Artykuł metodologiczny

Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili

DOI:

10.3791/64971

⸱

2 czerwca 2023

 ,  , 
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy stopniowe protokoły mierzące oddychanie mitochondrialne mysich i ludzkich neutrofili oraz komórek HL60 za pomocą analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neutrofile są pierwszą linią obrony i najliczniejszymi leukocytami u ludzi. Te komórki efektorowe pełnią takie funkcje, jak fagocytoza i wybuch oksydacyjny, a także tworzą zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili (NET) w celu usunięcia drobnoustrojów. Nowe informacje na temat aktywności metabolicznej neutrofili podważają wczesną koncepcję, że opierają się one głównie na glikolizie. Precyzyjny pomiar aktywności metabolicznej może ujawnić różne wymagania metaboliczne neutrofili, w tym cykl kwasu trikarboksylowego (TCA) (znany również jako cykl Krebsa), fosforylację oksydacyjną (OXPHOS), szlak pentozofosforanowy (PPP) i utlenianie kwasów tłuszczowych (FAO) w warunkach fizjologicznych i w stanach chorobowych. W tym artykule opisano krok po kroku protokół i wymagania wstępne dotyczące pomiaru wskaźnika zużycia tlenu (OCR) jako wskaźnika oddychania mitochondrialnego na neutrofilach pochodzących ze szpiku kostnego myszy, neutrofilach pochodzących z ludzkiej krwi i neutrofilopodobnej linii komórkowej HL60 podobnej do neutrofili, przy użyciu analizy strumienia metabolicznego na analizatorze strumienia metabolicznego zewnątrzkomórkowego. Metoda ta może być stosowana do ilościowego określania funkcji mitochondrialnych neutrofili w warunkach normalnych i chorobowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria odgrywają główną rolę w bioenergetyce komórek, która wytwarza adenozynotrójfosforan (ATP) poprzez fosforylację oksydacyjną (OXPHOS). Oprócz tego rola mitochondriów rozciąga się na wytwarzanie i detoksykację reaktywnych form tlenu, cytoplazmatyczną i mitochondrialną macierz regulację wapnia, syntezę komórkową, katabolizm i transport metabolitów w komórce1. Oddychanie mitochondrialne jest niezbędne we wszystkich komórkach, ponieważ ich dysfunkcja może powodować problemy metaboliczne2, w tym choroby sercowo-naczyniowe3 i wiele innych chorób neurodegeneracyjnych, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem4, choroby Parkinsona i Alzheimera5 oraz choroba Charcota-Marie-Tootha 2 A (CMT2A)6.

Badania mikroskopowe neutrofili wykazały, że mitochondriów jest stosunkowo niewiele7, a ich produkcja energii opiera się głównie na glikolizie, ponieważ tempo oddychania mitochondriów jest bardzo niskie8. Jednak mitochondria mają kluczowe znaczenie dla funkcji neutrofili, takich jak chemotaksja9 i apoptoza10,11,12. Poprzednie badanie ujawniło złożoną sieć mitochondrialną w ludzkich neutrofilach o wysokim potencjale błonowym. Utrata potencjału błony mitochondrialnej jest wczesnym wskaźnikiem apoptozy neutrofili10. Leczenie mitochondrialnym cyjankiem karbonylu cyjanku m-chlorofenylu (CCCP) wykazało znaczące hamowanie chemotaksji, wraz ze zmianą morfologii mitochondriów9,10.

Chociaż głównym źródłem energii dla neutrofili jest glikoliza, mitochondria dostarczają ATP, które inicjuje aktywację neutrofili poprzez napędzanie pierwszej fazy sygnalizacji purynergicznej, która wzmacnia sygnalizację Ca2+, wzmacnia produkcję ATP w mitochondriach i inicjuje funkcjonalne reakcje neutrofili13. Dysfunkcja mitochondrialnego łańcucha oddechowego powoduje nadmierną produkcję toksycznych reaktywnych form tlenu (ROS) i prowadzi do uszkodzeń chorobotwórczych14,15,16. NEToza, czyli proces tworzenia zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET), jest kluczową właściwością neutrofili, która pomaga im w walce z patogenami17 i przyczynia się do wielu stanów patologicznych, w tym raka, zakrzepicy i zaburzeń autoimmunologicznych18. ROS pochodzące z mitochondriów przyczyniają się do NETosis19, mitochondrialne DNA może być składnikiem NETs18, a zmieniona homeostaza mitochondriów upośledza NETosis20,21,22,23,24. Ponadto, podczas normalnego różnicowania lub dojrzewania, przeprogramowanie metaboliczne neutrofili zostaje odwrócone poprzez ograniczenie aktywności glikolitycznej i angażują się one w oddychanie mitochondrialne i mobilizują wewnątrzkomórkowe lipidy25,26.

Analizator metabolicznego strumienia zewnątrzkomórkowego może stale monitorować i określać ilościowo oddychanie mitochondrialne i glikolizę żywych komórek. Analizator wykorzystuje 96-dołkowy wkład czujnika w formacie płytki i dwa fluorofory do ilościowego określania stężenia tlenu (O2) i zmian pH. Wkład czujnika znajduje się nad monowarstwą komórki podczas testu i tworzy mikrokomorę o wysokości ~200 nm. Wiązki światłowodów w analizatorze służą do wzbudzania fluoroforów i wykrywania zmian intensywności fluorescencji. Zmiany stężeniaO2 i pH w czasie rzeczywistym są automatycznie obliczane i pokazywane jako wskaźnik zużycia tlenu (OCR) i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR). Na kartridżu czujnika znajdują się cztery porty, które umożliwiają załadowanie do czterech związków do każdego dołka podczas pomiarów testowych. Protokół ten koncentruje się na ilościowym określeniu oddychania mitochondrialnego neutrofili myszy i ludzi, a także neutrofilopodobnych komórek HL60, przy użyciu analizatora metabolicznego strumienia zewnątrzkomórkowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heparynizowane próbki krwi pełnej zostały pobrane od zdrowych ludzkich dawców po uzyskaniu świadomej zgody, zatwierdzonej przez Institutional Review Board of UConn Health zgodnie z Deklaracją Helsińską. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z wytycznymi UConn Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), a zgodę na stosowanie gryzoni uzyskano od UConn Health IACUC zgodnie z kryteriami określonymi w Przewodniku opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych z National Institutes of Health. W tym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6 w wieku 6 tygodni.

1. Przygotowanie płytki 96-dołkowej do badania metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego

  1. Wkład z czujnikiem jest umieszczony na specjalnie zaprojektowanej 96-dołkowej płytce do badania metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego. Uwodnić wkład, ostrożnie go podnosząc, i umieścić 200 μl/studzienkę pożywki kalibracyjnej w każdym dołku znajdującej się pod spodem płytki. Umieść wkład na płytce z kalibrem w nawilżanym inkubatorze o temperaturze 37 °C bez emisjiCO2 w celu nawodnienia przez noc.
  2. W zależności od typu komórki użyj specjalnej powłoki na płytkę hodowlaną, aby zapewnić adhezję komórek. W przypadku ludzkich neutrofili - niezróżnicowanych i zróżnicowanych komórek HL60 - pokryj 96-dołkową płytkę sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) zawierającym 50 μl oczyszczonego mysiego przeciwciała anty-ludzkiego CD18 o stężeniu 5 μg/ml (klon TS1/18) w temperaturze 4 °C przez noc. W przypadku neutrofili mysich pokryj 96-dołkową płytkę 25 μl 22,4 μg/ml Cell Tak o pH 8,0 w 0,1 M NaHCO3 w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut.
  3. Umyć płytki dwukrotnie 200 μl sterylnego PBS.
  4. Dodać kompletną pożywkę do dołków narożnych (A1, A12, H1 i H12) płytki do hodowli komórkowych (bez komórek) w celu korekcji tła na płytkach do kultur komórkowych podczas wysiewu.
    UWAGA: Parowanie podczas powlekania i kalibracji może mieć wpływ na objętość nośnika kalibracyjnego i normalizację. Użyj tacki lub komory ze sterylną chusteczką zwilżoną wodą i umieść płytkę z kalibrem nad nią, aby zapobiec parowaniu.

2. Przygotowanie i wysiewanie komórek

  1. Przygotowanie podłoża do oznaczania
    1. Przygotować pożywkę testową, dodając 1 mM pirogronianu, 10 mM glukozy i 2 mM glutaminy do zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco.
  2. Izolacja mysich neutrofili ze szpiku kostnego
    1. Wyizoluj mysie neutrofile ze szpiku kostnego za pomocą zestawu do wzbogacania neutrofili u myszy, zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Znieczulić myszy przez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie ketaminy (125 mg / kg) i ksylazyny (12,5 mg / kg), a następnie poddać myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
    3. Zbierz kości udowe i piszczelowe, jak opisano wcześniej27. Krótko przeciąć skórę, aby odsłonić nogę z mięśniami. Przetnij staw biodrowy, aby usunąć nogę z ciała. Następnie usuń mięśnie, aby zebrać kość udową i piszczelową.
    4. Odetnij mniejsze końce kości udowych i piszczelowych. Trzymając odcięte końce w dół, umieść je w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 ml z dwoma otworami w dolnej części strzykawki o pojemności 25 g, a następnie umieść probówkę o pojemności 0,5 ml w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml (Rysunek 1A). Dodaj 50 μl PBS do probówki 0,5 ml, aby zapobiec wysuszeniu komórek szpiku kostnego.
    5. Wirować przy 5 900 × g w temperaturze pokojowej przez 15 sekund, aby pobrać szpik kostny z dna probówki o pojemności 1,5 ml. Zawiesić komórki szpiku kostnego za pomocą 1 ml DMEM. Dodać 50 μl surowicy szczurzej z zestawu, delikatnie wymieszać pipetując i przenieść zawiesinę komórkową do probówki do hodowli polistyrenu o pojemności 5 ml.
    6. Dodać 50 μl koktajlu wzbogacającego z zestawu do wzbogacania neutrofili myszy i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przy 300 × g w temperaturze smotej przez 5 minut.
    7. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml DMEM, dodać 50 μl koktajlu selekcyjnego biotyny z zestawu, delikatnie wymieszać pipetując i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Dodać 150 μl wirowych cząstek magnetycznych z zestawu, delikatnie wymieszać pipetując i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Dodaj ~1,3 ml DMEM, delikatnie wymieszaj pipetując, umieść probówkę w magnesie na 3 minuty i przenieś supernatant zawierający oczyszczone neutrofile myszy do nowej probówki do hodowli polistyrenu o pojemności 5 ml, odwracając oryginalną probówkę wraz z magnesem.
    10. Wirować przy 300 × g w temperaturze pokojowej przez 5 min. Po usunięciu supernatantu przez aspirację próżniową, ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml pożywki do oznaczania.
    11. Policz komórki ręcznie za pomocą hemocytometru.
    12. Dostosować gęstość komórek do 1,1 × 106 komórek/ml, dodając pożywkę do oznaczania, wysiewając 180 μl zawiesiny neutrofili myszy (2 × 105 komórek) na basenie do przygotowanej płytki 96-dołkowej (kroki 1.2-1.4) i odwirować płytkę przy 300 × g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty bez przerwy, aby zapewnić prawidłowe przyleganie komórek na dnie płytki.
    13. Inkubować płytkę w inkubatorze niezawierającymCO2, nawilżonym, w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu wstępnego zrównoważenia komórek z pożywką do oznaczania.
      UWAGA: Czystość neutrofili ma kluczowe znaczenie dla testu, ponieważ jest to potencjalne odchylenie. Czystość izolacji neutrofili myszy wynosi 69,9%-88,7% według tego protokołu. Istnieją inne metody izolowania neutrofili ze szpiku kostnego myszy, takie jak wirowanie w gradionym gradiencie gęstości28. Istnieją również alternatywne zestawy do izolacji neutrofili od innych dostawców, oparte na negatywnej selekcji magnetycznej przy użyciu przeciwciał monoklonalnych przeciwko antygenom, które nie ulegają ekspresji na neutrofilach.
  3. Izolacja ludzkich neutrofili z krwi obwodowej
    1. Dodać 8 ml roztworu polisacharydów do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, a następnie nałożyć 4 ml krwi obwodowej na wierzch roztworu polisacharydów bez mieszania.
    2. Wirować przy 550 × g w temperaturze 20 °C przez 30 min. Sprawić, aby wirnik zwolnił przy 1,
      UWAGA: Czas separacji neutrofili może się różnić w zależności od dawcy. Jest to minimum 30 minut, a dodatkowe 10-20 minut może być potrzebne, jeśli separacja neutrofili nie powiedzie się.
    3. Obserwuj separację osocza/płytek krwi i komórek jednojądrzastych po odwirowaniu, jak pokazano na Rysunek 1B. Ostrożnie usunąć górny żółty płyn na wierzchu (osocze i płytki krwi) oraz górne mętne pasmo (komórki jednojądrzaste), nie naruszając dolnego mętnego pasma (neutrofile) za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
    4. Zebrać dolny mętny pas i ~ 3-4 ml klarownego płynu poniżej do nowej 15 ml probówki wirówkowej zawierającej 10 ml PBS.
    5. Wirować w temperaturze 400 × g w temperaturze 20 °C przez 10 minut i usunąć supernatant przez aspirację próżniową.
    6. Zawiesić komórki w 5 ml PBS i odwirować przy 300 × g w temperaturze 20 °C przez 5 minut.
    7. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml pożywki do oznaczania.
    8. Policz komórki ręcznie za pomocą hemocytometru.
      UWAGA: Ponieważ erytrocyty we krwi nie mają żadnych mitochondriów, zanieczyszczenie erytrocytów nie wpływa na test stresu mitochondrialnego i zapobiega aktywacji/torowaniu neutrofili/torowaniu29,30. Erytrocyty muszą być poddawane lizie podczas liczenia komórek, aby uzyskać dokładne stężenie neutrofili. Dodaj 10 μl zawiesiny komórkowej do 891 μl wody dejonizowanej przez 10-30 s w celu lizy erytrocytów, a następnie dodaj 99 μl 10x PBS, aby zrównoważyć ciśnienie osmotyczne, unikając lizy neutrofili.
    9. Dostosować gęstość komórek do 2,2 × 106 komórek/ml, dodając pożywkę do oznaczania, wysiewając 180 μl ludzkich neutrofili (~4 × 105) na dołek do przygotowanej płytki 96-dołkowej i odwirować płytkę przy 300 × g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty bez hamulca, aby zapewnić prawidłowe przyleganie komórek na dnie płytki.
    10. Inkubować płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C bez -CO2 przez 1 godzinę w celu wstępnego zrównoważenia komórek z pożywką do oznaczania.
      UWAGA: Czystość neutrofili ma kluczowe znaczenie dla testu, ponieważ jest to potencjalne odchylenie. Czystość izolacji ludzkich neutrofili wynosi 86,6%-96,8%. Istnieją inne metody wirowania w gradiencie gęstości do izolowania neutrofili od ludzkiej krwi, w tym izolacja Percoll, a także połączenie izolacji Ficollu i sedymentacji dekstranu31.
  4. Hodowla komórkowa HL60 i różnicowanie ukierunkowane na neutrofile
    1. Utrzymuj komórki HL60 w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 μg/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 250 ng/ml amfoterycyny B w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. W celu różnicowania ukierunkowanego na neutrofile utrzymuj komórki HL60 (komórki zawieszone) w kolbie T25 o gęstości 1 × 105 komórek/ml w pożywce RPMI-1640 zawierającej 10% FBS, 100 μg/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 250 ng/ml amfoterycyny B i 1,3% dimetylosulfotlenku (DMSO) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 6 dni.
    3. W dniu testu należy ręcznie policzyć komórki za pomocą hemocytometru, odwirować zróżnicowane lub niezróżnicowane komórki HL60 przy 300 × g w RT przez 5 minut, przemyć raz DMEM i ponownie zawiesić komórki pożywką do oznaczania, aby uzyskać gęstość komórek 1,39 × 106 komórek/ml.
    4. Wysiewać 180 μl zróżnicowanych lub niezróżnicowanych komórek HL60 (~2,5 × 105) na basenie do przygotowanej płytki 96-dołkowej i odwirować płytkę przy 300 × g w temperaturze pokojowej przez 3 minuty bez hamulca, aby zapewnić prawidłowe przyleganie komórek na dnie płytki.
    5. Inkubować płytkę w inkubatorze niezawierającymCO2, nawilżonym, w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu wstępnego zrównoważenia komórek z pożywką do oznaczania.
      UWAGA: Przed następnym krokiem potwierdź całkowitą adhezję komórek za pomocą mikroskopu.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat ideowy izolacji komórek szpiku kostnego i neutrofili. (A) Pobieranie komórek szpiku kostnego od myszy oraz (B) izolowanie neutrofili od krwi ludzkiej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

) ) )
Typ komórkiKomórki na studzienkęZwiązki/odczynnikiStężenie roztworu roboczegoObjętość wtrysku do portówKońcowe stężenie w studniach
Neutrofile myszy2 × 105Oligomycyna25 μM20 μL2,5 μM
FCCP (Protokół FCCP7,5 μM17,6 μl0,61 μM
Mieszanina rotenonu antymycyny A10 μM24 μL1 μM
Ludzkie neutrofile4 × 105Oligomycyna10 μM20 μL1 μM
FCCP (Protokół FCCP12,5 μM22 μL1,25 μM
Mieszanina rotenonu antymycyny A10 μM24 μL1 μM
Niezróżnicowane lub zróżnicowane komórki HL602,5 × 105Oligomycyna25 μM20 μL2,5 μM
FCCP (Protokół FCCP15 μM22 μL1,5 μM
Mieszanina rotenonu antymycyny A10 μM24 μL1 μM

Tabela 1: Liczba komórek i stężenia odczynników do testu stresu mitochondrialnego.

3. Przygotowanie związków w zestawie do testów wysiłkowych w mitochondriach

  1. Otwórz zestaw do testu wysiłkowego mitochondriów i przygotuj odczynniki.
    UWAGA: Różne stężenia roztworu roboczego, objętość wstrzyknięcia do studzienek i końcowe stężenia w studzienkach oligomycyny, p-trifluorometoksyfenylohydrazonu karbonylowego (FCCP) i mieszaniny rotenonu/antymycyny A stosowanej do neutrofili myszy, neutrofili ludzkich i komórek HL60 w studzienkach przedstawiono w tabeli 1.
    1. Przygotować roztwór podstawowy oligomycyny, rozpuszczając oligomycynę w 630 μl pożywki do oznaczania w celu otrzymania roztworu podstawowego o stężeniu 100 μM.
      UWAGA: Zaleca się użycie roztworu podstawowego tego samego dnia.
      1. Przygotować roztwór roboczy oligomycyny do oznaczania neutrofili myszy i komórek HL60, mieszając 630 μl roztworu podstawowego z 1,890 μl pożywki do oznaczania w celu uzyskania roztworu roboczego o stężeniu 25 μM.
      2. Przygotować roztwór roboczy oligomycyny do testu na obecność neutrofili u ludzi, mieszając 300 μl roztworu podstawowego z 2 700 μl pożywki do oznaczania w celu uzyskania roztworu roboczego o stężeniu 10 μM.
        UWAGA: Wiązanie oligomycyny z podjednostką podstawowej Fo ATPazy Fo/F1 (syntaza ATP) zapobiega ponownemu wejściu protonów do mitochondriów i hamuje syntezę ATP32. To znacznie zmniejsza przepływ elektronów przez łańcuch transportu elektronów i OCR. Jednak przepływ elektronów nie zatrzymuje się całkowicie z powodu wycieku protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną33.
    2. Przygotować roztwór podstawowy FCCP, rozpuszczając FCCP w 720 μl pożywki do oznaczania w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 100 μM.
      1. Przygotować roztwór roboczy do testu neutrofili u myszy, mieszając 300 μl roztworu podstawowego z 3 700 μl pożywki do oznaczania w celu uzyskania roztworu roboczego o stężeniu 7,5 μM.
      2. Przygotować roztwór roboczy do oznaczania na obecność granulocytów obojętnochłonnych u ludzi, mieszając 375 μl roztworu podstawowego z 2,625 μl pożywki do oznaczania w celu uzyskania roztworu roboczego o stężeniu 12,5 μM.
      3. Przygotować roztwór roboczy do testu na komórkach HL60, mieszając 720 μl roztworu podstawowego z 4,080 μl pożywki do oznaczania w celu uzyskania roztworu roboczego o stężeniu 15 μM.
        UWAGA: Dodanie FCCP ujawnia maksymalną zdolność mitochondriów do korzystania z OXPHOS. Jest to rozpuszczalny w tłuszczach, słaby kwas przepuszczalny dla mitochondriów, co powoduje rozproszenie potencjału transbłonowego. Rozładowanie gradientu protonów przez wewnętrzną błonę mitochondriów i przekierowanie strumienia protonów z syntazy Fo / F1 ATP powoduje rozprzęgnięcie mitochondriów. Ten efekt rozprzęgania gwałtownie zwiększa zużycie tlenu w mitochondriach, aby zachować gradient protonów34.
    3. Przygotować roztwór podstawowy rotenonu/antymycyny A, rozpuszczając mieszaninę rotenonu/antymycyny A w 540 μl pożywki do oznaczania w celu otrzymania roztworu podstawowego o stężeniu 50 μM.
      1. Przygotować roztwór roboczy rotenonu/antymycyny A do wszystkich testów, mieszając 540 μl roztworu podstawowego z 2,160 μl pożywki do oznaczania w celu uzyskania roztworu roboczego 10 μM.
        UWAGA: Rotenon blokuje kompleks I poprzez hamowanie transferu elektronów z centrów żelazowo-siarkowych w kompleksie I do ubichinonu, podczas gdy antymycyna A blokuje kompleks III łańcucha transportu elektronów, prowadząc do blokady OXPHOS z ograniczoną syntezą ATP35. W ten sposób ujawnia się oddychanie niemitochondrialne36,37.
  2. Załaduj wkład odczynnikami; załaduj przygotowaną mieszaninę oligomycyny, FCCP i rotenonu/antymycyny A odpowiednio do portów A, B i C we wkładzie do wstrzykiwań (Rysunek 2). Użyj wkładki szablonowej dostępnej wraz z wkładem, aby ułatwić załadunek odczynników do portów. Niewykorzystane porty należy wypełnić 20 μl pożywki do oznaczania.
    1. W przypadku testu neutrofili u myszy załadować 20 μl oligomycyny (25 μM; każda studzienka 96-dołkowej płytki ma na początku 180 μl pożywki testowej, więc końcowe stężenie wynosi 2,5 μM) do portów A. Załaduj 17,6 μL FCCP (7,5 μM; stężenie końcowe: ~0,61 μM) do portów B. Załadować 24 μl mieszaniny rotenonu/antymycyny A (10 μM; stężenie końcowe: ~1 μM) do portów C.
    2. W przypadku testu na obecność neutrofili u ludzi należy załadować 20 μl oligomycyny (10 μM; każda studzienka na 96-dołkowej płytce ma na początku 180 μl pożywki do oznaczania, a zatem końcowe stężenie wynosi 1 μM) do portów A. Załaduj 22 μL FCCP (12,5 μM; stężenie końcowe: ~1,25 μM) do portów B. Załadować 24 μl mieszaniny rotenonu/antymycyny A (10 μM; stężenie końcowe: ~1 μM) do portów C.
    3. W przypadku testu komórkowego HL60 i dHL60 należy załadować 20 μl oligomycyny (25 μM; każda studzienka na 96-dołkowej płytce ma na początku 180 μl pożywki testowej, a zatem końcowe stężenie wynosi 2,5 μM) do portów A. Załaduj 22 μL FCCP (15 μM; stężenie końcowe: ~1,5 μM) do portów B. Załaduj 24 μl mieszaniny rotenonu/antymycyny A (10 μM; stężenie końcowe: ~1 μM) do portów C.
      UWAGA: Odpipetować roztwór leku w porcie, nie dotykając dna portu. Nie stukaj w płytkę po załadowaniu, aby uniknąć wycieku, ponieważ płyny są utrzymywane przez siły kapilarne. Studzienki tła płytki hodowlanej i porty we wkładzie czujnika są ładowane pożywką testową lub tym samym portem ładowania odczynników, co w dołkach na próbki, aby znormalizować wpływ odczynników na wartości tła. Odczynniki muszą być dodawane do odpowiednich portów bez podnoszenia wkładu z tabliczki narzędziowej zawierającej kaliber, aby uniknąć syfon powietrznych. Napełnij ostatni port wszystkich studzienek pożywką, jak pokazano na rysunku 2.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Wkład do testu stresu mitochondrialnego i jego porty iniekcji. Obraz przedstawia wkład testu stresu mitochondrialnego oraz powiększony obraz pokazujący ładowanie poszczególnych leków/pożywki do portów. Skrót: FCCP = p-trifluorometoksyfenylohydrazon karbonylocyjanku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przeprowadzanie testu stresu mitochondrialnego

  1. Włącz analizator metaboliczny i komputer, otwórz oprogramowanie Wave i kliknij Heater On, aby ustawić urządzenie w temperaturze 37 °C co najmniej 5 godzin wcześniej. Po osiągnięciu temperatury w lewym dolnym rogu oprogramowania fali pojawia się komunikat gotowy.
  2. Otwórz szablon zestawu do testowania stresu mitochondrialnego w oprogramowaniu. Kliknij Definicja grupy na górnym pasku menu.
  3. Oddzielnie wstępnie ustaw każdą definicję po lewej stronie, taką jak strategie wstrzykiwania, obróbka wstępna, podłoża testowe i typy komórek (użyty biomateriał).
  4. Kliknij strategie iniekcji po lewej stronie, a następnie kliknij Dodaj i nazwij warunek wstrzyknięcia jako Ludzkie neutrofile / Neutrofile myszy / HL60. Wybierz port A-D, klikając na każdy z nich, a następnie kliknij Dodaj związek i wprowadź oligomycynę/FCCP/rotenonową antymycynę A o odpowiednich stężeniach (Tabela 1).
  5. Kliknij obróbkę wstępną po lewej stronie, a następnie kliknij Dodaj i nazwij je osobno jako CD18 i Cell Tak. Kliknij na użyty biomateriał po lewej stronie, a następnie kliknij Dodaj i nazwij je jako neutrofile ludzkie, neutrofile myszy i HL60/dHL60 z gęstością wysiewu.
  6. Zdefiniuj grupy, klikając Dodaj grupę (np. dla testu na obecność neutrofili u ludzi) i klikając definicję leżącą u jego podstaw (np. Strategie iniekcji zgodnie z tabelą 1 - Neutrofile ludzkie, Leczenie wstępne jako CD18 i typ komórki jako neutrofile ludzkie).
  7. Kliknij na Mapa tablic w górnym menu, aby obserwować wszystkie grupy, z definicjami po lewej stronie i mapą tablic po prawej. Przeciągnij i upuść, aby dodać każdą studnię do grupy, zachowując cztery narożne studzienki jako tło (domyślnie).
  8. Ustaw protokół, klikając Protokół w górnym menu i zdefiniuj trzy cykle mieszaniny linii podstawowej, oligomycyny, FCCP, rotenonu i antymycyny A, ustawiając czas mieszania na 3 min, odpoczynku na 0 min i pomiaru na 7 min.
  9. Przejdź do strony Uruchom test, podaj informacje podsumowujące projekt w celach informacyjnych, a następnie kliknij przycisk Rozpocznij uruchamianie.
  10. Podaj lokalizację do zapisania plików, aby wszystkie wyniki zostały zapisane po zakończeniu testu.
  11. Po automatycznym załadowaniu testu poczekaj, aż taca się otworzy, aby umieścić wkład czujnika i płytkę z 200 μl kalibru (krok 1.1). Ustaw kierunek kodu kreskowego kasety skierowany w prawo. Uruchom kalibrację, klikając przycisk Jestem gotowy, co zajmuje około 20 minut.
  12. Po kalibracji kliknij Otwórz zasobnik. Zastąp płytkę płytką z nasionami komórek i kliknij płytkę z ogniwem obciążnikowym, aby kontynuować test.
  13. Po zakończeniu testu dane są automatycznie zapisywane. Kliknij Wyświetl wyniki i wyeksportuj je jako arkusz kalkulacyjny lub inny plik oprogramowania analitycznego.
  14. Wykres i analiza danych (Rysunek 3 i Rysunek 4).
  15. Oblicz parametry oddychania, w tym podstawowe oddychanie mitochondrialne, oddychanie sprzężone z protonami, oddychanie sprzężone z ATP, maksymalne oddychanie, zapasową pojemność oddechową i oddychanie niemitochondrialne (Rysunek 4A)38,39,40,41.
    1. Oblicz podstawowe oddychanie mitochondrialne, odejmując wartość OCR zmierzoną po dodaniu mieszaniny rotenonu/antymycyny A z OCR przed wstrzyknięciem oligomycyny (Rysunek 4A, a).
    2. Oblicz oddychanie sprzężone z wyciekiem protonów, odejmując wartość OCR po wstrzyknięciu mieszaniny rotenonu/antymycyny A od wartości OCR zmierzonej po wstrzyknięciu oligomycyny (Rysunek 4A,b).
    3. Oszacuj oddychanie związane z ATP, obliczając różnicę między podstawowym oddychaniem mitochondrialnym a oddychaniem sprzężonym z wyciekiem protonów. Odejmij pierwszą wartość OCR zmierzoną po wstrzyknięciu oligomycyny od pierwszej wartości OCR przed wstrzyknięciem oligomycyny (Rysunek 4A,c).
    4. Maksymalne oddychanie to maksymalna szybkość oddychania, jaką komórka może osiągnąć po dodaniu FCCP. Oblicz to, odejmując wartość OCR po wstrzyknięciu mieszaniny rotenonu/antymycyny A od wartości OCR zmierzonej po wstrzyknięciu FCCP (Rysunek 4A,d).
    5. Wolna wydolność oddechowa odnosi się do zdolności komórki do zaspokojenia wyższego zapotrzebowania na energię przez OXPHOS. Oblicz to, znajdując różnicę między maksymalnym oddechem a podstawowym oddychaniem mitochondrialnym (Rysunek 4A, e).
    6. Oddychanie niemitochondrialne to ilość tlenu zużywanego przez źródła niemitochondrialne. Zmierz to po dodaniu mieszaniny rotenonu i antymycyny A (Rysunek 4A,f).
  16. Przeprowadź analizę statystyczną za pomocą testu t-Studenta, aby porównać różne parametry oddychania niezróżnicowanych i zróżnicowanych komórek HL60. Uznajmy, że p < 0,05 jest statystycznie istotne.
    UWAGA: Powtórzenia z wartościami OCR lub ECAR poniżej zera są uważane za błąd w przygotowaniu próbki, wstrzyknięciu związku lub pomiarze. Są one wyłączone z przyszłych analiz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywna dynamika OCR wskazuje na zmiany w oddychaniu mitochondrialnym w odpowiedzi na oligomycynę, FCCP i rotenon/antymycynę Mieszanina mysich neutrofili (Rysunek 3A), ludzkie neutrofile (Rysunek 3B) oraz niezróżnicowane i zróżnicowane komórki HL60 (Rysunek 3C). We wszystkich komórkach leczenie oligomycyną zmniejsza wartość OCR poprzez hamowanie kanału protonowego syntazy ATP; Leczenie FCCP przywraca wartość OCR poprzez zwiększenie przepływu elektronów i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standardowa procedura, która mierzy oddychanie mitochondrialne neutrofili za pomocą metabolicznego analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, jest ograniczona przez wiele czynników, w tym liczbę komórek, wzrost komórek i żywotność. Stężenie każdego związku różni się w zależności od typu i źródła komórek w tym teście. Oligomycyna i rotenon/antymycyna A są najczęściej stosowane w podobnym stężeniu wśród większości typów komórek. Ponieważ jednak maksymalna częstość oddechów wywołana przez FCCP różni się w zależności od róż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Anthony T. Vella i dr Federice Aglianoin z Wydziału Immunologii UConn Health za ich szkolenie w zakresie korzystania z analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego, oraz dr Lynn Puddington z Wydziału Immunologii UConn Health za jej wsparcie dla tych instrumentów. Dziękujemy dr Genewie Hargis z UConn School of Medicine za jej pomoc w pisaniu naukowym i redagowaniu tego manuskryptu. Badania te były wspierane przez granty z National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 i P20GM139763), fundusz startowy z UConn Health oraz stypendium Career Re-entry od American Association of Immunologs.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
37 &stopnie; C bez CO2  inkubatorPrecisionEconomy Model 2EGInstrument
BiorenderSoftware
Application CentrifugeEppendorfModel 5810RInstrument
Corning  Cell-Tak Klej do komórek i tkanekOdczynnik Corning102416-100
Magnes EasySepMagnesSTEMCELL18000
Zestaw do wzbogacania neutrofili EasySepMouse OdczynnikiGraphpad
Prism 9Aplikacja oprogramowania
Roztwór albuminy ludzkiej surowicy (25%)Odczynniki
Ketamina (VetaKet)DAILYMEDNDC 59399-114-10Znieczulenie
PBSCytivaSH30256.01Odczynniki
Wiadra na talerzeAkcesoriumEppendorfUL155
PolymorphPrepPROGEN1895 (poprzedni 1114683)roztwór polisacharydowy
Oczyszczone mysie przeciwciało anty-ludzkie CD18Biolegend302102Klon TS1/18
RPMI 1640 MediumGibco11-875-093Odczynniki
Analizator metabolicznego strumienia zewnątrzkomórkowego konika morskiegoInstrument AgilentXFe96
Zestaw do testów wysiłkowych Seahorse XF Cell MitoZestaw do testu wysiłkowego mitochondriówAgilent103015-100
WirnikEppendorfA-4-62Rotor
Vactrap 2 Pułapka próżniowaFox Nauki biologiczne3052101-FLSAplikacja oprogramowania Instrument
Wave
XF 1.0 M Roztwór glukozyAgilent103577-100Odczynnik
XF 100 mM Roztwór pirogronianuAgilent103578-100Odczynnik
XF 200 mM Roztwór glutaminyAgilent103579-100Odczynnik
XF DMEM mediumAgilent103575-100Odczynnik
XFe96 FluxPakAgilent102601-100Materiał
Ksylazyna (AnaSed Injection)DAILYMEDNDC 59399-110-20Znieczulenie
GeminiBio 800-120 wahadłowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136(2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858(2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472(2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521(2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121(2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444(2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586(2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487(2021).
  30. Zhang, Z. -W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907(2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850(2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465(2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656(2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845(2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975(2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079(2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019).
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899(2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech. , Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020).
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608(2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856(2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099(2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306(2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oddychanie mitochondrialnebioenergetyka neutrofilitempo zu ycia tlenuanaliza strumienia metabolicznegoanalizator strumienia zewn trzkom rkowegotest stresu mitochondrialnegokom rki HL60fosforylacja oksydacyjnaa cuch transportu elektron woddychanie podstawowe

Powiązane artykuły