Żywiące się krwią stawonogi, takie jak komary, kleszcze i muchy piaskowe, przenoszą kilka patogenów istotnych z medycznego punktu widzenia, z których wiele jest niedostatecznie zbadanych i brakuje im odpowiednich środków terapeutycznych. Dlatego zapobieganie przenoszeniu chorób często wymaga celowania w stawonoga1. Na przykład zintegrowane zarządzanie wektorami (IVM) to kompleksowe ramy, które mają na celu zwiększenie skuteczności tradycyjnych metod zwalczania wektorów, takich jak insektycydy, poprzez rozszerzenie ich o bardziej innowacyjne metody, takie jak kontrola genetyczna2. Ta specjalna kolekcja podkreśla różnorodny wachlarz transgenicznych stawonogów generowanych w celu badania i kontrolowania chorób przenoszonych przez wektory, a także umiejętności techniczne i twórcze niezbędne do rozwoju takich genetycznie zmodyfikowanych organizmów.
Relacje stawonogi-patogen-gospodarz ewoluują przez wiele lat, aby ukształtować genetykę wszystkich dotkniętych gatunków 3,4,5. Systemy modelowe są zazwyczaj nieodpowiednie do badania stawonogów żywiących się krwią, ponieważ ich biologia i zachowania są specyficzne dla gatunku. Entomolodzy molekularni muszą odtworzyć złożone środowiska, które pozwalają na odżywianie się krwią i rozmnażanie, aby poszczególne gatunki mogły być rutynowo utrzymywane i badane w laboratorium w kontrolowanych warunkach. Hodowla stawonogów hematofagicznych wymaga zarówno wiedzy biologicznej, jak i "skrupulatnej uwagi wykwalifikowanych osób"6. Z tego powodu nic dziwnego, że biologia wektorowa znajduje się w czołówce innowacji genetycznych.
Chociaż to wydanie specjalne dotyczy generowania transgenicznych stawonogów z różnych rodzajów, wyłania się jeden główny temat: proces ten wymaga dużej dbałości o szczegóły, dokładnego zrozumienia biologii organizmu i pomysłowego sposobu myślenia. Louradour i wsp.7 zwracają uwagę na wyzwania związane z dostosowaniem technik mikroiniekcji embrionalnych do wektorów pasożytów Leishmania – a mianowicie muszek piaskowych – które składają bardzo małe jaja. Świeżo złożone jaja przenosi się na pojedyncze kawałki czarnej bibuły filtracyjnej na szkiełku mikroskopowym z szkiełkiem nakrywkowym i starannie ustawia się w kolejce do mikroiniekcji. Poziom wilgotności, jakość przygotowanych materiałów i staranność, z jaką przeprowadzany jest proces, to tylko kilka zmiennych, które decydują o powodzeniu techniki. Mikroiniekcja jaj kleszcza twardego wiąże się z różnymi wyzwaniami – grubą zewnętrzną warstwą wosku na zarodkach, twardą kosmówką i wysokim ciśnieniem wewnątrzowalnym8. Sharma i wsp. opisują procedury u Ixodes scapularis , które pokonują te przeszkody poprzez usunięcie warstwy woskowiny, zmiękczenie kosmówki i wysuszenie jaj8. Obejmują one ablację narządu (gruczołu woskowego) Gené od samic składających jaja, zebranie jaj w ciągu 24 godzin od złożenia jaj, a następnie umieszczenie jaj w 1% (w/v) roztworze chlorku sodu na około 1 godzinę przed mikrowstrzyknięciem8.
Możliwe jest obejście embrionalnych mikroiniekcji poprzez wstrzyknięcie poczwarkom lub dorosłym osobnikom maszynerii, która edytuje lub wycisza geny. Benetta i wsp. opisują tę technikę przy użyciu dwóch metod dostarczania jajników – transdukcji ładunku jajnika za pośrednictwem receptora (ReMOT Control) lub rozgałęzionych kapsułek z peptydami amfifilowymi (BAPC) – a także dwóch strategii wstrzykiwania (rurki Femtojet lub aspiratora) w pasożytniczej osie klejnotowej Nasonia vitripennis9. Poczwarki ustawiono w rzędzie i przymocowano do szkiełka mikroskopowego za pomocą kleju, aby ułatwić proces wstrzykiwania i zmniejszyć śmiertelność9. Z kolei dorośli byli znieczuleni na lodzie, aby użytkownik mógł podtrzymać samicę kleszczami podczas iniekcji w brzuch.
Oprócz edycji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9, wydanie to obejmuje inne technologie inżynierii genetycznej stosowane w stawonogach, w tym ukierunkowaną na miejsce rekombinazę φC31 i GAL4-UAS. Pierwsza, opisana przez Adolfiego i wsp., osiąga ukierunkowaną na miejsce integrację ładunku transgenicznego flankowanego przez attB w celu pojedynczej integracji lub wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy w wektorach malarii Anopheles gambiae i Anopheles stephensi10. Technologia ta pozwala na ukierunkowane wprowadzanie do linii dokujących, które zostały wcześniej ustanowione, co upraszcza walidację, unikając efektów pozycyjnych i dalszych schematów kojarzenia niezbędnych dla stabilnej linii genetycznej10. Druga technika, dwuczęściowy system GAL4-UAS, jest wykorzystywana przez Poultona i wsp. do generowania transgenicznych Anopheles gambiae , które eksprymują kasety transgenowe w sposób czasoprzestrzenny, specyficzny dla tkanki, nawet kosztem poważnych kosztówsprawności11. Ze względu na swoją elastyczność, system ten pozwala badaczom badać fenotypy i wnioskować o funkcjach genów, które w innym przypadku mogą być niemożliwe.
Rzeczywiście, ładunek transgeniczny często wiąże się z kosztami sprawności stawonogów; dlatego Williams i in. opracowali proste protokoły pomiaru kosztów sprawności u transgenicznych komarów Aedes aegypti 12. Obejmowały one płodność, rozmiar i kształt skrzydeł, płodność, stosunek płci, żywotność, czas rozwoju, wkład samców i długowieczność dorosłego osobnika12. Takie pomiary dopasowania mogą być wykorzystane do porównania stanu zdrowia transgenicznych komarów generowanych w różnych badaniach lub do modelowania tempa fiksacji transgenu w modelach matematycznych.
Szczegóły metodologiczne w tych rękopisach są ilustrowane wizualnie, aby ułatwić ich powielanie. Przedstawiono różnorodne techniki molekularne i entomologiczne: określanie płci i badanie przesiewowe poczwarek komarów pod kątem markerów fluorescencyjnych11,12; łączenie i oczyszczanie mieszanin plazmidowych dawcy i pomocnika φC3110; wstrzykiwanie dorosłych os jubilerskich dobrzusznie9; ustawianie jaj muchy piaskowej do mikroiniekcji7; i ablacja gruczołów woskowych kleszczy8. Biorąc pod uwagę szeroki zakres technik omówionych w tym wydaniu specjalnym, zarówno amatorzy, jak i eksperci są zaproszeni do zapoznania się z podstawami generowania genetycznie zmodyfikowanych stawonogów. Techniki te stanowią podstawę do badania fizjologii stawonogów i interakcji wektor-patogen, które są niezbędne do opracowania nowych strategii ograniczających choroby przenoszone przez wektory.