Oparte na spektrometrii mas podejścia do analizy struktury białek wyższego rzędu

Xiaoran Roger Liu; Yining Huang

doi:10.3791/64979

Artykuł metodologiczny

Oparte na spektrometrii mas podejścia do analizy struktury białek wyższego rzędu

647 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64979

⸱

3 marca 2023

Xiaoran Roger Liu¹ , Yining Huang²

¹Biologics Development, Bristol Myers Squibb, ²Eli Lilly and Company

W tym artykule

Streszczenie

OMÓWIONE ARTYKUŁY:

Espino, J. A., Jones, L. M. Ślad białka rodnika hydroksylowego in vivo w celu zbadania interakcji białek w Caenorhabditis elegans. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (158), E60910 (2020).

Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Charakterystyka białek komórkowych za pomocą szybkiego fotochemicznego utleniania białek w komórce. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (157), E60911 (2020).

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Metody spektrometrii mas do badania struktury i oddziaływań białek w liofilizowanych proszkach. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (98), E52503 (2015).

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. Platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) do badania enzymów biosyntezy peptydów. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (159), E61053 (2020).

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Kowalencyjne znakowanie za pomocą dietylopirowęglanu do badania struktury białka wyższego rzędu za pomocą spektrometrii mas. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (172), E61983 (2021).

Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Platforma inkubator z ruchomym stopniem XY: Nowa platforma do implementacji szybkiego fotochemicznego utleniania białek w komórce. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (171), E62153 (2021).

Haupt, C. et al. Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (129), E56747 (2017).

Lento, C. et al. Czasowo-rozdzielcza spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylania wodoru i deuteru do badania struktury i dynamiki białek. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (122), E55464 (2017).

Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laserowe usuwanie śladów białek rodników hydroksylowych w celu przeprowadzenia analizy strukturalnej białek wyższego rzędu. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (172), E61861 (2021).

Misra, S. K., Sharp, J. S. Umożliwienie kompensacji w czasie rzeczywistym w szybkim fotochemicznym utlenianiu białek w celu określenia zmian topografii białek. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (163), E61580 (2020).

Chaihu, L. et al. Wymiana wodoru i deuteru oparta na elektroforezie kapilarnej do konformacyjnej charakterystyki białek za pomocą spektrometrii mas top-down. Dziennik Eksperymentów Wizualnych. (172), E62672 (2021).

Artykuł redakcyjny

Struktura wyższego rzędu (HOS) jest ważnym aspektem charakterystyki białek, ponieważ jest ściśle związana z funkcją białka. Spektrometria mas (MS) jest jedną z kluczowych metod oceny białka HOS¹. Chociaż podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym nie są w stanie rozwiązać struktury białka z rozdzielczością atomową, mają zalety średniej i wysokiej rozdzielczości przestrzennej, wysokiej specyficzności, niskich wymagań dotyczących ilości próbek, wysokiej przepustowości i możliwości proteomicznych.

Metody śladu białkowego oparte na MS oceniają białko HOS poprzez analizę dostępnej dla rozpuszczalnika powierzchni białka i są zwykle sprzężone z różnymi podejściami do znakowania chemicznego. Odwracalne znakowanie, takie jak wymiana wodorowo-deuterowa (HDX), jest ukierunkowane na wodory amidowe w białku ^1,2. Nieodwracalne etykietowanie wykorzystuje albo substancje chemiczne, które są ukierunkowane na określone reszty aminokwasowe³, albo rodniki, które znakują wiele różnych reszt z większą szybkością reakcji¹. Sieciowanie chemiczne jest również częścią kategorii etykietowania nieodwracalnego, jednak jego dwuwartościowa cecha pozwala na określenie ograniczeń przestrzennych między dwoma usieciowanymi miejscami, co oferuje unikalny wgląd topologiczny ^4,5. Wszystkie te podejścia można połączyć w celu stworzenia "zestawu narzędzi", co sprawia, że stwardnienie rozsiane jest cennym narzędziem do wyjaśniania białek HOS.

Zorganizowaliśmy ten zbiór metod, aby przedstawić najnowsze postępy w dziedzinie analizy HOS białek opartych na stwardnieniu rozsianym. Pierwszy zestaw artykułów przedstawia podejścia oparte na HDX. Habibi i Thibodeaux⁶ opisują stosunkowo klasyczne ciągłe, oddolne podejście HDX-MS. Dzięki wymianie wodorowo-deuterowej (H/D) w roztworze w wielokrotnym czasie wymiany, po której następuje trawienie pepsyny na kolumnie, można określić poziom wychwytu deuteru na poziomie peptydu. Podczas przeprowadzania eksperymentów różnicowych (tj. stanów związanych i niezwiązanych), peptydy, które wykazują zwiększony lub zmniejszony poziom wychwytu deuteru, reprezentują obszary, w których występują zmiany w HOS. Autorzy używają syntetaz lantipeptydów, aby dobrze zademonstrować przebieg pracy HDX-MS.

Oprócz podejścia oddolnego, HDX-MS może być również przeprowadzany w sposób odgórny, co pozwala analitykom na zastosowanie różnych strategii separacji na poziomie nienaruszonego białka. Chaihu i ^wsp.7 wykorzystują elektroforezę kapilarną do oddzielania różnych stanów białkowych lub proteoform, które współistnieją w roztworze. Białka podlegają wymianie H/D podczas elektroforezy podczas migracji w kapilarze w deuterowanym roztworze elektrolitu tła, a następnie przeprowadzana jest odgórna analiza MS i fragmentacja w fazie gazowej w celu oceny poziomu wychwytu deuteru zarówno na poziomie globalnym, jak i fragmentarycznym. Wreszcie, w tej kolekcji znajdują się również dwie inne metody, które podkreślają różne metody wymiany H/D, a mianowicie wymianę na liofilizowaną moc⁸ i wymianę po jonizacji elektronrozpylanej⁹.

Druga grupa artykułów dotyczy metody etykietowania nieodwracalnego. Wśród nich szybkie fotochemiczne utlenianie białek (FPOP) wykorzystuje rodniki jako gatunki znakujące do oznaczania powierzchni białka^10,11. W praktyce nadtlenek wodoru jest fotoaktywowany przez laser w celu wytworzenia rodników hydroksylowych, które służą jako aktywne formy znakujące. Misra i Sharp¹² przedstawiają strategię dozymetrii rodnikowej, w której adenina jest używana jako reporter stężenia rodników, a system dozymetrii rodnikowej in-line jest używany do monitorowania odpowiedzi adeniny. Pozwala to na kompensację stężeń rodników hydroksylowych w czasie rzeczywistym, a tym samym normalizację warunków reakcji w celu uzyskania dokładnego odczytu. Następnie Weinberger i Chea współpracowali z grupą Sharp w celu opracowania bezlaserowej platformy FPOP¹³. Zastępując niebezpieczny laser plazmowym źródłem światła i łącząc to z dozymetrią rodnikową in-line i zautomatyzowanym systemem pobierania próbek, opracowali i zapewnili zintegrowane rozwiązanie dla badaczy, którzy muszą scharakteryzować białko HOS.

Trzy artykuły grupy^Jonesa 14,15,16 badają możliwość wprowadzenia FPOP i śladu białkowego do badań in vivo. Zaleta tego podejścia jest bezprecedensowa, ponieważ pozwala na analizę białka HOS w środowisku natywnym. Udane zastosowanie śladów stóp w komórkach¹⁴ i Caenorhabditis elegans¹⁵ otwiera nowe możliwości śledzenia HOS całego proteomu w jego stanie naturalnym, umożliwiając w ten sposób głębokie zrozumienie białka HOS, czego nie można osiągnąć za pomocą innych narzędzi.

Inną ważną metodą nieodwracalnego etykietowania są odczynniki chemiczne, które są ukierunkowane na określone reszty aminokwasowe³. Kirsch i ^wsp.17 donoszą o dobrze wykorzystanym przepływie pracy śladu białka poprzez znakowanie kowalencyjne. Używając dietylopirowęglanu jako odczynnika znakującego, autorzy badają zmiany w białkowym HOS, znakując kilka rodzajów reszt aminokwasowych na powierzchni białka. Dzięki eksperymentom różnicowym, po których następuje trawienie proteolityczne i oddolna analiza stwardnienia rozsianego, przepływ pracy pozwala na identyfikację zmian w dostępności rozpuszczalników, które są bezpośrednio związane ze zmianami w HOS.

Wreszcie, sieciowanie chemiczne jest kolejnym ważnym podejściem, które wykorzystuje dwuwartościowe odczynniki chemiczne do znakowania białek ^4,5. Chemiczne środki sieciujące służą do sieciowania dwóch białek, które są przestrzennie blisko siebie i często tworzą kompleks strukturalny. Haupt i ^wsp.18 opisują protokół, w którym demonstrują zastosowanie chemicznych środków sieciujących do zrozumienia architektury kompleksów białkowych. Usieciowany kompleks białkowy może być analizowany na dwóch różnych poziomach. Poprzez trawienie proteolityczne, a następnie identyfikację stwardnienia rozsianego, usieciowane dipeptydy ujawniają miejsca interakcji kompleksu białkowego. Podczas analizy usieciowanej próbki przez nienaruszoną masę, informacje stechiometryczne na temat podjednostek białkowych w kompleksie są łatwo dostępne.

Podsumowując, w ciągu ostatnich trzech dekad byliśmy świadkami znacznego rozwoju narzędzi opartych na stwardnieniu rozsianym do analizy HOS białek. Nieodwracalny i odwracalny ślad węglowy w połączeniu z analizą stwardnienia rozsianego uzupełniają się nawzajem i razem w znacznym stopniu przyczyniają się do charakterystyki białka HOS. Prace zawarte w tym zbiorze metod reprezentują najnowocześniejsze metody w dziedzinie analizy HOS białek opartych na stwardnieniu rozsianym; Badania te są cennym źródłem informacji dla badaczy, którzy próbują wykorzystać podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym, aby odpowiedzieć na kluczowe pytania. Patrząc z szerszej perspektywy, włączenie danych dotyczących śladów do prognoz strukturalnych ma kluczowe znaczenie dla przełamania limitu rozdzielczości przestrzennej w metodach opartych na MS. Istnieją pionierskie prace, które wskazują na wykonalność takiego podejścia^19,20. Ponadto kluczowa jest również integracja platform, ponieważ podejścia te wzajemnie się uzupełniają i dostarczają spostrzeżeń z różnych perspektyw^21,22. Metody przedstawione w tym zbiorze pokazują siłę takiej integracji i w tym kierunku będzie się stale rozwijać. Dzięki tym wszystkim postępom podejście oparte na stwardnieniu rozsianym wykroczyło poza określanie masy cząsteczkowej, a w nadchodzących dziesięcioleciach będzie można zaobserwować ciągły wzrost w tej dziedzinie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Bibliografia

Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: Fundamentals and applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2020).
Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224-1234 (2011).
Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing protein structure by amino acid-specific covalent labeling and mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (5), 785-815 (2009).
Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein–protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
Leitner, A. Cross-linking and other structural proteomics techniques: How chemistry is enabling mass spectrometry applications in structural biology. Chemical Science. 7 (8), 4792-4803 (2016).
Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes. Journal of Visualized Experiments. (159), e61053(2020).
Chaihu, L., et al. Capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e62672(2021).
Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders. Journal of Visualized Experiments. (98), e52503(2015).
Lento, C., et al. Time-resolved electrospray ionization hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61580(2020).
Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins. Journal of Visualized Experiments. (172), e61861(2021).
Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (157), e60911(2020).
Espino, J. A., Jones, L. M. In vivo hydroxyl radical protein footprinting for the study of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e60910(2020).
Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Platform incubator with movable XY stage: A new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (171), e62153(2021).
Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e61983(2021).
Haupt, C., et al. Combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies. Journal of Visualized Experiments. (129), e56747(2017).
Biehn, S. E., Lindert, S. Accurate protein structure prediction with hydroxyl radical protein footprinting data. Nature Communications. 12 (1), 341(2021).
Biehn, S. E., Lindert, S. Protein structure prediction with mass spectrometry data. Annual Review of Physical Chemistry. 73, 1-19 (2022).
Zhang, M. M., et al. Epitope and paratope mapping of PD-1/nivolumab by mass spectrometry-based hydrogen-deuterium exchange, cross-linking, and molecular docking. Analytical Chemistry. 92 (13), 9086-9094 (2020).
Zhang, M. M., et al. An integrated approach for determining a protein–protein binding interface in solution and an evaluation of hydrogen–deuterium exchange kinetics for adjudicating candidate docking models. Analytical Chemistry. 91 (24), 15709-15717 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Protein Interactions Hydroxyl Radical Footprinting Photochemical Oxidation Hydrogen-deuterium Exchange Covalent Labeling Protein Analysis Electrospray Ionization Chemical Cross-linking Multi-subunit Assemblies Conformational Characterization