$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Oddziaływania biomolekularne odgrywają kluczową rolę w procesach biologicznych, a tym samym mają fundamentalne znaczenie dla nauk przyrodniczych. Techniki fluorescencji stały się jednymi z najpotężniejszych i najszerzej stosowanych metod badania i zrozumienia tych procesów. Metody fluorescencji in vitro oferują możliwość wykrywania w czasie rzeczywistym zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych interakcji molekularnych, co stanowi dużą przewagę nad innymi podejściami. Zostało to wykorzystane do różnych interakcji białko-białko, białko-kwas nukleinowy i białko-błona, które odgrywają kluczową rolę w regulacji procesów komórkowych.
Zbiór ten zawiera przegląd różnych technik i zastosowań opartych na fluorescencji w badaniu interakcji biomolekularnych i poszerza naszą wiedzę na temat procesów komórkowych.
Reiser i wsp.1 opisują wysokoprzepustową metodę analizy kinetyki komórkowej z pojedynczych komórek poprzez zautomatyzowane pozyskiwanie i przetwarzanie obrazów (Live Cell Imaging on Single Cell Arrays [LISCA]). Korzystając z tej techniki, reportery fluorescencyjne zapewniają odczyt z rozdzielczością czasową różnych niezależnych procesów biologicznych, takich jak ekspresja genów pojedynczej komórki po transfekcji, odpowiedź komórkowa w kaskadach sygnałowych, zdarzenia apoptotyczne lub różnicowanie komórek macierzystych. Autorzy przeprowadzają obrazowanie w izolowanych macierzach komórkowych za pomocą skaningowej mikroskopii poklatkowej, co prowadzi do setek trajektorii pojedynczych komórek i wystarczającej ilości danych do analizy statystycznej. Ślady czasu fluorescencji pojedynczej komórki pomogą naukowcom lepiej zrozumieć mechanizmy dostarczania genów i rozwiązać problem heterogeniczności komórkowej – cechy charakterystycznej złożonych systemów biologicznych, zwykle podyktowanych wewnętrznymi fluktuacjami.
Konate i wsp.2 opisują metodę biofizyczną do scharakteryzowania interakcji, perturbacji i / lub przepuszczalności peptydów oddziałujących z błoną. W swoim protokole dokładnie opisują różne etapy formułowania i oczyszczania liposomów oraz charakteryzowania wycieku fluorescencji. Metodę stosuje się z peptydem penetrującym komórki (CPP) o nazwie WRAP w połączeniu z małym interferującym RNA (siRNA) lub w połączeniu z silnym peptydem terapeutycznym (iCAL36) i porównuje się z dobrze znanym CPP, penetratyną. Ta technika ma wiele zalet. Jest szybki i prosty do wdrożenia. Pozwala na ścisłą kontrolę składu błony lipidowej w celu naśladowania różnych typów błon komórkowych. Fluorofory można dostosować w zależności od interesującego peptydu i jego właściwości nieszczelności błony. Wreszcie, próbka po przygotowaniu jest wyjątkowo stabilna. Wszechstronność tej techniki sprawia, że jest to użyteczne podejście do badania różnych kwestii biologicznych dotyczących uszkodzenia komórek lub dostarczania leków.
Obecność fosfatydyloseryny (PS) w błonach komórkowych ssaków jest ważna w różnych procesach sygnalizacyjnych, takich jak apoptoza komórek lub rekrutacja białek do naprawy błony. Przenoszenie i zmiany w rozmieszczeniu PS na powierzchni błon plazmatycznych są kluczowym pytaniem, z którym Ikhlef i wsp.3 mierzą się w swoim artykule. Opisują one protokół pomiaru w czasie rzeczywistym transportu i wymiany lipidów PS i PI-4-P przez rekombinowane białko drożdży Osh6p. Metoda wykorzystuje czujniki fluorescencyjne do wykrywania, czy białko przenoszące lipidy (LTP) ekstrahuje lub przenosi lipidy w sztucznych błonach wzdłuż gradientu między pęcherzykami lipidowymi. Protokół ten umożliwia pracę z nieznakowanymi lipidami, aby umożliwić prawidłowe wiązanie lipidów z LTP. Ponadto uzyskuje się lepszą rozdzielczość czasową w porównaniu z konwencjonalnymi metodami, takimi jak testy oparte na promieniotwórczości lub spektrometria mas. Metoda ta pomoże naukowcom lepiej zrozumieć ekstrakcję i wymianę lipidów między różnymi organellami i błonami.
Rezonansowy transfer energii Förstera (FRET) to potężna metoda badania układów biomolekularnych. Technika ta może być stosowana do pojedynczych cząsteczek (np. smFRET) i umożliwia pomiar odległości bezwzględnych w biomolekułach. Abdelhamid i wsp.4 prezentują krok po kroku protokół, jak wykonać smfBox, niedawno opracowany konfokalny układ zdolny do pomiaru wydajności FRET między dwoma barwnikami na swobodnie dyfuzujących pojedynczych cząsteczkach. Pokazują one, jak wdrożyć i wykorzystać technikę smFRET od przygotowania próbki po konfigurację urządzenia, wyrównanie, akwizycję i analizę danych. Ponadto opisano, w jaki sposób określić współczynniki korekcyjne wymagane do dokładnych pomiarów odległości pochodzących z FRET. W tym przypadku metoda ta jest stosowana do swobodnie dyfuzyjnych dupleksów DNA i może być rozszerzona na szeroki zakres zastosowań, takich jak badanie zmian konformacyjnych białek lub interakcji białko-DNA.
Procesy biologiczne obejmują bardzo zróżnicowane i liczne interakcje biomolekularne, które pozostawiają dużo miejsca na rozwój nowych testów lub czujników opartych na fluorescencji. Zbiór ten oferuje naukowcom przegląd innowacji i osiągnięć w metodach opartych na fluorescencji. Każdy artykuł rzuca światło na inną metodę opartą na fluorescencji, podkreślając, jak ważne i wszechstronne stały się testy fluorescencyjne. Zbiór opisuje te metody, a tym samym zachęca do ich szerokiego stosowania w różnych grupach i obszarach badawczych.