Method Article

Badanie funkcji tkanki tłuszczowej

DOI:

10.3791/64957

⸱

March 3rd, 2023

 , 
1Team Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity and Diabetes, C3M, Université Côte d'Azur, Inserm

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OMÓWIONE ARTYKUŁY:

Cho, D. S., Doles, J. D. Przygotowanie komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej z tkanki tłuszczowej najądrza myszy. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (162), doi: 10.3791/61694 (2020).

Peics, J. et al. Izolacja subpopulacji komórek zrębu adipogennego i włóknisto-zapalnego z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (162), doi: 10.3791/61610 (2020).

Estrada-Gutierrez, G. et al. Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (164), doi: 10.3791/61884 (2020).

Gilleron, J. et al. Badanie struktury tkanki tłuszczowej za pomocą oczyszczania metylosalicylanu i obrazowania 3D. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (162), doi: 10.3791/61640 (2020).

Czepielewski, R. S. et al. Analiza limfatyczna i krwionośna podczas otyłości. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (165), doi: 10.3791/61814 (2020).

Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. Model hodowli komórek adipocytów do badania wpływu modulacji białek i mikro-RNA na funkcję adipocytów. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (171), doi: 10.3791/61925 (2021).

Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Izolacja, proliferacja i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej makaka rezusa. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (171), doi: 10.3791/61732 (2021).

Batista Jr., M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Trójwymiarowa hodowla adipocytów jako model do badania przebudowy białej tkanki tłuszczowej wywołanej kacheksją. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (167), doi: 10.3791/61853 (2021).

Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z ludzkich adipocytów za pomocą filtracji i ultrawirowania. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (170), doi: 10.3791/61979 (2021).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otyłość, charakteryzująca się wzrostem masy tkanki tłuszczowej (AT) i prozapalną przebudową komórek odpornościowych AT, stała się głównym światowym problemem zdrowia publicznego, ponieważ dramatycznie zwiększa ryzyko rozwoju chorób sercowo-naczyniowych, cukrzycy typu 2 i chorób wątroby. W związku z tym badanie struktury i funkcji AT stało się ważnym wyzwaniem klinicznym. W tym zbiorze metod prezentujemy kilka najnowocześniejszych metod opracowanych do badania struktury i funkcji AT w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

AT to niejednorodna tkanka składająca się z kilku populacji komórek, w tym dojrzałych adipocytów, komórek progenitorowych tkanki tłuszczowej (APC), włóknistych komórek progenitorowych (FIP), komórek śródbłonka i komórek odpornościowych. Dlatego, aby scharakteryzować tę tkankę, można przeprowadzić fenotypowanie pojedynczych komórek. W swoich artykułach Cho i in. oraz Peics i wsp. przedstawiają protokoły izolacji i charakterystyki mysich białych APC rezydujących w AT za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)1,2. Ten krok ma kluczowe znaczenie nie tylko dla zliczania liczby rezydentnych APC, co jest ważnym czynnikiem w określaniu zdolności do ekspansji AT, ale także dla dalszego badania funkcji tych komórek na poziomie pojedynczej komórki. Peics i wsp. podają również metodę izolowania mysich białych FIPs2 rezydentnych w AT, nieadipogennych komórek wytwarzających kolagen, które mogą przyczyniać się do rozwoju fenotypu prozapalnego, o którym wiadomo, że odgrywa rolę w dysfunkcji AT. Podobnie Estrada-Gutierrez i wsp. opisują protokół jednoczesnej izolacji żywotnych dojrzałych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu z ludzkich trzewnych biopsji AT3. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły te są złotym standardem w generowaniu pojedynczej zawiesiny komórkowej z ludzkiego i mysiego AT, co jest pierwszym krytycznym krokiem do dalszego liczenia i funkcjonalnego fenotypowania różnych subpopulacji komórek AT.

Związek między strukturą a funkcją jest bardzo istotny w AT. Cechą charakterystyczną dysfunkcji AT podczas otyłości jest wzrost wielkości adipocytów i głęboka przebudowa AT. Ta przebudowa wpływa nie tylko na populacje adipocytów i komórek odpornościowych, ale także na sieć limfatyczną i naczynia krwionośne. Aby docenić te zmiany w całym AT, Gilleron i wsp. opracowali bardzo prosty, niedrogi i szybki protokół czyszczenia AT4. Ten prosty protokół trójwymiarowo wizualizuje morfologię biopsji całego AT myszy i dużych ludzkich biopsji AT. Obejmuje to sieci neuronalne i naczyniowe, adipocyty oraz wrodzoną i adaptacyjną dystrybucję komórek odpornościowych, które są ważnymi parametrami do zbadania w otyłości i związanych z nią patologiach. Aby scharakteryzować wpływ otyłości na naczynia limfatyczne i krwionośne AT, Czepielewski i wsp. podają metodę in vivo polegającą na jednoczesnym barwieniu arboryzacji limfatycznej i naczyń krwionośnych poprzez wstrzykiwanie lektyn sprzężonych z fluorochromem5. Protokół ten umożliwia analizę morfologii in vivo obu sieci, w tym ich gęstości, objętości i rozgałęzień. Co ciekawe, połączenie tej strategii etykietowania z procedurą czyszczenia AT4 umożliwia mapowanie w wysokiej rozdzielczości całego AT myszy w trzech wymiarach (3D)5. Podsumowując, podejścia te mogą scharakteryzować strukturę AT w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych, uzyskując wgląd w korelację między strukturą a funkcją AT.

Ze względu na wysoką heterogeniczność i ogromną zdolność do przebudowy, analiza funkcji adipocytów w AT in vivo nie jest prosta, dlatego opracowano kilka systemów hodowli. Główną zaletą wszystkich tych systemów hodowli komórkowych jest wysoki poziom kontroli nad populacją komórek i mikrośrodowiskiem. Jager i wsp. opracowują prosty protokół manipulowania ekspresją RNA w dojrzałych adipocytach zróżnicowanych 3T3-L16. Chociaż ten system hodowli jest daleki od idealnych warunków fizjologicznych, adipocyty 3T3-L1 pozostają funkcjonalne w odniesieniu do sygnalizacji insulinowej, wychwytu glukozy, lipogenezy i lipolizy. Dlatego protokół ten zapewnia potężne narzędzie do manipulowania ekspresją białek i niekodujących RNA oraz badania ich roli w funkcjach adipocytów. Aby zbliżyć się do idealnych warunków fizjologicznych, Poret i wsp. opisują metodę generowania funkcjonalnych dojrzałych adipocytów przy użyciu komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) uzyskanych z makaka rezusa AT7. Protokół ten wyjaśnia, jak izolować pierwotne ADSC oraz jak indukować ich proliferację i różnicowanie. Autorzy sugerują ponadto, że procedura ta może być dostosowana do innych gatunków. Chociaż ten system hodowli jest bliższy idealnym warunkom fizjologicznym w porównaniu z linią komórkową 3T3-L1, dojrzałe adipocyty pochodzące z pierwotnych ADSC są hodowane w 2D, co różni się od in vivo. Aby poradzić sobie z tym problemem, Batista Jr. i in. zapewniają skuteczny protokół dla trójwymiarowego systemu drukowania kultur tkankowych8. W tej pracy autorzy generują adiposferoidy z komórek frakcji naczyniowej zrębu myszy i różnicują prekursory adipocytów bezpośrednio w tym systemie hodowli 3D. Takie podejście jest nieodwołalnie bliższe idealnym warunkom fizjologicznym niż metoda hodowli 2D, ale należy wziąć pod uwagę brak naczyń, które mogłyby dostarczać składniki odżywcze do adipocytów w środku sferoid. Modulowanie ekspresji białek i niekodujących RNA, jak opisano6, w tych systemach hodowli może prowadzić do dalszego wglądu w funkcjonalną rolę tych celów w adipocytach o bardziej fizjologicznym znaczeniu. Jednak tak złożony system nie został jeszcze ustalony. Głównym interesem tych systemów hodowli ex vivo/in vitro jest wysoki poziom kontroli nad mikrośrodowiskiem, które obejmuje również czynniki wydzielane przez komórki. W związku z tym protokół Akbara i wsp. izoluje i charakteryzuje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) wydzielane przez ludzkie adipocyty9. Niedawno stwierdzono, że pojazdy elektryczne są ważnymi regulatorami metabolizmu; ta metoda jest obowiązkowa do analizy wpływu metabolicznego tych EV pochodzących z adipocytów w różnych sytuacjach metabolicznych.

W niniejszym zbiorze metod przedstawiamy przegląd najnowocześniejszych protokołów obejmujących kilka aspektów analizy AT, w tym systemy hodowli ex vivo i in vitro , eksplorację całych tkanek 3D i analizę pojedynczych komórek. Chociaż żaden system hodowli nie jest doskonały, ważne jest, aby wybrać system hodowli, który jest dostosowany do kwestii biologicznej. Dlatego ten zbiór metod zapewnia duży zestaw procedur do izolacji, różnicowania i manipulowania adipocytami in vitro. Połączenie wszystkich opisanych tutaj metod doprowadzi do wglądu w morfologię i funkcję AT.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni Jean-Francois Tanti i Mireille Cormont za ich naukowe wsparcie i wkład. Prace te były wspierane przez INSERM, Université Côte d'Azur oraz przez granty z Francuskiej Narodowej Agencji Badawczej (ANR) w ramach Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), programu UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) oraz Young Investigator Program dla J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON) i J.J. (ANR-20-CE14-0010-01).

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. Journal of Visualized Experiments. (162), e61694(2020).">Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. Journal of Visualized Experiments. (162), e61694(2020).
  2. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (162), e61610(2020).">Peics, J., et al. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (162), e61610(2020).
  3. Isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for RNA analysis and macrophage phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (164), e61884(2020).">Estrada-Gutierrez, G., et al. Isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for RNA analysis and macrophage phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (164), e61884(2020).
  4. Exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3D imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).">Gilleron, J., et al. Exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3D imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
  5. Lymphatic and blood network analysis during obesity. Journal of Visualized Experiments. (165), e61814(2020).">Czepielewski, R. S., et al. Lymphatic and blood network analysis during obesity. Journal of Visualized Experiments. (165), e61814(2020).
  6. An adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-RNA modulation on adipocyte function. Journal of Visualized Experiments. (171), e61925(2021).">Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. An adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-RNA modulation on adipocyte function. Journal of Visualized Experiments. (171), e61925(2021).
  7. Isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61732(2021).">Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61732(2021).
  8. Three-dimensional adipocyte culture as a model to study cachexia-induced white adipose tissue remodeling. Journal of Visualized Experiments. (167), e61853(2021).">Batista, M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Three-dimensional adipocyte culture as a model to study cachexia-induced white adipose tissue remodeling. Journal of Visualized Experiments. (167), e61853(2021).
  9. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).">Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Adipose TissueAdipose Progenitor CellsMurine Adipose DepotsViable AdipocytesStromal Vascular FractionObesity AnalysisAdipocyte FunctionExtracellular VesiclesAdipocyte Culture ModelRNA AnalysisMacrophage Phenotyping3D Imaging

Related Articles