203 mm, grubość ścianki 3 mm), który jest zamknięty od jednego końca (dołu) za pomocą spawanej płyty aluminiowej.
- Siłownik
- Zmontuj górną konstrukcję, używając tarczy, trzech prętów, płyty trójkątnej oraz prowadnicy pionowej (Rycina 3).
- Zamontuj mechanizm śrubowy (skok: 150 mm, maksymalne obciążenie: 10 000 N, przełożenie: 27:1, przesunięcie na obrót: 0,148 mm) na płycie trójkątnej.
- Zamontuj adapter kątowy na prowadnicy liniowej.
- Zamontuj niskotarciowy stół x-y na adapterze kątowym.
- Zamontuj sześcioosiowy przetwornik siły (maksymalny błąd pomiarowy: 0,005%; maksymalna siła: 10 000 N; maksymalny moment obrotowy: 500 Nm) na niskotarciowym stole, wyrównując płaszczyznę x-z przetwornika z płaszczyzną czołową górnej konstrukcji.
- Połącz śrubę siłownika z adapterem kątowym.

Rycina 3: Zespół niestandardowego, radioprzezroczystego stopnia kompresyjnego. Zdjęcie (po lewej) i model (po prawej) stopnia kompresyjnego. Na modelu przedstawiono i wskazano: (A) komorę kompresyjną, która jest cylindrem aluminiowym o grubości 3 mm zamkniętym od dołu; (B) zespół siłownika z górną strukturą; (C) mechanizm śruby pociągowej; (D) niskotarciowy stół x-y; oraz (E) sześcioosiową ogniwo obciążenia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
4. Przygotowanie eksperymentu
- Rozmrozić preparat w temperaturze pokojowej przez 24 h, utrzymując go w wodoodpornej plastikowej torebce owiniętej materiałem chłonnym nasączonym roztworem fizjologicznym w celu zachowania wilgotności kości.
- Zamocuj zestaw z próbką w aluminiowym kubku do ogniwa obciążnikowego, wyrównując płaszczyznę czołową zestawu z próbką do płaszczyzny czołowej siłownika.
- Zmontuj górną strukturę, wraz z preparatem, w komorze kompresyjnej. Należy zadbać o to, aby głowa kości udowej była wyrównana ze sferycznym wgłębieniem w polietylenowej panewce naciskowej. Upewnij się, że głowa kości udowej znajduje się w sferycznym wgłębieniu panewki naciskowej, ale nie jest w nim ściśle osadzona.
- Umieść stopień kompresyjny na stole obrotowym skanera mikro-CT w linii wiązki obrazowania i medycyny (IMBL).
- Podłącz ogniwo obciążnikowe (błąd < 0,005%; maksymalna siła: 10 000 N; maksymalny moment obrotowy: 500 Nm) do wzmacniacza odkształceń.
- Połącz, poprzez USB, wzmacniacz odkształceń do laptopa wyposażonego w oprogramowanie aplikacyjne dostarczone wraz z ogniwem obciążnikowym.
- Uruchom mechanizm śrubowy w stopniu kompresji, przesuwając próbkę w dół w kierunku gniazda naciskowego, monitorując jednocześnie siłę reakcji mierzoną przez ogniwo obciążnikowe na laptopie. Zatrzymaj mechanizm śrubowy po osiągnięciu siły kompresji równej 100 N. Odciąż próbkę do wstępnego obciążenia wynoszącego 50 N.
- Wybierz pojedynczy scyntylator sprzężony z soczewką czujnika pco.edge „Ruby” (http://archive.synchrotron.org.au/31-australian-synchrotron/imbl/811-preparation-for-imaging-experiments).
- Ustaw pole widzenia na 76,31 mm x 64,39 mm, co przy rozmiarze matrycy 2 560 pikseli x 2 160 pikseli zapewnia rozmiar piksela wynoszący 29.81 μm.
- Ustaw oś stołu obrotowego w odległości 8 mm (poziomo) od osi pola widzenia (tryb skanowania z przesunięciem), aby zwiększyć pole widzenia do 145,71 mm x 64,39 mm przy rozmiarze piksela wynoszącym 29.81 μm.
- Ustaw parametry skanowania na energię wiązki 60 keV oraz przyrost obrotu wynoszący 0.1°, dwie partie 180° obrót (skanowanie z przesunięciem), czas ekspozycji wynoszący 50 μsor uśrednianie dwóch klatek na jedną pozycję obrotową.
- Ustaw skanowanie tak, aby pozyskać pięć kolejnych, pionowo ułożonych skanów z przesunięciem pionowym o 26 mm każdy, tak aby całkowita wysokość skanowanej objętości wynosiła 132,2 mm przy całkowitym czasie skanowania wynoszącym 30 min.
5. Badania mechaniczne z jednoczesnym obrazowaniem mikrostrukturalnym
- Wykonaj obrazowanie micro-CT (rozmiar piksela: 0.03 mm) dwukrotnie w warunkach referencyjnych (przyjętych jako warunki zerowego odkształcenia).
- Zastosuj przyrost siły poprzez ręczne uruchomienie mechanizmu śruby przymusowej ze stałą prędkością wynoszącą około 1 s na obrót (0.1-0.2 mm/s).
- Wykonaj obrazowanie micro-CT.
- Powtarzaj krok 5.2 oraz krok 5.3 aż do doprowadzenia do pęknięcia próbki, co zostanie zasygnalizowane nagłym spadkiem siły reakcji.
- Wykonaj obrazowanie micro-CT pękniętej próbki.
- Zszyj 1 800 obrazów projekcyjnych (o rozmiarze 2 560 pikseli x 896 pikseli, 76.8 mm x 26.88 mm, szerokość x wysokość, 32-bitowe obrazy zmiennoprzecinkowe). Proces ten zszywa dwa obrazy projekcyjne (wykonane w trybie skanowania z poziomym przesunięciem) oraz pięć obrazów przesuniętych pionowo, tworząc w ten sposób pojedynczy obraz projekcyjny.
- Zrekonstruuj objętość obrazów przekrojów poprzecznych (4 407 obrazów, każdy o rozmiarze 4 888 x 4 888 pikseli) i zapisz je jako 32-bitowe pliki zmiennoprzecinkowe w formacie .TIFF (zajmujące 392 GB miejsca na dysku).
- Zastosuj filtr Gaussa 3 x 3 w celu redukcji szumów. Konwertuj obrazy na 8-bitowe (obrazy 256-poziomowe w skali szarości, zapisane w formacie bitmapy, zajmujące około 100 GB na objętość).
UWAGA: W niniejszej pracy przetwarzanie obrazów zostało przeprowadzone przy użyciu oprogramowania dostępnego w Australian Synchrotron pod kierunkiem operatora IMBL.
6. Obliczanie pola przemieszczeń i odkształceń
- Przeprowadź subsampling obrazów przekrojów czterokrotnie (120 μm/pixel), aby skrócić czas obliczeń.
- Wykonaj sztywne współrejestrowanie w przestrzeni obrazów preparatu pod obciążeniem z obrazami preparatu w referencyjnym stanie nieobciążonym. Jako cel współrejestrowania wykorzystaj dystalną część trzonu (Supplementary File 1 oraz Supplementary File 2).
- Po binaryzacji obrazów mikro-CT stwórz trójwymiarowe modele powierzchniowe (pliki .STL) do wizualizacji11.
- Wykonaj elastyczną rejestrację wolumenu obrazu względem wolumenu referencyjnego, używając rozmiaru siatki wynoszącego 50 pikseli (SDER = 0.076% błąd odkształcenia, BoneDVC, https://bonedvc.insigneo.org/dvc/), aby wyznaczyć przemieszczenia w węzłach siatki.
- Przekształć siatkę w model elementów skończonych. Nałóż na model przemieszczenia węzłów obliczone przez BoneDVC. Rozwiąż model, aby wyznaczyć tensor odkształcenia w całej objętości kości.
- Powtórz analizę w obszarze wykazującym najwyższy poziom odkształceń, korzystając z obrazów o pełnej rozdzielczości.
- Zmapuj mapy odkształceń DVC na obrazy o pełnej rozdzielczości, stosując interpolację sześcienną za pomocą funkcji interp3 (Matlab)2.
- Zwizualizuj przemieszczenia, odkształcenia i obrazy mikrostrukturalne w celu uzyskania wizualizacji dużych wolumenów oraz animacji (Matlab)2.
7. Analiza
- Wyświetl trwałą deformację kości (uszkodzenie) poprzez nałożenie na siebie obrazów uzyskanych w warunkach braku obciążenia oraz po złamaniu2.
- Wyświetl postępującą deformację mikrostrukturalną kości poprzez nałożenie na siebie modeli trójwymiarowych w warunkach braku obciążenia, przy zwiększających się poziomach obciążenia oraz po złamaniu2.
- Wyświetl odkształcenie kości w miejscu złamania2.
- Przeanalizuj energię deformacji, sztywność i przemieszczenie, korzystając ze statystyki opisowej i metod regresji2.