Nie dotyczy
Artykuł metodologiczny
14 lipca 2023
Nie dotyczy
Mięśnie szkieletowe, pokrywające ~40% ludzkiego ciała, są głównym narządem, wspierającym kluczowe funkcje, od ruchu po oddychanie i metabolizm. Co ważne, ma wyjątkową zdolność do samonaprawy po urazie, a dzięki tej zdolności regeneracyjnej zapewnia pełną funkcjonalną i strukturalną regenerację po poważnych uszkodzeniach w mniej niż miesiąc. Kilka typów komórek jest zaangażowanych w tę niezwykłą zdolność naprawczą, przy czym komórki macierzyste mięśni odgrywają kluczową rolę.
Naukowcy zajmujący się mięśniami na całym świecie opracowali kilka testów do analizy mięśni szkieletowych na poziomie funkcjonalnym, molekularnym i komórkowym. Każda technika ma swoje mocne strony, przy czym testy in vivo na modelach zwierzęcych reprezentują opcję o największym znaczeniu dla ludzi i złożoności organizmów żywych. Ich odpowiedniki in vitro i ex vivo zyskują na popularności, ponieważ grupy badawcze na całym świecie dążą do zminimalizowania badań na zwierzętach w świetle uznanej na całym świecie zasady Replacement-Reduction-Refinement (3R). Zbiór ten miał na celu dostarczenie modeli in vivo i ex vivo do molekularnych, komórkowych i funkcjonalnych badań mięśni u różnych gatunków.
Montandon i wsp.1 opisują techniki szybkiego charakteryzowania fenotypów regeneracji mięśni u danio pręgowanego o genotypach kontrolnych i zmutowanych. Po pierwsze, zarodki są genotypowane przy użyciu materiału, który jest strząsany ze znieczulonych zwierząt. Jest to ekscytująca perspektywa, ponieważ większość protokołów obejmujących genotypowanie genetycznie zmodyfikowanych zarodków wymaga jednoczesnego złożenia zarodka w ofierze. Następnie regeneracja jest indukowana przez dźgnięcie określonego obszaru mięśni larwy danio pręgowanego. Dzięki właściwościom optycznym sarkomeru integralność uszkodzonego mięśnia można ocenić za pomocą obrazowania po urazie. Protokół ten cieszy się dużym zainteresowaniem naukowców zajmujących się regeneracją mięśni, ponieważ jest to szybka, potencjalnie wysokoprzepustowa metoda badania różnych mutantów pod kątem wad regeneracyjnych.
Hüttner i wsp.2 oraz Pegoli i wsp.3 prezentują metodę, która umożliwia badania komórkowe i molekularne komórek macierzystych mięśni, populacji komórek stanowiących rdzeń regeneracji mięśni. Metoda ta jest bardzo interesująca dla naukowców zajmujących się wczesną aktywacją i interakcjami komórka-nisza. Metoda pojedynczych hodowli włókien mięśniowych pozwala na hodowlę i badanie komórek macierzystych mięśni do 96 godzin, gdy są one jeszcze związane z włóknami mięśniowymi, odbierając sygnały z tej bliższej, endogennej niszy. Technika ta jest szczególnie trudna do ustalenia ze względu na wiele delikatnych kroków, które Hüttner i wsp.2 dokładnie wyjaśniają (np. delikatne rozwarstwienie mięśni i dysocjacja). Idąc o krok dalej, autorzy szczegółowo opisują celowanie w siRNA w celu przeprowadzenia funkcjonalnych analiz czynników, które mogą wpływać na zachowanie komórek macierzystych, i podkreślają znaczenie porównywania komórek transfekowanych siRNA z komórkami transfekowanymi w grupie kontrolnej od tej samej myszy i mięśnia. Równolegle Pegoli i wsp.3 opisują, w jaki sposób można dostosować tę metodę do badania komórek macierzystych mięśni w kontekście dystrofii mięśniowej Emery'ego-Dreifussa i wczesnego życia poporodowego, koncentrując się na wyzwaniach związanych z kruchością mięśni w tym kontekście. Aby zwiększyć wydajność protokołu, prowadzą czytelników za pomocą obrazów włókien o dobrej i złej przeżywalności i podkreślają potrzebę "empirycznej walidacji" czasu trawienia.
Zaidan i wsp.4 opisują system hodowli ex vivo mięśni szkieletowych, który sprzyja produkcji komórek rezerwowych przypominających stan spoczynku, przy jednoczesnym zachowaniu wielu innych typów komórek, przy czym oba stanowią wyzwanie w alternatywnych systemach hodowli. W związku z tym metoda ta może być przydatna dla badaczy zorientowanych na badania spoczynku lub interakcje niszowo-komórkowe komórkami macierzystymi, w tym w warunkach, które modyfikują szlaki molekularne za pomocą leków, siRNA lub wektorów. Protokół obejmuje szybkie rozwarstwienie mięśni kończyn tylnych, a następnie trawienie enzymatyczne i filtrację. Następnie komórki umieszcza się w hodowli, a w ciągu tygodnia pojawiają się komórki rezerwowe. Protokół umożliwia amplifikację tych komórek rezerwowych na dużą skalę, z możliwością obrazowania żywych komórek przy użyciu genetycznie znakowanych myszy, takich jak Pax7nGFP.
Park i wsp.5 pokazują, w jaki sposób azotany i azotyny można mierzyć w mięśniach szkieletowych, jednym z głównych narządów magazynujących azotany. Opisana metoda jest szczególnie interesująca dla badaczy zajmujących się fizjologią wysiłku fizycznego oraz zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi czy metabolicznymi związanymi z cyklem tlenku azotu. Mimo znacznego rozwoju technologicznego ułatwiającego pomiary azotanów i azotynów, istnieje kilka parametrów, które mogą mieć wpływ na wynik końcowy i są dokładnie opisane i porównane przez autorów (np. metoda homogenizacji, wielkość biopsji, typ mięśni).
Hessel i wsp.6 opisują bardzo szczegółowo procedurę pobierania biopsji z mięśnia piszczelowego przedniego u pacjentów w celu uzyskania włókien o długości wystarczającej do eksperymentów mechanicznych. Autorzy podkreślają, że należy wykluczyć pacjentów z niedawnym uszkodzeniem mięśnia. Po uzyskaniu świadomej zgody kwalifikujących się pacjentów, ultradźwięki są wykorzystywane do oceny najlepszego miejsca w mięśniu do pobrania biopsji. Po omówieniu idealnej drogi wstrzyknięcia, zespół wykonuje biopsję przy użyciu specjalistycznej igły. Na koniec szczegółowo omówiono pooperacyjną opiekę nad pacjentem i metody przetwarzania tkanek. Metoda ta jest szczególnie interesująca dla lekarzy-naukowców, którzy chcą ustandaryzować pobieranie tkanek od pacjentów do badań mechanicznych włókien mięśniowych.
W tym zbiorze metod badania mechaniczne są prezentowane przez Brightwella i wsp.7 oraz Corony i wsp.8. W tych artykułach omówiono metody pomiaru siły w małych i dużych modelach zwierzęcych. Choroba lub uraz nerwowo-mięśniowy negatywnie wpływa na siłę mięśni; Dlatego ćwiczenia, odżywianie i interwencje terapeutyczne mają na celu jej przywrócenie. Brightwell i wsp.7 szczegółowo opisują metodę oceny funkcji mięśnia czworogłowego uda u myszy w sposób analogiczny do metod stosowanych u ludzi. Po pierwsze, podają kroki w celu przygotowania sprzętu i oprogramowania wymaganego do eksperymentu. Następnie mysz jest znieczulana i ustawiana w pozycji do oceny funkcji prostownika. Elektrody umieszcza się w dystalnej części mięśnia czworogłowego w celu indukcji skurczu, ocenia się optymalny prąd oraz rejestruje i analizuje pomiary szczytowego izometrycznego momentu tężcowego. Korzystając z większego modelu zwierzęcego, Corona i wsp.8 oceniają izometryczny moment obrotowy w mięśniu zginacza grzbietowego kończyn tylnych świni, pokazując krok po kroku ustawienia sprzętu i protokół pomiaru siły. Warto zauważyć, że pokazują one czoła fal o wysokiej i niskiej jakości, aby zapewnić optymalne uzyskanie wyników. Dostrzegają mocne strony tej nieinwazyjnej techniki, która umożliwia analizy podłużne tego samego zwierzęcia, ale także szczegółowo omawiają kluczowe etapy (np. stymulację nerwów, wyrównanie mechaniczne) i ograniczenia metody.
W dziedzinie badań nad mięśniami szkieletowymi wciąż pozostaje wiele nierozstrzygniętych pytań: które geny są kluczowe dla regeneracji mięśni, w jaki sposób komórki satelitarne utrzymują potencjał regeneracyjny przez całe życie tak wielu różnych organizmów oraz jak wpływa to na funkcjonowanie mięśni w różnych stanach chorobowych. Kolekcja ta prezentuje szereg nowoczesnych technik badania funkcji i naprawy mięśni na poziomie molekularnym i mechanicznym, przy użyciu szerokiej gamy systemów modelowych. Dostarczając szczegółowe protokoły, autorzy tych artykułów pomogli już zwiększyć spójność i przejrzystość podstawowych i stosowanych badań nad mięśniami szkieletowymi.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Żadne zewnętrzne finansowanie nie wsparło tej pracy.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie