Artykuł metodologiczny

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

4.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64970

⸱

17 lutego 2023

 , 
1Biophysics Department, Institute of Biomaterials and Biomolecular Systems, University of Stuttgart

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Streszczenie

Techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości pokazały, że wiele kanałów jonowych nie jest statycznych, ale podlega wysoce dynamicznym procesom, w tym przejściowemu powiązaniu podjednostek tworzących pory i pomocnicze, dyfuzji bocznej i grupowaniu z innymi białkami. Jednak związek między dyfuzją boczną a funkcją jest słabo poznany. Aby podejść do tego problemu, opisujemy, w jaki sposób ruchomość boczna i aktywność poszczególnych kanałów w podpartych błonach lipidowych może być monitorowana i korelowana za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). Membrany są wytwarzane na ultracienkim podłożu hydrożelowym przy użyciu techniki dwuwarstwowej granicy faz kropel (DIB). W porównaniu z innymi typami membran modelowych, membrany te mają tę zaletę, że są wytrzymałe mechanicznie i nadają się do bardzo czułych technik analitycznych. Protokół ten mierzy strumień jonów Ca2+ przez pojedyncze kanały, obserwując emisję fluorescencji barwnika wrażliwego na Ca2 + w bliskiej odległości od membrany. W przeciwieństwie do klasycznych metod śledzenia pojedynczych cząsteczek, nie są wymagane żadne fluorescencyjne białka fuzyjne ani znaczniki, które mogą zakłócać ruch boczny i funkcję w błonie. Możliwe zmiany strumienia jonów związane ze zmianami konformacyjnymi białka są spowodowane wyłącznie bocznym ruchem białka w błonie. Reprezentatywne wyniki przedstawiono przy użyciu mitochondrialnego kanału translokacji białek TOM-CC i kanału bakteryjnego OmpF. W przeciwieństwie do OmpF, bramkowanie TOM-CC jest bardzo wrażliwe na uwięzienie molekularne i naturę dyfuzji bocznej. W związku z tym obsługiwane dwuwarstwy interfejsu kropelkowego są potężnym narzędziem do scharakteryzowania związku między dyfuzją boczną a funkcją kanałów jonowych.

Wprowadzenie

Niniejszy protokół ma na celu opisanie sposobu badania korelacji między ruchliwością błony a przepuszczalnością kanałów jonowych białek błonowych w dwuwarstwowych membranach dwuwarstwowych (DIB) opartych na polimerach1,2,3.

Obecna technika uzupełnia imponujący wachlarz zaawansowanych narzędzi do analizy optycznej i powierzchniowej, takich jak śledzenie pojedynczych cząstek4,5, spektroskopia korelacji fluorescencji6,7, oraz szybka mikroskopia sił atomowych8,9,10. Dostarczają one cennych informacji na temat dynamicznego składu i struktury membran, które wpływają na reakcje oparte na błonach11,12,13. Podczas gdy ruch i dyfuzja boczna białek zależy od lokalnej gęstości białek w błonie, poszczególne cząsteczki białka mogą być również uwięzione w tratwach lipidowych14 oraz w interakcjach białko-białko15,16. W zależności od domen białkowych wystających z błony do środowiska zewnątrzkomórkowego lub cytozolu, ruchliwość białek może wahać się od wysoce ruchliwych do całkowicie nieruchomych. Jednak ze względu na złożoność błony i jej struktur obwodowych często trudno jest rozszyfrować wzajemne zależności między naturą mobilności bocznej a funkcją białka17.

Membrany DIB okazały się skuteczną platformą do biofizycznych analiz pojedynczych cząsteczek białek błonowych18,19,20,21,22. Powstają one w wyniku samoorganizacji lipidów poprzez kontakt kropelek wody z substratami hydrożelowymi w fazie lipidowo-olejowej. Podobnie jak powszechnie stosowane obsługiwane dwuwarstwy lipidowe (SLB)1,23,24,25, DIB umożliwiają lokalne dostrojenie ruchliwości bocznej poprzez tymczasowe lub stałe wiązanie białek z matrycą polimerową, gdy są funkcjonalizowane odpowiednimi ligandami17. Ten ostatni może służyć jako system modelowy dla procesów biochemicznych zachodzących w błonach komórkowych o niejednorodnym rozmieszczeniu białek10.

Opisane tutaj eksperymentalne podejście opiera się na fluorescencji barwników wrażliwych na Ca2+ do pomiaru strumienia jonów Ca2+ przez poszczególne kanały w bliskiej odległości od membrany2,22 za pomocą mikroskopii TIRF. Takie podejście optyczne ogranicza oświetlenie próbki do odległości zbliżonej do membrany, co ze względu na właściwości fizyczne ulotnego światła wzbudzającego prowadzi do znacznego zmniejszenia tła fluorescencji. To ostatnie jest warunkiem wstępnym, jeśli do wykrywania pojedynczych cząsteczek wymagana jest wysoka rozdzielczość przestrzenna i czasowa. W przeciwieństwie do klasycznych metod elektrofizjologicznych26,27, do badania strumienia jonów w poszczególnych kanałach nie są wymagane żadne napięcia membranowe. Ponadto metoda nie wymaga znakowania barwnikami fluorescencyjnymi lub cząsteczkami, które mogłyby zakłócać boczny ruch kanałów w membranie.

Metoda jest szczególnie przydatna do badania kanałów białkowych osadzonych w błonie na poziomie pojedynczej cząsteczki bez użycia klasycznej elektrofizjologii. Wykorzystanie mitochondrialnego kanału przewodzącego białka TOM-CC z Neurospora crassa28,29,30 i OmpF, który wspiera dyfuzję małych cząsteczek hydrofilowych przez zewnętrzną błonę Escherichia coli17,31, pokazujemy, w jaki sposób można badać i korelować ruchliwość błony i aktywność kanałów tych dwóch białek. Sugerujemy, że to podejście, choć zoptymalizowane pod kątem TOM-CC i OmpF, może być łatwo zastosowane do innych kanałów białkowych.

Protokół

1. Produkcja białka

UWAGA: Ta sekcja opisuje procedurę izolacji OmpF z Escherichia coli BE BL21(DE3) omp631,32, która nie posiada LamB i OmpC, oraz kompleksu rdzeniowego TOM z Neurospora crassa (Rysunek 1)28,29. Ten drugi wymaga mitochondriów wyizolowanych ze szczepu N. crassa28 zawierającego formę podjednostki TOM Tom22 z etykietą 6xHis (Rysunek 1A), którą można wyizolować zgodnie z opisem28. Poniższe protokoły zazwyczaj pozwalają uzyskać 1-2 mg TOM-CC z N. crassa oraz 10 mg OmpF z E. coli. W przypadku konieczności dostosowania ilości, ważne jest precyzyjne zachowanie stosunku białka do detergentu. O ile nie określono inaczej, wszystkie etapy należy przeprowadzać w temperaturze 4 °C.

  1. Izolacja kompleksu rdzeniowego TOM
    1. Zsolubilizować oczyszczone mitochondriom N. crassa (2 g białka) uzyskane metodą sedymentacji różnicowej z około 1,5 kg (masa mokra) strzępek, zgodnie z opisem Bauseweina i wsp.30, przy stężeniu białka 10 mg/mL w 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1% (w/v) DDM, 20% (v/v) glicerolu, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu oraz 1 mM fluorku fenylometylosulfonylowego (PMSF) przez 30 min w temperaturze 4 °C.
      OSTRZEŻENIE: PMSF jest toksyczny. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
    2. Przenieść zsolubilizowane mitochondria do probówek do ultrawirówki i oddzielić niezesolubilizowane membrany od zsolubilizowanych białek błonowych poprzez ultrawirowanie przy 130 000 x g przez 40 min w temperaturze 4 °C oraz filtrację przy użyciu standardowego papieru filtracyjnego.
    3. Równowagować przygotowaną kolumnę Ni-NTA (objętość 5 mL) około 5 objętościami kolumny (CV) buforu A1 (Tabela 1) za pomocą zautomatyzowanego systemu oczyszczania białek. Kolumnę Ni-NTA prowadzić przy stałej prędkości przepływu 1 mL/min podczas wszystkich etapów. W przypadku izolacji białek z mniejszej ilości niż 2 g mitochondriów należy zastosować kolumnę o mniejszej objętości (1 mL).
    4. Nałożyć próbkę zsolubilizowanego białka na kolumnę Ni-NTA przy prędkości przepływu 1 mL/min.
    5. Przemyć kolumnę Ni-NTA 5 CV buforu A1 (Tabela 1) w celu usunięcia niezwiązanych białek.
    6. Eluować TOM-CC z tagiem His za pomocą 30% buforu A2 (Tabela 1; 300 mM imidazolu) i zebrać pik białkowy w momencie jego pojawienia się na chromatogramie dla 280 nm (Rysunek 1B).
    7. W celu dalszego oczyszczania TOM-CC zrównoważyć przygotowaną kolumnę wymiany anionowej (1 mL), przepuszczając przez nią po 5 CV buforu B1, B2 i B1 (Tabela 1) za pomocą zautomatyzowanego systemu oczyszczania białek. Kolumnę wymiany anionowej prowadzić przy stałej prędkości przepływu 1 mL/min podczas wszystkich etapów.
    8. Nałożyć frakcję piku TOM-CC (krok 1.1.6) na kolumnę wymiany anionowej (prędkość przepływu 1 mL/min).
    9. Usunąć niezwiązane białka, przemywając kolumnę 5 CV buforu B1 (Tabela 1) oraz liniowym gradientem soli od 0% do 20% buforu B2 (Tabela 1).
    10. Eluować TOM-CC liniowym gradientem soli od 20% do 35% buforu B2 i zebrać frakcję piku białkowego w momencie jego pojawienia się na chromatogramie dla 280 nm (Rysunek 1C).
    11. Ocenić czystość próbki za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 1D) i oznaczyć stężenie białka przy użyciu dostępnego komercyjnie testu na białka, zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów).
    12. Zamrozić próbki białek w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
      OSTRZEŻENIE: Ciekłym azotem należy operować w dobrze wentylowanych pomieszczeniach. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
       
  2. Izolacja OmpF
    1. Wyizolować szczep E. coli BE BL21(DE3) omp6, pozbawiony LamB i OmpC32, z zamrożonego banku w glicerolu w warunkach sterylnych i wysiać na płytkę z agarem Luria-Bertani (LB) (Tabela 2). W tym celu należy stopniowo i równomiernie rozprowadzić próbkę na całej powierzchni płytki.
    2. Pozostawić próbkę do wchłonięcia w agar przez 5 min, a następnie odwrócić płytkę z zamkniętą pokrywką i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    3. Wybrać pojedynczą kolonię E. coli, zaszczepić nią 7,5 mL pożywki LB (Tabela 2) przy użyciu sterylnego wykałaczką i pozostawić do wzrostu przez noc (14 h) z wytrząsaniem (170 rpm) w temperaturze 37 °C.
    4. Przenieść 2 x 1 mL komórek E. coli sterylnymi pipetami do 2 x 500 mL pożywki LB (Tabela 2) i pozostawić do wzrostu przez noc (~14 h) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (~170 rpm) w inkubatorze z wytrząsarką.
    5. Zebrać komórki przez wirowanie przy 5 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C, zamrozić osad w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: Masa mokra osadu komórkowego wynosi zazwyczaj 5 g na 1 L kultury. Na tym etapie protokół można przerwać.
    6. Rozmrozić i resuspender komórki (2 g) w 20 mL buforu do lizy C1 (Tabela 2), a następnie przepuścić zawiesinę trzy razy pod ciśnieniem 1 000 psi przez schłodzony (4 °C) wysokociśnieniowy system rozbijania komórek, przy maksymalnej objętości próbki 35 mL, zgodnie z instrukcją producenta.
      OSTRZEŻENIE: Użycie prasy francuskiej może prowadzić do poważnych obrażeń. Nigdy nie należy przekraczać limitu ciśnienia urządzenia. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
    7. Usunąć niezniszczone komórki z lizatu przez wirowanie przy 4 000 x g przez 15 min i zebrać nadsącz.
    8. Zebrać membrany poprzez ultrawirowanie przy 100 000 x g przez 1 h.
    9. Resuspender osad błoniasty w 10 mL buforu C2 (Tabela 2) i zmieszać z równą objętością buforu SDS C3 (Tabela 2) przy użyciu szklanego homogenizatora kulowego.
      OSTRZEŻENIE: β-merkaptoetanol w buforze C3 jest toksyczny. Należy przestrzegać wszystkich odpowiednich przepisów bezpieczeństwa.
    10. Inkubować zawiesinę w kąpieli wodnej w temperaturze 50 °C przez 30 min.
    11. Odwirować próbkę przy 100 000 x g w temperaturze 20 °C przez 1 h.
    12. Resuspender osad błoniasty w 10 mL buforu SDS C4 (Tabela 2) przy użyciu szklanego homogenizatora kulowego i inkubować zawiesinę w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: Jeśli osad nie daje się resuspenderować, należy dodać więcej buforu SDS C4 aż do uzyskania objętości 20 mL.
    13. Odwirować próbkę przy 100 000 x g w temperaturze 20 °C przez 30 min i zebrać nadsącz.
    14. Zmieszać nadsącz z oktylopolioksyetylenem (octyl POE) do końcowego stężenia detergentu 0,5% (w/v) i dwukrotnie dializować próbkę przeciwko buforowi C5 (Tabela 2) w temperaturze 4 °C przez 24 h. W tym celu użyć membrany dializacyjnej z progiem odcięcia (cut-off) 20 kDa, zgodnie z instrukcją producenta, i umieścić próbkę w rurce lub urządzeniu dializacyjnym.
      UWAGA: Próg odcięcia membrany dializacyjnej musi zostać dostosowany, jeśli dializowane są białka o innych masach cząsteczkowych.
    15. Ocenić czystość próbki za pomocą SDS-PAGE i oznaczyć stężenie białka przy użyciu dostępnego komercyjnie testu na białka, zgodnie z protokołem producenta (Tabela materiałów).
      UWAGA: Próbki podgrzane do 95 °C wykazują obecność monomerów OmpF. Próbki niepodgrzane wykazują OmpF w formie trymerycznej (Rysunek 1F).
    16. Szybko zamrozić dializowany OmpF w alikwotach w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
      ​OSTRZEŻENIE: Ciekłym azotem należy operować w dobrze wentylowanych pomieszczeniach. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.

2. Optyczna rejestracja pojedynczych kanałów jonowych w błonach DIB

UWAGA: Ta sekcja opisuje procedurę przygotowania membran DIB w mikrofabrykowanych komorach z polimetakrylanu metylu (PMMA)2 w celu monitorowania bocznego ruchu białek oraz strumienia jonów przez pojedyncze kanały jonowe17. Wymiary oraz dokładne rysunki techniczne do wykonania komory można znaleźć w pracy Lepthin et al.2. Rycina 2 przedstawia ogólny schemat montażu komory PMMA2 oraz formowania membran DIB. O ile nie wskazano inaczej, wszystkie etapy są wykonywane w temperaturze pokojowej (RT). Rycina 3 przedstawia schematyczny obraz membrany DIB oraz sposób, w jaki strumień Ca2+ przez pojedyncze białko kanałowe jest wykorzystywany do monitorowania zarówno ruchu w membranie, jak i stanu otwarcia/zamknięcia kanału.

  1. Przygotowanie lipidów
    1. Usunąć roztwór zapasowy lipidów zawierający 1,2-difitanoylo-Brak tekstu źródłowego do tłumaczenia. Proszę o dostarczenie treści.-glicero-3-fosfocholina (25 mg/mL DPhPC) rozpuszczona w chloroformie z zamrażarki w temperaturze -20 °Ci ogrzać do temperatury pokojowej. W tym celu zazwyczaj wystarczy powolne ogrzewanie próbki w dłoni przez kilka minut.
      OSTROŻNIE: Chloroform jest toksyczny. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i wykonywać wszystkie procedury z użyciem chloroformu pod wyciągiem (dygestorium).
    2. Transfer 380 µL roztworu stokowego DPhPC (25 mg/ml DPhPC) do szklanej fiolki. Należy unikać pipet z gumowymi uszczelkami. Zamiast nich należy używać szklanych mikrostrzykawek z tłokami ze stali nierdzewnej.
    3. Po przygotowaniu roztworu zapasowego lipidów, należy przykryć go warstwą Ar lub N2.2 gaz w celu zapobiegania utlenianiu lipidów. Należy stosować jak najniższy przepływ gazu, aby uniknąć odparowania rozpuszczalnika organicznego, w którym rozpuszczone są lipidy, lub rozpryskiwania się rozpuszczalnika z fiolki. Należy upewnić się, że nakrętki fiolek szklanych zawierających lipidy w rozpuszczalniku organicznym są od wewnątrz pokryte politetrafluoroetylenem (PTFE).
    4. Osuszyć próbkę lipidów (krok 2.1.2) w strumieniu N22następnie należy usunąć pozostały rozpuszczalnik organiczny z próbki lipidów, pozostawiając ją na noc pod próżnią (2,0 mbar) z wykorzystaniem bezolejowej pompy próżniowej.
    5. Rozpuścić film lipidowy w roztworze heksadekanu i oleju silikonowego, dodając równe objętości heksadekanu oraz oleju silikonowego (500 µL (każdej) za pomocą szklanej strzykawki mikrolitrowej do końcowego stężenia lipidów wynoszącego 9,5 mg/ml.
      UWAGA: Roztwór lipidowy jest stabilny w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni.
  2. Przygotowanie hydrożelu agarozy
    1. Przygotuj około 1 ml roztworu niskotopliwej agarozy (0,75% [m/v]) w podwójnie dejonizowanej wodzie i podgrzej do 85 °C w bloku grzewczym przez 20 min w celu przygotowania szklanych foremek do nanoszenia warstw metodą spin coatingu.
      UWAGA: Roztwór agarozy można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni i można go wielokrotnie podgrzewać.
    2. Przygotować 2,5% (m/v) roztwór agarozy niskotopliwej w 0,66 M CaCl22 oraz 8,8 mM HEPES (pH 7,2), a następnie podgrzać do 85 °C w bloku grzewczym przez 20 min. Należy upewnić się, że agaroza jest całkowicie roztopiona.
      UWAGA: Roztwór agarozy można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej i można go wielokrotnie podgrzewać, podobnie jak agarozę (krok 2.2.1) używaną do nanoszenia warstw metodą spin coatingu.
  3. Montaż komory z polimetylometakrylanu (PMMA) i tworzenie monowarstwy lipidowej na granicy faz hydrożel–heksadekan/olej silikonowy
    1. Umieść szklane szkiełka nakrywowe (40 mm x 24 mm x 0,13 mm) w uchwycie ze stali nierdzewnej i myj je w zlewce szklanej przez 10 min w acetonie, korzystając z myjki ultradźwiękowej. Użyj takiej ilości acetonu, która wystarczy do całkowitego zanurzenia szkiełek, a zlewkę przykryj luźno szklaną płytką, aby stworzyć zamknięty system bez ciśnienia, który zminimalizuje ucieczkę par podczas procesu czyszczenia.
      OSTRZEŻENIE: Aceton jest wysoce łatwopalnym rozpuszczalnikiem o niskiej temperaturze zapłonu. Mieszaniny par z powietrzem są wybuchowe. Myjkę ultradźwiękową należy uruchamiać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i przestrzegać oficjalnych środków ostrożności (np. zakaz używania otwartego ognia i powstawania iskier).
    2. Opłucz szklane lamelki wodą podwójnie dejonizowaną i wysusz je strumieniem N2.2.
      UWAGA: Oczyszczone w ten sposób szkiełka nakrywki można przechowywać przez kilka tygodni.
    3. Dalszą czystość i hydrofilowość szkiełka cover slip osiągnięto poprzez oczyszczanie w plazmowniku tlenowym (0,5 mbar) przez 5 min.
      UWAGA: Ten krok należy przeprowadzić bezpośrednio przed nanoszeniem agarozy metodą spin coatingu, ponieważ efekt hydrofilowy uzyskiwany w wyniku czyszczenia plazmowego zanika z upływem czasu.
    4. Zamocuj podkładkę szklaną poddaną obróbce plazmowej na spin coaterze (Rysunek 2, krok 1).
    5. Pokryj szkiełko nakrywkę warstwą agarozy o grubości submikrometrycznej, powoli dodając 140 µL podgrzanej 0,75% (w/v) agarozy niskotopliwej (krok 2.2.1) przy 3000 obr./min przez 30 s, używając 200 µL pipeta (Rysunek 2, krok 1).
      UWAGA: Grubość filmu agarozowego można określić za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM), zgodnie z opisem17.
    6. Należy niezwłocznie przytwierdzić do dolnej części komory z PMMA szkiełko nakrywkowe pokryte cienką warstwą hydrożelu agarozowego naniesioną metodą spin-coatingu.2Upewnij się, że hydrożel agarozowy jest skierowany ku górze (Rycina 2, krok 2).
    7. Przymocuj krawędzie szkiełka nakrywki do mikrobobrobionego urządzenia z PMMA za pomocą przezroczystej taśmy klejącej.
    8. Umieść urządzenie z PMMA na płycie grzejnej rozgrzanej do 35 °C (Rysunek 2, krok 3).
    9. Ostrożnie wlej 200 µL 2,5% roztworu agarozy (krok 2.2.2) do wlotu komory za pomocą pipety (Rycina 2, krok 3), nie tworząc pęcherzyków powietrza, aby cienka warstwa hydrożelu naniesiona metodą spin coatingu mogła osiągnąć równowagę z buforem 2,5% roztworu agarozy i pozostać nawilżona. Należy upewnić się, że 2,5% roztwór agarozy jest rozprowadzony wokół naniesionego metodą spin coatingu hydrożelu agarozowego, ale nie na nim (Rycina 3A), czego można uniknąć, delikatnie dociskając komorę z PMMA do płyty grzejnej.
    10. Niestrudzenie przykryć dołki komory z PMMA (Rysunek 2, krok 4) z całkowitą ilością 60 µL roztworu lipidów/oleju (krok 2.1.5), aby zainicjować tworzenie monowarstwy lipidowej na granicy faz agarose-olej oraz zapobiec dehydratacji agarose naniesionej metodą spin-coatingu w studzienkach komory z PMMA. Urządzenie należy pozostawić na płycie grzewczej w temperaturze 35 °C przez około 2 h.
      UWAGA: Okrągłe dołki w komorze z PMMA mają średnicę 0,5 mm i głębokość 1,8 mm, zgodnie z wcześniej opublikowaną pracą2.
  4. Przygotowanie wodnych kropel powleczonych lipidami w roztworze heksadekanu/oleju silikonowego
    1. Miejsce 20 µL roztworu lipidów w heksadekanie/oleju silikonowym (krok 2.1.5) do każdego z kilku mikrofabrykowanych studzienek w komorze inkubacyjnej do kropli (Rysunek 2, krok 4). Odpowiednimi pojemnikami dla roztworu lipidów w heksadekanie/oleju silikonowym są małe wgłębienia o wymiarach 40 mm x 30 mm x 3,5 mm w cienkiej płytce z PMMA2.
    2. Przygotuj szklaną igłę mikrokapilarną o średnicy otworu w końcówce wynoszącej 20 µm przy użyciu pionowego lub poziomego wyciągacza do mikropipet (np. takiego, który służy do wykonywania pipet do patch-clampu lub ostrych elektrod szklanych). Oszacuj średnicę otworu szklanej igły mikrokapilarnej pod binokularowym stereomikroskopem przy małym powiększeniu, w zakresie zoomu od 7,5x do 35x.
      UWAGA: Parametry trybu wstępnego podgrzewania przed wyciąganiem kapilary szklanej, trybu grzania podczas wyciągania oraz siła rozciągania powinny zostać wcześniej określone doświadczalnie, zgodnie ze specyfikacją producenta urządzenia do wyciągania oraz rodzajem kapilary.
    3. Napełnij szklaną igłę mikrokapilarną za pomocą 5 µL wodnego roztworu do wstrzykiwania zawierającego 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 µM Fluo-8, 400 µM EDTA, 1,32 M KCl i 30 nM kompleksu rdzeniowego TOM lub alternatywnie 20 nM OmpF, używając końcówki pipety mikrokapilarnej. Należy używać wyłącznie wody dwukrotnie destylowanej, uprzednio poddanej działaniu żywicy chelatującej, która wiąże wielowartościowe jony metali (Ca2+) w celu przygotowania wodnego roztworu do wstrzykiwań.
    4. Zamocuj szklaną mikrokapilarną igłę z wodnym roztworem do wstrzykiwania w nanowtryskiwaczu sterowanym piezoelektrycznie.
    5. Wstrzyknij 100–200 nL kropli wodnych (Rycina 2, krok 4) zawierający 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 µM Fluo-8, 400 µM EDTA, 1,32 M KCl oraz 30 nM kompleksu rdzeniowego TOM (krok 1.1.12) lub alternatywnie 20 nM OmpF (krok 1.2.16) do dołków w komorze inkubacji kropelek wypełnionych roztworem lipidy/heksadekan/olej silikonowy (patrz 2.1.5) przy użyciu nanoinjektora. Należy upewnić się, że kropelki nie stykają się ze sobą, umieszczając je w odległości kilku milimetrów (>(10 mm) od siebie w dołkach. W przeciwnym razie, jeśli monowarstwy lipidowe nie utworzyły się jeszcze na granicy fazy olej/bufor, połączą się one w większe krople.
      UWAGA: W przypadku braku dostępności kapilar klasycznych i nanoinjektorów, krople można alternatywnie przygotować ręcznie za pomocą jednokanałowych pipet mikrolitrowych dla objętości w zakresie od 0.1 µL i 0.5 µLzgodnie z opisem2W tym przypadku jednak objętości kropli nie są tak dokładne.
    6. Pozostawić na około 2 h w celu umożliwienia sformowania monowarstwy lipidowej na granicy faz kropla/olej, utrzymując komory inkubacyjne z PMMA i kroplami (Rycina 2, krok 4) na płycie grzejnej rozgrzanej do 35 °C.
  5. Przygotowanie i obrazowanie pojedynczych kanałów jonowych w błonach DIB
    1. Ręcznie przenieść poszczególne kropelki wodne z dołków komory inkubacyjnej kropel pod stereomikroskopem do dołków komory PMMA (Rysunek 2, krok 5), używając jednokanałowej pipety mikrolitrowej z 10 µL jednorazowa końcówka polipropylowa. Pozostawić krople przez około 5 min, aby opadły na monowarstwy lipidowe utworzone na granicach faz hydrożel-olej, w celu sformowania dwuwarstwy lipidowej (Rysunek 3) pomiędzy kropelkami a hydrożelem agarozowym.
    2. Zamocuj komorę z PMMA z membranami DIB w uchwycie na próbki odwróconego mikroskopu świetlnego i oceń proces tworzenia się membran, korzystając z obiektywu 10x z kontrastem modulacji Hoffmana (Rycina 2, krok 6). O utworzeniu błony DIB świadczy obecność wyraźnego białego pierścienia na styku kropli i hydrożelu (Rysunek 4A). Uszkodzone membrany DIB nie wykazują tego pierścienia (Rysunek 4B).
      UWAGA: Alternatywnie membrany DIB można wizualizować przy powiększeniu 10x za pomocą mikroskopii fazowo-kontrastowej lub mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC).
    3. Jeśli utworzyły się błony DIB, zamontuj komorę PMMA na uchwycie próbek mikroskopu TIRF (Rysunek 2, krok 7) wyposażony w konwencjonalne źródło światła do oświetlenia epifluorescencyjnego, laser 488 nm (Pmaks. = 100 mW) oraz kamera CCD z mnożeniem elektronów z tylnym podświetleniem (512 x 512 pikseli; >(QE 95%) w celu uzyskania rozmiaru piksela ok.0.16 µm.
    4. Ustaw ostrość na krawędzi membrany DIB przy użyciu obiektywu o powiększeniu 10x, stosując oświetlenie epifluorescencyjne z wysokiej intensywności źródłem światła i zestawem filtrów GFP.
    5. Dokonaj precyzyjnego ustawienia ostrości (fine focus) tej samej krawędzi membrany DIB przy dużym powiększeniu, używając obiektywu TIRF apochromatycznego 100x/N.A. 1.49 z imersją olejową, ponownie przy oświetleniu epifluorescencyjnym i wysokiej intensywności źródła światła, z zestawem filtrów GFP umożliwiającym wizualizację słabej fluorescencji tła barwnika fluorescencyjnego Fluo-8 w kropli (Rycina 4C).
    6. Zmień ustawienie filtra z GFP na zestaw filtrów TIRF szerokopasmowych (quad-band).
    7. Włącz laser 488 nm i ustaw natężenie lasera na obiektywie na wartość od 8 mW do 10 mW.
      UWAGA: Ponieważ często brakuje danych ilościowych dotyczących natężenia lasera w obiektywie, ustawienia natężenia lasera należy wcześniej skalibrować w osobnych pomiarach przy soczewce, przy użyciu optycznego miernika mocy lasera wyposażonego w czujnik fotodiody, zgodnie ze specyfikacją producenta.
      UWAGA: Aby zapewnić bezpieczną pracę lasera, operator musi być świadomy potencjalnych zagrożeń wynikających z promieniowania laserowego oraz przepisów dotyczących zapobiegania wypadkom.
    8. Aby zwizualizować pojedyncze kanały jonowe, należy dostosować kąt TIRF oraz wzmocnienie kamery EMCCD (np. ustawienie mnożnika wzmocnienia EM: 285), tak aby otwarte kanały jonowe w błonie DIB pojawiały się jako wysokokontrastowe fluorescencyjne punkty na ciemnym tle (Rycina 4D-G), a stosunek sygnału do tła w ocenie wizualnej osiąga maksimum. Należy upewnić się, że plamki odpowiadające Ca2+-strumień przez pojedyncze kanały jonowe, pozostają w polu ostrości i mają okrągły kształt, z wysoką intensywnością w centrum, stopniowo malejącą ku peryferiom. Membrany bez kanałów wykazują jedynie fluorescencję tła (Rysunek 4C).
    9. Przed zarejestrowaniem ruchu oraz aktywności otwarcia i zamknięcia poszczególnych kanałów w czasie, należy sprawdzić, czy plamki fluorescencyjne znajdują się w płaszczyźnie ostrości, aby upewnić się, że kanały jonowe zostały zrekonstytuowane w błonach DIB i przemieszczają się bocznie w płaszczyźnie błony. W przeciwnym razie może to wskazywać, że cząsteczka fluorescencyjna wchodzi i wychodzi z pola ewanescencyjnego generowanego przez laser w pobliżu błony.
    10. Należy zarejestrować serię obrazów błony, która umożliwi właściwe śledzenie pozycji oraz monitorowanie stanu otwartego i zamkniętego poszczególnych kanałów jonowych. Aby określić rodzaj mobilności bocznej (np. ruch swobodny w porównaniu z kotwiczeniem przejściowym [w celu uzyskania informacji należy sprawdzić16]) i stan aktywności kanału (np. otwarty lub zamknięty), należy pozyskać wystarczająco długie (np. od 30 s do 1 min) i dobrze próbkowane trajektorie (np. częstotliwość odświeżania 48 s-1).
      UWAGA: Obserwacja dyfuzji kanałowej, ograniczonej lub skokowej16 wymaga, aby częstotliwość próbkowania była wystarczająco wysoka, aby zmierzyć dyfuzję swobodną w obrębie ograniczających granic. Ponadto należy upewnić się, że czas próbkowania danych jest wystarczająco długi, aby zmierzyć przejście od dyfuzji nieograniczonej do ograniczonej (szczegóły znajdują się w pracy Jacobson et al.16).
  6. Przetwarzanie obrazów i danych
    UWAGA: Pakiety do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym33 lub własnoręcznie napisane rutyny17 do analizy dynamiki czasoprzestrzennej poszczególnych kanałów jonowych w DIBs można wykorzystać komercyjne pakiety oprogramowania. Aby umożliwić korelację bocznej mobilności błony z przepływem jonów przez poszczególne kanały, nie należy stosować algorytmów filtrowania.
    1. Korekcja szeregów czasowych obrazów pod kątem wybielania z zastosowaniem standardowych procedur34 przy użyciu własnych rutyn, poprzez dopasowanie średniej intensywności klatki Równanie równowagi statycznej ⟨I(t)⟩_raw; metoda analizy danych w eksperymencie fizycznym. całego obrazu do Równanie funkcji wykładniczej, f(t, a_k) = a_1exp(a_2t) + a_3exp(a_4t), analiza matematyczna., gdzie t czy indeks klatki (czas) i ak jest zestaw parametrów dopasowania. Następnie należy skorygować serie czasowe zgodnie z Równanie korekty intensywności z wykorzystaniem intensywności surowej i współczynnika korekcyjnego, symbol I(t)=I_raw(t)/f(t,a_k)., gdzie I(t) to natężenie. Alternatywnie, w przypadku wstępnych analiz danych, należy przeprowadzić korekcję tła, korzystając z oprogramowania otwartoźródłowego zaimplementowanego z algorytmami typu rolling-ball33 oraz promień toczącej się kulki (rolling-ball radius), zależny od wielkości plamki i rozmiaru piksela kamery (np. 50 pikseli).
    2. Wyznacz pozycje przestrzenne i amplitudy plamki fluorescencyjnej w obrębie zdefiniowanego obszaru zainteresowania (ROI, np. 30 x 30 pikseli) poprzez dopasowanie I(t) w danym czasie t do dwuwymiarowej funkcji Gaussa z nachyleniem płaszczyzny, która uwzględnia ewentualne lokalne gradienty oświetlenia zgodnie z Wzór rozkładu Gaussa, analiza statystyczna, równanie badawcze, badanie akademickie, dopasowanie danych.Tutaj, Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. = (x, y) jest ROI zawierającym informacje o intensywności fluorescencji, A i σ czy amplituda i szerokości funkcji Gaussa, pk są parametrami charakteryzującymi intensywność tła w ROI, a μ = (Proszę podać tekst do tłumaczenia.0, y0) definiuje położenie rozkładu Gaussa. Strumień jonowy przez pojedynczy kanał jest określony parametrem ATrajektoria kanału jest określona przez Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.oraz umożliwia określenie mobilności bocznej kanału. Alternatywnie możliwe jest wyznaczenie pozycji i intensywności poszczególnych punktów z wykorzystaniem platform otwartoźródłowych33 or wtyczki opisane w tekście35,36Oszacuj dokładność pozycjonowania37 po przekształceniu odczytu kamery EMCCD na liczbę fotonów38.
    3. Narysuj wykres amplitudy fluorescencji A w funkcji czasu oraz odpowiadająca mu trajektoria Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. aby określić możliwą korelację między dyfuzyjnością kanału a strumieniem jonów przez kanał. Należy wykonać to za pomocą dowolnego oprogramowania graficznego. W przypadku swobodnego bocznego ruchu kanału należy wyznaczyć współczynnik dyfuzji bocznej D za pomocą regresji liniowej opóźnienia czasowego τoraz obliczyć średni kwadrat przemieszczenia plamek względem Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. zgodnie z Równanie współczynnika dyfuzji; zmienne obejmują pozycję (x, y) i czas (τ); wzór matematyczny..
      UWAGA: Typowe współczynniki dyfuzji17 dla TOM-CC oraz OmpF swobodnie poruszających się w membranach DIB mieści się w zakresie od 0,5 do 1.5 µm2 s-1Cząsteczki, których stała dyfuzji jest mniejsza niż 0,01 mm2·s-1 definiuje się jako unieruchomione17.

Wyniki

Optyczna rejestracja pojedynczych kanałów w czasie rzeczywistym bez użycia elektrod ujawnia wzajemne oddziaływanie między lateralnym ruchem białek a funkcją poszczególnych kanałów jonowych w błonach DIB. Rekonstytucja rdzeniowego kompleksu TOM mitochondriów (Rysunek 1A) w błonie DIB (Rysunek 4D) ilustruje silną korelację czasową między mobilnością lateralną a przepuszczalnością jonową (Rysunek 5A). Bramkowanie TOM-CC wydaje się być wrażliwe na sposób ruchu lateralnego17. Poruszające się kanały wykazują przepływ Ca2+ przez swoje pory oraz wysoką intensywność punktowej fluorescencji. Cząsteczki uwięzione, nieruchome, wykazują niską i średnią intensywność fluorescencji. W przypadku ogólnego poru importowego białek mitochondriów TOM-CC, to podejście z zastosowaniem pojedynczych cząsteczek ujawniło silną korelację czasową między mobilnością lateralną a przepuszczalnością jonową, co sugeruje, że kanał TOM-CC posiada właściwości mechanosensytywne17. Lateralne zatrzymanie swobodnie poruszających się cząsteczek TOM-CC towarzyszy częściowe lub całkowite zamknięcie kanału TOM-CC. Obrazowanie błon DIB z białkiem OmpF (Rysunek 1E oraz Rysunek 4F), które jest niemal całkowicie zanurzone w błonie, nie wykazuje efektów typu stop-and-go (Rysunek 5B). Losowe zatrzymania OmpF nie wiążą się ze zmianą intensywności, a tym samym z zamknięciem jego porów. Na podstawie sygnałów fluorescencji38 dokładność pozycjonowania poszczególnych kanałów można oszacować w zakresie od 5 do 10 nm. Należy jednak zauważyć, że dokładność ta nie może zostać osiągnięta, jeśli kanały lekko drgają z powodu mobilnego zakotwiczenia w hydrożelu agarozowym, co pokazano na przykład dla cząsteczek TOM-CC w stanie pośrednim z wartością średniokwadratowego odchylenia (root mean displacement) wynoszącą 120 nm (Rysunek 5A).

Struktura kompleksu TOM, profile elucji chromatograficznej, żel SDS-PAGE; wyniki analizy białek.
Rycina 1: Izolacja TOM-CC. (A) Struktura cryo-EM TOM-CC z N. crassa30,39. Mitochondria z poziomu szczepu N. crassa zawierającego Tom22 z tagiem 6xHis zostały solubilizowane w DDM i poddane chromatografii powinowactwa Ni-NTA (B) oraz chromatografii wymiany anionowej (C). (D) SDS-PAGE wyizolowanego TOM-CC. (E) Struktura krystaliczna (PDB, 1OPF) i (F) SDS-PAGE oczyszczonego OmpF z E. coli. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu tworzenia membrany DIB z zastosowaniem hydrożelu agarozowego i mikroskopii TIRF.
Rysunek 2: Schemat montażu komory PMMA. Krok 1: Na szklaną lamelkę nanosi się warstwę hydrożelu agarozowego metodą spin-coatingu. Krok 2: Lamelka z naniesioną warstwą zostaje zamontowana w specjalnie wykonanej komorze mikroskopowej z PMMA. Krok 3: Do portu wlotowego komory PMMA dodaje się dodatkową agarozę o niskiej temperaturze topnienia na płycie grzewczej o temperaturze 35 °C. Krok 4: Monowarstwy lipidowe tworzą się wokół kropli wodnych na granicy faz bufor/olej (po lewej) oraz na granicy faz hydrożel agarozowy/olej (po prawej). Krok 5: Pojedyncze krople wodne są pipetowane do studzienek komory PMMA, tworząc lipidową dwuwarstwę w momencie kontaktu dwóch monowarstw lipidowych. Krok 6: Formowanie membran DIB jest weryfikowane za pomocą mikroskopii kontrastowej modulacji Hofmanna. Krok 7: Za pomocą mikroskopii TIRF obrazowane są wybrane obszary membran DIB z wbudowanymi kanałami jonowymi. Zielony: 0,75% agarozy; żółty: 2,5% agarozy zawierającej jony Ca2+; magenta: faza lipid/olej; ciemnoniebieski: bufor kropli wodnej zawierający barwnik wrażliwy na Ca2+ oraz białko. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dynamika błony komórkowej, napływ wapnia (Ca²⁺) za pomocą Fluo-8, schemat spektrometrii, ruch białek.
Rysunek 3: Układ eksperymentalny. (A) Schematyczna reprezentacja błony DIB w studzience z PMMA. Bipowarza spoczywa na ultracienkim filmie z 0,75% agarozy, co umożliwia obrazowanie TIRF strumienia Ca2+ przez kanał jonowy w czasie, z wykorzystaniem czułego na Ca2+ barwnika fluorescencyjnego (Fluo-8) w komorze trans. (B) Strumień Ca2+ jest kontrolowany wyłącznie przez ciśnienie osmotyczne z komory cis do trans. Pozwala to na wyznaczenie zarówno pozycji w błonie, jak i stanu otwarcia/zamknięcia kanału. Przedstawiony tutaj kanał to białkowy kanał przewodzący TOM-CC z mitochondriów N. crassa30. (C) Trajektoria pojedynczego kanału TOM-CC. Kolor zielony: kanał w ruchu; kolor żółty: kanał nieruchomy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza białek w nanodyskach, mapowanie intensywności, mikroskopia fluorescencyjna, wykres intensywności widmowej.
Rycina 4Obrazowanie TOM-CC i OmpF w błonach DIB. (A) Membrana DIB obrazowana za pomocą mikroskopii kontrastowej z modulacją Hoffmanna, przedstawiająca powierzchnię kontaktu dwuwarstwowego pomiędzy hydrożelem a kroplą. (B) Obraz uszkodzonej membrany DIB wykonany w sposób opisany w (A). Strzałka, krawędź komory z PMMA. (C) Membrana DIB obrazowana za pomocą mikroskopii TIRF bez kanałów białkowych. (D) membrana DIB z zrekonstytuowanym kompleksem TOM-CC, obrazowana za pomocą mikroskopii TIRF. Białe kwadraty zaznaczają punkty o wysokim (SH), pośredni (SI), oraz niskiej (SL) natężenia. (EDopasowanie profilu intensywności fluorescencji trzech punktów zaznaczonych w (A) do dwuwymiarowych funkcji Gaussa ujawnia położenie poszczególnych TOM-CC oraz Ca2+ przepływ przez kanał. (F) membrana DIB z zrekonstytuowanym białkiem OmpF. (G) Dopasowanie Gaussa do zaznaczonej plamki fluorescencyjnej w (F). W przeciwieństwie do dwuporowego kompleksu białkowego $\beta$-beczki TOM-CC, trójporowa $\beta$-beczka OmpF wykazuje tylko jeden stan przepuszczalności. Rozmiar piksela, 0.16 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres dynamiki białek; amplituda w funkcji czasu; pokazuje TOM-CC, OmpF; wyniki eksperymentalne, analiza.
Rycina 5: Aktywność kanału koreluje z mobilnością boczną TOM-CC. (A) Ślad amplitudy fluorescencji (góra) i odpowiadająca mu trajektoria (dół) TOM-CC wskazują, że aktywność kanału TOM-CC w stanach otwartym i zamkniętym koreluje z boczną mobilnością kompleksu w błonie. Trajektoria przedstawia trzy stany przepuszczalności. Kolor zielony: stan w pełni otwarty; żółty: stan o pośredniej przepuszczalności; czerwony: stan kanału zamkniętego; czerwona gwiazdka: TOM-CC w stanie pośrednim oscyluje wokół swojej średniej pozycji o około ±60 nm. Dokładność wyznaczenia pozycji37 na podstawie sygnałów fluorescencji w stanach w pełni otwartym i pośrednim mieści się w zakresie od 5 nm do 10 nm. (B) Ślad amplitudy fluorescencji (góra) i odpowiadająca mu trajektoria (dół) OmpF. OmpF wykazuje tylko jeden poziom intensywności, niezależnie od tego, czy jest w ruchu, czy uwięziony. Segmenty trajektorii odpowiadające okresom czasu uwięzienia cząsteczek zaznaczono na szaro. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Bufor Stężenia odczynnikówObjętość
A1*20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1% (m/v) n-dodecyl-β-D-maltosyd (DDM), 10% (v/v) glicerolu, 300 mM NaCl i 1 mM fenylometylosulfonylofluorku (PMSF)100 mL
A2*20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1% (w/v) DDM, 10% (v/v) glicerolu, 1 M imidazolu i 1 mM PMSF100 ml
B1*20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (m/v) DDM, 2% (v/v) dimetylosulfoksyd (DMSO)100 ml 
B2*20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (m/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimetylosulfoksyd (DMSO)100 mL
* Odgazuj i przepuść przez 0.22 μm przefiltrować przed użyciem.

Tabela 1: Roztwory buforowe do izolacji TOM-CC.

Bufor Stężenia reagentówObjętość
LB*1% (w/v) tryptony, 1% (w/v) NaCl oraz 0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego 1100 mL
C12 mM MgCl2, ok. 750 jednostek DNAzy oraz 50 mM Tris-HCl pH 7,5  20 mL
C250 mM Tris-HCl, pH 7,550 mL 
C34% (w/v) dodecylu siarczanu sodu (SDS), 2 mM β-merkaptoetanolu oraz 50 mM Tris-HCl pH 7,550 mL
C42% (w/v) SDS, 500 mM NaCl oraz 50 mM Tris-HCl pH 7,550 mL
C50,5% (w/v) oktylo polioksyetylenu (octyl POE), 1 mM EDTA oraz 20 mM Tris pH 8,5 1000 mL
* Sterylizować przed użyciem.

Tabela 2: Roztwory buforowe do izolacji OmpF.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół stanowi wprowadzenie do stosowania membran DIB do badania wzajemnych zależności między bocznym ruchem kanałów jonowych a funkcją kanału za pomocą mikroskopii TIRF pojedynczej cząsteczki. Aby uzyskać jak najlepsze dane, przygotowanie stabilnych membran DIB z jak największą liczbą dobrze oddzielonych kanałów ma kluczowe znaczenie dla uzyskania szeregów czasowych pojedynczych cząstek, które można zadowalająco analizować.

Krytyczne parametry, które należy zoptymalizować, obejmują wybór lipidów, stężenie lipidów w fazie olejowej oraz stężenia białka i detergentu w kropelkach wody. Zastosowane lipidy są niezwykłe, ponieważ nie wykazują wyraźnej przemiany fazowej w niskich temperaturach. DPhPC jest powszechnie stosowanym lipidem do produkcji stabilnych systemów błonowych40. W zasadzie każdy lipid, który utrzymuje swoje płynne środowisko w niskich temperaturach, może być odpowiedni do tego zastosowania. Ponadto lipid nie powinien być wrażliwy na utlenianie. Stężenie detergentu w kropelkach powinno być jak najniższe, aby uniknąć pęknięcia membrany. Stabilne błony i dobre wskaźniki wchłaniania białek są na ogół osiągane przy stężeniach detergentów poniżej krytycznego stężenia miceli (cmc), biorąc pod uwagę, że białko błonowe nie wytrąca się.

Jeśli błony DIB nie tolerują określonych detergentów21,41 lub jeśli białka nie integrują się z roztworem o niskiej zawartości detergentu z błonami DIB, kanały białkowe mogą najpierw zostać odtworzone w małe jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (SUV), które są następnie łączone z błonami DIB od strony kropli, jak to z powodzeniem wykazano w przypadku E. coli MscL42. Czasami błony DIB nie powstają, ponieważ stężenie lipidów w fazie olejowej jest zbyt niskie. Aby zapobiec pękaniu membran DIB, należy również pamiętać, że ciśnienie osmotyczne między hydrożelem a kroplą musi być precyzyjnie zrównoważone, bez nadmiernego wpływu na strumień Ca2+ od cis do trans. Zoptymalizowana grubość agarozy i rozmiar oczek wydają się być kluczowe dla obserwacji dyfuzji białek błonowych. Należy unikać wysuszania warstwy agarozy. Grubość można określić za pomocą mikroskopii sił atomowych17. Zmieniając stężenie, objętość i prędkość obrotową agarozy podczas powlekania wirowego, można zoptymalizować rozmiar i grubość oczek hydrożelu. Należy jednak pamiętać, że grubość warstwy hydrożelu wpływa na kontrast obrazu. Aby wychwycić białka błonowe w DIB, hydrożel agarozowy można zastąpić specjalnie zsyntetyzowaną, nieusieciowaną, zmodyfikowaną Ni-NTA, niskotopliwą agarozą, aby uwięzić je za pomocą znacznika Hisa17. Zbyt wysokie tło fluorescencyjne jest często spowodowane pęknięciem błon DIB. Jest to szczególnie problematyczne w przypadku komór wielodołkowych, ponieważ barwnik wrażliwy na Ca2+ dyfunduje do hydrożelu. W takim przypadku należy unikać sąsiednich studni. Barwienie fluorescencyjne barwnika wrażliwego na Ca2+ nad membraną nie powinno być istotnym czynnikiem ograniczającym, ponieważ jest ono wymieniane przez niewzbudzone barwniki w większości kropelki (ryc. 3A) poza polem ulotnym TIRF. Precyzja lokalizacji białka zależy od dokładności dopasowania plamek i rozmiaru piksela.

Słabe sygnały fluorescencyjne mogą być spowodowane niskim strumieniem Ca2+ przez kanał. Możliwe przyczyny to: (i) niedokładne ustawienia TIRF (np. intensywność lasera), (ii) ciśnienie osmotyczne Ca2+ na membranie lub (iii) wewnętrzna przepuszczalność Ca2+ kanałów jest zbyt niska. Aby poradzić sobie z pierwszym problemem, należy zoptymalizować intensywność lasera, kąt TIRF i wzmocnienie kamery. Te dwa ostatnie problemy można przezwyciężyć poprzez zastosowanie potencjału elektrycznego w poprzek membrany 2,43. Jednak zastosowanie napięć zewnętrznych może zniekształcić wynik, ponieważ efekty elektryczne mogą wpływać na otwarcie kanałów jonowych bramkowanych ligandem lub mechanowrażliwych, które w rzeczywistości nie są kontrolowane napięciem. Przykładami takich kanałów są mitochondrialna translokaza białkowa TOM-CC27 i jej podjednostka tworząca kanały Tom40 26,44,45,46. Na koniec należy zauważyć, że wprowadzanie białek błonowych do błon DIB w określonej orientacji w celu osiągnięcia pożądanej funkcjonalności jest trudne, a badania ilościowe są rzadkie47,48. W niektórych przypadkach orientacja zintegrowanych białek jest przypadkowa. Jest to poważny problem w badaniu białek błonowych, ponieważ niektóre białka błonowe są aktywowane tylko po jednej stronie błony.

Mikroskopia TIRF jest potężną metodą rozwiązywania zdarzeń pojedynczych cząsteczek w błonach o podłożu płaskim49. Przykłady obejmują wyjaśnienie szlaku składania i fałdowania białek kanałowych, takich jak α-hemolizyna50, perfringolizyna O51 i OmpG52. W badaniach tych uwzględniono FRET jako technikę dodatkową. Ponadto aktywacja mechanowrażliwego kanału jonowego MscL była wcześniej badana poprzez mechaniczną stymulację wspieranych dwuwarstw DIB42 przy użyciu pomiarów prądu. Opierając się na tych pracach, przyszłe badania mogą połączyć opisaną tutaj platformę z eksperymentami z pojedynczymi cząsteczkami FRET, aby zająć się mechanowrażliwymi kanałami na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób optyczny17. Wstrzyknięcie buforu do kropli, rozciągnięcie wewnętrznej monowarstwy DIB lub ukierunkowane wiązanie poszczególnych kanałów z leżącym poniżej hydrożelem może być wykorzystane do dalszych badań nie tylko fizycznego mechanizmu mechanicznie aktywowanych kanałów, które reagują na napięcie i / lub krzywiznę błony, jak pokazano dla MscL i MscS, dwuporowej domeny K+-kanałów, TREK-1, TREK-2 i TRAAK oraz PIEZO (w celu przeglądu, patrz53), ale także lokalne wiązanie z cytoszkieletem komórkowym, jak pokazano dla wrażliwego na dotyk kanału jonowego NOMPC54,55.

Oświadczenia

Oświadczamy, że nie występujemy w przypadku konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Beate Nitschke za pomoc w przygotowaniu białka oraz Robin Ghosh, Michaelowi Schweikertowi (Stuttgart) i Maximilanowi Ulbrichowi (Freiburg) za wnikliwe dyskusje. Prace te były wspierane przez Centrum Badawcze Biologii Systemów w Stuttgarcie (SRCSB) oraz grant Fundacji Badenii-Wirtembergii (BiofMO-6 do SN).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocholinaAvanti Polar Lipids850356C
100x Obiektyw olejowy Apochromat N.A. 1.49NikonMRD01991Mikroskop TIRF 
10x obiektyw kontrastowy z modulacją Hoffmanna NA 0,25 Mikroskop Nikondo oceny tworzenia się błony DIB   
10x obiektyw N.A. 0.25NikonMRL00102mikroskop TIRF 
40-krotny obiektyw kontrastowy z modulacją Hoffmanna NA 0,55Mikroskop Nikondo oceny tworzenia się błony DIB   
Laser 488 nm, 100 mW   Mikroskop VisitronTIRF 
Taśma
i Auml; KTA PURE   System oczyszczania białekCytiva
Zestaw testowy Bradford, PierceThermo Fisher 23236
CaCl2Roth5239.2
Żywica Chelax 100Biorad143-2832
Chloroform Sigma-AldrichMC1024452500
Kasety do dializy Slide-A-Lyzer 20 k MWCOThermo Fisher 87735
Komora DIB Wykonanana zamówienie komora PMMA do membran DIB
Cyfrowy miernik mocy i konsola energetycznaThorlabsPM100DLaserowy miernik mocy 
Sulftlenek dimetyluRoth 4720.1
Podwójnie destylowany mikroskop kontrastowy H2O
Eclipse TS 100 Hoffmann z modulacją Mikroskop Nikondo oceny tworzenia się błony DIB   
Kamera EDTARoth8042.2
EMCCD Mikroskop iXon Ultra 897AndorTIRF 
EtanolSigma-Aldrich32205-M
Rotor o stałym kącie nachylenia Ti70Beckman Coulter
Fluo-8, CalciFluorTMSanta Cruz BiotechnologySC-362561Ca2+-wrażliwy barwnik
Homogenizator komórek French PressIgneusIgneus 40000 psi
Filtr GFPAHFPrzesiąkanie filtracyjne stosowane do wzbudzania membran DIB metodą epifluorescencji ze źródłem światła białego 
Kapilary szklaneWorld Precision Instruments4878
Szkiełka nakrywkowe szklane 40 mm x 24 mm x 0,13 mmRoth1870.2
GlicerolRoth3783.2
Strzykawka Hamilton 10 mlRothX033.1
Strzykawka Hamilton 100 mlRothX049.1
Strzykawka Hamilton 500 mlRothEY49.1
Blok grzewczy EppendorfThermomixer comfort
Płyta grzewczaMinitube HT200
HepesRoth 9205.3
HexadcaneSigma-Aldrich296317
His Trap HP 1 mLCytiva29051021kolumna Ni-NTA
ImidazolSigma-Aldrich1.04716.1000
KCl
KLM Lista Schaefer TecSCV-10
medyczny pionowy ściągacz do pipet L/M-3P-AArtisan Technology Group57761-1
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaSigma-Aldrich A9414
M8 Mikroskop stereoskopowyWildStereomicrosope 
Matlab MathWorksR2022a
MetanolSigma-Aldrich34860
Końcówki do pipet MicroFilWorld Precision InstrumentsMF34G-5
Wtryskiwacz N2 NaCl
Roth3957.1
Nanolitr 2010 Światowe Instrumenty PrecyzyjneNanolitr 2010 
n-dodecyl-b-D-maltozydGlycon BiochemicalsD97002-C
Ni-NTA agaroza, nieusieciowanaCube Biotech 124115393Niestandardowe
oprogramowanie NIS-Elements ARNikonMQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930Oprogramowanie do obrazowania
n-oktylo-polioksyetylenSigma-Aldrich40530
O2 gaz
Fluorek fenylometylosulfonyluRoth 6367.3
Czujnik fotodiody  Si, 400 - 1100 nm, 500 mWThorlabsS130CCzujnik do miernika mocy lasera 
Myjka plazmowaDiener ElectronicsZepto
Preparatywna ultrawirówka OptimaBeckman Coulter
Czterozakresowy filtr TIRF 446/523/600/677 HCAHFUstawienie filtra służące do wzbudzania membran DIB za pomocą lasera 488 nm 
Zasób Q 1 mLCytiva17117701Kolumna anionowymienna
Olej silikonowy AR 20Sigma-Aldrich10836
Dodecylosiarczan soduRoth2326.2
Kamera Super LoLuxJVCStereomicrosope 
TermowytrząsarkaGerhardtTHL 500/1
Ti-E Mikroskop fluorescencyjny   NikonMEA53100
Tris-HClSigma-Aldrich9090.3
TryptoneRoth8952.2
Kąpiel ultradźwiękowa Bandelin SonorexRK 100
Pompa próżniowaVacuubrandMD 4C NT
Białe źródło światła do oświetlenia epifluorescencyjnego (100 W)Mikroskop NikonMBF72655TIRF 
Ekstrakt drożdżowyRoth2363.2
β-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148
klejąca Powlekarka wirowa Honeywell 10314243

Bibliografia

  1. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  2. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  3. Thompson, J. R., Heron, A. J., Santoso, Y., Wallace, M. I. Enhanced stability and fluidity in droplet on hydrogel bilayers for measuring membrane protein diffusion. Nano Letters. 7 (12), 3875-3878 (2007).
  4. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34 (1), 351-378 (2005).
  5. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysical Journal. 60 (4), 910-921 (1991).
  6. Kusumi, A., Shirai, Y. M., Koyama-Honda, I., Suzuki, K. G. N., Fujiwara, T. K. Hierarchical organization of the plasma membrane: Investigations by single-molecule tracking vs. fluorescence correlation spectroscopy. FEBS Letters. 584 (9), 1814-1823 (2010).
  7. Betaneli, V., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy to examine protein-lipid interactions in membranes. Methods in Molecular Biology. 974, 253-278 (2013).
  8. Ando, T., et al. A high-speed atomic force microscope for studying biological macromolecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (22), 12468-12472 (2001).
  9. Casuso, I., et al. Characterization of the motion of membrane proteins using high-speed atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (8), 525-529 (2012).
  10. Karner, A., et al. Tuning membrane protein mobility by confinement into nanodomains. Nature Nanotechnology. 12 (3), 260-266 (2017).
  11. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118 (6), 1099-1102 (2005).
  12. Schink, K. O., Tan, K. -W., Stenmark, H. Phosphoinositides in control of membrane dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 143-171 (2016).
  13. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  14. Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10005-10010 (2008).
  15. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  16. Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The lateral organization and mobility of plasma membrane components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
  17. Wang, S., et al. Spatiotemporal stop-and-go dynamics of the mitochondrial TOM core complex correlates with channel activity. Communications Biology. 5 (1), 471(2022).
  18. Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 265 (2), 595-599 (1999).
  19. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  20. Heron, A. J., Thompson, J. R., Mason, A. E., Wallace, M. I. Direct detection of membrane channels from gels using water-in-oil droplet bilayers. Journal of the American Chemical Society. 129 (51), 16042-16047 (2007).
  21. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  22. Huang, S., Romero-Ruiz, M., Castell, O. K., Bayley, H., Wallace, M. I. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array. Nature Nanotechnology. 10 (11), 986-991 (2015).
  23. Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
  24. Kiessling, V., Yang, S. -T., Tamm, L. K. Supported lipid bilayers as models for studying membrane domains. Current Topics in Membranes. 75, 1-23 (2015).
  25. Murray, D. H., Tamm, L. K., Kiessling, V. Supported double membranes. Journal of Structural Biology. 168 (1), 183-189 (2009).
  26. Hill, K., et al. Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins. Nature. 395 (6701), 516-521 (1998).
  27. Poynor, M., Eckert, R., Nussberger, S. Dynamics of the preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Biophysical Journal. 95 (3), 1511-1522 (2008).
  28. Künkele, K. P., et al. The preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Cell. 93 (6), 1009-1019 (1998).
  29. Ahting, U., et al. The TOM core complex: the general protein import pore of the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 959-968 (1999).
  30. Bausewein, T., et al. Cryo-EM structure of the TOM core complex from Neurospora crassa. Cell. 170 (4), 693-700 (2017).
  31. Cowan, S. W., et al. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins. Nature. 358 (6389), 727-733 (1992).
  32. Bieligmeyer, M., et al. Reconstitution of the membrane protein OmpF into biomimetic block copolymer-phospholipid hybrid membranes. Beilstein Journal of Nanotechnology. 7, 881-892 (2016).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Vicente, N. B., Zamboni, J. E. D., Adur, J. F., Paravani, E. V., Casco, V. H. Photobleaching correction in fluorescence microscopy images. Journal of Physics: Conference Series. 90 (1), 012068(2007).
  35. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  36. Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  37. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  38. Hirsch, M., Wareham, R. J., Martin-Fernandez, M. L., Hobson, M. P., Rolfe, D. J. A stochastic model for electron multiplication charge-coupled devices - From theory to practice. PLoS One. 8 (1), 53671(2013).
  39. Bausewein, T., Naveed, H., Liang, J., Nussberger, S. The structure of the TOM core complex in the mitochondrial outer membrane. Biological Chemistry. 401 (6-7), 687-697 (2020).
  40. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta. 555 (1), 147-167 (1979).
  41. Manafirad, A. Single ion-channel analysis in droplet interface bilayer. Methods in Molecular Biology. 2186, 187-195 (2021).
  42. Rosholm, K. R., et al. Activation of the mechanosensitive ion channel MscL by mechanical stimulation of supported Droplet-Hydrogel bilayers. Scientific Reports. 7 (1), 45180(2017).
  43. Wang, Y., et al. Electrode-free nanopore sensing by DiffusiOptoPhysiology. Science Advances. 5 (9), (2019).
  44. Ahting, U., et al. the pore-forming component of the protein-conducting TOM channel in the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1151-1160 (2001).
  45. Romero-Ruiz, M., Mahendran, K. R., Eckert, R., Winterhalter, M., Nussberger, S. Interactions of mitochondrial presequence peptides with the mitochondrial outer membrane preprotein translocase TOM. Biophysical Journal. 99 (3), 774-781 (2010).
  46. Kuszak, A. J., et al. Evidence of distinct channel conformations and substrate binding affinities for the mitochondrial outer membrane protein translocase pore Tom40. The Journal of Biological Chemistry. 290 (43), 26204-26217 (2015).
  47. Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: Experimental verification with the potassium channel KcsA. Journal of the American Chemical Society. 133 (30), 11774-11779 (2011).
  48. Goers, R., et al. Optimized reconstitution of membrane proteins into synthetic membranes. Communications Chemistry. 1, 35(2018).
  49. Castell, O. K., Dijkman, P. M., Wiseman, D. N., Goddard, A. D. Single molecule fluorescence for membrane proteins. Methods. 147, 221-228 (2018).
  50. Thompson, J. R., Cronin, B., Bayley, H., Wallace, M. I. Rapid assembly of a multimeric membrane protein pore. Biophysical Journal. 101 (11), 2679-2683 (2011).
  51. Senior, M. J. T., et al. Single-molecule tracking of perfringolysin O assembly and membrane insertion uncoupling. The FEBS Journal. , (2022).
  52. Weatherill, E. E., et al. Fast slow folding of an outer membrane porin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2121487119(2022).
  53. Kefauver, J. M., Ward, A. B., Patapoutian, A. Discoveries in structure and physiology of mechanically activated ion channels. Nature. 587 (7835), 567-576 (2020).
  54. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
  55. Wang, Y., et al. The push-to-open mechanism of the tethered mechanosensitive ion channel NompC. eLife. 10, 58388(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dwubłonowa interfejsowa kropelkowastrumień jonów wapniadyfuzja białek błonowychwspierane błony lipidoweśledzenie fluorescencyjne
Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.