Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili

3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64971

⸱

2 czerwca 2023

 ,  , 
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy stopniowe protokoły mierzące oddychanie mitochondrialne mysich i ludzkich neutrofili oraz komórek HL60 za pomocą analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego.

Streszczenie

Neutrofile są pierwszą linią obrony i najliczniejszymi leukocytami u ludzi. Te komórki efektorowe pełnią takie funkcje, jak fagocytoza i wybuch oksydacyjny, a także tworzą zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofili (NET) w celu usunięcia drobnoustrojów. Nowe informacje na temat aktywności metabolicznej neutrofili podważają wczesną koncepcję, że opierają się one głównie na glikolizie. Precyzyjny pomiar aktywności metabolicznej może ujawnić różne wymagania metaboliczne neutrofili, w tym cykl kwasu trikarboksylowego (TCA) (znany również jako cykl Krebsa), fosforylację oksydacyjną (OXPHOS), szlak pentozofosforanowy (PPP) i utlenianie kwasów tłuszczowych (FAO) w warunkach fizjologicznych i w stanach chorobowych. W tym artykule opisano krok po kroku protokół i wymagania wstępne dotyczące pomiaru wskaźnika zużycia tlenu (OCR) jako wskaźnika oddychania mitochondrialnego na neutrofilach pochodzących ze szpiku kostnego myszy, neutrofilach pochodzących z ludzkiej krwi i neutrofilopodobnej linii komórkowej HL60 podobnej do neutrofili, przy użyciu analizy strumienia metabolicznego na analizatorze strumienia metabolicznego zewnątrzkomórkowego. Metoda ta może być stosowana do ilościowego określania funkcji mitochondrialnych neutrofili w warunkach normalnych i chorobowych.

Wprowadzenie

Mitochondria odgrywają główną rolę w bioenergetyce komórek, która wytwarza adenozynotrójfosforan (ATP) poprzez fosforylację oksydacyjną (OXPHOS). Oprócz tego rola mitochondriów rozciąga się na wytwarzanie i detoksykację reaktywnych form tlenu, cytoplazmatyczną i mitochondrialną macierz regulację wapnia, syntezę komórkową, katabolizm i transport metabolitów w komórce1. Oddychanie mitochondrialne jest niezbędne we wszystkich komórkach, ponieważ ich dysfunkcja może powodować problemy metaboliczne2, w tym choroby sercowo-naczyniowe3 i wiele innych chorób neurodegeneracyjnych, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem4, choroby Parkinsona i Alzheimera5 oraz choroba Charcota-Marie-Tootha 2 A (CMT2A)6.

Badania mikroskopowe neutrofili wykazały, że mitochondriów jest stosunkowo niewiele7, a ich produkcja energii opiera się głównie na glikolizie, ponieważ tempo oddychania mitochondriów jest bardzo niskie8. Jednak mitochondria mają kluczowe znaczenie dla funkcji neutrofili, takich jak chemotaksja9 i apoptoza10,11,12. Poprzednie badanie ujawniło złożoną sieć mitochondrialną w ludzkich neutrofilach o wysokim potencjale błonowym. Utrata potencjału błony mitochondrialnej jest wczesnym wskaźnikiem apoptozy neutrofili10. Leczenie mitochondrialnym cyjankiem karbonylu cyjanku m-chlorofenylu (CCCP) wykazało znaczące hamowanie chemotaksji, wraz ze zmianą morfologii mitochondriów9,10.

Chociaż głównym źródłem energii dla neutrofili jest glikoliza, mitochondria dostarczają ATP, które inicjuje aktywację neutrofili poprzez napędzanie pierwszej fazy sygnalizacji purynergicznej, która wzmacnia sygnalizację Ca2+, wzmacnia produkcję ATP w mitochondriach i inicjuje funkcjonalne reakcje neutrofili13. Dysfunkcja mitochondrialnego łańcucha oddechowego powoduje nadmierną produkcję toksycznych reaktywnych form tlenu (ROS) i prowadzi do uszkodzeń chorobotwórczych14,15,16. NEToza, czyli proces tworzenia zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET), jest kluczową właściwością neutrofili, która pomaga im w walce z patogenami17 i przyczynia się do wielu stanów patologicznych, w tym raka, zakrzepicy i zaburzeń autoimmunologicznych18. ROS pochodzące z mitochondriów przyczyniają się do NETosis19, mitochondrialne DNA może być składnikiem NETs18, a zmieniona homeostaza mitochondriów upośledza NETosis20,21,22,23,24. Ponadto, podczas normalnego różnicowania lub dojrzewania, przeprogramowanie metaboliczne neutrofili zostaje odwrócone poprzez ograniczenie aktywności glikolitycznej i angażują się one w oddychanie mitochondrialne i mobilizują wewnątrzkomórkowe lipidy25,26.

Analizator metabolicznego strumienia zewnątrzkomórkowego może stale monitorować i określać ilościowo oddychanie mitochondrialne i glikolizę żywych komórek. Analizator wykorzystuje 96-dołkowy wkład czujnika w formacie płytki i dwa fluorofory do ilościowego określania stężenia tlenu (O2) i zmian pH. Wkład czujnika znajduje się nad monowarstwą komórki podczas testu i tworzy mikrokomorę o wysokości ~200 nm. Wiązki światłowodów w analizatorze służą do wzbudzania fluoroforów i wykrywania zmian intensywności fluorescencji. Zmiany stężeniaO2 i pH w czasie rzeczywistym są automatycznie obliczane i pokazywane jako wskaźnik zużycia tlenu (OCR) i wskaźnik zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR). Na kartridżu czujnika znajdują się cztery porty, które umożliwiają załadowanie do czterech związków do każdego dołka podczas pomiarów testowych. Protokół ten koncentruje się na ilościowym określeniu oddychania mitochondrialnego neutrofili myszy i ludzi, a także neutrofilopodobnych komórek HL60, przy użyciu analizatora metabolicznego strumienia zewnątrzkomórkowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki pełnej krwi z dodatkiem heparyny pobrano od zdrowych dawców ludzi po uzyskaniu świadomej zgody, zgodnie z zatwierdzeniem przez Institutional Review Board UConn Health oraz zgodnie z Deklaracją Helsińską. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) UConn Health, a zgodę na wykorzystanie gryzoni uzyskano z IACUC UConn Health zgodnie z kryteriami opisanymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals National Institutes of Health. W badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6 w wieku 6 tygodni.

1. Przygotowanie płytki 96-dołkowej do analizy metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego

  1. Wkład sensorowy jest zapakowany na górze specjalnie zaprojektowanej płytki 96-dołkowej do metabolicznego pomiaru strumienia zewnątrzkomórkowego. Nawilż wkład, ostrożnie go podnosząc i wlewając 200 µL/well medium kalibracyjnego do każdego dołka znajdującej się poniżej płytki. Umieść wkład na płytce z kalibrantem w inkubatorze bez CO2, w warunkach wysokiej wilgotności i w temperaturze 37 °C na noc w celu nawodnienia.
  2. W zależności od typu komórek zastosuj odpowiednią powłokę dla płytki hodowlanej, aby zapewnić adhezję komórek. W przypadku neutrofili ludzkich – niediferencjonowanych i zróżnicowanych komórek HL60 – pokryj płytkę 96-dołkową sterylnym solanki fosforanową (PBS) zawierającą 50 µL oczyszczonego przeciwciała mysiego anty-ludzkiego CD18 (klon TS1/18) w stężeniu 5 µg/mL w temperaturze 4 °C przez noc. W przypadku neutrofili mysich pokryj płytkę 96-dołkową 25 µL Cell Tak w stężeniu 22,4 µg/mL przy pH 8,0 w 0,1 M NaHCO3 w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 min.
  3. Przemyj płytki dwukrotnie 200 µL sterylnego PBS.
  4. Dodaj pełne medium do narożnych dołków (A1, A12, H1 i H12) płytki do hodowli komórek (bez komórek) w celu korekcji tła podczas wysiewania komórek.
    UWAGA: Parowanie podczas powlekania i kalibracji może wpłynąć na objętość mediów kalibracyjnych i normalizację. Użyj tacki lub komory z nasączoną sterylną wodą chusteczką i umieść nad nią płytkę z kalibrantem, aby zapobiec parowaniu.

2. Przygotowanie i wysiew komórek

  1. Przygotowanie pożywki do analizy
    1. Przygotuj pożywkę do analizy, dodając 1 mM pirogronianu, 10 mM glukozy i 2 mM glutaminy do pożywki DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium).
  2. Izolacja neutrofili mysich z szpiku kostnego
    1. Izoluj neutrofile mysie z szpiku kostnego, używając zestawu Mouse Neutrophil Enrichment Kit, zgodnie z instrukcją producenta.
    2. Uśpij myszy poprzez doszpikowe (i.p.) wstrzyknięcie ketaminy (125 mg/kg) i ksylazyny (12,5 mg/kg), a następnie poddaj je eutanazji poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych.
    3. Pobierz kości udowe i piszczelowe, zgodnie z wcześniejszym opisem27. W skrócie: rozetnij skórę, aby odsłonić kończynę wraz z mięśniami. Przetnij staw biodrowy, aby oddzielić kończynę od ciała. Następnie usuń mięśnie, aby wydobyć kość udową i piszczelową.
    4. Odciśnij węższe końce kości udowych i piszczelowych. Trzymając odcięte końce skierowane w dół, umieść je w probówce wirówkowej 0,5 mL z dwoma otworami wykonanymi igłą 25 G w dnie, a następnie umieść probówkę 0,5 mL w probówce wirówkowej 1,5 mL (Rysunek 1A). Dodaj 50 µL PBS do probówki 0,5 mL, aby zapobiec wysychaniu komórek szpiku kostnego.
    5. Wirować przy 5 900 × g w temperaturze pokojowej (RT) przez 15 s, aby zebrać szpik kostny na dnie probówki 1,5 mL. Resuspenduj komórki szpiku kostnego w 1 mL DMEM. Dodaj 50 µL surowicy szczurzej z zestawu, delikatnie wymieszaj pipetując i przenieś zawiesinę komórkową do polistyrenowej probówki hodowlanej 5 mL.
    6. Dodaj 50 µL koktajlu wzbogacającego z zestawu Mouse Neutrophil Enrichment Kit i inkubuj przez 15 min w RT. Wirować przy 300 × g w RT przez 5 min.
    7. Resuspenduj komórki w 1 mL DMEM, dodaj 50 µL koktajlu selekcyjnego z biotyną z zestawu, delikatnie wymieszaj pipetując i inkubuj przez 15 min w RT.
    8. Dodaj 150 µL wymieszanych w wortexie cząstek magnetycznych z zestawu, delikatnie wymieszaj pipetując i inkubuj przez 10 min w RT.
    9. Dodaj ok. 1,3 mL DMEM, delikatnie wymieszaj pipetując, umieść probówkę w magnesie na 3 min, a następnie przenieś nadsącz zawierający oczyszczone neutrofile mysie do nowej polistyrenowej probówki hodowlanej 5 mL, odwracając oryginalną probówkę wraz z magnesem.
    10. Wirować przy 300 × g w RT przez 5 min. Po usunięciu nadsączu za pomocą aspiratora próżniowego, resuspenduj komórki w 1 mL pożywki do analizy.
    11. Policz komórki ręcznie za pomocą komory hemocytometrycznej.
    12. Dostosuj gęstość komórek do 1,1 × 106 komórek/mL poprzez dodanie pożywki do analizy, wysiej 180 µL zawiesiny neutrofili mysich (2 × 105 komórek) na studzienkę w przygotowanej płytce 96-dołkowej (kroki 1.2-1.4) i wiruj płytkę przy 300 × g w RT przez 3 min bez hamowania, aby zapewnić prawidłową adhezję komórek do dna płytki.
    13. Inkubuj płytkę w inkubatorze bez CO2, nawilżanym, w temperaturze 37 °C przez 1 h, aby wstępnie wyrównać stan komórek z pożywką do analizy.
      UWAGA: Czystość neutrofili jest kluczowa dla analizy, ponieważ może stanowić potencjalne źródło błędu. Czystość izolacji neutrofili mysich przy tym protokole wynosi 69,9%–88,7%. Istnieją inne metody izolacji neutrofili z mysiego szpiku kostnego, takie jak wirowanie w gradiencie gęstości28. Dostępne są również alternatywne zestawy do izolacji neutrofili od innych dostawców, oparte na negatywnej selekcji magnetycznej z użyciem przeciwciał monoklonalnych przeciwko antygenom, które nie są ekspresowane na neutrofilach.
  3. Izolacja neutrofili ludzkich z krwi obwodowej
    1. Dodaj 8 mL roztworu polisacharydowego do probówki wirówkowej 15 mL, a następnie nałóż 4 mL krwi obwodowej na powierzchnię roztworu polisacharydowego bez mieszania.
    2. Wirować przy 550 × g w temperaturze 20 °C przez 30 min. Ustaw hamowanie rotora na stopień 1.
      UWAGA: Czas separacji neutrofili może się różnić w zależności od dawcy. Wynosi on minimum 30 min, a w przypadku niepowodzenia separacji neutrofili może być wymagane dodatkowe 10–20 min.
    3. Obserwuj separację osocza/płytek krwi i komórek mononuklearnych po wirowaniu, jak pokazano na Rysunku 1B. Ostrożnie usuń górną żółtą warstwę cieczy (osocze i płytki) oraz górny mętny pas (komórki mononuklearne), nie naruszając dolnego mętnego pasa (neutrofile), używając pipety 1 mL.
    4. Zbierz dolny mętny pas i ok. 3–4 mL przejrzystej cieczy znajdującej się poniżej do nowej probówki wirówkowej 15 mL zawierającej 10 mL PBS.
    5. Wirować przy 400 × g w temperaturze 20 °C przez 10 min i usuń nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego.
    6. Resuspenduj komórki w 5 mL PBS i wiruj przy 300 × g w temperaturze 20 °C przez 5 min.
    7. Po usunięciu nadsączu, resuspenduj komórki w 1 mL pożywki do analizy.
    8. Policz komórki ręcznie za pomocą komory hemocytometrycznej.
      UWAGA: Ponieważ erytrocyty w krwi nie posiadają mitochondriów, zanieczyszczenie erytrocytami nie wpływa na test stresu mitochondrialnego i zapobiega aktywacji/primingowi neutrofili29,30. Aby uzyskać dokładne stężenie neutrofili, erytrocyty muszą zostać poddane lizie podczas liczenia komórek. Dodaj 10 µL zawiesiny komórkowej do 891 µL wody dejonizowanej na 10–30 s w celu lityzacji erytrocytów, a następnie dodaj 99 µL 10x PBS, aby zrównoważyć ciśnienie osmotyczne i uniknąć lityzacji neutrofili.
    9. Dostosuj gęstość komórek do 2,2 × 106 komórek/mL poprzez dodanie pożywki do analizy, wysiej 180 µL neutrofili ludzkich (ok. 4 × 105) na studzienkę w przygotowanej płytce 96-dołkowej i wiruj płytkę przy 300 × g w RT przez 3 min bez hamowania, aby zapewnić prawidłową adhezję komórek do dna płytki.
    10. Inkubuj płytkę w inkubatorze bez CO2, nawilżanym, w temperaturze 37 °C przez 1 h, aby wstępnie wyrównać stan komórek z pożywką do analizy.
      UWAGA: Czystość neutrofili jest kluczowa dla analizy, ponieważ może stanowić potencjalne źródło błędu. Czystość izolacji neutrofili ludzkich wynosi 86,6%–96,8%. Istnieją inne metody wirowania w gradiencie gęstości do izolacji neutrofili z ludzkiej krwi, w tym izolacja Percollem oraz połączenie izolacji Ficollm i sedymentacji dekstranem31.
  4. Kultura komórek HL60 i różnicowanie w kierunku neutrofili
    1. Hoduj komórki HL60 w pożywce RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute), zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 µg/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny i 250 ng/mL amfoterycyny B w temperaturze 37 °C i 5% CO2.
    2. Aby uzyskać różnicowanie w kierunku neutrofili, utrzymuj komórki HL60 (komórki w zawiesinie) w kolbie T25 przy gęstości 1 × 105 komórek/mL w pożywce RPMI-1640 zawierającej 10% FBS, 100 µg/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny, 250 ng/mL amfoterycyny B oraz 1,3% dimetylosulfotlenku (DMSO) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 6 dni.
    3. W dniu przeprowadzenia analizy policz komórki ręcznie za pomocą komory hemocytometrycznej, wiruj zróżnicowane lub niezróżnicowane komórki HL60 przy 300 × g w RT przez 5 min, przemyj raz pożywką DMEM i resuspenduj komórki w pożywce do analizy, aby uzyskać gęstość komórek 1,39 × 106 komórek/mL.
    4. Wysiej 180 µL zróżnicowanych lub niezróżnicowanych komórek HL60 (ok. 2,5 × 105) na studzienkę w przygotowanej płytce 96-dołkowej i wiruj płytkę przy 300 × g w RT przez 3 min bez hamowania, aby zapewnić prawidłową adhezję komórek do dna płytki.
    5. Inkubuj płytkę w inkubatorze bez CO2, nawilżanym, w temperaturze 37 °C przez 1 h, aby wstępnie wyrównać stan komórek z pożywką do analizy.
      UWAGA: Przed kolejnym krokiem potwierdź całkowitą adhezję komórek za pomocą mikroskopu.

Izolacja neutrofili z szpiku kostnego myszy i krwi ludzkiej, schemat krok po kroku procesu wirowania.
Rycina 1: Schemat izolacji komórek szpiku kostnego i neutrofili. (A) Pozyskiwanie komórek szpiku kostnego od myszy oraz (B) izolacja neutrofili z krwi ludzkiej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Typ komórkiLiczba komórek na studzienkęZwiązki/OdczynnikiStężenie roztworu roboczegoObjętość wtrysku do portówStężenie końcowe w studzienkach
Neutrofile mysie2 × 105Oligomycyna25 µM20 µL2.5 µM
FCCP7.5 µM17.6 µL0.61 µM
mieszanina rotenonu i antymycyny A10 µM24 µL1 µM
Neutrofile ludzkie4 × 105Oligomycyna10 µM20 µL1 µM
FCCP12.5 µM22 µL1.25 µM
mieszanina rotenonu i antymycyny A10 µM24 µL1 µM
Nieróżnicowane lub zróżnicowane komórki HL602.5 × 105Oligomycyna25 µM20 µL2.5 µM
FCCP15 µM22 µL1.5 µM
mieszanina rotenonu i antymycyny A10 µM24 µL1 µM

Tabela 1: Liczba komórek i stężenia odczynników dla testu stresu mitochondrialnego.

3. Przygotowanie związków w zestawie do testu stresu mitochondrialnego

  1. Otwórz zestaw do testu stresu mitochondrialnego i przygotuj odczynniki.
    UWAGA: Różne stężenia roztworów roboczych, objętości iniekcji do studzienek oraz stężenia końcowe w studzienkach oligomycyny, karbonylocyjanidku p-trifluorometoksyfenylohydrazony (FCCP) oraz mieszaniny rotenonu/antymycyny A stosowane dla neutrofilów mysich, neutrofilów ludzkich i komórek HL60 przedstawiono w Tabeli 1.
    1. Przygotuj roztwór zapasowy oligomycyny, rozpuszczając oligomycynę w 630 µL medium do analizy, aby uzyskać roztwór zapasowy o stężeniu 100 µM.
      UWAGA: Zaleca się użycie roztworu zapasowego w dniu przygotowania.
      1. Przygotuj roztwór roboczy oligomycyny do analiz neutrofilów mysich i komórek HL60, mieszając 630 µL roztworu zapasowego z 1 890 µL medium do analizy, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 25 µM.
      2. Przygotuj roztwór roboczy oligomycyny do analizy neutrofilów ludzkich, mieszając 300 µL roztworu zapasowego z 2 700 µL medium do analizy, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 10 µM.
        UWAGA: Wiązanie oligomycyny do podjednostki podstawy Fo syntazy ATP (ATP-azy Fo/F1) zapobiega powrotowi protonów do mitochondriów i hamuje syntezę ATP32. Znacząco redukuje to przepływ elektronów przez łańcuch transportu elektronów oraz OCR. Przepływ elektronów nie zostaje jednak całkowicie zatrzymany ze względu na przeciek protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną33.
    2. Przygotuj roztwór zapasowy FCCP, rozpuszczając FCCP w 720 µL medium do analizy, aby uzyskać roztwór zapasowy o stężeniu 100 µM.
      1. Przygotuj roztwór roboczy do analizy neutrofilów mysich, mieszając 300 µL roztworu zapasowego z 3 700 µL medium do analizy, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 7,5 µM.
      2. Przygotuj roztwór roboczy do analizy neutrofilów ludzkich, mieszając 375 µL roztworu zapasowego z 2 625 µL medium do analizy, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 12,5 µM.
      3. Przygotuj roztwór roboczy do analizy komórek HL60, mieszając 720 µL roztworu zapasowego z 4 080 µL medium do analizy, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 15 µM.
        UWAGA: Dodatek FCCP pozwala określić maksymalną zdolność mitochondriów do wykorzystania OXPHOS. Jest to rozpuszczalna w lipidach, słaba kwasa przenikająca do mitochondriów, co skutkuje rozproszeniem potencjału transmembrane. Rozładowanie gradientu protonowego przez wewnętrzną błonę mitochondrialną i odwrócenie strumienia protonów od syntazy ATP Fo/F1 prowadzi do rozprzęgania mitochondrialnego. Efekt rozprzęgania ten gwałtownie zwiększa mitochondrialne zużycie tlenu w celu zachowania gradientu protonowego34.
    3. Przygotuj roztwór zapasowy rotenonu/antymycyny A, rozpuszczając mieszaninę rotenonu/antymycyny A w 540 µL medium do analizy, aby uzyskać roztwór zapasowy o stężeniu 50 µM.
      1. Przygotuj roztwór roboczy rotenonu/antymycyny A do wszystkich analiz, mieszając 540 µL roztworu zapasowego z 2 160 µL medium do analizy, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 10 µM.
        UWAGA: Rotenon blokuje kompleks I, hamując przekazywanie elektronów z centrów żelazowo-siarkowych w kompleksie I do ubichinonu, podczas gdy antymycyna A blokuje kompleks III łańcucha transportu elektronów, co prowadzi do blokady OXPHOS z ograniczoną syntezą ATP35. W ten sposób wykazane zostaje oddychanie niemitochondrialne36,37.
  2. Napełnij kartridż odczynnikami; wprowadź przygotowaną oligomycynę, FCCP oraz mieszaninę rotenonu/antymycyny A odpowiednio do portów A, B i C w kartridżu do iniekcji (Rycina 2). Aby ułatwić wprowadzanie odczynników do portów, użyj dołączonej do kartridża wkładki szablonowej. Niewykorzystane porty wypełnij 20 µL medium do analizy.
    1. W przypadku analizy neutrofilów mysich, wprowadź do portów A 20 µL oligomycyny (25 µM; każda studzienka płytki 96-dołkowej zawiera na początku 180 µL medium do analizy, zatem stężenie końcowe wynosi 2,5 µM). Wprowadź do portów B 17,6 µL FCCP (7,5 µM; stężenie końcowe: ~0,61 µM). Wprowadź do portów C 24 µL mieszaniny rotenonu/antymycyny A (10 µM; stężenie końcowe: ~1 µM).
    2. W przypadku analizy neutrofilów ludzkich, wprowadź do portów A 20 µL oligomycyny (10 µM; każda studzienka płytki 96-dołkowej zawiera na początku 180 µL medium do analizy, zatem stężenie końcowe wynosi 1 µM). Wprowadź do portów B 22 µL FCCP (12,5 µM; stężenie końcowe: ~1,25 µM). Wprowadź do portów C 24 µL mieszaniny rotenonu/antymycyny A (10 µM; stężenie końcowe: ~1 µM).
    3. W przypadku analizy komórek HL60 i dHL60, wprowadź do portów A 20 µL oligomycyny (25 µM; każda studzienka płytki 96-dołkowej zawiera na początku 180 µL medium do analizy, zatem stężenie końcowe wynosi 2,5 µM). Wprowadź do portów B 22 µL FCCP (15 µM; stężenie końcowe: ~1,5 µM). Wprowadź do portów C 24 µL mieszaniny rotenonu/antymycyny A (10 µM; stężenie końcowe: ~1 µM).
      UWAGA: Pipetuj roztwór leku do portu, nie dotykając dna portu. Nie uderzaj płytką po napełnieniu, aby uniknąć wycieków, ponieważ ciecze są utrzymywane przez siły kapilarne. Studzienki tła płytki hodowlanej oraz porty w kartridżu z czujnikiem są napełniane medium do analizy lub tym samym odczynnikiem w portach, co w studzienkach z próbką, aby znormalizować wpływ odczynników na wartości tła. Odczynniki należy dodawać do odpowiednich portów bez podnoszenia kartridża z płytki pomocniczej zawierającej kalibrant, aby uniknąć uwięzienia powietrza. Ostatni port wszystkich studzienek wypełnij medium, jak pokazano na Rycinie 2.

Układ analizy na mikropłytce; analiza enzymów; pipetowanie preparatów; konfiguracja testowania leków.
Rysunek 2: Kaseta do analizy stresu mitochondrialnego oraz jej porty wtryskowe.Na obrazie przedstawiono kasetę do analizy stresu mitochondrialnego oraz powiększony widok pokazujący wprowadzanie poszczególnych leków/pośredek do portów. Skrót: FCCP = karbonylocyjanek p-trifluorometoksyfenylohydrazonu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

4. Wykonanie testu stresu mitochondrialnego

  1. Włącz analizator metaboliczny oraz komputer, otwórz Fala oprogramowania, a następnie kliknij Grzałka włączona aby ustawić urządzenie na 37 °C przynajmniej 5 godz. wcześniej. Po osiągnięciu wymaganej temperatury w lewym dolnym rogu oprogramowania Wave pojawi się Jestem gotowy. Proszę o przesłanie tekstu źródłowego do tłumaczenia..
  2. Otwórz w oprogramowaniu szablon dla zestawu do analizy stresu mitochondrialnego. Kliknij w Definicja grup na górnym pasku menu.
  3. Osobno przygotuj każdą definicję po lewej stronie, taką jak strategie iniekcji, przygotowania wstępne, podłoża do analiz oraz typy komórek (użyty biomateriał).
  4. Kliknij w strategie wstrzykiwania po lewej stronie, następnie kliknij Dodaj i nazwać warunki wtrysku jako Neutrofile ludzkie/Neutrofile mysie/HL60Wybierz port A-D poprzez kliknięcie każdego z nich i kliknięcie w Dodaj związek i zatwierdź Oligomycyna/FCCP/Rotenon Antymycyna A z odpowiednimi stężeniami (Tabela 1).
  5. Kliknij w obróbka wstępna po lewej stronie, następnie kliknij Dodaj i nazwać je jako CD18 i Linia komórkowa Tak osobno. Kliknij w biomateriał użyty po lewej stronie, następnie kliknij w Dodać i nazwać je jako Neutrofile ludzkie, Neutrofile mysie, i HL60/dHL60 z gęstość wysiewu.
  6. Zdefiniuj grupy, klikając w Dodaj grupę (np. dla testu z ludzkimi neutrofilami) oraz poprzez kliknięcie definicji, która leży u jego podstaw (np. Strategie wstrzykiwania zgodnie z Tabela 1–Ludzkie neutrofile, Obróbka wstępna jako CD18, i typ komórki Jako Neutrofile ludzkie).
  7. Kliknij w Układ płytki w górnym menu, aby przejrzeć wszystkie grupy, z definicjami po lewej stronie i mapą płytki po prawej. Przeciągnij i upuść, aby dodać każdą studzienkę do grupy, zachowując cztery studzienki narożne jako Wstęp Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.
  8. Skonfiguruj protokół, klikając w Protokół w górnym menu i zdefiniuj trzy cykle linii bazowej, oligomycyny, FCCP oraz mieszaniny rotenonu i antymycyny A, ustawiając czas na Wymieszaj przez 3 min, Odpoczynek jako 0 min, i Pomiar przez 7 min.
  9. Przejdź do Przeprowadzenie analizy strona, udostępnij informacje o podsumowaniu projektu w celach referencyjnych i kliknij w Rozpocznij przebieg.
  10. Wskaż lokalizację zapisu plików, aby po zakończeniu analizy wszystkie wyniki zostały zapisane.
  11. Po automatycznym ładowaniu analizy należy poczekać na otwarcie tacki, aby umieścić w niej wkład z sensorem oraz płytkę z 200 µL kalibratora (krok 1.1). Ustaw kartridż tak, aby kod kreskowy był skierowany w prawo. Uruchom kalibrację, klikając w Jestem gotowyco trwa około 20 min.
  12. Po przeprowadzeniu kalibracji kliknij w Otwórz tackęZastąp płytkę płytką z wysianymi komórkami i kliknij Płyta ogniwa obciążnikowego aby kontynuować analizę.
  13. Po zakończeniu analizy dane są zapisywane automatycznie. Kliknij w Wyświetl wyniki i wyeksportować go jako arkusz kalkulacyjny lub plik innego oprogramowania analitycznego.
  14. Wykres i analiza danych (Rysunek 3 i Rycina 4).
  15. Oblicz parametry oddychania, w tym podstawowe oddychanie mitochondrialne, oddychanie związane z wyciekiem protonów, oddychanie związane z syntezą ATP, oddychanie maksymalne, rezerwową wydolność oddechową oraz oddychanie pozamitochondrialne (Rysunek 4A)38,39,40,41.
    1. Oblicz podstawową oddychanie mitochondrialne, odejmując wartość OCR zmierzoną po dodaniu mieszaniny rotenonu/antymycyny A od wartości OCR przed wstrzyknięciem oligomycyny (Rycina 4A, a).
    2. Oblicz oddychanie związane z przeciekiem protonów, odejmując wartość OCR po wstrzyknięciu mieszaniny rotenonu i antymycyny A od wartości OCR zmierzonej po wstrzyknięciu oligomycyny (Rysunek 4A,b).
    3. Oszacuj respirację powiązaną z ATP, obliczając różnicę między podstawową respiracją mitochondrialną a respiracją powiązaną z przeciekiem protonów. Odejmij pierwszą wartość OCR zmierzoną po wstrzyknięciu oligomycyny od pierwszej wartości OCR zmierzonej przed wstrzyknięciem oligomycyny (Rysunek 4A,c).
    4. Maksymalna respiracja to maksymalna szybkość oddychania, jaką komórka może osiągnąć po dodaniu FCCP. Oblicza się ją, odejmując wartość OCR zmierzoną po wstrzyknięciu mieszaniny rotenonu i antymycyny A od wartości OCR zmierzonej po wstrzyknięciu FCCP (Rysunek 4A,d).
    5. Rezerwa wydajności oddechowej odnosi się do zdolności komórki do zaspokojenia zwiększonego zapotrzebowania energetycznego poprzez fosforylację oksydacyjną (OXPHOS). Oblicz ją, wyznaczając różnicę między maksymalnym oddychaniem a podstawowym oddychaniem mitochondrialnym (Rysunek 4A, e).
    6. Oddychanie pozimitochondrialne to ilość tlenu zużywanego przez źródła pozamitochondrialne. Należy zmierzyć tę wartość po dodaniu mieszaniny rotenonu/antymycyny A (Rycina 4A,f).
  16. Przeprowadź analizę statystyczną przy użyciu testu t Studenta t– test w celu porównania różnych parametrów oddychania niediferencjonowanych i zróżnicowanych komórek HL60. Należy wziąć pod uwagę p < 0,05 uznaje się za statystycznie istotne.
    UWAGA: Powtórzenia z wartościami OCR lub ECAR poniżej zera są uznawane za błąd w przygotowaniu próbek, wstrzykiwaniu związku lub pomiarze. Są one wykluczone z dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono reprezentatywną dynamikę OCR, wskazującą na zmiany w oddychaniu mitochondrialnym w odpowiedzi na oligomycynę, FCCP oraz mieszaninę rotenonu/antymycyny A w neutrofilach myszy (Rycina 3A), neutrofilach ludzkich (Rycina 3B) oraz nieróżnicowanych i zróżnicowanych komórkach HL60 (Rycina 3C). We wszystkich komórkach traktowanie oligomycyną obniża wartość OCR poprzez hamowanie kanału protonowego syntazy ATP; traktowanie FCCP ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Standardowa procedura, która mierzy oddychanie mitochondrialne neutrofili za pomocą metabolicznego analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, jest ograniczona przez wiele czynników, w tym liczbę komórek, wzrost komórek i żywotność. Stężenie każdego związku różni się w zależności od typu i źródła komórek w tym teście. Oligomycyna i rotenon/antymycyna A są najczęściej stosowane w podobnym stężeniu wśród większości typów komórek. Ponieważ jednak maksymalna częstość oddechów wywołana przez FCCP różni się w zależności od róż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy dr Anthony T. Vella i dr Federice Aglianoin z Wydziału Immunologii UConn Health za ich szkolenie w zakresie korzystania z analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego, oraz dr Lynn Puddington z Wydziału Immunologii UConn Health za jej wsparcie dla tych instrumentów. Dziękujemy dr Genewie Hargis z UConn School of Medicine za jej pomoc w pisaniu naukowym i redagowaniu tego manuskryptu. Badania te były wspierane przez granty z National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (R35GM147713 i P20GM139763), fundusz startowy z UConn Health oraz stypendium Career Re-entry od American Association of Immunologs.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
37 &stopnie; C bez CO2  inkubatorPrecisionEconomy Model 2EGInstrument
BiorenderSoftware
Application CentrifugeEppendorfModel 5810RInstrument
Corning  Cell-Tak Klej do komórek i tkanekOdczynnik Corning102416-100
Magnes EasySepMagnesSTEMCELL18000
Zestaw do wzbogacania neutrofili EasySepMouse OdczynnikiGraphpad
Prism 9Aplikacja oprogramowania
Roztwór albuminy ludzkiej surowicy (25%)Odczynniki
Ketamina (VetaKet)DAILYMEDNDC 59399-114-10Znieczulenie
PBSCytivaSH30256.01Odczynniki
Wiadra na talerzeAkcesoriumEppendorfUL155
PolymorphPrepPROGEN1895 (poprzedni 1114683)roztwór polisacharydowy
Oczyszczone mysie przeciwciało anty-ludzkie CD18Biolegend302102Klon TS1/18
RPMI 1640 MediumGibco11-875-093Odczynniki
Analizator metabolicznego strumienia zewnątrzkomórkowego konika morskiegoInstrument AgilentXFe96
Zestaw do testów wysiłkowych Seahorse XF Cell MitoZestaw do testu wysiłkowego mitochondriówAgilent103015-100
WirnikEppendorfA-4-62Rotor
Vactrap 2 Pułapka próżniowaFox Nauki biologiczne3052101-FLSAplikacja oprogramowania Instrument
Wave
XF 1.0 M Roztwór glukozyAgilent103577-100Odczynnik
XF 100 mM Roztwór pirogronianuAgilent103578-100Odczynnik
XF 200 mM Roztwór glutaminyAgilent103579-100Odczynnik
XF DMEM mediumAgilent103575-100Odczynnik
XFe96 FluxPakAgilent102601-100Materiał
Ksylazyna (AnaSed Injection)DAILYMEDNDC 59399-110-20Znieczulenie
GeminiBio 800-120 wahadłowy

Bibliografia

  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136(2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858(2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472(2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521(2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121(2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444(2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586(2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487(2021).
  30. Zhang, Z. -W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907(2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850(2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465(2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656(2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845(2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975(2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079(2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019).
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899(2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech. , Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020).
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608(2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856(2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099(2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306(2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oddychanie mitochondrialnebioenergetyka neutrofilitempo zużycia tlenuanaliza strumienia metabolicznegoanalizator strumienia zewnątrzkomórkowegotest stresu mitochondrialnegokomórki HL60fosforylacja oksydacyjnałańcuch transportu elektronówoddychanie podstawowe
Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.