Przepływ pracy "Cell Surface Capture" do ilościowego oznaczania proteomu powierzchni komórki bez znaczników

Summary

Tutaj opisujemy proces proteomiki do charakterystyki proteomu powierzchni komórki różnych typów komórek. Ten przepływ pracy obejmuje wzbogacanie białek na powierzchni komórki, późniejsze przygotowanie próbki, analizę przy użyciu platformy LC-MS/MS oraz przetwarzanie danych za pomocą specjalistycznego oprogramowania.

Abstract

W ciągu ostatniej dekady, proteomika oparta na spektrometrii mas umożliwiła dogłębną charakterystykę systemów biologicznych w szerokim zakresie zastosowań. Proteom powierzchniowy komórki ("surfaceom") w chorobach człowieka jest bardzo interesujący, ponieważ białka błony komórkowej są głównym celem większości klinicznie zatwierdzonych terapii, a także kluczową cechą, dzięki której można diagnostycznie odróżnić chore komórki od zdrowych tkanek. Jednak skoncentrowana charakterystyka białek błonowych i powierzchniowych komórki pozostaje wyzwaniem, przede wszystkim ze względu na złożoność lizatów komórkowych, które maskują białka będące przedmiotem zainteresowania innymi białkami o wysokiej liczebności. Aby pokonać tę barierę techniczną i dokładnie zdefiniować proteom powierzchni komórki różnych typów komórek za pomocą proteomiki spektrometrii mas, konieczne jest wzbogacenie lizatu komórkowego w białka powierzchniowe komórki przed analizą na spektrometrze mas. W artykule przedstawiono szczegółowy przebieg procesu znakowania białek powierzchniowych komórek z komórek nowotworowych, wzbogacania tych białek z lizatu komórkowego, a następnie przygotowania próbki do analizy spektrometrii mas.

Introduction

Białka służą jako podstawowe jednostki, za pomocą których realizowana jest większość funkcji komórkowych. Scharakteryzowanie struktury i funkcji odpowiednich białek jest niezbędnym krokiem do zrozumienia procesów biologicznych. W ciągu ostatniej dekady postępy w technologii spektrometrii mas, oprogramowaniu analitycznym i bazach danych umożliwiły dokładne wykrywanie i pomiar białek w skali obejmującej cały proteom¹. Proteomika oparta na spektrometrii mas może być wykorzystywana w różnorodnych zastosowaniach, od podstawowej analizy szlaków biochemicznych, przez identyfikację nowych celów leków w warunkach translacyjnych, po diagnostykę i monitorowanie chorób w klinice². Podczas badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych celów terapeutycznych szczególnie ważna jest charakterystyka proteomu powierzchni komórki, przy czym ponad 65% obecnie zatwierdzonych leków dla ludzi jest ukierunkowanych na białka powierzchni komórki³. Dziedzina immunoterapii nowotworów również całkowicie opiera się na antygenach powierzchniowych specyficznych dla raka, które celują i specyficznie eliminują komórki nowotworowe⁴. Proteomika oparta na spektrometrii mas może zatem służyć jako obiecujące narzędzie do identyfikacji nowych białek powierzchniowych komórek w celu interwencji terapeutycznych.

Istnieje jednak kilka ograniczeń podczas korzystania z konwencjonalnych metod proteomicznych do badania komórek nowotworowych pod kątem nowych celów białkowych na powierzchni komórki. Podstawowym problemem jest to, że białka powierzchniowe stanowią bardzo małą część wszystkich cząsteczek białka w komórce. W związku z tym fragmenty tych białek są maskowane przez dużą obfitość białek wewnątrzkomórkowych podczas wykonywania analizy spektrometrii mas lizatu całokomórkowego⁵. To ograniczenie sprawia, że dokładne scharakteryzowanie proteomu powierzchni komórki za pomocą tradycyjnego przepływu pracy proteomicznego jest trudne. Aby sprostać temu wyzwaniu, konieczne jest opracowanie sposobów wzbogacania białek powierzchniowych komórek z lizatu całokomórkowego przed analizą na spektrometrze mas. Jedna z takich metod polega na utlenianiu i znakowaniu biotyną glikozylowanych białek powierzchniowych komórek w nienaruszonych komórkach, a następnie wzbogacaniu tych biotynylowanych białek z lizatu za pomocą neutrawidyny, procesu, który został nazwany "wychwytywaniem powierzchni komórki"6. Ponieważ uważa się, że ~85% białek powierzchniowych komórek ssaków jest glikozylowanych⁷, służy to jako skuteczna metoda wzbogacania proteomu powierzchni komórki z całego lizatu komórkowego. Ten artykuł opisuje pełny przebieg pracy, począwszy od hodowanych komórek, znakowania biotyny na powierzchni komórki, a następnie przygotowania próbki do analizy spektrometrii mas (Rysunek 1). W przypadku kilku powtórzeń metoda ta zapewnia solidne pokrycie proteomu powierzchni komórki w określonej próbce. Wykorzystanie tej metody do scharakteryzowania proteomu powierzchni komórki zarówno nowotworu, jak i zdrowych komórek może ułatwić odkrycie nowych antygenów powierzchniowych komórek w celu identyfikacji potencjalnych celów immunoterapeutycznych⁸.

Protocol

UWAGA: komórki plazmocytomy AMO1 zostały użyte w tym eksperymencie z proteomem na powierzchni komórki. Ten sam protokół może być również używany dla innych typów komórek, w tym szerokiej gamy zawiesinowych i przylegających linii komórkowych⁹, a także różnych typów próbek pierwotnych¹⁰. Jednak liczba komórek (materiał wyjściowy do eksperymentu) zazwyczaj musi być zoptymalizowana pod kątem równoważnego pokrycia proteomu. Szczegółowe informacje dotyczące materiałów i wyposażenia znajdują się w Tabeli materiałów. Szczegółowe informacje dotyczące i roztworów odczynników oraz ich składu znajdują się w Tabeli 1.

1. Znakowanie powierzchni komórek za pomocą biotyny

1. Policzyć wyhodowane komórki i osad około 3,5 × 10⁷ żywych komórek przez odwirowanie (5 min w temperaturze 500 × g, 24 °C).
   UWAGA: Komórki plazmocytomy AMO1 pasażowano świeżą pożywką co 3 dni przed pobraniem.
2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad, dodając 1 ml zimnego (4 °C) buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (D-PBS) firmy Dulbecco (bez wapnia, bez magnezu) i delikatnie pipetując w górę i w dół.
3. Ponownie ogarnąć komórki (jak w kroku 1.1) i powtórzyć etap mycia (krok 1.2) jeszcze raz (w sumie dwa prania).
4. Po drugim płukaniu rozpakować komórki w granulki (jak w kroku 1.1) i ponownie zawiesić je w 990 μl zimnego D-PBS, delikatnie pipetując.
5. Wcześniej przygotować roztwór podstawowy 160 mM metaperiodianu sodu (NaIO₄). Podzielić na porcje o pojemności 50 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Dodać 10 μl 160 mM roztworu metaperiodianu sodu do zawiesiny komórek w kroku 1.4, dokładnie wymieszać i inkubować na wirniku typu end-to-end przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
6. Po zakończeniu inkubacji zagnieździć komórki (jak w kroku 1.1), zdekantować supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml zimnego D-PBS. Powtórz ten krok prania dwa razy (w sumie trzy prania). Po trzecim płukaniu ponownie zawiesić komórki w 989 μl D-PBS.
7. Wcześniej przygotować roztwór podstawowy 100 mM hydrazydu biocytyny. Podzielić na porcje o pojemności 50 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Dodać 1 μl aniliny i 10 μl 100 mM hydrazydu biocytyny do zawiesiny komórek w kroku 1.6, dokładnie wymieszać i inkubować na rotorze typu end-to-end przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
8. Po zakończeniu inkubacji zagnieździć komórki (jak w kroku 1.1), zdekantować supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml zimnego D-PBS. Powtórz ten krok prania dwa razy (w sumie trzy prania).
9. Po trzecim przemyciu ostrożnie odessać supernatant za pomocą pipety i zatrzaskowo zamrozić osad komórek, umieszczając probówkę w cieczy_N2. Umieścić zamrożone granulki w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do przeprowadzenia lizy i ściągania.

2. Liza komórek i spadek biotyny

1. Rozmrozić zamrożone osady komórkowe na lodzie.
2. Dodaj 500 μL 2x buforu do lizy do granulatu, dokładnie wymieszaj i wiruj przez 30 s.
   UWAGA: Do pełnej lizy granulatu może być wymagane energiczne pipetowanie i wirowanie. Niektóre nierozpuszczalne zanieczyszczenia (np. DNA) są dopuszczalne, ponieważ są usuwane w kolejnym etapie sonikacji.
3. Sonikacja lizatu komórkowego na lodzie (trzy impulsy, każdy po 20 s, 60% cykl pracy).
4. Odwirować lizat w celu osadzenia wszelkich pozostałych zanieczyszczeń (10 min w temperaturze 17 200 × g w temperaturze 4 °C).
5. Podczas odwirowywania lizatu dodać 100 μl kulek żywicy agarozowej neutrawidyny do kolumny filtracyjnej. Przymocuj kolumnę do kolektora próżniowego, zastosuj delikatną próżnię i umyj kulki, przelewając na nie 3 ml buforu płuczącego 1.
6. Wyjmij kolumnę filtracyjną z kolektora próżniowego, zakryj dno i dodaj sklarowany lizat komórkowy do kolumny z kulkami. Przykryć górną część kolumny i inkubować lizat z kulkami na wirniku od końca do końca przez 120 minut w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Podczas zaślepiania górnej części kolumny należy mocno przytrzymać dolną nasadkę na miejscu, w przeciwnym razie może się ona wysunąć, a lizat komórkowy może wyciekać podczas inkubacji.
7. Przygotować do przemywania 1, 2 i 3 (około 5 ml każdego buforu do płukania na próbkę, patrz Tabela 1) i umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C
8. Po zakończeniu inkubacji lizatu umieść kolumnę filtracyjną z powrotem na kolektorze próżniowym, zastosuj delikatną próżnię i umyj kulki, przepływając po nich 5 ml buforu płuczącego 1.
   UWAGA: Do mycia można użyć więcej niż 5 ml do mycia; Dodatkowe pranie może zmniejszyć tło, niespecyficzne wiązanie na koralikach.
9. Powtórzyć etap płukania z 5 ml buforu do przemywania 2.
10. Powtórzyć etap płukania z 5 ml buforu do przemywania 3.
11. Gdy końcowy bufor płuczący całkowicie przepłynie przez kulki, wyjmij kolumnę z kolektora. Dodać 100 μl roztworu "Lyse" do kulek i przenieść je do 1,7 ml probówki wirówkowej z mikrobiałkami o niskiej zawartości białka za pomocą pipety. Krótko obrócić probówkę, aby osadzić kulki i usunąć 50 μl roztworu, nie naruszając osadzonych kulek.
    UWAGA: Odczynniki w tym kroku i we wszystkich kolejnych krokach wykorzystują dostępny na rynku zestaw do przygotowywania próbek proteomicznych. Zestaw zapewnia zoptymalizowany, uproszczony proces przygotowania próbki. Jednak te kroki można również wykonać niezależnie od zestawu, przy użyciu tradycyjnego przepływu pracy proteomiki, jak opisano w Verma et al.⁹. Jeśli koraliki pozostają przyklejone do boku lub dna kolumny, pozwól, aby koraliki, które zostały przeniesione do rurki, osiadły i użyj dodatkowego roztworu "Lizy" w rurze, aby przenieść pozostałe koraliki.
12. Umieść probówkę na bloku grzewczym/wytrząsarce w temperaturze 65 °C i potrząsaj z prędkością 1 000 obr./min przez 10 minut
    UWAGA: Ten etap jest wymagany do redukcji i alkilacji reszt cysteiny przed trawieniem.

3. Trawienie białek

1. Zawiesić suszoną trypsynę (probówkę "Digest" w zestawie, przechowywaną w temperaturze -20 °C), dodając 210 μl roztworu "Resuspend". Odpipetować roztwór kilka razy w górę i w dół, aby upewnić się, że cała wysuszona trypsyna została ponownie zawieszona.
2. Po zakończeniu inkubacji dodać 50 μl ponownie zawieszonego roztworu trypsyny do kulek. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 500 obr./min przez co najmniej 90 minut w celu strawienia białka.
3. Po zakończeniu trawienia przenieś roztwór zawierający kulki do kolumny wirowej i włóż kolumnę do probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml o niskiej zawartości białka. Obracać probówkę (500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej [RT]), aby oddzielić strawiony roztwór peptydu od kulek.
   UWAGA: Na tym etapie leczenie PNGazą można przeprowadzić na kulkach po ich oddzieleniu od roztworu peptydów, aby wymyć biotynylowane fragmenty peptydu z kulek streptawidyny. Ta próbka peptydu może być następnie przeniesiona przez pozostałą część przepływu pracy jako oddzielna, wtórna próbka peptydu, którą można analizować i porównywać z pierwotną próbką z trypsynizacji na kulkach. Podejście PNGazy prawdopodobnie dostarczy danych uzupełniających do trypsynizacji na kulkach, biorąc pod uwagę dodatkową specyficzność dla wychwyconych N-glikozylowanych asparagin, opartą na wykrywalnej przez MS modyfikacji łańcucha bocznego¹². Jednak wadą tego podejścia do sekwencyjnej elucji jest wymóg dwukrotnego czasu przyrządu spektrometru mas na analizę próbki.
4. Dodać 100 μl roztworu "Stop", aby zatrzymać reakcję trawienia i zakwasić roztwór peptydowy.

4. Odsalanie peptydów

1. Za pomocą adaptera probówki umieść kolumnę odsalającą w probówce mikrowirówki o pojemności 1,7 ml o niskiej zawartości wiązania białek. Dodaj cały zakwaszony roztwór peptydu do kolumny. Obracać kolumnę (3 800 × g przez 3 minuty) tak, aby roztwór przepłynął przez kolumnę. Peptydy są teraz związane z kolumną; Odrzuć przepływ.
2. Dodać 200 μl roztworu "Wash 1" do kolumny i odwirować (3 800 × g przez 3 min, RT). Odrzuć przepływ.
3. Dodać 200 μl roztworu "Wash 2" do kolumny i odwirować (3 800 × g przez 3 min, RT). Odrzuć przepływ.
4. Przenieść kolumnę do nowej, znakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml o niskiej zawartości wiązania białek. Dodać 100 μl roztworu "Elute" do kolumny i odwirować (3 800 × g przez 3 minuty, RT). Dodać kolejne 100 μl roztworu "Elute" do kolumny i odwirować (3 800 × g przez 3 min, RT). Peptydy są teraz eluowane z kolumny do probówki.
5. Umieść roztwór peptydowy w wirówce próżniowej i pozostaw do wyschnięcia na noc. Umieścić wysuszone peptydy w temperaturze -80 °C do momentu, aż będą gotowe do oznaczania ilościowego, i poddać analizie na spektrometrze masowym.

5. Reprodukcja peptydów i kwantyfikacja

1. Wysuszone peptydy zawiesić ponownie w 20 μl rozpuszczalnika A (0,1% kwas mrówkowy, 2% acetonitryl).
2. Odwirować zawieszone peptydy (17 200 × g przez 10 minut) w celu osadzenia wszelkich nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.
3. Przygotuj wzorce peptydowe do kolorymetrycznego testu ilościowego peptydów.
   1. Umieścić 5 μl roztworu podstawowego peptydu o stężeniu 1,000 mg/ml w jednym dołku 96-dołkowej płytki.
   2. Wykonać siedmiostopniowe seryjne rozcieńczanie w płytce z wodą dejonizowaną (DI) w następujący sposób, z 5 μl każdego wzorca na studzienkę: 1,000 mg/mL, 500 mg/mL, 250 mg/mL, 125 mg/mL, 62,5 mg/mL, 31,25 mg/ml i 15,625 mg/mL. Umieść 5 μl wody DI w ósmym dołku na ślepą próbę.
4. Umieść 4 μl wody DI w trzech oddzielnych studzienkach na 96-dołkowej płytce. Dodać 1 μl zawieszonego roztworu peptydu do każdej studzienki, uzyskując całkowitą objętość 5 μl.
   UWAGA: Podczas pipetowania roztworu peptydowego w celu oznaczania ilościowego, należy ostrożnie pipetować od góry roztworu, aby zapobiec naruszeniu osiadłych zanieczyszczeń.
5. Oblicz, ile potrzebnego odczynnika roboczego (wymagane 45 μl na studzienkę). Przygotować wymaganą objętość odczynnika roboczego do testu kolorymetrycznego; Odwiruj odczynnik roboczy, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie składników.
6. Dodać 45 μl odczynnika roboczego do każdego z dołków wzorcowych i dołków na próbki.
   UWAGA: Wykonaj wzorce w dwóch egzemplarzach i użyj pipety wielokanałowej, aby zapewnić minimalną różnicę w czasie dodawania odczynnika do studzienek.
7. Przykryć płytkę folią aluminiową i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
8. Przeanalizuj płytkę na automatycznym czytniku płytek. Wartości absorbancji zarejestrowane dla próbek wzorcowych należy wykorzystać do wygenerowania liniowej krzywej wzorcowej. Określ równanie krzywej standardowej i wartości R². Jeżeli wartość R² jest rozsądna (≥0,95), należy użyć krzywej wzorcowej do określenia stężenia ponownie zawieszonych peptydów, biorąc pod uwagę pięciokrotne rozcieńczenie na płytce do oznaczania kolorymetrycznego.

6. Chromatografia cieczowa z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) analiza strawionych peptydów

1. Dostosuj stężenie próbek peptydów do 0,2 μg/μl, dodając rozpuszczalnik A i przenieś 10 μl do 0,6 ml probówki o niskiej zawartości białka.
2. Umieść probówkę w automatycznym podajniku próbek LC.
3. Ustaw parametry LC i MS/MS zgodnie z Rysunek 2 i Rysunek 3.
4. Wstrzyknąć 5 μl (1 μg) próbki peptydu do zestawu LC-MS/MS w celu analizy.
   UWAGA: Pokazane tutaj ustawienia LC-MS/MS są reprezentatywne tylko dla ilustracji. W zależności od dostępności przyrządów LC i MS, użytkownicy mogą modyfikować ustawienia gradientu LC i parametrów MS/MS, aby uzyskać głębokie pokrycie proteomu. W tym artykule analizę danych MS przeprowadzono przy użyciu MaxQuant https://www.maxquant.org/, wtórną analizę danych przeprowadzono przy użyciu Perseus https://maxquant.net/perseus/, a analizę ścieżek przy użyciu https://reactome.org/.

Results

W tym eksperymencie scharakteryzowaliśmy proteom powierzchni komórki linii komórek nowotworowych, znakując N-glikozylowane białka błonowe nienaruszonych komórek biotyną i wzbogacając te znakowane białka z całego lizatu komórkowego za pomocą obniżenia neutrawidyny (Rysunek 1). Ponadto przeprowadziliśmy analizę proteomu przy użyciu LC-MS/MS w celu scharakteryzowania wzbogaconych białek powierzchniowych komórek. W przeciwieństwie do analizy proteomu całej komórki, w tym przypadku celem było scha...

Discussion

Proteomika oparta na spektrometrii mas jest potężnym narzędziem, które umożliwiło bezstronną charakterystykę tysięcy nieznanych białek na wcześniej niemożliwą skalę. Takie podejście pozwala nam zidentyfikować i określić ilościowo białka, a także uzyskać szereg informacji na temat zdolności strukturalnych i sygnalizacyjnych komórek i tkanek, poprzez scharakteryzowanie różnorodności białek obecnych w danej próbce. Wykraczając poza globalne profilowanie białek w próbce, spektrometria mas pozwala nam scharakteryzować różne m...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kits
96X iST Zestaw do przygotowania próbek	PreOmics	P.O.00027	Zestaw do przygotowania próbek Proteomics. Zawiera odczynniki do redukcji, alkilowania i trawienia. Obejmują również kolumny odsalające i odczynniki.
Pierce Ilościowy kolorymetryczny test peptydowy	Thermo	23275	Zestaw do kwantyfikacji peptydów. Obejmuje wzorce peptydowe i składniki odczynników roboczych.
odczynniki
Acetonitryl	Fisher	A955-1
Wodorowęglan amonu	Millipore Sigma	09830-1KG
Hydrazyd biocytyny	Biotium	90060
D-PBS (bez soli wapnia i magnezu)	UCSF Zakład hodowli komórkowych	CCFAL003-225B01
Kwas mrówkowy	Honeywell	94318
Halt Inhibitor proteazy i fosfatazy Jednorazowy koktajl	Thermo	1861280
Żywica agarozowa o dużej pojemności Neutrawidyna Thermo		29204
Buforowana fosforanami sól fizjologiczna	UCSF Zakład hodowli komórkowych	CCFAL001-22J01
Bufor do lizy RIPA, 10x	Millipore Sigma	20-188
Chlorek sodu	Fisher	BP358-212
Metaperiodat sodu	Alfa Aesar	13798
Trypan Blue Stain (0,4%)	Gibco	15250-061
Ultrapure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575-038
Mocznik (klasa proteomiczna)	VWR	M123-1KG
silny>Sprzęt
TC20 Automatyczny licznik komórek	Bio-Rad	1450102
PrismR Mikrowirówka	Labnet International	C2500-R-230V
Sonikator	VWR	Branson Sonifier 240
Kolektor próżniowy	Promega	Promega Vac-Man
Wytrząsający blok grzewczy	Eppendorf	Eppendorf Eppendorf Thermomixer C
Rotator end-to-end	Rewolwer Labnet	Regulowany rotator
LC	Thermo	Ultimate 3000 HPLC i UHPLC
Q Exactive Plus Hybrydowy kwadrapolowy spektrometr masowy Orbitrap	Thermo	IQLAAEGAAPFALGMBDK
Czytnik mikropłytek	Biotek	Biotek Synergy 2
Koncentrator próżniowy	Labconco	7810010
Supplies
1,5 mL Probówki białkowe LoBind	Eppendorf	22431081
1,7 ml Mikrowirówki Kolumny
filtracyjne	Bio-Rad	7326008
Kolumny wirowe	Thermo	Numer katalogowy: 69725