$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Historycznie rzecz biorąc, naukowcy w dużej mierze opierali się na badaniach na zwierzętach, aby ustalić, czy produkt medyczny (tj. lek lub wyrób medyczny) jest bezpieczny przed przetestowaniem go na ludziach. Podczas gdy testy na zwierzętach są nadal uzasadnione w wielu sytuacjach, znalezienie alternatyw jest wysoce pożądane. Dzięki najnowszym postępom w nauce i inżynierii, opracowanie alternatyw dla testów na zwierzętach jest bardziej wykonalne niż kiedykolwiek. Ponowne skupienie się na rozwoju alternatywnych metod oceny bezpieczeństwa serca u ludzi in vitro można przynajmniej częściowo przypisać postępom w technologii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ludzkie komórki serca można wytworzyć w laboratorium przy użyciu prostej próbki krwi lub skóry od pacjenta, uzyskując ludzkie indukowane pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych (iPSC-CM), odpowiednie do solidnych testów wysokoprzepustowych. Postęp w bioinżynierii tkankowej 3D, technologiach matryc mikroelektrodowych, obrazowaniu żywych komórek i innych technologiach również odegrał kluczową rolę w rozwoju protokołów zawartych w tej kolekcji.
W protokole Gergesa i wsp.1 zastosowano nieinwazyjną metodę optyczną (MyoBLAZER) do oceny zmian kurczliwości w pierwotnych kardiomiocytach komorowych dorosłego człowieka. Komórki są sterowane elektrycznie, a analiza obrazu mierzy skracanie się sarkomeru w wielu komórkach równolegle. Ta metoda może zbierać krzywe stężenie-odpowiedź co 30 minut na związek na urządzenie i dostarcza danych o zależności struktura-aktywność. Ta nieinwazyjna metoda optyczna pomaga zachować fizjologię i farmakologię kardiomiocytów dorosłego człowieka podczas wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Ponadto wykorzystanie ludzkich dorosłych kardiomiocytów może stanowić kluczowy element translacyjny do przewidywania kurczliwości.
Metodologia Lickiss i wsp.2 przedstawia hybrydową technologię kurczliwości i impedancji/potencjału pola zewnątrzkomórkowego (EFP), dodając znaczące cechy sprzyjające dojrzewaniu do standardowej w branży platformy 96-dołkowej dzięki zastosowaniu miękkiego, elastycznego substratu do hodowli komórkowych na bazie krzemu. Podejście to okazało się skuteczne poprzez przywrócenie fizjologicznie dodatniej odpowiedzi inotropowej na izoproterenol w dostępnych na rynku zdrowych hiPSC-CM, który jest świadomie nieobecny w standardowej (sztywnej hodowli substratu) bez potrzeby stosowania systemu 3D. System hybrydowy pozwala na bezpośredni pomiar siły skurczu (mN/mm2), szybkości dudnienia, a także gęstości i integralności komórek jednowarstwowych. Odpowiada również na wyzwania związane z tradycyjnym systemem 3D (tj. niska przepustowość, znaczne potrzeby szkoleniowe), skracając czas i koszty niezbędne do wykonania testu.
Kolekcja zawiera również prace Feastera i wsp.3, którzy demonstrują in vitro, wysokoprzepustową, nieinwazyjną metodę oceny terapii modulacją kurczliwości serca (CCM) w kardiomiocytach 2D z ludzkich komórek macierzystych platerowanych na elastycznym materacu Matrigel, przy użyciu mikroskopii wideo bez sondy. Autorzy podkreślają ostry wpływ CCM na właściwości kurczliwe zdrowych i chorych hiPSC-CM. Narzędzie to oferuje tanią metodę zrozumienia bezpieczeństwa lub skuteczności CCM i może zmniejszyć zależność od badań na zwierzętach i pomóc w podejmowaniu decyzji regulacyjnych dotyczących wyrobów medycznych do elektrofizjologii serca.
Udoskonalony protokół Schaefera i wsp.4 opisuje nowatorskie rozszerzenie standardowego systemu macierzy mikroelektrod (MEA), który normalnie rejestruje potencjał pola zewnątrzkomórkowego w hiPSC-CM, umożliwiając wewnątrzkomórkowe zapisy potencjału czynnościowego poprzez otwieranie błon komórkowych za pomocą nanosekundowych impulsów wiązki laserowej. Urządzenie to nie tylko zawiera standardowe zalety MEA (tj. monitorowanie propagacji sygnału, eksperymenty ostre i przewlekłe), ale także pozwala na wgląd w kształt potencjału czynnościowego podobnego do wewnątrzkomórkowego bez użycia silnych impulsów pola elektrycznego do elektroporacji ogniw.
Protokół autorstwa Berry'ego i wsp.5 opisuje nową platformę, która umożliwia powtarzalne wytwarzanie tkanek mięśniowych (EMT) zaprojektowanych w 3D do bezpośrednich pomiarów siły kurczliwości. Instrument może wykrywać mikroniutonowe zmiany siły kurczliwości, co czyni go potężnym narzędziem do badań przesiewowych związków zależnych od dawki. Kurczliwość tkanki serca opartej na hiPSC, a także tkanek mięśni szkieletowych, może być rejestrowana w maksymalnie 24 tkankach jednocześnie, a dane mogą być analizowane podłużnie przez tygodnie lub miesiące. W związku z tym od badaczy wymagane są minimalne dodatkowe umiejętności lub szkolenia.
Wreszcie, publikacja Zhao i wsp.6 opisuje szereg testów funkcjonalnych (potencjał pola zewnątrzkomórkowego, potencjał czynnościowy, kurczliwość i wapń) zoptymalizowanych do stosowania z kardiomiocytami, które mogą być generowane we własnym zakresie przez laboratoria użytkowników. Można to zrobić za pomocą wcześniej opublikowanych protokołów różnicowania i iPSC dostępnych w Stanford University Cardiovascular Institute Biobank (https://med.stanford.edu/scvibiobank/request-cells.html), zapewniając szeroki zakres "chorych" i kontrolnych komórek. Jest to kompletny zestaw metod do głównych zapisów kurczliwości i elektrofizjologii serca, w tym standardowe podejścia (zacisk krosowy, matryce mikroelektrod, sondy fluorescencyjne wrażliwe na wapń i pomiary kurczliwości oparte na wideo).
Podsumowując, chociaż obecny zbiór metod nie twierdzi, że jest kompletny (i nadal rośnie), jest to już stosunkowo obszerny zestaw metod ilustrujących wiele aktualnych wyzwań w zakresie kurczliwości i zapisów elektrofizjologicznych w ludzkich kardiomiocytach. Obejmuje on protokoły dla pierwotnych ludzkich kardiomiocytów1, dostępne na rynku hiPSC-CM pochodzące od zdrowych dawców 2,3,4, a także protokoły zoptymalizowane pod kątem komórek noszących sygnaturę wrodzonej choroby serca 3,6. Metody te obejmują różne warunki hodowli komórek, od pojedynczych komórek do eksperymentów z klamrą krosową6, do konwencjonalnych monowarstw hiPSC-CM 2D na sztywnych podłożach 1,4, monowarstw 2D kardiomiocytów na miękkich, elastycznych podłożach 2,3 i wreszcie zmodyfikowanych w 3D tkanek serca5. Uwzględnione metody wykorzystują różne podejścia do rejestrowania najistotniejszych parametrów fizjologii serca, takich jak kurczliwość (mierzona pośrednio za pomocą testów wideo 1,3,6 lub bezpośrednio za pomocą siły skurczu 2,5), potencjał czynnościowy (w pojedynczej komórce za pomocą patch clamp6, zastępczy potencjały pola zewnątrzkomórkowego o MEA 4,6lub stosując nowatorskie podejście do polaryzacji komórek w celu zarejestrowania zapisów podobnych do potencjału czynnościowego za pomocą standardowego systemu MEA4) i stanów przejściowych wapnia (przy użyciu sond wrażliwych na wapń6). Podsumowując, metody te zapewniają nie tylko szczegółowe protokoły, które można odtworzyć w innych laboratoriach, ale także ilustrują niektóre wyzwania związane z metodami in vitro u ludzkiego serca, takie jak: niedojrzałość hiPSC-CM, zwłaszcza w przypadku stosowania standardowej hodowli 2D na sztywnym podłożu; niepożądane skutki fluorescencyjnych sond wrażliwych na napięcie lub wapń; niska przepustowość konwencjonalnych zapisów potencjału czynnościowego; trudności w interpretacji standardowych zapisów czasu trwania potencjału polowego; oraz brak testów do oceny wyrobów medycznych (np. w porównaniu z lekami). Inspirujące jest to, jak wiele laboratoriów pracuje nad ulepszeniem tych metod, co nieuchronnie doprowadzi do szerokiej adaptacji tych metod w przyszłości.