Artykuł metodologiczny

Sekcja całego ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego myszy

DOI:

10.3791/64974

⸱

24 lutego 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Functional Genomics, Université de Sherbrooke, 2Department of Dermatology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Department of Pathology, Université de Sherbrooke, 4Centre de Recherche du Centre Hospitalier de Universitaire de Sherbrooke, Université de Sherbrooke, 5Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 6UTSW Comprehensive Neurofibromatosis Clinic, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 7Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do zakończenia sekcji centralnego i obwodowego układu nerwowego myszy. Wypreparowane tkanki są dalej analizowane w dalszych zastosowaniach, takich jak robienie zdjęć ogólnych lub histologia.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele zwierzęce reprezentują konia pociągowego w dziedzinie neuronauki. Mimo to nadal nie ma protokołu krok po kroku, który pozwoliłby przeanalizować cały układ nerwowy gryzoni, ani nie ma kompletnego schematu przedstawiającego go, który byłby swobodnie dostępny. Dostępne są tylko metody pobierania mózgu, rdzenia kręgowego, określonego zwoju korzenia grzbietowego i nerwu kulszowego (osobno). Tutaj przedstawiamy szczegółowe zdjęcia i schemat ośrodkowego i obwodowego mysiego układu nerwowego. Co ważniejsze, przedstawiamy solidną procedurę przeprowadzania jego sekcji. 30-minutowy etap presekcji pozwala na odizolowanie nienaruszonego układu nerwowego w obrębie kręgu z mięśniami wolnymi od wnętrzności i skóry. Po 2-4 godzinnej sekcji pod mikroskopem mikropreparacyjnym odsłania się rdzeń kręgowy i nerwy piersiowe, a na koniec odkleja się cały ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy od tuszy. Protokół ten stanowi znaczący krok naprzód w badaniu anatomii i patofizjologii układu nerwowego na całym świecie. Na przykład wypreparowane gangliony korzenia grzbietowego z modelu myszy z nerwiakowłókniakowatością typu I mogą być dalej przetwarzane do badań histologicznych w celu wyjaśnienia zmian w progresji guza.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnym celem tej metody jest odizolowanie centralnego i obwodowego układu nerwowego myszy w jednym kawałku. Obecnie nie ma protokołu pozwalającego na przeanalizowanie całego układu nerwowego gryzonia w celu zbadania go na poziomie globalnym. Neurobiolodzy zazwyczaj używają nerwu kulszowego jako substytutu dla dowolnego nerwu obwodowego1, a ganglionów od L3 do L52 jako substytutu dla dowolnych ganglionów. Korzystając z tych metod, nie można stwierdzić, czy wyniki są specyficzne dla konkretnego nerwu/zwoju. Ponieważ wiadomo, że przynajmniej niektóre patologie nerwowe nie wpływają jednakowo na wszystkie nerwy i zwoje3,4,5, należy opracować technikę, która pozwoli na izolację całego układu nerwowego gryzoni, aby zbadać go globalnie.

Przez lata opracowaliśmy i udoskonaliliśmy metodę analizy całego centralnego i obwodowego układu nerwowego myszy. Pierwszym krokiem jest zasadniczo gruba sekcja myszy w ramach przygotowań do etapów mikrosekcji pod mikroskopem preparacyjnym. W krokach od 2 do 4 rdzeń kręgowy i nerwy piersiowe są odsłaniane, mózg jest preparowany, a cały rdzeń kręgowy i nerwy obwodowe są odrywane od tuszy.

Ta metoda jest skuteczna w połączeniu z obrazowaniem lub histologią, aby udokumentować wszelkie makroskopowe lub mikroskopowe zmiany6,7,8,9. Neurobiolodzy zainteresowani badaniem globalnych zmian lub przeprowadzaniem eksperymentów nieopartych na hipotezach powinni używać tej metody do badania globalnego układu nerwowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Comité Institutionnel des Animaux de l'Université de Sherbrooke, kanadyjską instytucję posiadającą certyfikat opieki nad zwierzętami.

1. Przygotowanie do mikropreparacji (prepreparacja)

  1. Wykonaj znieczulenie 5% izofluranem, a następnie eutanazję 2% izofluranu i 10 psi CO2 do momentu, gdy nie pojawią się żadne parametry życiowe.
    UWAGA: Nie należy wykonywać zwichnięcia szyjki macicy, ponieważ powoduje to uszkodzenie rdzenia kręgowego i ganglionów szyjnych.
  2. Umieść uśpioną mysz przodem do góry (widok z przodu) na podkładce preparacyjnej i spryskaj futro 70% etanolem.
  3. Następnie przypnij kończyny górne i dolne, używając czterech szpilek o małej średnicy, aby utrzymać mysz w pozycji podczas sekcji.
  4. Za pomocą nożyczek chirurgicznych rozetnij skórę od podbrzusza do gardła.
  5. Zdejmij skórę, aby odsłonić narządy wewnętrzne i użyj dodatkowych szpilek, aby utrzymać skórę z każdej strony, jednocześnie odsłaniając jamę brzuszną.
  6. Rozetnij klatkę piersiową, aby odsłonić serce i płuca.
  7. Używając pary standardowych kleszczy anatomicznych, chwyć przełyk i tchawicę i przetnij tuż nad kleszczami.
  8. Następnie zacznij odklejać wszystkie narządy wewnętrzne w podejściu czaszkowo-ogonowym. Aby to zrobić, przetnij przeponę wzdłuż kręgosłupa, aby usunąć wszystkie narządy wewnętrzne w jednym kawałku.
  9. Odepnij mysz i spłucz nadmiar mysiej krwi z jamy brzusznej w zlewie.
  10. Umieść mysz ekranem do dołu (widok z tyłu). Przypnij kończyny górne i dolne, używając czterech szpilek, aby utrzymać mysz w pozycji podczas sekcji.
  11. Za pomocą nożyczek chirurgicznych zdejmij skórę od głowy do kończyn tylnych.
  12. Odsłoń lewy nerw kulszowy (kończyna dolna).
    1. Rozetnij mięśnie w dolnej części lewej kończyny dolnej.
    2. Zlokalizuj i odsłoń nerw kulszowy, usuwając otaczający go mięsień.
    3. Ostrożnie przeciąć nerw kulszowy na rozgałęzieniu nerwu łydkowego, piszczelowego i strzałkowego i oszczędzić naczynia krwionośne.
    4. Kontynuuj izolowanie nerwu kulszowego za pomocą standardowych kleszczy anatomicznych i bardzo cienkich nożyczek Bonn, aż stanie się równoległy do kręgosłupa, pozostawiając wolny nerw o długości około 2 cm.
    5. Włóż nożyczki chirurgiczne równolegle do rdzenia kręgowego i przetnij biodro.
    6. Zwichnąć biodro, rozsuwając kość krzyżową i kość udową za pomocą palców.
      UWAGA: Podczas tego procesu należy często zatrzymywać się, aby delikatnie pociągnąć nerw kulszowy za pomocą kleszczy, aby uniknąć zakłóceń.
    7. Na koniec delikatnie oderwij tylną kończynę od tuszy myszy, pozostawiając nerw kulszowy o długości około 4 cm.
      UWAGA: Podczas tego procesu zlokalizuj nerw L2 i wyciągnij go z tylnej kończyny, aby uniknąć uszkodzenia L2. Powtórz krok 1.12 dla prawej strony.
  13. Odsłoń nerwy ramienne (kończyny górne).
    1. Manipuluj tuszą myszy w dłoniach, a nie na płaskiej powierzchni (podkładka do sekcji).
    2. Zlokalizuj lewy splot ramienny, rozsuwając tłuszcz i mięśnie pod lewą pachą.
    3. Po zlokalizowaniu odetnij główne rozgałęzienia splotu ramiennego (promieniowo, pachowo, nadłopatkowo) i ich podrozgałęzienia wokół kości łokciowej za pomocą bardzo drobnych nożyczek Bonn, pozostawiając wolne nerwy o długości około 1,5 cm. Delikatnie oderwij splot z lewej górnej kończyny.
    4. Zwichnąć górną lewą kończynę, upewnić się, że jest wolna od nerwów. Powtórz krok 1.13 dla prawej strony.
  14. Odsłoń mózg.
    1. Teraz umieść mysz ekranem do góry (widok z przodu)
    2. Włóż jedno ostrze bardzo cienkich nożyczek Bonn do ust i przeetnij żuchwę przez gardło.
    3. Usuń żuchwę, dalej tnąc od policzków do gardła.
    4. Następnie przetnij kość czaszki przechodzącą od jednego ucha do drugiego.
      UWAGA: Uważaj, aby nie wchodzić zbyt głęboko i nie uszkodzić mózgu.
    5. Wytnij i usuń podniebienie i kości nosowe, aby otworzyć czaszkę.
    6. Przetnij kręg C1 u podstawy czaszki, uwalniając móżdżek i początek rdzenia kręgowego.
    7. Na koniec przetnij czaszkę poprzecznie do oka i usuń kawałki czaszki, aby odsłonić mózg.
      UWAGA: Trzymaj mózg w jego jamie, dopóki nerwy nie zostaną oderwane.
  15. Usuń nadmiar tłuszczu lub mięśni z tuszy. Umieść tuszę w 10% formalinie na 15 minut w temperaturze pokojowej (RT), a następnie krótkie płukanie 1x buforowaną solą fizjologiczną (PBS), aż nie będzie już zapachu utrwalacza, i przejdź do następnego kroku.
    UWAGA: Jeśli układ nerwowy zostanie wycięty w ciągu najbliższych 2 tygodni, przechowuj go w temperaturze 4 °C w PBS. W przeciwnym razie przechowuj go w 10% formalinie przez czas nieokreślony. Zawsze używaj kaptura chemicznego podczas manipulowania formaliną.

2. Ekspozycja rdzenia kręgowego

  1. Aby odsłonić rdzeń kręgowy, użyj podejścia czaszkowo-ogonowego. Aby usunąć każdy kręg i jego warstwę mięśniową powyżej, przetnij na godzinie dziesiątej i drugiej po stronie brzusznej, używając nożyczek sprężynowych Vannas. Odetnij kręg za pomocą mini-kleszczy Dumont. Kontynuuj ten proces przez kręgi szyjne i piersiowe.
  2. W przypadku odcinka lędźwiowego przetnij wyrostek poprzeczny po każdej stronie kręgu. Następnie przetnij w pozycjach godziny drugiej i dziesiątej, wkładając ostrze pary nożyczek sprężynowych Vannas do kanału kręgowego. Usuń tkanki, zwracając uwagę na nerwy, które czasami są przyklejone do kości.
  3. Podobnie postępować w przypadku części ogonowej.

3. Odsłonięcie nerwu piersiowego

  1. Umieść tuszę pod mikroskopem preparacyjnym, aby uwidocznić przednią stronę.
  2. Za pomocą nożyczek sprężynowych Vannas przetnij wzdłuż każdego żebra (od mostka do kończyn dolnych), aby odsłonić nerwy obwodowe.
  3. Następnie przetnij kręg po obu stronach (bocznie) ganglionu, aby odsłonić ganglion.

4. Złuszczanie się nerwów obwodowych

  1. Aby odkleić rdzeń kręgowy i dalej usunąć nerwy obwodowe, użyj mini-kleszczy Dumont, aby delikatnie zwinąć rdzeń kręgowy i wyciągnąć nerwy jeden po drugim, zaczynając od ogonowej części rdzenia kręgowego.
    UWAGA: Przed odklejeniem można wykonać dodatkowe utrwalenie w 10% formalinie przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie krótkie płukanie 1x PBS, aż do momentu, gdy nie będzie już zapachu utrwalającego, jak wykonano w kroku 1.15.
  2. W przypadku części piersiowej pociągnij nerw pod kątem 90° (prostopadle do rdzenia kręgowego).
  3. W przypadku splotu ramiennego przetnij kręg obok nerwu, aby zrobić miejsce na nerw.
    UWAGA: Splot ramienny nie może być przepuszczony pod kręgiem, jak w odcinku piersiowym.
  4. Usuń nadmiar mięśni, aby oczyścić nerwy.
  5. Przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C łącznie do 2 tygodni lub przez czas nieokreślony w 10% formalinie w temperaturze pokojowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gryzonie odegrały kluczową rolę w naszym zrozumieniu biologii i patofizjologii układu nerwowego10. Co ciekawe, żadna metoda nie przedstawia pełnej sekcji ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego gryzonia w celu oceny anatomii i patologicznej zmienności w modelu w czasie rzeczywistym1,2,11. Rysunek 1 przedstawia przegląd etapów od 1 do 4 (przygotowanie do mikropreparacji, ods...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zapobiec wysuszeniu mięśni i nerwów, tuszę należy moczyć w PBS co 10 minut. Podczas zwichnięcia kończyn dolnych (krok 1.12.6) ważne jest, aby zawsze mieć splot nerwu kulszowego i L2 w zasięgu wzroku, aby uniknąć jego uszkodzenia/rozerwania. Podczas preparacji mózgu (krok 1.14.4) bardzo ważne jest, aby nie wchodzić zbyt głęboko, aby nie uszkodzić mózgu. Podczas preparowania ganglionów korzenia grzbietowego i ogólnie nerwów obwodowych bardzo ważne jest, aby używać wysokiej jakości (nieuszkodzonych) minikleszczy Dumonta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JPB jest stypendystą FRSQ J1 i laureatem nagrody Early Investigator Research Award przyznawanej przez Departament Obrony USA. LQL posiada nagrodę Career Award for Medical Scientists przyznaną przez Burroughs Wellcome Fund oraz profesurę dermatologii im. Thomasa L. Shieldsa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mini-kleszcze DumontNarzędzia Fine Science #11200-10
Dodatkowe nożyczki BonnNarzędzia Fine Science #14084-08
Formalin 10%Fischer Scientific#22-046-361
PBS 1xBioShopCanada#PBS404.500
Standardowe kleszcze anatomiczneFine Science Tools#91100-12
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools#140001-12
Nożyczki sprężynowe VannasKent Scientific#INS600124

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bala, U., Tan, K. L., Ling, K. H., Cheah, P. S. Harvesting the maximum length of sciatic nerve from adult mice: a step-by-step approach. BMC Reserach Notes. 7, 714(2014).
  2. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Reserach Notes. 9, 82(2016).
  3. Ikram, A., Rehman, A. Paraganglioma. StatPearls. , Treasure Island, FL. (2022).
  4. Ehara, Y., Koga, M., Imafuku, S., Yamamoto, O., Yoshida, Y. Distribution of diffuse plexiform neurofibroma on the body surface in patients with neurofibromatosis 1. The Journal of Dermatology. 47 (2), 190-192 (2020).
  5. Plotkin, S. R., et al. Updated diagnostic criteria and nomenclature for neurofibromatosis type 2 and schwannomatosis: An international consensus recommendation. Genetics in Medicine. 24 (9), 1967-1977 (2022).
  6. Brosseau, J. P., et al. NF1 heterozygosity fosters de novo tumorigenesis but impairs malignant transformation. Nature Communications. 9 (1), 5014(2018).
  7. Chen, Z., et al. Spatiotemporal loss of NF1 in Schwann cell lineage leads to different types of cutaneous neurofibroma susceptible to modification by the hippo pathway. Cancer Discovery. 9 (1), 114-129 (2019).
  8. Liao, C. P., et al. Contributions of inflammation and tumor microenvironment to neurofibroma tumorigenesis. The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2848-2861 (2018).
  9. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807(2021).
  10. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. The Mouse Nervous System. , Elsevier, Academic Press. New York. (2012).
  11. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  12. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  13. Brosseau, J. P., et al. The biology of cutaneous neurofibromas: Consensus recommendations for setting research priorities. Neurology. 91, 14-20 (2018).
  14. Wu, J., et al. Preclincial testing of sorafenib and RAD001 in the Nf(flox/flox);DhhCre mouse model of plexiform neurofibroma using magnetic resonance imaging. Pediatric Blood & Cancer. 58 (2), 173-180 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Disekcja uk adu nerwowegoo rodkowy uk ad nerwowydisekcja myszyizolacja rdzenia kr gowegozwoje korzeni grzbietowychdisekcja nerwu kulszowegomikroskop do mikrodisekcjimodel mysi neurofibromatozyanatomia uk adu nerwowego
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły