Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podwzgórzowe neurony kisspeptyny jako cel dla nagrań patch-clamp dla całych komórek

3.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64989

⸱

17 marca 2023

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do wykonania klamry na całej komórce na wycinkach mózgu zawierających neurony kisspeptyny, głównego modulatora komórek hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH). Dodając wiedzę na temat aktywności neuronów kisspeptyny, to elektrofizjologiczne narzędzie posłużyło jako podstawa znaczących postępów w dziedzinie neuroendokrynologii w ciągu ostatnich 20 lat.

Streszczenie

Kisspeptyny są niezbędne dla dojrzewania osi podwzgórze-przysadka-gonady (HPG) i płodności. Podwzgórzowe neurony kisspeptyny zlokalizowane w jądrze okołokomorowym przednio-brzusznym i jądrze okołokomorowym rostralnym, a także w jądrze łukowatym podwzgórza, rzutują między innymi na neurony hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH). Wcześniejsze badania wykazały, że sygnalizacja kisspeptyny zachodzi przez receptor Kiss1 (Kiss1r), ostatecznie pobudzając aktywność neuronów GnRH. U ludzi i eksperymentalnych modeli zwierzęcych kisspeptyny są wystarczające do indukowania wydzielania GnRH, a w konsekwencji uwalniania hormonu luteinizującego (LH) i hormonu stymulującego mieszki włosowe (FSH). Ponieważ kisspeptyny odgrywają istotną rolę w funkcjach rozrodczych, naukowcy pracują nad oceną, w jaki sposób wewnętrzna aktywność neuronów kisspeptyny podwzgórza przyczynia się do działań związanych z reprodukcją i zidentyfikowaniem głównych neuroprzekaźników/neuromodulatorów zdolnych do zmiany tych właściwości. Technika klamry krosowej dla całych komórek stała się cennym narzędziem do badania aktywności neuronów kisspeptyny w komórkach gryzoni. Ta eksperymentalna technika pozwala naukowcom rejestrować i mierzyć spontaniczne pobudzające i hamujące prądy jonowe, spoczynkowy potencjał błonowy, wyzwalanie potencjału czynnościowego i inne właściwości elektrofizjologiczne błon komórkowych. W niniejszym badaniu dokonano przeglądu kluczowych aspektów techniki patch-clamp dla całych komórek, znanych jako pomiary elektrofizjologiczne, które definiują neurony kisspeptyny w podwzgórzu, oraz omówiono istotne kwestie dotyczące tej techniki.

Wprowadzenie

Hodgkin i Huxley dokonali pierwszego wewnątrzkomórkowego zapisu potencjału czynnościowego opisanego w kilku badaniach naukowych. Zapis ten został wykonany na aksonie kałamarnicy, który ma dużą średnicę (~500 μm), co pozwala na umieszczenie mikroelektrody wewnątrz aksonu. Prace te dały ogromne możliwości badań naukowych, których kulminacją było później stworzenie trybu cęgów napięciowych, który został wykorzystany do badania jonowych podstaw generowania potencjału czynnościowego1,2,3,4,5,6,7,8. Z biegiem lat technika ta została udoskonalona i stała się szeroko stosowana w badaniach naukowych6,9. Wynalezienie techniki patch-clamp, które miało miejsce pod koniec lat siedemdziesiątych XX wieku dzięki badaniom zainicjowanym przez Erwina Nehera i Sakmanna, pozwoliło naukowcom rejestrować pojedyncze kanały jonowe i wewnątrzkomórkowe potencjały lub prądy błonowe w praktycznie każdym typie komórki przy użyciu tylko jednej elektrody9,10,11,12. Zapisy patch-clamp mogą być wykonywane na różnych preparatach tkankowych, takich jak hodowane komórki lub wycinki tkanek, w trybie zacisku napięciowego (utrzymywanie błony komórkowej przy ustalonym napięciu, co pozwala na rejestrację, na przykład, prądów zależnych od napięcia i prądów synaptycznych) lub trybie cęgowym (umożliwiającym rejestrację, na przykład, zmian spoczynkowego potencjału błonowego wywołanych prądami jonowymi, potencjały czynnościowe i częstość występowania potencjału postsynaptycznego).

Użycie techniki zacisku krosowego umożliwiło dokonanie kilku znaczących odkryć. Rzeczywiście, przełomowe odkrycia dotyczące właściwości elektrofizjologicznych neuronów kisspeptyny podwzgórza zlokalizowanych w przednio-brzusznych jądrach okołokomorowych i rostralnych jądrach okołokomorowych (AVPV/PeNKisspeptin), znanych również jako rostralny obszar okołokomorowy trzeciej komory (RP3V) i łukowate jądro podwzgórza (ARH kisspeptyna)13,14,15 cieszą się szczególnym zainteresowaniem. W 2010 roku Ducret i in. przeprowadzili pierwsze nagrania neuronów AVPV/PeNKisspeptinu myszy przy użyciu innego narzędzia elektrofizjologicznego, techniki luźnokomórkowego patch-clamp. Badania te dostarczyły elektrycznego opisu neuronów AVPV/PeNKisspeptin i wykazały, że ich wzorce wypalania są zależne od cyklu rujowego16. W 2011 roku Qiu i in. wykorzystali technikę patch-clamp dla całej komórki, aby wykazać, że neuronyARH kisspeptyny wyrażają endogenne prądy rozrusznika serca17. Następnie Gottsch i wsp. wykazali, że neurony kisspeptyny wykazują spontaniczną aktywność i wyrażają zarówno prądy wapniowe typu h (rozrusznik serca), jak i typu T, co sugeruje, że neuronyARH kisspeptyny dzielą właściwości elektrofizjologiczne z innymi neuronami rozrusznika ośrodkowego układu nerwowego18. Ponadto wykazano, że neuronykisspeptyny ARH wykazują dymorficzną szybkość odpalania płciowego i że neurony AVPV/PeNKisspeptin wykazują bimodalny spoczynkowy potencjał błonowy (RMP), na który wpływają wrażliwe na ATP kanały potasowe (KATP)19,20. Ponadto ustalono, że steroidy gonadalne pozytywnie wpływają na spontaniczną aktywność elektryczną neuronów kisspeptyny u myszy19,20,21. Pierwsze prace, które badają właściwości elektrofizjologiczne neuronów kisspeptyny, są wymienione16,17,18,19,20. Od tego czasu w wielu badaniach wykorzystano technikę patch-clamp dla całych komórek, aby wykazać, które czynniki/neuromodulatory są wystarczające do modulowania aktywności elektrycznej neuronów kisspeptyny (Rysunek 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Biorąc pod uwagę znaczenie tej techniki dla badania neuronów niezbędnych do reprodukcji, wśród innych typów komórek, które nie zostały tutaj omówione, ten artykuł opisuje podstawowe kroki do rozwoju techniki patch-clamp dla całej komórki, takie jak przygotowanie roztworów, preparowanie i krojenie mózgu oraz wykonywanie uszczelnienia błony komórkowej dla nagrań. Ponadto omówiono istotne kwestie dotyczące tej techniki, takie jak jej zalety, ograniczenia techniczne i ważne zmienne, które muszą być kontrolowane w celu uzyskania optymalnej wydajności eksperymentalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Instytutu Nauk Biomedycznych na Uniwersytecie w São Paulo i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi przyjętymi przez Brazylijskie Kolegium Eksperymentów na Zwierzętach.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotowanie roztworu wewnętrznego
    UWAGA: Roztwór wewnętrzny wypełnia mikropipetę z zaciskiem krosowym i styka się z wnętrzem ogniwa (patrz przykład w Rysunek 2). Rozwiązania wewnętrzne mogą się różnić w zależności od rodzaju mierzonej aktywności33.
    1. Wybierz rozwiązanie wewnętrzne, biorąc pod uwagę jego eksperymentalny cel i odpowiedni typ rekordu. Aby zarejestrować potencjał membrany w trybie cęgów prądowych, należy użyć wewnętrznego roztworu składającego się ze 120 mM K-glukonianu, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 3 mM KOH, 10 mM KCl i 4 mM (Mg)-ATP. Zważyć wszystkie sole zgodnie z pożądaną objętością końcową, jak podano w tabeli 1.
    2. Użyj wystarczającej ilości wody dejonizowanej, aby osiągnąć 90% końcowej objętości roztworu. Ta objętość zapewni wystarczająco dużo miejsca na dostosowanie pH i osmolarności.
    3. Po dodaniu i dokładnym wymieszaniu wszystkich składników należy za pomocą pH-metru ustawić pH na 7,2-7,3 za pomocą 5 M KOH. Użyj osmometru, aby sprawdzić osmolarność, która powinna wynosić około 275-280 mOsm (w razie potrzeby dostosuj tylko w dół).
    4. Przygotować wcześniej roztwór wewnętrzny i przechowywać w temperaturze 8 °C. Dodać ATP w dniu eksperymentu. Roztwór wewnętrzny zawierający ATP należy przechowywać w temperaturze -20 °C (1 ml podwielokrotności) przez 3-4 miesiące.
  2. Przygotowanie roztworu do krojenia
    1. Przygotować roztwór do krojenia zawierający 238 mM sacharozy, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,0 mM NaH2PO4, 10 mM glukozy, 1,0 mM CaCl2 i 5,0 mM MgCl2. Zważyć wszystkie sole zgodnie z pożądaną objętością końcową, jak pokazano w tabeli 2. Dokładna objętość tego roztworu, który ma być przygotowany, będzie zależeć od wielkości komory tnącej.
    2. Mieszając wszystkie sole w wodzie dejonizowanej, stale nasycaj karbogenem (95%O2 i 5%CO2). Podłącz rurkę polietylenową (średnica zewnętrzna 1.57 mm [OD] x średnica wewnętrzna 1.14 mm [ID]) do cylindra karbogenicznego, aby dostarczyć karbogen do roztworu do krojenia. Trzymać otwarty koniec probówki w zlewce zawierającej roztwór do krojenia.
    3. Po dokładnym wymieszaniu wszystkich składników dostosuj pH do 7,3 za pomocą 10% kwasu azotowego za pomocą pH-metru. Użyj osmometru, aby sprawdzić osmolarność, która powinna wynosić 290-295 mOsm (w razie potrzeby dostosuj tylko w dół). Następnie schłodzić roztwór do temperatury 0-2 °C.
  3. Przygotowanie roztworu CSF do nagrań
    1. Przygotować roztwór sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) do zapisów zawierających 124 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 1,2 mMMgSO4, 5 mM glukozy i 2,5 mM CaCl2. Zważyć wszystkie sole zgodnie z pożądaną objętością końcową, podaną w tabeli 3.
    2. Mieszając wszystkie sole w wodzie dejonizowanej, stale nasycaj karbogenem (95%O2 i 5% CO2), jak opisano w kroku 1.2.2.
    3. Po dodaniu i wymieszaniu wszystkich składników dostosuj pH do 7,3 (można użyć 10% kwasu azotowego) za pomocą pH-metru. Użyj osmometru, aby sprawdzić osmolarność, która powinna wynosić 290-300 mOsm. Następnie wlać aCSF do zlewki i przechowywać w łaźni wodnej w temperaturze 30 °C.

2. Sekcja mózgu i krojenie

UWAGA: Ponieważ różne struktury mózgu mogą wymagać cięcia w różnych płaszczyznach (wycinki czołowe, strzałkowe lub poziome), dokładne podejście do uzyskania wycinków zależy od obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Zazwyczaj do badania komórek wykazujących ekspresję Kiss1 w AVPV / PeN i ARH (tutaj określanych jako neurony AVPV / PeNKisspeptin i neuronyARH kisspeptyny; Rysunek 2A,B), koronalne wycinki mózgu (200-300 μm) są zwykle wykonywane17,19,20,21,34. Neurony AVPV/PeNKisspeptin znajdują się w odległości od -0,5 do -0,22 mm od bregmy, podczas gdy neuronyARH kisspeptyny znajdują się w odległości od -1,22 do -2,70 mm. Położenie jąder można określić za pomocą stereotaktycznego atlasu mózgu myszy 35 lub atlasu referencyjnego mózgu myszy Allena (http://mouse.brain-map.org/). W tym badaniu wykorzystano dorosłe samice Kiss1-Cre/GFP (stadium diestrus) i samce myszy36.

  1. Usunięcie mózgu
    1. Przygotuj miejsce sekcji i narzędzia potrzebne do ekstrakcji mózgu: nożyczki do dekapitacji, nożyczki do tęczówki, zakrzywione nożyczki Castroviejo, osteotom, pęseta, szpatułka, bibuła filtracyjna, szalka Petriego, żyletka i klej cyjanoakrylowy.
    2. Przed wykonaniem plastrów należy przygotować stół, na którym zostanie przeprowadzona sekcja, ponieważ wszystkie kolejne zabiegi muszą być wykonywane szybko. Upewnij się, że masz dostęp do urządzenia do krojenia, takiego jak wibratom.
    3. Przygotuj komorę rejestracyjną, aby utrzymać plastry mózgu przed pokrojeniem tkanki. Kup komorę nagrywającą o wymiarach wanny 24 mm x 15 mm x 2 mm (dł. x szer. x wys.) marki handlowej (tabela materiałów) lub wykonaj ją we własnym zakresie.
      UWAGA: Wewnętrzną komorę rekonwalescencyjną można wyprodukować w następujący sposób: wyciąć płytkę 24-dołkową tak, aby dostępnych było dziewięć dołków. Przyklej nylonowy ekran do podstawy dziewięciu studzienek. Z pozostałą częścią płytki studzienki wykonaj podstawę tak, aby dolna część nylonu była wolna. Tak przystosowaną bazę można umieścić w zlewce o pojemności 500 ml zawierającej aCSF (rysunek uzupełniający 1).
    4. Po przygotowaniu wszystkiego znieczulij zwierzę wziewnym środkiem znieczulającym przy użyciu 4%-5% izofluranu. Znieczulenie musi być zgodne z protokołem zatwierdzonym przez komisję etyczną. Krótko po tym, jak zwierzę jest unieruchomione, wykonaj testy szczypania ogona i łapy, aby upewnić się, że zwierzę jest głęboko znieczulone.
    5. Szybko odetnij głowy myszom, gdy serce jest nadal aktywne, aby zwiększyć żywotność komórek. Zbierz mózg szybko po ścięciu.
    6. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w skórze na szczycie czaszki zwierzęcia, od ogona do rostralu, i usuń skórę głowy z głowy zwierzęcia. Następnie przeciąć płytkę międzyciemieniową wzdłuż szwu strzałkowego nożyczkami do tęczówki i usunąć kość potyliczną. Wsuń osteotom pod kość ciemieniową i delikatnie go wyciągnij, aż mózg zostanie odsłonięty.
    7. Po odsłonięciu mózgu odwróć głowę do góry nogami, delikatnie opuść mózg, aby uwidocznić nerw trójdzielny z każdej strony, a następnie przetnij nerw trójdzielny za pomocą zakrzywionych nożyczek Castroviejo. Po wizualizacji podwzgórza zidentyfikuj nerw wzrokowy i delikatnie go przetnij.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas przecinania nerwu wzrokowego, ponieważ pociągnięcie go spowoduje rozerwanie sąsiedniego obszaru podwzgórza zawierającego jądro AVPV/PeN.
    8. Wytnij najbardziej przednią część płata czołowego i całkowicie usuń mózg. Natychmiast zanurz mózg w roztworze do krojenia, aż do uzyskania plasterków.
  2. Krojenie próbek mózgu
    1. Umieść mózg na bibule filtracyjnej (podpartej na szalce Petriego), aby wysuszyć nadmiar roztworu. Następnie za pomocą ostrej żyletki do cięcia wykonaj cięcie koronalne oddzielające pień mózgu z móżdżkiem od reszty tkanki.
    2. Następnie przyklej ogonową część mózgu do podstawy wibratomu i wypełnij komorę urządzenia do krojenia roztworem do krojenia/aCSF schłodzonym do 0-2 °C. Podczas zabiegu owiń suchy lód wokół komory wibratomowej, aby roztwór do krojenia był zimny.
    3. Włóż żyletkę do wibratomu i ustaw odpowiednie parametry cięcia urządzenia: prędkość = 3, częstotliwość = 9 i posuw = 250 μm. Użyj akrylowej pipety transferowej (pipeta z odwróconego szkła Pasteura przymocowana do silikonowego smoczka), aby przenieść plastry do komory odzyskiwania (opisanej w kroku 2.1.3) podczas procedury krojenia tkanek. Odczekaj 60 minut na regenerację tkanki po pobraniu plastra.

3. Uszczelnianie komórek do nagrywania

  1. Upewnij się, że wszystkie elementy wyposażenia (mikroskop, amplifier, digitizer, mikromanipulator i inne) są włączone przed rozpoczęciem nagrywania.
  2. Napełnij komorę zapisu, marki handlowej (Tabela Materiałów), dołączoną do mikroskopu roztworem aCSF do nagrań. Użyj pompy perfuzyjnej, aby stale perfuzjować aCSF z szybkością 2 ml/min.
  3. Przenieś interesujący Cię wycinek mózgu (pojedynczo) do komory nagraniowej. Użyj akrylowej pipety transferowej (odwrócona szklana pipeta Pasteura przymocowana do silikonowego smoczka), aby przenieść plastry podwzgórza do komory. Użyj kotwicy plasterka (Tabela materiałów), aby przytrzymać plasterek, aby nie poruszał się podczas perfuzji CSF.
  4. Umieść plasterek na środku komory rejestracyjnej przymocowanej do mikroskopu. Pozycja warstwy ma kluczowe znaczenie, aby umożliwić dobry widok żądanego obszaru pod mikroskopem i zapewnić doskonały zasięg mikropipety rejestrującej.
  5. Użyj soczewki obiektywu mikroskopu immersyjnego o małej mocy (10x lub 20x), aby pomóc w ustawieniu wycinka i zlokalizowaniu obszaru zainteresowania.
  6. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania zmień soczewkę obiektywu na soczewkę o dużej mocy (63x) i skup się na poziomie tkanki, obserwując endogenne białko fluorescencyjne i kształty komórek w regionie docelowym, aby zlokalizować komórki kisspeptyny na powierzchni wycinka mózgu20.
  7. Gdy znajduje się możliwa komórka docelowa, zaznacz ją na ekranie komputera kursorem myszy lub rysując format, taki jak kwadrat, nad obszarem zainteresowania. Znacznik ekranowy komputera pomaga wskazać pozycję mikropipety rejestrującej do celi.
  8. Po ustaleniu dokładnego położenia celi docelowej należy podnieść obiektyw i wprowadzić mikropipetę rejestrującą wypełnioną roztworem wewnętrznym. Umieszczając mikropipetę w uchwycie elektrody, upewnij się, że roztwór wewnętrzny styka się z elektrodą srebrną.
    UWAGA: Informacje na temat przygotowania, umieszczenia i umiejscowienia mikropipety na uchwycie elektrody można znaleźć na stronie 33.
  9. Przed zanurzeniem mikropipety w roztworze aCSF, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń do mikropipety, należy zastosować nadciśnienie za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem o pojemności 1-3 ml połączonej z uchwytem mikropipety za pomocą rurki polietylenowej (≈130 cm dłuższej); nanieść prawie 100-200 μl powietrza.
  10. Za pomocą mikromanipulatora poprowadź mikropipetę poniżej środka obiektywu. Przesuń przyciski na mikromanipulatorze, aby poprowadzić mikropipetę na osi X-Y-Z w kierunku interesującej Cię komórki.
  11. Ustaw ostrość tak, aby była widoczna końcówka mikropipety i zbliż ostrość do plasterka, ale nie za blisko. Zmniejsz prędkość mikromanipulatora i powoli opuść mikropipetę do płaszczyzny ostrości. Upewnij się, że końcówka mikropipety nie wnika gwałtownie w plasterek, ale raczej powoli opada, aż dotknie powierzchni komórki/obszaru docelowego.
  12. Zastosuj lekkie nadciśnienie (≈100 μl) za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem o pojemności 1-3 ml podłączonej do uchwytu mikropipety, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia ze ścieżki podejścia.
  13. Skoncentruj się na celi docelowej i powoli przesuwaj mikromanipulator na osi X-Y-Z, aby zbliżyć mikropipetę do celi docelowej. Po przytknięciu mikropipety do celi można zaobserwować wgłębienie spowodowane ciśnieniem wywieranym przez końcówkę mikropipety (Rysunek 2C).
  14. Po uformowaniu wgłębienia, ze względu na bliskość mikropipety do celi, należy zastosować słabe, krótkie odsysanie przez usta (1-2 s) przez rurkę podłączoną do uchwytu mikropipety, aby wytworzyć uszczelnienie między mikropipetą a celą (uszczelka gigaomowa lub gigapipeta >1 GΩ; Rysunek 2D). Aby utworzyć pieczęć, użyj trybu cęgów napięcia w oprogramowaniu. Szczegółowe informacje na temat formowania uszczelnień można znaleźć na stronie 33.
  15. Jeśli uszczelnienie pozostaje stabilne (uszczelnienie gigaomowe powinno być stabilne mechanicznie i bez zakłóceń hałasu, określonych przez obserwację przez około 1 min), należy ustawić napięcie podtrzymania na najbliższym fizjologicznym potencjale spoczynkowym interesującego nas ogniwa. W przypadku neuronów podwzgórza kisspeptyny zaleca się -50 mV.
  16. Zastosuj krótkie odsysanie przez usta (podciśnienie) z mikropipetą przytwierdzoną do komórki, aby przerwać błonę plazmatyczną (Rysunek 2E). Odpowiednią konfigurację całej komórki uzyskuje się, gdy ssanie odbywa się z wystarczającą siłą, aby pęknięta membrana nie zatkała mikropipety i nie przyciągnęła znacznej części membrany, a nawet komórki.
  17. Sprawdź używaną instrukcję ustawień systemowych. Użyj oprogramowania (patrz tabela materiałów), aby cyfrowo sprawdzić i obliczyć rezystancję szeregową (SR) oraz pojemność całego ogniwa (wcc).
  18. W trybie cęgowania napięcia, po zerwaniu błony komórkowej, włącz opcję całego ogniwa i kliknij polecenie Auto odnoszące się do zakładki całe ogniwo. SR i wcc komórki zostaną automatycznie obliczone i natychmiast wyświetlone przez oprogramowanie. Parametry te można również sprawdzić, wykonując test membrany ze wzmacniaczem wymienionym w Tabeli Materiałów33.
  19. Upewnij się, że sprawdziłeś parametry żywotności komórek. W przypadku neuronów kisspeptyny sprawdź, czy pomiary elektrofizjologiczne wynoszą: SR < 25 mΩ, rezystancja wejściowa > 0,3 GΩ i aktualna wartość bezwzględna < 30 pA (osobiste obserwacje i odniesienie21). Średnia wartość wcc neuronówkisspeptyny AVPV/PeN lub ARHkisspeptyny wynosi ≈ 10-12 pF u myszy z nienaruszonymi gonadami20.
  20. Monitoruj SR i pojemność ogniwa w stanie ustalonym podczas eksperymentów. Upewnij się, że SR nie zmienia się o więcej niż 20% podczas nagrywania i że pojemność membrany jest stabilna.
  21. Sprawdź ustawienia oprogramowania. Utwórz konkretne protokoły dla nagrań w zależności od rodzaju eksperymentu. Aby zarejestrować potencjał membrany w trybie cęgowym prądowym, za pomocą sprzętu wymienionego w Tabeli materiałów, filtruj dolnoprzepustowe sygnały elektrofizjologiczne przy 2-4 kHz i analizuj wyniki w trybie offline w oprogramowaniu (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania informacji o oprogramowaniu).
  22. Po prawidłowym osiągnięciu konfiguracji całego ogniwa zmierz prądy synaptyczne w trybie cęgów napięciowych (Rysunek 2G). Rejestruj zmiany spoczynkowego potencjału błonowego (RMP) i indukowane zmiany RMP w trybie cęgów prądowych (Rysunek 2H). Zmiany w RMP, takie jak depolaryzacja błony komórkowej, mogą być wywołane przez podanie do kąpieli znanego leku/neuroprzekaźnika (opisanego w kroku 3.2), jak pokazano w Rysunek 1.
    UWAGA: W trybie cęgów prądowych można wstrzyknąć prąd dodatni lub ujemny, aby utrzymać napięcie membrany na żądanym napięciu. W przypadku neuronów kisspeptyny zwykle ustawiamy wstrzyknięcie prądu zerowego (I = 0), aby zarejestrować spontaniczną zmianę potencjału błonowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zbadać możliwy wpływ ludzkiego rekombinowanego hormonu wzrostu (hGH) na aktywność podwzgórzowych neuronów kisspeptynowych, wykonaliśmy rejestrację metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell w skrawkach mózgu i oceniliśmy, czy hormon ten wywołuje ostre zmiany w aktywności neuronów AVPV/PeNKisspeptin oraz ARHkisspeptin. W badaniu wykorzystano dorosłe samice (w fazie diestrus) i samce myszy Kiss1-Cre/GFP36. Do eksperymentów wybrano zwierzęta z nieusuniętymi gonadami, ponie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowanie techniki patch-clamp całokomórkowych wywarło znaczący wpływ na społeczność naukową, ponieważ uważa się, że ma ogromne znaczenie dla rozwoju badań naukowych i umożliwiło dokonanie kilku odkryć. Jego wpływ na naukę był wystarczający, aby osiągnąć kulminację w Nagrodzie Nobla w dziedzinie medycyny w 1991 roku, ponieważ odkrycie to otworzyło drzwi do lepszego zrozumienia, jak funkcjonują kanały jonowe w warunkach fizjologicznych i patologicznych, a także do identyfikacji potencjalnych celów dla środków terapeutyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie należy zgłaszać konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Fundację Badawczą São Paulo [numery grantów FAPESP: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); oraz przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Kod finansowy 001" (HRV).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Związki do aCSF, roztwory wewnętrzne i do krojenia
ATPSigma Aldrich/różneA9187
CaCl2Sigma Aldrich/różneC7902
D-(+)-GlukozaSigma Aldrich/różneG7021
EGTASigma Aldrich/różneO3777
HEPESSigma Aldrich/różneH3375
KCLSigma Aldrich/różneP5405
K-glukonianSigma Aldrich/różneG4500
KOHSigma Aldrich/różneP5958
MgCl2Sigma Aldrich/różneM9272
MgSO4 Sigma Aldrich/różne230391
NaClSigma Aldrich/różneS5886
NaH2PO4 Sigma Aldrich/różneS5011
NaHCO3Sigma Aldrich/różneS5761
kwas azotowySigma Aldrich/różne225711UWAGA
SacharozaSigma Aldrich/różneS1888
Equipments
Air tableTMC63-534
WzmacniaczUrządzenia molekularneMulticlamp 700B
Komputerróżny-DIGIDATA
1440 SYSTEM AKWIZYCJI DANYCH O NISKIM POZIOMIE SZUMÓWUrządzenia molekularneDD1440
Cyfrowa pompa perystaltycznaIsmatecISM833C 
Klatka FaradayaTMC81-333-03
Kamera do obrazowaniaLeicaDFC 365 FX
MikromanipulatorSutter InstrumentsRoe-200
Ściągacz do mikropipet MikroskopNarishigePC-10
LeicaDM6000 FS
OsteotomBonther sprzęt i Tecnologia/różne128
Komora regeneracyjnaWarner Instruments/Aparatura Harvard-może być wykonana we własnym
zakresie Komora nagraniowaWarner Instruments640277
SpatulaFisher Scientific / różneFISH-14-375-10; RYBA-21-401-20
Wibratom LeicaVT1000 S
 Fisher Scientific /różneIsotemp
Oprogramowanie i systemy
Oprogramowanie AxoScope 10Oprogramowanie MolecularDevices-Commander
System szerokokątny LAS XAkwizycja i analiza obrazówLeica-Image
Urządzenia molekularneMultiClamp 700BOprogramowanieMULTICLAMP 700B
OPROGRAMOWANIE PCLAMP 10 DLAWINDOWS Urządzenia molekularnePclamp 10 Standard
Tools
Ag/AgCl elektroda, granulka, 1,0 mmWarner Instruments64-1309
Zakrzywiony kleszczyk hemostatycznyróżny-klej
cyjanoakrylowyLOCTITE/różne-
Nożyczki do dekapitacjiróżne-
Bibuła filtracyjnaróżne-
Kapilary szklane (mikropipety)World Precision Instruments, IncTW150F-4
Akcesoria Bonther i Tecnologia/różne65-66
Pipeta szklana Pasteura Sigma Aldrich / różneCLS7095B9-1000EA
szalka Petriegoróżne
rurki polietylenowe Warner Instruments64-0756
Żyletka do preparacji mózguTED PELLATEDP-121-1
Żyletka do wibratomuTED PELLATEDP-121-9
NożyczkiBonther akcesoria & Tecnologia/różne71-72, 48,49;  
smoczek silikonowyróżny-Kotwica
Slice Warner Instruments64-0246
Filtry strzykawkoweMerck Millipore LtdaSLGVR13SLMillex-GV 0,22 μ m
PęsetaBonther equipamentos & Tecnologia/various131, 1518
Kąpiel wodna Commander Nożyczki do irysów

Bibliografia

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357(2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532(2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006(2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698(2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , Academic Press. (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscience. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380(1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449(1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. Electrolyte Solutions. 2nd edition. , Butterworths Scientific. (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246(2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928(2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045(2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957(2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425(2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Neurony podwzg rzaw a ciwo ci elektrofizjologiczneprzygotowanie skrawka m zguspoczynkowy potencja b onowypr dy synaptyczneclamp napi ciowyclamp pr dowyRTPCR pojedynczej kom rki
Podwzgórzowe neurony kisspeptyny jako cel dla nagrań patch-clamp dla całych komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.