$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie organizmy wielokomórkowe na Ziemi, w tym zwierzęta i rośliny, wyewoluowały z jednokomórkowych eukariontów ~1,7 miliarda lat temu1. W odróżnieniu od prymitywnych prokariontów, komórki eukariotyczne mają jądro związane z błoną i wiele organelli otoczonych błoną w swojej cytoplazmie, w tym mitochondria, aparat Golgiego, retikulum endoplazmatyczne (ER), lizosomy i pęcherzyki. Te organelle tworzą przedziały, w których zlokalizowane są wyspecjalizowane funkcje biologiczne i wysoce wydajna aktywność metaboliczna. Ze względu na ograniczoną rozdzielczość mikroskopii świetlnej większość organelli wewnątrzkomórkowych zawiera struktury funkcjonalne, które mieszczą się w limicie dyfrakcji światła, co sprawia, że ich wizualizacja jest trudna2. Innowacyjne techniki znakowania mikroskopowego i biologicznego zaczynają umożliwiać wizualizację ultraprecyzyjnych architektur w wysokiej rozdzielczości i dynamikę organelli in vivo . Kolekcja ta łączy najnowsze metody, które z powodzeniem oznaczyły i zobrazowały różne organelle wewnątrzkomórkowe u różnych gatunków, a tym samym pogłębiły naszą wiedzę na temat czasoprzestrzennej regulacji biologii organelli.
W ostatnich dziesięcioleciach rozwój czujników fluorescencyjnych i znakowanie białek w żywych komórkach znacznie ułatwiły nam zrozumienie dynamiki sieci wewnątrzkomórkowych, transdukcji sygnału i interakcji między komórkami. Dzięki zastosowaniu zaawansowanych metod syntezy nieorganicznej, fluorescencyjne nanokryształy półprzewodnikowe o rozmiarach w nanoskali, znane również jako kropki kwantowe lub QD, zostały wynalezione jako nowa klasa reporterów optycznych. Zwykle cząstki QD mają wielkość w zakresie 2–10 nm i mają wysoką światłoczułość, stabilność i niską cytotoksyczność dla komórek. Cząstki QD pojawiły się jako alternatywa dla barwników organicznych i białek fluorescencyjnych do obrazowania procesów wewnątrzkomórkowych w wysokiej rozdzielczości. W protokole Aishwarya i wsp. autorzy opisują immunoznakowanie za pośrednictwem QD, a następnie obrazowanie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)3. Wykonując znakowanie QD ukierunkowane na przeciwciała i obrazowanie w TEM w superrozdzielczości, autorzy z powodzeniem zwizualizowali lokalizację Sigmar1 na wielu organellach komórkowych w komórkach serca dorosłej myszy i podkreślili jego wzbogacenie w lizosomach i błonach mitochondrialnych. Oprócz podkreślenia wysokiej rozdzielczości i wysokiej czułości QD-TEM, autorzy wspominają również o kilku wadach tych metod. Na przykład tetratlenek osmu stosowany w immunoznakowaniu za pośrednictwem QD nieodwracalnie niszczy właściwości próbki, a optymalizacja etapów fiksacji i demaskowania antygenu jest kluczowym, ale trudnym elementem zapewniającym wysoką jakość obrazów.
Oprócz QD wiele innych różnych barwników zostało z powodzeniem zastosowanych do znakowania organelli w żywych komórkach. Metody te ułatwiły obrazowanie na żywo procesu transformacji lub translokacji organelli komórkowych in vivo. Czasami do jednoczesnej wizualizacji różnych typów organelli stosuje się wiele barwników specyficznych dla organelli. W protokole autorstwa Liu, Li i wsp.4 autorzy przedstawiają szczegółowy protokół barwienia na żywo i obrazowania zarówno mitochondriów, jak i lizosomów w mysich komórkach fibroblastów embrionalnych (MEF) przy użyciu dwóch różnych barwników: MitoTracker Green i LysoTracker Red4. W tym badaniu oba barwniki wykazały wysoką wrażliwość fluorescencyjną i stabilność specyficzną odpowiednio dla mitochondriów i lizosomów. Co więcej, autorzy z powodzeniem zaobserwowali i zarejestrowali krytyczny proces komórkowy mitofagii in vivo indukowany przez cyjanek karbonylu-4 (trifluorometoksy) fenylohydrazon (FCCP) w komórkach MEF przy użyciu protokołu. W dyskusji autorzy wspominają, że protokół może być stosowany z różnymi liniami komórkowymi lub komórkami z tkanek poprzez optymalizację stężenia barwnika i czasu barwienia.
Wykorzystując konstrukty reporterowe złożone z białek specyficznych dla organelli połączonych ze znacznikami fluorescencyjnymi, można obserwować dynamikę organelli in vivo i wzorce ekspresji bez znakowania immunologicznego. W protokole autorstwa Liu, Zhu i wsp.5 autorzy przedstawiają szczegółowy protokół obrazowania większości typów organelli subkomórkowych w żywych, pączkujących drożdżach, Saccharomyces cerevisiae5. Dla początkujących pracujących z pączkującymi drożdżami protokół ten jest pomocny w nauce identyfikowania lokalizacji subkomórkowej białek i śledzenia interesujących organelli za pomocą obrazowania poklatkowego. Ograniczeniem protokołu jest to, że większość konstruktów użytych w protokole nie może być używana do znakowania organelli u innych gatunków. W przypadku różnych typów komórek eukariotycznych specyficzne dla organelli wzorce białek fluorescencyjnych nadal musiałyby zostać zweryfikowane przez barwienie immunologiczne przeciwciał.
Po raz pierwszy opracowano test wychwytu przeciwciał do specyficznego znakowania na żywo endosomalnej sygnalizacji Notch/Delta w prekursorach narządów zmysłów Drosophila notum 6. Ze względu na wrażliwy na dawkę charakter sygnalizacji Notch / Delta, ekspresja konstruktu reporterowego wewnątrz komórek nie jest odpowiednia do wizualizacji sygnalizacji Notch / Delta in vivo, ponieważ dodatkowa kopia genu połączonego reporterowo przerwałaby normalną sygnalizację, a co za tym idzie, los komórki. W protokole Zhao i Guo7 autorzy stosują test wychwytu przeciwciał do obrazowania endosomalnego transportu Notch/Delta w promienistych progenitorach gleju rozwijającego się mózgu zebryka7. W protokole, po mikrowstrzyknięciu przeciwciała sprzężonego anty-DeltaD-Atto647N precyzyjnie do zarodkowej komory tyłomózgowia 24 hpf (godziny po zapłodnieniu), cały proces transportu endosomalnego jest rejestrowany przy użyciu zinternalizowanego przeciwciała anty-DeltaD-Atto647N przez całą mitozę promieniowych komórek progenitorowych gleju. W badaniu stwierdzono, że test wychwytu przeciwciał nie zakłócał sygnalizacji Notch/Delta. Protokół ten może być wykorzystany do wizualizacji innych sygnalizacji ligand-receptor błonowy, pod warunkiem, że dostępne jest przeciwciało przeciwko domenie zewnątrzkomórkowej białka będącego przedmiotem zainteresowania.
Najnowsze osiągnięcia w mikroskopii ekspansyjnej (ExM), polegające na fizycznym rozszerzaniu próbki w pęczniejącym hydrożelu, umożliwiły stosowanie konwencjonalnych mikroskopów konfokalnych do obrazowania w superrozdzielczości. Od czasu wynalezienia ExM był testowany na wielu różnych typach próbek biologicznych8. Jednym z głównych wyzwań związanych z ExM jest utrata sygnału fluorescencyjnego na etapach polimeryzacji i trawienia. Niedawno opracowany system mocowania etykiet ExM rozwiązał problem z kotwami trójfunkcyjnymi9. W protokole Park i wsp.10 autorzy opisują, jak przeprowadzić retencję etykiet ExM (LR-ExM) za pomocą zestawu kotwic trójfunkcyjnych10. Protokół usprawnia obrazowanie za pomocą mikroskopii rozszerzającej nie tylko poprzez zapobieganie utracie sygnału, ale także poprzez promowanie wysokowydajnego etykietowania za pomocą znaczników SNAP lub CLIP. W swoich badaniach autorzy z powodzeniem zademonstrowali wielokolorowy LR-ExM dla różnych struktur subkomórkowych i osiągnęli rozdzielczość jednocząsteczkową podczas połączenia LR-ExM ze stochastyczną mikroskopią rekonstrukcji optycznej o wysokiej rozdzielczości (STORM).
Wraz z szybkim rozwojem mikroskopii superrozdzielczej i pojawieniem się nowatorskich technik znakowania fluorescencyjnego, możemy spodziewać się dalszych ulepszeń w metodach i protokołach wizualizacji organelli wewnątrzkomórkowych w niespotykanej dotąd rozdzielczości. Wysiłki te mogą przynieść nowe przełomy w zrozumieniu dynamiki i funkcji organelli wewnątrzkomórkowych.