Artykuł metodologiczny

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

DOI:

10.3791/64970

⸱

17 lutego 2023

 , 
1Biophysics Department, Institute of Biomaterials and Biomolecular Systems, University of Stuttgart

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości pokazały, że wiele kanałów jonowych nie jest statycznych, ale podlega wysoce dynamicznym procesom, w tym przejściowemu powiązaniu podjednostek tworzących pory i pomocnicze, dyfuzji bocznej i grupowaniu z innymi białkami. Jednak związek między dyfuzją boczną a funkcją jest słabo poznany. Aby podejść do tego problemu, opisujemy, w jaki sposób ruchomość boczna i aktywność poszczególnych kanałów w podpartych błonach lipidowych może być monitorowana i korelowana za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). Membrany są wytwarzane na ultracienkim podłożu hydrożelowym przy użyciu techniki dwuwarstwowej granicy faz kropel (DIB). W porównaniu z innymi typami membran modelowych, membrany te mają tę zaletę, że są wytrzymałe mechanicznie i nadają się do bardzo czułych technik analitycznych. Protokół ten mierzy strumień jonów Ca2+ przez pojedyncze kanały, obserwując emisję fluorescencji barwnika wrażliwego na Ca2 + w bliskiej odległości od membrany. W przeciwieństwie do klasycznych metod śledzenia pojedynczych cząsteczek, nie są wymagane żadne fluorescencyjne białka fuzyjne ani znaczniki, które mogą zakłócać ruch boczny i funkcję w błonie. Możliwe zmiany strumienia jonów związane ze zmianami konformacyjnymi białka są spowodowane wyłącznie bocznym ruchem białka w błonie. Reprezentatywne wyniki przedstawiono przy użyciu mitochondrialnego kanału translokacji białek TOM-CC i kanału bakteryjnego OmpF. W przeciwieństwie do OmpF, bramkowanie TOM-CC jest bardzo wrażliwe na uwięzienie molekularne i naturę dyfuzji bocznej. W związku z tym obsługiwane dwuwarstwy interfejsu kropelkowego są potężnym narzędziem do scharakteryzowania związku między dyfuzją boczną a funkcją kanałów jonowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół ma na celu opisanie sposobu badania korelacji między ruchliwością błony a przepuszczalnością kanałów jonowych białek błonowych w dwuwarstwowych membranach dwuwarstwowych (DIB) opartych na polimerach1,2,3.

Obecna technika uzupełnia imponujący wachlarz zaawansowanych narzędzi do analizy optycznej i powierzchniowej, takich jak śledzenie pojedynczych cząstek4,5, spektroskopia korelacji fluorescencji6,7, oraz szybka mikroskopia sił atomowych8,9,10. Dostarczają one cennych informacji na temat dynamicznego składu i struktury membran, które wpływają na reakcje oparte na błonach11,12,13. Podczas gdy ruch i dyfuzja boczna białek zależy od lokalnej gęstości białek w błonie, poszczególne cząsteczki białka mogą być również uwięzione w tratwach lipidowych14 oraz w interakcjach białko-białko15,16. W zależności od domen białkowych wystających z błony do środowiska zewnątrzkomórkowego lub cytozolu, ruchliwość białek może wahać się od wysoce ruchliwych do całkowicie nieruchomych. Jednak ze względu na złożoność błony i jej struktur obwodowych często trudno jest rozszyfrować wzajemne zależności między naturą mobilności bocznej a funkcją białka17.

Membrany DIB okazały się skuteczną platformą do biofizycznych analiz pojedynczych cząsteczek białek błonowych18,19,20,21,22. Powstają one w wyniku samoorganizacji lipidów poprzez kontakt kropelek wody z substratami hydrożelowymi w fazie lipidowo-olejowej. Podobnie jak powszechnie stosowane obsługiwane dwuwarstwy lipidowe (SLB)1,23,24,25, DIB umożliwiają lokalne dostrojenie ruchliwości bocznej poprzez tymczasowe lub stałe wiązanie białek z matrycą polimerową, gdy są funkcjonalizowane odpowiednimi ligandami17. Ten ostatni może służyć jako system modelowy dla procesów biochemicznych zachodzących w błonach komórkowych o niejednorodnym rozmieszczeniu białek10.

Opisane tutaj eksperymentalne podejście opiera się na fluorescencji barwników wrażliwych na Ca2+ do pomiaru strumienia jonów Ca2+ przez poszczególne kanały w bliskiej odległości od membrany2,22 za pomocą mikroskopii TIRF. Takie podejście optyczne ogranicza oświetlenie próbki do odległości zbliżonej do membrany, co ze względu na właściwości fizyczne ulotnego światła wzbudzającego prowadzi do znacznego zmniejszenia tła fluorescencji. To ostatnie jest warunkiem wstępnym, jeśli do wykrywania pojedynczych cząsteczek wymagana jest wysoka rozdzielczość przestrzenna i czasowa. W przeciwieństwie do klasycznych metod elektrofizjologicznych26,27, do badania strumienia jonów w poszczególnych kanałach nie są wymagane żadne napięcia membranowe. Ponadto metoda nie wymaga znakowania barwnikami fluorescencyjnymi lub cząsteczkami, które mogłyby zakłócać boczny ruch kanałów w membranie.

Metoda jest szczególnie przydatna do badania kanałów białkowych osadzonych w błonie na poziomie pojedynczej cząsteczki bez użycia klasycznej elektrofizjologii. Wykorzystanie mitochondrialnego kanału przewodzącego białka TOM-CC z Neurospora crassa28,29,30 i OmpF, który wspiera dyfuzję małych cząsteczek hydrofilowych przez zewnętrzną błonę Escherichia coli17,31, pokazujemy, w jaki sposób można badać i korelować ruchliwość błony i aktywność kanałów tych dwóch białek. Sugerujemy, że to podejście, choć zoptymalizowane pod kątem TOM-CC i OmpF, może być łatwo zastosowane do innych kanałów białkowych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja białka

UWAGA: Ta sekcja opisuje procedurę izolacji OmpF z Escherichia coli BE BL21(DE3) omp631,32, który nie ma LamB i OmpC, oraz kompleksu rdzeniowego TOM z Neurospora crassa (Rysunek 1)28,29. To ostatnie wymaga mitochondriów wyizolowanych ze szczepu N. crassa28 zawierającego znakowaną 6xHis-labeled formę podjednostki TOM Tom22 (Rysunek 1A), którą można wyizolować zgodnie z opisem28. Poniższe protokoły zwykle dają 1-2 mg N. crassa TOM-CC i 10 mg E. coli OmpF. Jeśli ilość ma być dostosowana, ważne jest, aby proporcje białka do detergentu były precyzyjnie utrzymane. O ile nie określono inaczej, wszystkie czynności należy wykonywać w temperaturze 4 °C.

  1. Izolacja kompleksu rdzeniowego TOM
    1. Oczyszczone mitochondria N. crassa (2 g białka) rozpuszczać solubilizować otrzymane przez sedymentację różnicową z około 1,5 kg (mokrej masy) strzępek, zgodnie z Bausewein et al.30, przy stężeniu białka 10 mg/ml w 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1% (w/v) DDM, 20% (v/v) glicerolu, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu i 1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: PMSF jest toksyczny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
    2. Przenieś rozpuszczone mitochondria do probówek ultrawirówek i oddziel nierozpuszczone membrany od rozpuszczonych białek błonowych przez ultrawirowanie przy 130 000 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C i filtrację za pomocą bibuły filtracyjnej standardowej jakości.
    3. Zrównoważyć wstępnie napakowaną kolumnę Ni-NTA (objętość 5 ml) z około 5 objętościami kolumny (CV) buforu A1 (Tabela 1) przy użyciu automatycznego systemu oczyszczania białek. Uruchom kolumnę Ni-NTA ze stałym natężeniem przepływu 1 ml/min podczas wszystkich etapów. Użyj kolumny o mniejszej objętości (1 ml), jeśli białka zostały wyizolowane z mniej niż 2 g mitochondriów.
    4. Załadować rozpuszczoną próbkę białka do kolumny Ni-NTA z natężeniem przepływu 1 ml/min.
    5. Przemyć kolumnę Ni-NTA 5 CV buforu A1 (tabela 1) w celu usunięcia niezwiązanych białek.
    6. Eluować znakowany przez Hisa TOM-CC za pomocą 30% buforu A2 (Tabela 1; 300 mM imidazolu) i zebrać pik białka, tak jak pojawia się na chromatogramie 280 nm (Rysunek 1B).
    7. W celu dalszego oczyszczania TOM-CC należy zrównoważyć wstępnie wypełnioną kolumnę wymiany anionowej (1 ml) z 5 CV każdego buforu B1, B2 i B1 (Tabela 1) przy użyciu automatycznego systemu oczyszczania białek. Uruchom kolumnę wymieniacza anionowego ze stałym natężeniem przepływu 1 ml/min podczas wszystkich etapów.
    8. Załadować frakcję szczytową TOM-CC (krok 1.1.6) na kolumnę anionowymienną (natężenie przepływu 1 ml/min).
    9. Usunąć niezwiązane białka, przemłukując kolumnę 5 CV buforu B1 (Tabela 1) i liniowym gradientem soli 0%-20% buforu B2 (Tabela 1).
    10. Eluować TOM-CC za pomocą liniowego gradientu soli 20%-35% buforu B2 i zebrać frakcję piku białka, tak jak pojawia się na chromatogramie 280 nm (Rysunek 1C).
    11. Oceń czystość próbki za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 1D) i określ stężenie białka za pomocą dostępnego na rynku testu białka, zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).
    12. Próbki białek należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: Z ciekłym azotem należy obchodzić się w dobrze wentylowanych pomieszczeniach. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
       
  2. Izolacja OmpF
    1. Odzyskaj szczep E. coli BE BL21(DE3) omp6, pozbawiony LamB i OmpC32, z zamrożonego bulionu glicerolowego w sterylnych warunkach i rozprowadź smugi na płytce agarowej Luria-Bertani (LB) (Tabela 2). Aby to zrobić, stopniowo rozprowadź próbkę równomiernie na całej płytce.
    2. Pozostawić próbkę do wchłonięcia w agar na 5 minut, a następnie odwrócić płytkę z zamkniętą pokrywką i rozpocząć inkubację przez noc w temperaturze 37 °C.
    3. Wybierz pojedynczą kolonię E. coli, zaszczep 7,5 ml pożywki LB (Tabela 2) tą pojedynczą kolonią za pomocą sterylnej wykałaczki i pozostaw do wzrostu na noc (14 godzin) z mieszaniem (170 obr./min) w temperaturze 37 °C.
    4. Przenieść 2 x 1 ml komórek E. coli za pomocą sterylnych pipet do 2 x 500 ml pożywki LB (Tabela 2) i pozostawić do wzrostu na noc (~14 h) w temperaturze 37 °C z mieszaniem (~170 obr./min) w shakerze.
    5. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, zamrozić osad w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.
      UWAGA: Mokra masa osadu komórkowego wynosi zwykle 5 g na 1 l kultury. W tym momencie protokół może zostać wstrzymany.
    6. Rozmrozić i ponownie zawiesić komórki (2 g) w 20 ml buforu do lizy C1 (Tabela 2), a następnie trzykrotnie przepuścić zawiesinę pod ciśnieniem 1000 psi przez wstępnie schłodzony (4 °C) wysokociśnieniowy system rozbijania komórek, z maksymalną objętością próbki 35 ml, zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Używanie prasy francuskiej może prowadzić do poważnych obrażeń. Nigdy nie przekraczaj limitu ciśnienia używanego ogniwa. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
    7. Usunąć nieuszkodzone komórki z lizatu przez odwirowanie przy 4 000 x g przez 15 minut i zebrać supernatant.
    8. Zebrać membrany przez ultrawirowanie przy 100 000 x g przez 1 godzinę.
    9. Zawiesić osad membrany w 10 ml buforu C2 (Tabela 2) i wymieszać z równą objętością buforu SDS C3 (Tabela 2) za pomocą homogenizatora ze szkłem kulkowym.
      UWAGA: β-merkaptoetanol w buforze C3 jest toksyczny. Przestrzegaj wszystkich odpowiednich przepisów bezpieczeństwa.
    10. Inkubować zawiesinę w łaźni wodnej w temperaturze 50 °C przez 30 minut.
    11. Odwirować próbkę w temperaturze 100 000 x g w temperaturze 20 °C przez 1 godzinę.
    12. Zawiesić osad membranowy w 10 ml buforu SDS C4 (tabela 2) za pomocą homogenizatora ze szkła kulkowego i inkubować zawiesinę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: Jeśli osad nie może być ponownie zawieszony, dodaj więcej buforu SDS C4 do objętości 20 ml.
    13. Odwirować próbkę o masie 100 000 x g w temperaturze 20 °C przez 30 minut i zebrać supernatant.
    14. Zmieszać sklarowany nad osadem z oktylowym polioksyetylenem (oktylowym POE) do końcowego stężenia detergentu wynoszącego 0,5% (w/v) i dwukrotnie poddać próbkę dializie w stosunku do buforu C5 (tabela 2) w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. W tym celu należy użyć rurki do dializy z odcięciem 20 kDa, zgodnie z instrukcjami producenta, i umieścić próbkę w wężyku lub urządzeniu do dializy.
      UWAGA: Odcięcie rurki dializacyjnej należy dostosować, jeśli dializowane są białka o innych masach cząsteczkowych.
    15. Ocenić czystość próbki za pomocą SDS-PAGE i oznaczyć stężenie białka za pomocą dostępnego w handlu testu białkowego, zgodnie z protokołem producenta (tabela materiałów).
      UWAGA: Próbki podgrzane do temperatury 95 °C wykazują monomeryczny OmpF. Próbki, które nie zostały podgrzane, pokazują OmpF w postaci trimerycznej (Rysunek 1F).
    16. Szokowo zamrożony dializowany OmpF w porcjach ciekłego azotu i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
      UWAGA: Z ciekłym azotem należy obchodzić się w dobrze wentylowanych pomieszczeniach. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.

2. Optyczny jednokanałowy zapis kanałów jonowych w membranach DIB

UWAGA: Ta sekcja opisuje procedurę przygotowania membran DIB w mikrofabrykowanych komorach z polimetakrylanu metylu (PMMA)2 do monitorowania bocznego ruchu białek i przepływu jonów przez pojedyncze kanały jonowe17. Wymiary i dokładne rysunki do produkcji komory można znaleźć w Lepthin et al.2. Rysunek 2 przedstawia przegląd montażu komory PMMA2 i formowania membran DIB. O ile nie określono inaczej, wszystkie czynności są wykonywane w temperaturze pokojowej (RT). Rysunek 3 pokazuje schematyczną reprezentację błony DIB oraz sposób, w jaki strumień Ca2+ przez białko jednokanałowe jest używany do monitorowania zarówno ruchu w błonie, jak i stanu otwartego-zamkniętego kanału.

  1. Przygotowanie lipidów
    1. Z zamrażarki w temperaturze -20 °C wyjąć podstawowy roztwór lipidów zawierający 1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (25 mg/ml DPhPC) rozpuszczony w chloroformie i ogrzać go do temperatury pokojowej. W tym celu zazwyczaj wystarcza powolne ręczne podgrzewanie próbki przez kilka minut.
      UWAGA: Chloroform jest toksyczny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i wykonywać wszystkie zabiegi z udziałem chloroformu pod wyciągiem.
    2. Przenieść 380 μl roztworu podstawowego DPhPC (25 mg/ml DPhPC) do szklanej fiolki. Unikaj pipet z gumowymi uszczelkami. Zamiast tego użyj szklanych strzykawek o pojemności mikrolitrów z tłokami ze stali nierdzewnej.
    3. Po kontakcie z podstawowym roztworem lipidów należy nałożyć na niego roztwór podstawowy lipidów gazem Ar lubN2, aby zapobiec utlenianiu lipidów. Stosować najmniejszy możliwy przepływ gazu, aby uniknąć parowania rozpuszczalnika organicznego, w którym rozpuszczone są lipidy, lub rozpryskiwania się rozpuszczalnika w sprayu z fiolki. Upewnij się, że wieczko szklanych fiolek zawierających lipidy z rozpuszczalnikiem organicznym jest pokryte od wewnątrz politetrafluoroetylenem (PTFE).
    4. Wysuszyć próbkę lipidów (etap 2.1.2) pod strumieniemN2 i usunąć pozostały rozpuszczalnik organiczny z próbki lipidów przez noc w próżni (2,0 mbar) za pomocą bezolejowej pompy próżniowej.
    5. Rozpuścić film lipidowy w roztworze heksadekanu/oleju silikonowego, dodając równe objętości heksadekanu i oleju silikonowego (po 500 μl każdy) za pomocą mikrolitrowej szklanej strzykawki do końcowego stężenia lipidów 9,5 mg/ml.
      UWAGA: Roztwór lipidowy jest stabilny w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni.
  2. Przygotowanie hydrożelu agarozowego
    1. Przygotować około 1 ml niskotopliwego roztworu agarozy (0,75% [w/v]) w podwójnie dejonizowanej wodzie i podgrzewać do 85 °C w bloku grzewczym przez 20 minut, aby użyć do wirowania szklanych szkiełek nakrywkowych.
      UWAGA: Roztwór agarozy może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni i może być kilkakrotnie podgrzewany.
    2. Przygotować niskotopliwy 2,5% (w/v) roztwór agarozy w 0,66 M CaCl2 i 8,8 mM HEPES (pH 7,2) i podgrzewać do 85 °C w bloku grzewczym przez 20 minut. Upewnij się, że agaroza jest dobrze stopiona.
      UWAGA: Roztwór agarozy może być przechowywany przez kilka tygodni w temperaturze pokojowej i może być kilkakrotnie podgrzewany, podobnie jak agaroza (krok 2.2.1) używana do powlekania wirowego.
  3. Zespół komory z polimetakrylanu metylu (PMMA) i tworzenie monowarstwy lipidowej na granicy faz heksadekanu hydrożelu i oleju silikonowego
    1. Umieść kilka szklanych szkiełek nakrywkowych (40 mm x 24 mm x 0,13 mm) w uchwycie na szkiełko nakrywkowe ze stali nierdzewnej i wyczyść je w szklanej zlewce przez 10 minut z acetonem w myjce ultradźwiękowej. Użyj tylko takiej ilości acetonu, aby zanurzyć szkiełka nakrywkowe i luźno przykryj zlewkę szklaną płytką, aby stworzyć bezciśnieniowy, zamknięty system, który minimalizuje ulatnianie się oparów podczas procesu czyszczenia.
      UWAGA: Aceton jest wysoce łatwopalnym rozpuszczalnikiem o niskiej temperaturze zapłonu. Mieszaniny par i powietrza są wybuchowe. Myjkę ultradźwiękową należy używać w dobrze wentylowanym miejscu. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i przestrzegać oficjalnych środków ostrożności (np. nie używać otwartego ognia i nie iskrzyć).
    2. Opłucz szklane szkiełka nakrywkowe wodą podwójnie dejonizowaną i wysusz je pod strumieniem N2,
      UWAGA: Oczyszczone w ten sposób szkiełka nakrywkowe można przechowywać przez kilka tygodni.
    3. Następnie wyczyść i hydrofilizuj szkiełko nakrywkowe w myjce plazmowej z tlenem (0,5 mbar) przez 5 min.
      UWAGA: Wykonaj ten krok bezpośrednio przed wirowaniem powlekania roztworem agarozy, ponieważ hydrofilowy efekt czyszczenia plazmowego zanika z czasem.
    4. Zamontuj plazmowo impregnowane szkiełko nakrywkowe na powlekarce wirowej (Rysunek 2, krok 1).
    5. Pokryj szkiełko nakrywkowe warstwą agarozy o grubości submikrometra, powoli dodając 140 μl podgrzanej 0,75% (w/v) niskotopliwej agarozy (krok 2.2.1) przy 3,000 obr./min przez 30 s, używając pipety o pojemności 200 μl (Rysunek 2, krok 1).
      UWAGA: Grubość filmu agarozowego można określić za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM), zgodnie z opisem17.
    6. Natychmiast przymocuj spin-coated covershed z cienką warstwą hydrożelu agarozowego do spodu komory PMMA2. Upewnij się, że hydrożel agarozowy jest skierowany do góry (Rysunek 2, krok 2).
    7. Przymocuj krawędzie szkiełka nakrywkowego do urządzenia poddanego mikroobróbce PMMA za pomocą przezroczystej taśmy klejącej.
    8. Umieść urządzenie PMMA na płycie grzejnej podgrzanej do 35 °C (Rysunek 2, krok 3).
    9. Ostrożnie wlać 200 μl 2,5% roztworu agarozy (krok 2.2.2) do wlotu komory za pomocą pipety (Rysunek 2, krok 3), nie tworząc pęcherzyków powietrza, tak aby cienki hydrożel nałożony przez powlekanie wirowe mógł zrównoważyć się z buforem 2,5% roztworu agarozy i pozostać uwodniony. Upewnij się, że 2,5% roztwór agarozy jest rozprowadzony wokół hydrożelu agarozowego pokrytego wirowaniem, ale nie nad nim (Rysunek 3A), czego można uniknąć, delikatnie dociskając komorę PMMA do płyty grzewczej.
    10. Natychmiast przykryj studzienki komory PMMA (Rysunek 2, krok 4) łącznie 60 μl roztworu lipid/olej (krok 2.1.5), aby zainicjować tworzenie monowarstwy lipidowej na granicy faz agaroza-olej i uniknąć odwodnienia agarozy pokrytej spinem w dołkach komory PMMA. Trzymaj urządzenie na płycie grzejnej w temperaturze 35 °C przez około 2 godziny < br /> UWAGA: Okrągłe studzienki w komorze PMMA mają średnicę 0,5 mm i głębokość 1,8 mm, zgodnie z wcześniej opublikowanymi pracami2.
  4. Przygotowanie kropelek wodnych pokrytych lipidami w roztworze heksadekanu/oleju silikonowego
    1. Umieść 20 μl roztworu heksadekanu lipidowego/oleju silikonowego (krok 2.1.5) do każdej z kilku mikrofabrykowanych studzienek w komorze inkubacji kropelkowej (Rysunek 2, krok 4). Odpowiednimi pojemnikami na roztwór heksadekanu lipidowego/oleju silikonowego są małe wgłębienia o wymiarach 40 mm x 30 mm x 3,5 mm w cienkiej płycie PMMA2.
    2. Przygotować szklaną igłę mikrokapilarną o średnicy otworu końcówki 20 μm za pomocą pionowego lub poziomego ściągacza do mikropipet (np. używanego do wykonywania pipet punktowych lub ostrych elektrod szklanych). Oszacuj średnicę otworu szklanej igły mikrokapilarnej pod dwuokularowym mikroskopem stereoskopowym przy małym powiększeniu, w zakresie powiększenia od 7,5x do 35x,
      UWAGA: Ustawienia trybu podgrzewania przed pociągnięciem szklanej kapilary, trybu grzania do ciągnięcia oraz siły uciągu należy wcześniej określić eksperymentalnie, zgodnie ze specyfikacją producenta urządzenia ciągnącego i rodzajem kapilary.
    3. Napełnij igłę ze szkła mikrokapilarnego 5 μl wodnego roztworu iniekcyjnego zawierającego 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl i 30 nM kompleksu rdzeniowego TOM lub alternatywnie 20 nM OmpF za pomocą końcówki pipety mikrokapilarnej. Do przygotowania wodnego roztworu iniekcyjnego należy używać wyłącznie wody podwójnie destylowanej uprzednio potraktowanej żywicą chelatującą, która wiąże jony metali wielowartościowych (Ca2+).
    4. Zamontuj szklaną igłę mikrokapilarną z wodnym roztworem do wstrzykiwań na nanowtryskiwaczu napędzanym piezo.
    5. Wstrzyknąć 100-200 nL wodnych kropelek (Rysunek 2, krok 4) zawierających 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl i 30 nM kompleksu rdzeniowego TOM (krok 1.1.12) lub alternatywnie 20 nM OmpF (krok 1.2.16) do studzienek w komorze inkubacyjnej kropelek wypełnionej roztworem heksadekanu lipidowego/oleju silikonowego (patrz 2.1.5) za pomocą nanoiniektora. Upewnij się, że kropelki nie stykają się ze sobą, umieszczając je w studzienkach w odległości kilku milimetrów (>10 mm). W przeciwnym razie, jeśli monowarstwy lipidowe nie utworzyły się jeszcze na granicy faz olej/bufor, połączą się w większe kropelki.
      UWAGA: Jeśli nie są dostępne kapilary klasy i nanowtryskiwacze, kropelki można alternatywnie przygotować ręcznie za pomocą jednokanałowych pipet mikrolitrowych dla objętości od 0,1 μl do 0,5 μl, zgodnie z opisem2. Jednak w tym przypadku objętości kropel nie są tak dokładne.
    6. Pozwól na wytworzenie się monowarstwy lipidowej na granicy faz kropla/olej przez około 2 godziny, utrzymując komory inkubacyjne PMMA i kropelkowe (Rysunek 2, krok 4) na płycie grzejnej podgrzanej do 35 °C.
  5. Przygotowanie i obrazowanie pojedynczych kanałów jonowych w membranach DIB
    1. Ręcznie przenieś pojedyncze kropelki wody z dołków komory inkubacji kropel pod mikroskopem stereoskopowym do studzienek komory PMMA (Rysunek 2, krok 5), używając jednokanałowej pipety mikrolitrowej z jednorazową końcówką polipropylenową o pojemności 10 μl. Pozwól, aby kropelki opadły na monowarstwy lipidowe utworzone na granicy faz hydrożel-olej przez około 5 minut, aby utworzyć dwuwarstwę lipidową (Rysunek 3) między kropelkami a hydrożelem agarozowym.
    2. Zamontuj komorę PMMA z membranami DIB na uchwycie próbki mikroskopu z odwróconym światłem i oceń tworzenie się membrany za pomocą obiektywu kontrastowego z 10-krotną modulacją Hoffmana (Rysunek 2, krok 6). Tworzenie się błony DIB jest sygnalizowane przezroczystym białym pierścieniem na granicy faz między kroplą a hydrożelem (Rysunek 4A). Membrany DIB, które zostały uszkodzone, nie pokazują tego pierścienia (Rysunek 4B).
      UWAGA: Alternatywnie, membrany DIB można uwidocznić w 10-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego lub różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC).
    3. Jeśli uformowały się membrany DIB, zamontuj komorę PMMA na uchwycie próbki mikroskopu TIRF (Rysunek 2, krok 7) wyposażonego w konwencjonalne źródło światła do oświetlenia epifluorescencyjnego, laser 488 nm (Pmax = 100 mW) i podświetlaną od tyłu kamerę CCD zwielokrotniającą elektrony (512 x 512 pikseli; >95% QE), aby osiągnąć rozmiar piksela ~0,16 μm.
    4. Ustaw ostrość krawędź membrany DIB za pomocą obiektywu o powiększeniu 10x w oświetleniu epifluorescencyjnym za pomocą źródła światła o wysokiej intensywności za pomocą zestawu filtrów GFP.
    5. Dokładnie ustaw ostrość na tej samej krawędzi membrany DIB przy dużym powiększeniu za pomocą obiektywu TIRF 100x/N.A. 1,49 oleju apochromatycznego, ponownie w oświetleniu epifluorescencyjnym, ze źródłem światła o wysokiej intensywności przy użyciu zestawu filtrów GFP, który umożliwia wizualizację słabej fluorescencji tła barwnika fluorescencyjnego Fluo-8 w kropli (Rysunek 4C).
    6. Zmień ustawienie filtra z GFP na czterozakresowy zestaw filtrów TIRF.
    7. Włącz laser 488 nm i ustaw intensywność lasera na soczewce obiektywu na wartość od 8 mW do 10 mW.
      UWAGA: Ponieważ często nie ma informacji ilościowych na temat natężenia lasera na soczewce obiektywu, ustawienia intensywności lasera należy wcześniej skalibrować w oddzielnych pomiarach na soczewce, za pomocą optycznego miernika mocy lasera wyposażonego w czujnik fotodiody, zgodnie ze specyfikacją producenta.
      UWAGA: Aby zapewnić bezpieczną pracę lasera, operator musi zdawać sobie sprawę z możliwych zagrożeń związanych z promieniowaniem laserowym oraz przepisów dotyczących zapobiegania wypadkom.
    8. Aby zobrazować pojedyncze kanały jonowe, dostosuj kąt TIRF i wzmocnienie kamery EMCCD (np. ustawienie mnożnika wzmocnienia EM: 285) tak, aby otwarte kanały jonowe w membranie DIB pojawiały się jako fluorescencyjne plamy o wysokim kontraście na ciemnym tle (Rysunek 4D-G), a stosunek sygnału do tła, po oględzinach, osiągnął maksimum. Upewnij się, że plamki, odpowiadające strumieniowi Ca2+ przez pojedyncze kanały jonowe, pozostają ostre i mają okrągły kształt, z dużą intensywnością w środku i stopniowo zmniejszającą się w kierunku obrzeży. Membrany bez kanałów wykazują tylko fluorescencję tła (Rysunek 4C).
    9. Przed zarejestrowaniem ruchu i aktywności otwartej-zamkniętej poszczególnych kanałów w czasie, należy sprawdzić, czy plamki fluorescencyjne są ostre, aby upewnić się, że kanały jonowe odtworzyły się w błony DIB i poruszają się poprzecznie w płaszczyźnie membrany. Jeśli tak nie jest, może to oznaczać, że cząsteczka fluorescencyjna zanurza się i wychodzi z pola ulotnego generowanego przez laser w pobliżu membrany.
    10. Rejestruj serię obrazów membranowych, które umożliwiają prawidłowe śledzenie położenia i monitorowanie stanu otwartego-zamkniętego poszczególnych kanałów jonowych. Aby określić rodzaj mobilności bocznej (np. swobodny ruch vs zakotwiczenie przejściowe [dla porównania, patrz16]) oraz stan aktywności kanału (np. otwarty lub zamknięty), uzyskaj wystarczająco długie (np. 30 s do 1 min) i dobrze próbkowane trajektorie (np. liczba klatek na sekundę 48 s-1).
      UWAGA: Obserwacja dyfuzji kanałowej, ograniczonej lub chmielowej16 wymaga, aby częstotliwość próbkowania była wystarczająco szybka, aby zmierzyć nieograniczoną dyfuzję w ograniczonych granicach. Ponadto upewnij się, że czas próbkowania danych jest wystarczająco długi, aby zmierzyć przejście od dyfuzji nieograniczonej do ograniczonej (aby uzyskać szczegółowe informacje, zobacz Jacobson et al.16).
  6. Przetwarzanie obrazów i danych
    UWAGA: Pakiety do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym33 lub samodzielnie napisane procedury17 oparte na komercyjnych pakietach oprogramowania mogą być używane do analizy czasoprzestrzennej dynamiki poszczególnych kanałów jonowych w DIB. Aby móc skorelować boczną ruchliwość błony ze strumieniem jonów przepływającym przez poszczególne kanały, nie należy stosować algorytmów filtrowania.
    1. Popraw szeregi czasowe obrazu do wybielania, stosując standardowe procedury34 przy użyciu samodzielnie napisanych procedur, dopasowując średnią intensywność klatki figure-protocol-1 całego obrazu do figure-protocol-2, gdzie t to indeks klatki (czas) i k to parametry dopasowania. Następnie popraw szereg czasowy zgodnie z figure-protocol-3, gdzie I(t) jest intensywnością. Alternatywnie, w przypadku wstępnych analiz danych, należy wykonać korekty tła za pomocą oprogramowania open source z zaimplementowanymi algorytmami toczącej się piłki33 i promieniem toczącej się piłki, w zależności od plamki i rozmiaru piksela kamery (np. 50 pikseli).
    2. Określ pozycje przestrzenne i amplitudy plamki fluorescencyjnej w określonym obszarze zainteresowania (ROI) (np. 30 x 30 pikseli), dopasowując I(t) w danym czasie t do dwuwymiarowej funkcji Gaussa z płaskim nachyleniem, która uwzględnia możliwe lokalne gradienty oświetlenia zgodnie z figure-protocol-4. Tutaj x = (x, y) to ROI z informacją o intensywności fluorescencji, A i σ to amplituda i szerokość Gaussa, pk to parametry charakteryzujące intensywność tła ROI, a μ = (x0, y0) określa położenie Gaussa. Strumień jonów przepływający przez pojedynczy kanał jest określony przez parametr A. Trajektoria kanału jest określona przez x i pozwala na określenie ruchliwości bocznej kanału. Alternatywnie możliwe jest określenie pozycji i intensywności poszczególnych spotów za pomocą platform open-source33 i wtyczek zgodnie z opisem35,36. Oszacuj dokładność pozycjonowania37 po konwersji odczytu z kamery EMCCD na liczby fotonów38.
    3. Wykreślić amplitudę fluorescencji A w funkcji czasu i odpowiadającą jej trajektorię x, aby określić możliwą korelację między dyfuzyjnością kanału a strumieniem jonów przez kanał. Zrób to za pomocą dowolnego oprogramowania graficznego. W przypadku swobodnego ruchu poprzecznego kanału należy wyznaczyć współczynnik dyfuzji bocznej D za pomocą regresji liniowej opóźnienia czasowego τ i obliczyć średnie kwadratowe przemieszczenie plamek od x zgodnie z figure-protocol-5.
      UWAGA: Typowe współczynniki dyfuzji17 dla TOM-CC i OmpF swobodnie poruszających się w membranach DIB mieszczą się w zakresie od 0,5 do 1,5μm2 s-1. Cząsteczki, których stała dyfuzji jest mniejsza niż 0,01 mm2·s-1, są definiowane jako unieruchomione17.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednokanałowy zapis optyczny w czasie rzeczywistym bez elektrod ujawnia wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem białka a funkcją poszczególnych kanałów jonowych w błonach DIB. Rekonstytucja mitochondrialnego kompleksu rdzeniowego TOM (Rysunek 1A) w błonę DIB (Figura 4D) ilustruje silną korelację czasową między ruchliwością boczną a przepuszczalnością jonów (Figura 5A). Bramkowanie TOM-CC wydaje się być wrażliwe na tryb ruchu bocznego17. Ruchome kanały wykazują strumień Ca2+ przez swoje pory i wysokie natężenie punktu fluorescencji. Uwięzione, nieruchome cząsteczki wykazują niską i średnią intensywność fluorescencji. W przypadku ogólnego poru importu białek mitochondriów TOM-CC, to podejście oparte na pojedynczej cząsteczce ujawniło silną korelację czasową między ruchliwością boczną a przepuszczalnością jonów, co sugeruje, że kanał TOM-CC ma właściwości mechanowrażliwe17. Bocznemu zatrzymaniu swobodnie poruszających się cząsteczek TOM-CC towarzyszy częściowe lub całkowite zamknięcie kanału TOM-CC. Obrazowanie membran DIB za pomocą OmpF (Rysunek 1E i Rysunek 4F), który jest prawie całkowicie osadzony w membranie, nie wykazuje żadnych efektów stop-and-go (Rysunek 5B). Przypadkowe zatrzymania OmpF nie są związane ze zmianą intensywności, a tym samym z zamknięciem jego porów. Na podstawie sygnałów fluorescencyjnych s38 można oszacować dokładność pozycjonowania poszczególnych kanałów w zakresie od 5 do 10 nm. Należy jednak zauważyć, że tej dokładności nie można osiągnąć, jeśli kanały lekko się chwieją z powodu ruchomego zakotwiczenia hydrożelem agarozowym, jak pokazano na przykład dla cząsteczek TOM-CC w stanie pośrednim ze średnim przemieszczeniem korzeniowym 120 nm (Rysunek 5A).

figure-results-1
Rysunek 1: Izolacja TOM-CC. (A) Struktura Cryo EM N. crassa TOM-CC30,39. Mitochondria ze szczepu N. crassa zawierającego Tom22 ze znacznikiem 6xHis rozpuszczono w DDM i poddano chromatografii powinowactwa Ni-NTA (B) i chromatografii anionowymiennej (C). (D) SDS-PAGE na białym tle TOM-CC. (E) Struktura krystaliczna (PDB, 1OPF) i (F) SDS-PAGE oczyszczonego E. coli OmpF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat blokowy montażu komory PMMA. Krok 1: Szklane szkiełko nakrywkowe jest wirowane hydrożelem agarozowym. Krok 2: Szkiełko nakrywkowe z powłoką spinową jest montowane w specjalnie wykonanej komorze mikroskopowej z PMMA. Krok 3: Dodatkowa niskotopliwa agaroza jest dodawana do portu wlotowego komory PMMA na płycie grzejnej o temperaturze 35 °C. Krok 4: Monowarstwy lipidów tworzą się wokół kropelek wody na granicy faz bufor/olej (po lewej) oraz na granicy faz hydrożel/olej agarozowy (po prawej). Krok 5: Pojedyncze kropelki wody są pipetowane do studzienek komory PMMA w celu utworzenia dwuwarstwy lipidowej w kontakcie z dwiema monowarstwami lipidowymi. Krok 6: Tworzenie membran DIB jest weryfikowane za pomocą mikroskopii kontrastowej z modulacją Hofmanna. Krok 7: Obrazy wybranych obszarów błon DIB z wstawionymi kanałami jonowymi są pozyskiwane za pomocą mikroskopii TIRF. Zielony: 0,75% agarozy; żółty: 2,5% agarozy zawierającej jony Ca2+; magenta: faza lipidowa/olejowa; ciemnoniebieski: wodny bufor kropelkowy zawierający barwnik i białko wrażliwe naCa2+. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Konfiguracja eksperymentalna. (A) Schematyczne przedstawienie membrany DIB w studni PMMA. Dwuwarstwa spoczywa na ultracienkiej folii agarozowej o sile 0,75%, aby umożliwić obrazowanie TIRF strumienia Ca2 + przez kanał jonowy w czasie przy użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca2 + (Fluo-8) w trans. (B) Strumień Ca2+ jest kontrolowany wyłącznie przez ciśnienie osmotyczne od cis do trans. Pozwala to zarówno na określenie położenia w membranie, jak i stanu otwartego-zamkniętego kanału. Pokazany tutaj kanał to kanał przewodzący białka TOM-CC mitochondria N. crassa mitochondria30. (C) Trajektoria pojedynczego kanału TOM-CC. Zielony: ruchomy kanał; Żółty: nieruchomy kanał. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Obrazowanie TOM-CC i OmpF w membranach DIP. (A) Membrana DIB zobrazowana za pomocą mikroskopii kontrastowej modulacji Hoffmanna, pokazująca dwuwarstwową powierzchnię kontaktu między hydrożelem a kroplą. (B) Pęknięta membrana DIB zobrazowana jak w (A). Strzałka, krawędź komory PMMA. (C) Błona DIB zobrazowana za pomocą mikroskopii TIRF bez kanałów białkowych. (D) Membrana DIB z odtworzonym TOM-CC, zobrazowana za pomocą mikroskopii TIRF. Białe kwadraty oznaczają miejsca o wysokiej (SH), średniej (SI) i niskiej (SL) intensywności. (E) Dopasowanie profilu intensywności fluorescencji trzech plamek oznaczonych w (A) do dwuwymiarowych funkcji Gaussa ujawnia położenie poszczególnych TOM-CC i strumienia Ca2+ przez kanał. (F) Membrana DIB z odtworzonym OmpF. (G) Dopasowanie gaussowskie plamki fluorescencyjnej oznaczonej w (F). W przeciwieństwie do dwuporowego kompleksu białkowego TOM-CC z β beczki, trójporowy β-barwiskowy OmpF wykazuje tylko jeden stan przepuszczalności. Rozmiar piksela, 0,16 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Aktywność kanału koreluje z ruchliwością boczną TOM-CC. (A) Ślad amplitudy fluorescencji (na górze) i odpowiadająca mu trajektoria (na dole) TOM-CC wskazują, że aktywność kanału otwartego-zamkniętego TOM-CC koreluje z boczną ruchliwością błony kompleksu. Trajektoria przedstawia trzy stany przepuszczalności. Zielony: stan w pełni otwarty; żółty: pośredni stan przepuszczalności; czerwony: stan zamkniętego kanału; czerwona gwiazda: TOM-CC w stanie pośrednim chwieje się wokół swojej średniej pozycji o około ±60 nm. Dokładność pozycyjna s37 na podstawie sygnałów fluorescencyjnych w stanie całkowicie otwartym i pośrednim mieści się w zakresie od 5 nm do 10 nm. (B) Ślad amplitudy fluorescencji (u góry) i odpowiadająca mu trajektoria (na dole) OmpF. OmpF ujawnia tylko jeden poziom intensywności, niezależnie od tego, czy jest w ruchu, czy uwięziony. Odcinki trajektorii odpowiadające okresom czasu uwięzionych cząsteczek są oznaczone kolorem szarym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

bufor Stężenia odczynnikówgłośność
A1*20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltozyd (DDM), 10% (v/v) glicerol, 300 mM NaCl i 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)100 ml
A2*20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,1% (w/v) DDM, 10% (v/v) glicerol, 1 M imidazol i 1 mM PMSF100 ml
B1*20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (w/v) DDM, 2% (v/v) dimetylosulfotlenek (DMSO)100 ml
B2*20 mM HEPES pH 7,2, 0,1% (w/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) dimetylosulfotlenek (DMSO)100 ml
* Odgazuj i przepuść przez filtr 0,22 μm przed użyciem.

Tabela 1: Roztwory buforowe do izolacji TOM-CC.

bufor Stężenia odczynnikówgłośność
funt*1% (w/v) tryptonu, 1% (w/v) NaCl i 0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego 1100 ml
Klasa C12 mM MgCl2 i ~750 jednostek DNAzy i 50 mM Tris-HCl pH 7,5 20 ml
Klasa C250 mM Tris-HCl, pH 7,550 ml
Zobacz materiał C34% (w/v) dodecylosiarczan sodu (SDS), 2 mM β-merkaptoetanol i 50 mM Tris-HCl pH 7,550 ml
Zobacz materiał C42% (w/v) SDS, 500 mM NaCl i 50 mM Tris-HCl pH 7,550 ml
Zobacz materiał C50,5% (w/v) polioksyetylen oktylowy (oktyl POE), 1 mM EDTA i 20 mM Tris pH 8,5 1000 ml
* Sterylizuj przed użyciem.

Tabela 2: Roztwory buforowe do izolacji OmpF.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół stanowi wprowadzenie do stosowania membran DIB do badania wzajemnych zależności między bocznym ruchem kanałów jonowych a funkcją kanału za pomocą mikroskopii TIRF pojedynczej cząsteczki. Aby uzyskać jak najlepsze dane, przygotowanie stabilnych membran DIB z jak największą liczbą dobrze oddzielonych kanałów ma kluczowe znaczenie dla uzyskania szeregów czasowych pojedynczych cząstek, które można zadowalająco analizować.

Krytyczne parametry, które należy zoptymalizować, obejmują wybór lipidów, stężenie lipidów w fazie olejowej oraz stężenia białka i detergentu w kropelkach wody. Zastosowane lipidy są niezwykłe, ponieważ nie wykazują wyraźnej przemiany fazowej w niskich temperaturach. DPhPC jest powszechnie stosowanym lipidem do produkcji stabilnych systemów błonowych40. W zasadzie każdy lipid, który utrzymuje swoje płynne środowisko w niskich temperaturach, może być odpowiedni do tego zastosowania. Ponadto lipid nie powinien być wrażliwy na utlenianie. Stężenie detergentu w kropelkach powinno być jak najniższe, aby uniknąć pęknięcia membrany. Stabilne błony i dobre wskaźniki wchłaniania białek są na ogół osiągane przy stężeniach detergentów poniżej krytycznego stężenia miceli (cmc), biorąc pod uwagę, że białko błonowe nie wytrąca się.

Jeśli błony DIB nie tolerują określonych detergentów21,41 lub jeśli białka nie integrują się z roztworem o niskiej zawartości detergentu z błonami DIB, kanały białkowe mogą najpierw zostać odtworzone w małe jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (SUV), które są następnie łączone z błonami DIB od strony kropli, jak to z powodzeniem wykazano w przypadku E. coli MscL42. Czasami błony DIB nie powstają, ponieważ stężenie lipidów w fazie olejowej jest zbyt niskie. Aby zapobiec pękaniu membran DIB, należy również pamiętać, że ciśnienie osmotyczne między hydrożelem a kroplą musi być precyzyjnie zrównoważone, bez nadmiernego wpływu na strumień Ca2+ od cis do trans. Zoptymalizowana grubość agarozy i rozmiar oczek wydają się być kluczowe dla obserwacji dyfuzji białek błonowych. Należy unikać wysuszania warstwy agarozy. Grubość można określić za pomocą mikroskopii sił atomowych17. Zmieniając stężenie, objętość i prędkość obrotową agarozy podczas powlekania wirowego, można zoptymalizować rozmiar i grubość oczek hydrożelu. Należy jednak pamiętać, że grubość warstwy hydrożelu wpływa na kontrast obrazu. Aby wychwycić białka błonowe w DIB, hydrożel agarozowy można zastąpić specjalnie zsyntetyzowaną, nieusieciowaną, zmodyfikowaną Ni-NTA, niskotopliwą agarozą, aby uwięzić je za pomocą znacznika Hisa17. Zbyt wysokie tło fluorescencyjne jest często spowodowane pęknięciem błon DIB. Jest to szczególnie problematyczne w przypadku komór wielodołkowych, ponieważ barwnik wrażliwy na Ca2+ dyfunduje do hydrożelu. W takim przypadku należy unikać sąsiednich studni. Barwienie fluorescencyjne barwnika wrażliwego na Ca2+ nad membraną nie powinno być istotnym czynnikiem ograniczającym, ponieważ jest ono wymieniane przez niewzbudzone barwniki w większości kropelki (ryc. 3A) poza polem ulotnym TIRF. Precyzja lokalizacji białka zależy od dokładności dopasowania plamek i rozmiaru piksela.

Słabe sygnały fluorescencyjne mogą być spowodowane niskim strumieniem Ca2+ przez kanał. Możliwe przyczyny to: (i) niedokładne ustawienia TIRF (np. intensywność lasera), (ii) ciśnienie osmotyczne Ca2+ na membranie lub (iii) wewnętrzna przepuszczalność Ca2+ kanałów jest zbyt niska. Aby poradzić sobie z pierwszym problemem, należy zoptymalizować intensywność lasera, kąt TIRF i wzmocnienie kamery. Te dwa ostatnie problemy można przezwyciężyć poprzez zastosowanie potencjału elektrycznego w poprzek membrany 2,43. Jednak zastosowanie napięć zewnętrznych może zniekształcić wynik, ponieważ efekty elektryczne mogą wpływać na otwarcie kanałów jonowych bramkowanych ligandem lub mechanowrażliwych, które w rzeczywistości nie są kontrolowane napięciem. Przykładami takich kanałów są mitochondrialna translokaza białkowa TOM-CC27 i jej podjednostka tworząca kanały Tom40 26,44,45,46. Na koniec należy zauważyć, że wprowadzanie białek błonowych do błon DIB w określonej orientacji w celu osiągnięcia pożądanej funkcjonalności jest trudne, a badania ilościowe są rzadkie47,48. W niektórych przypadkach orientacja zintegrowanych białek jest przypadkowa. Jest to poważny problem w badaniu białek błonowych, ponieważ niektóre białka błonowe są aktywowane tylko po jednej stronie błony.

Mikroskopia TIRF jest potężną metodą rozwiązywania zdarzeń pojedynczych cząsteczek w błonach o podłożu płaskim49. Przykłady obejmują wyjaśnienie szlaku składania i fałdowania białek kanałowych, takich jak α-hemolizyna50, perfringolizyna O51 i OmpG52. W badaniach tych uwzględniono FRET jako technikę dodatkową. Ponadto aktywacja mechanowrażliwego kanału jonowego MscL była wcześniej badana poprzez mechaniczną stymulację wspieranych dwuwarstw DIB42 przy użyciu pomiarów prądu. Opierając się na tych pracach, przyszłe badania mogą połączyć opisaną tutaj platformę z eksperymentami z pojedynczymi cząsteczkami FRET, aby zająć się mechanowrażliwymi kanałami na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób optyczny17. Wstrzyknięcie buforu do kropli, rozciągnięcie wewnętrznej monowarstwy DIB lub ukierunkowane wiązanie poszczególnych kanałów z leżącym poniżej hydrożelem może być wykorzystane do dalszych badań nie tylko fizycznego mechanizmu mechanicznie aktywowanych kanałów, które reagują na napięcie i / lub krzywiznę błony, jak pokazano dla MscL i MscS, dwuporowej domeny K+-kanałów, TREK-1, TREK-2 i TRAAK oraz PIEZO (w celu przeglądu, patrz53), ale także lokalne wiązanie z cytoszkieletem komórkowym, jak pokazano dla wrażliwego na dotyk kanału jonowego NOMPC54,55.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczamy, że nie występujemy w przypadku konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Beate Nitschke za pomoc w przygotowaniu białka oraz Robin Ghosh, Michaelowi Schweikertowi (Stuttgart) i Maximilanowi Ulbrichowi (Freiburg) za wnikliwe dyskusje. Prace te były wspierane przez Centrum Badawcze Biologii Systemów w Stuttgarcie (SRCSB) oraz grant Fundacji Badenii-Wirtembergii (BiofMO-6 do SN).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfocholinaAvanti Polar Lipids850356C
100x Obiektyw olejowy Apochromat N.A. 1.49NikonMRD01991Mikroskop TIRF 
10x obiektyw kontrastowy z modulacją Hoffmanna NA 0,25 Mikroskop Nikondo oceny tworzenia się błony DIB   
10x obiektyw N.A. 0.25NikonMRL00102mikroskop TIRF 
40-krotny obiektyw kontrastowy z modulacją Hoffmanna NA 0,55Mikroskop Nikondo oceny tworzenia się błony DIB   
Laser 488 nm, 100 mW   Mikroskop VisitronTIRF 
Taśma
i Auml; KTA PURE   System oczyszczania białekCytiva
Zestaw testowy Bradford, PierceThermo Fisher 23236
CaCl2Roth5239.2
Żywica Chelax 100Biorad143-2832
Chloroform Sigma-AldrichMC1024452500
Kasety do dializy Slide-A-Lyzer 20 k MWCOThermo Fisher 87735
Komora DIB Wykonanana zamówienie komora PMMA do membran DIB
Cyfrowy miernik mocy i konsola energetycznaThorlabsPM100DLaserowy miernik mocy 
Sulftlenek dimetyluRoth 4720.1
Podwójnie destylowany mikroskop kontrastowy H2O
Eclipse TS 100 Hoffmann z modulacją Mikroskop Nikondo oceny tworzenia się błony DIB   
Kamera EDTARoth8042.2
EMCCD Mikroskop iXon Ultra 897AndorTIRF 
EtanolSigma-Aldrich32205-M
Rotor o stałym kącie nachylenia Ti70Beckman Coulter
Fluo-8, CalciFluorTMSanta Cruz BiotechnologySC-362561Ca2+-wrażliwy barwnik
Homogenizator komórek French PressIgneusIgneus 40000 psi
Filtr GFPAHFPrzesiąkanie filtracyjne stosowane do wzbudzania membran DIB metodą epifluorescencji ze źródłem światła białego 
Kapilary szklaneWorld Precision Instruments4878
Szkiełka nakrywkowe szklane 40 mm x 24 mm x 0,13 mmRoth1870.2
GlicerolRoth3783.2
Strzykawka Hamilton 10 mlRothX033.1
Strzykawka Hamilton 100 mlRothX049.1
Strzykawka Hamilton 500 mlRothEY49.1
Blok grzewczy EppendorfThermomixer comfort
Płyta grzewczaMinitube HT200
HepesRoth 9205.3
HexadcaneSigma-Aldrich296317
His Trap HP 1 mLCytiva29051021kolumna Ni-NTA
ImidazolSigma-Aldrich1.04716.1000
KCl
KLM Lista Schaefer TecSCV-10
medyczny pionowy ściągacz do pipet L/M-3P-AArtisan Technology Group57761-1
Agaroza o niskiej temperaturze topnieniaSigma-Aldrich A9414
M8 Mikroskop stereoskopowyWildStereomicrosope 
Matlab MathWorksR2022a
MetanolSigma-Aldrich34860
Końcówki do pipet MicroFilWorld Precision InstrumentsMF34G-5
Wtryskiwacz N2 NaCl
Roth3957.1
Nanolitr 2010 Światowe Instrumenty PrecyzyjneNanolitr 2010 
n-dodecyl-b-D-maltozydGlycon BiochemicalsD97002-C
Ni-NTA agaroza, nieusieciowanaCube Biotech 124115393Niestandardowe
oprogramowanie NIS-Elements ARNikonMQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930Oprogramowanie do obrazowania
n-oktylo-polioksyetylenSigma-Aldrich40530
O2 gaz
Fluorek fenylometylosulfonyluRoth 6367.3
Czujnik fotodiody  Si, 400 - 1100 nm, 500 mWThorlabsS130CCzujnik do miernika mocy lasera 
Myjka plazmowaDiener ElectronicsZepto
Preparatywna ultrawirówka OptimaBeckman Coulter
Czterozakresowy filtr TIRF 446/523/600/677 HCAHFUstawienie filtra służące do wzbudzania membran DIB za pomocą lasera 488 nm 
Zasób Q 1 mLCytiva17117701Kolumna anionowymienna
Olej silikonowy AR 20Sigma-Aldrich10836
Dodecylosiarczan soduRoth2326.2
Kamera Super LoLuxJVCStereomicrosope 
TermowytrząsarkaGerhardtTHL 500/1
Ti-E Mikroskop fluorescencyjny   NikonMEA53100
Tris-HClSigma-Aldrich9090.3
TryptoneRoth8952.2
Kąpiel ultradźwiękowa Bandelin SonorexRK 100
Pompa próżniowaVacuubrandMD 4C NT
Białe źródło światła do oświetlenia epifluorescencyjnego (100 W)Mikroskop NikonMBF72655TIRF 
Ekstrakt drożdżowyRoth2363.2
β-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148
klejąca Powlekarka wirowa Honeywell 10314243

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  2. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  3. Thompson, J. R., Heron, A. J., Santoso, Y., Wallace, M. I. Enhanced stability and fluidity in droplet on hydrogel bilayers for measuring membrane protein diffusion. Nano Letters. 7 (12), 3875-3878 (2007).
  4. Kusumi, A., et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 34 (1), 351-378 (2005).
  5. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysical Journal. 60 (4), 910-921 (1991).
  6. Kusumi, A., Shirai, Y. M., Koyama-Honda, I., Suzuki, K. G. N., Fujiwara, T. K. Hierarchical organization of the plasma membrane: Investigations by single-molecule tracking vs. fluorescence correlation spectroscopy. FEBS Letters. 584 (9), 1814-1823 (2010).
  7. Betaneli, V., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy to examine protein-lipid interactions in membranes. Methods in Molecular Biology. 974, 253-278 (2013).
  8. Ando, T., et al. A high-speed atomic force microscope for studying biological macromolecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (22), 12468-12472 (2001).
  9. Casuso, I., et al. Characterization of the motion of membrane proteins using high-speed atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (8), 525-529 (2012).
  10. Karner, A., et al. Tuning membrane protein mobility by confinement into nanodomains. Nature Nanotechnology. 12 (3), 260-266 (2017).
  11. Rajendran, L., Simons, K. Lipid rafts and membrane dynamics. Journal of Cell Science. 118 (6), 1099-1102 (2005).
  12. Schink, K. O., Tan, K. -W., Stenmark, H. Phosphoinositides in control of membrane dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 143-171 (2016).
  13. Schafer, D. A. Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).
  14. Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10005-10010 (2008).
  15. Engelman, D. M. Membranes are more mosaic than fluid. Nature. 438 (7068), 578-580 (2005).
  16. Jacobson, K., Liu, P., Lagerholm, B. C. The lateral organization and mobility of plasma membrane components. Cell. 177 (4), 806-819 (2019).
  17. Wang, S., et al. Spatiotemporal stop-and-go dynamics of the mitochondrial TOM core complex correlates with channel activity. Communications Biology. 5 (1), 471(2022).
  18. Ide, T., Yanagida, T. An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochemical and Biophysical Research Communications. 265 (2), 595-599 (1999).
  19. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Analytical Chemistry. 78 (24), 8169-8174 (2006).
  20. Heron, A. J., Thompson, J. R., Mason, A. E., Wallace, M. I. Direct detection of membrane channels from gels using water-in-oil droplet bilayers. Journal of the American Chemical Society. 129 (51), 16042-16047 (2007).
  21. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  22. Huang, S., Romero-Ruiz, M., Castell, O. K., Bayley, H., Wallace, M. I. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array. Nature Nanotechnology. 10 (11), 986-991 (2015).
  23. Sackmann, E. Supported membranes: scientific and practical applications. Science. 271 (5245), 43-48 (1996).
  24. Kiessling, V., Yang, S. -T., Tamm, L. K. Supported lipid bilayers as models for studying membrane domains. Current Topics in Membranes. 75, 1-23 (2015).
  25. Murray, D. H., Tamm, L. K., Kiessling, V. Supported double membranes. Journal of Structural Biology. 168 (1), 183-189 (2009).
  26. Hill, K., et al. Tom40 forms the hydrophilic channel of the mitochondrial import pore for preproteins. Nature. 395 (6701), 516-521 (1998).
  27. Poynor, M., Eckert, R., Nussberger, S. Dynamics of the preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Biophysical Journal. 95 (3), 1511-1522 (2008).
  28. Künkele, K. P., et al. The preprotein translocation channel of the outer membrane of mitochondria. Cell. 93 (6), 1009-1019 (1998).
  29. Ahting, U., et al. The TOM core complex: the general protein import pore of the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 147 (5), 959-968 (1999).
  30. Bausewein, T., et al. Cryo-EM structure of the TOM core complex from Neurospora crassa. Cell. 170 (4), 693-700 (2017).
  31. Cowan, S. W., et al. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins. Nature. 358 (6389), 727-733 (1992).
  32. Bieligmeyer, M., et al. Reconstitution of the membrane protein OmpF into biomimetic block copolymer-phospholipid hybrid membranes. Beilstein Journal of Nanotechnology. 7, 881-892 (2016).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Vicente, N. B., Zamboni, J. E. D., Adur, J. F., Paravani, E. V., Casco, V. H. Photobleaching correction in fluorescence microscopy images. Journal of Physics: Conference Series. 90 (1), 012068(2007).
  35. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  36. Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  37. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  38. Hirsch, M., Wareham, R. J., Martin-Fernandez, M. L., Hobson, M. P., Rolfe, D. J. A stochastic model for electron multiplication charge-coupled devices - From theory to practice. PLoS One. 8 (1), 53671(2013).
  39. Bausewein, T., Naveed, H., Liang, J., Nussberger, S. The structure of the TOM core complex in the mitochondrial outer membrane. Biological Chemistry. 401 (6-7), 687-697 (2020).
  40. Lindsey, H., Petersen, N. O., Chan, S. I. Physicochemical characterization of 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine in model membrane systems. Biochimica et Biophysica Acta. 555 (1), 147-167 (1979).
  41. Manafirad, A. Single ion-channel analysis in droplet interface bilayer. Methods in Molecular Biology. 2186, 187-195 (2021).
  42. Rosholm, K. R., et al. Activation of the mechanosensitive ion channel MscL by mechanical stimulation of supported Droplet-Hydrogel bilayers. Scientific Reports. 7 (1), 45180(2017).
  43. Wang, Y., et al. Electrode-free nanopore sensing by DiffusiOptoPhysiology. Science Advances. 5 (9), (2019).
  44. Ahting, U., et al. the pore-forming component of the protein-conducting TOM channel in the outer membrane of mitochondria. The Journal of Cell Biology. 153 (6), 1151-1160 (2001).
  45. Romero-Ruiz, M., Mahendran, K. R., Eckert, R., Winterhalter, M., Nussberger, S. Interactions of mitochondrial presequence peptides with the mitochondrial outer membrane preprotein translocase TOM. Biophysical Journal. 99 (3), 774-781 (2010).
  46. Kuszak, A. J., et al. Evidence of distinct channel conformations and substrate binding affinities for the mitochondrial outer membrane protein translocase pore Tom40. The Journal of Biological Chemistry. 290 (43), 26204-26217 (2015).
  47. Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: Experimental verification with the potassium channel KcsA. Journal of the American Chemical Society. 133 (30), 11774-11779 (2011).
  48. Goers, R., et al. Optimized reconstitution of membrane proteins into synthetic membranes. Communications Chemistry. 1, 35(2018).
  49. Castell, O. K., Dijkman, P. M., Wiseman, D. N., Goddard, A. D. Single molecule fluorescence for membrane proteins. Methods. 147, 221-228 (2018).
  50. Thompson, J. R., Cronin, B., Bayley, H., Wallace, M. I. Rapid assembly of a multimeric membrane protein pore. Biophysical Journal. 101 (11), 2679-2683 (2011).
  51. Senior, M. J. T., et al. Single-molecule tracking of perfringolysin O assembly and membrane insertion uncoupling. The FEBS Journal. , (2022).
  52. Weatherill, E. E., et al. Fast slow folding of an outer membrane porin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (20), 2121487119(2022).
  53. Kefauver, J. M., Ward, A. B., Patapoutian, A. Discoveries in structure and physiology of mechanically activated ion channels. Nature. 587 (7835), 567-576 (2020).
  54. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
  55. Wang, Y., et al. The push-to-open mechanism of the tethered mechanosensitive ion channel NompC. eLife. 10, 58388(2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dwub onowa interfejsowa kropelkowastrumie jon w wapniadyfuzja bia ek b onowychwspierane b ony lipidoweledzenie fluorescencyjne

Powiązane artykuły