Tutaj prezentujemy protokół o wysokiej przepustowości do przejściowego transfekcji milionów protoplastów kukurydzy do testowania dużych bibliotek plazmidów w komórkach mezofilu kukurydzy.
Artykuł metodologiczny
Skalowalna transfekcja protoplastów mezofilu kukurydzy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Transfekcja komórek mezofilu kukurydzy często polega na trawieniu ścian komórkowych roślin w celu wytworzenia protoplastów, a następnie wprowadzeniu DNA za pomocą elektroporacji lub glikolu polietylenowego (PEG). Poprzednie metody zostały opracowane w celu wytworzenia dziesiątek tysięcy transfekowanych protoplastów jednocześnie. W tym miejscu opisujemy prostą metodę izolacji i transfekcji milionów protoplastów mezofilu liści w kukurydzy (Zea mays L.). Ten uproszczony proces eliminuje niektóre typowe etapy protoplastingu, takie jak mycie w W5. Ponadto etapy takie jak wirowanie, transfekcja za pośrednictwem PEG i inkubacja zostały zmodyfikowane tak, aby działały z większą liczbą protoplastów. Zdolność do ekspresji dużych bibliotek konstruktów plazmidowych umożliwia eksperymenty na skalę genomu, takie jak masowo równoległe testy reporterowe w kukurydzy.
Wprowadzenie
Przejściowa ekspresja genów jest potężnym narzędziem w biologii roślin. Jednak komórki roślinne są trudne do transfekcji, ponieważ są otoczone ścianą komórkową. Ta bariera wnikania DNA nie występuje w innych powszechnie badanych typach komórek, takich jak komórki ssaków lub owadów. Wcześniejsze badania zajęły się tym wyzwaniem, wykorzystując protoplasty: komórki roślinne, których ściany komórkowe zostały strawione i usunięte. W przeciwieństwie do nieprzetworzonej tkanki liścia, protoplasty roślinne są łatwe w obróbce w zawiesinie i podatne na techniki transfekcji, w których pośredniczy elektroporacja lub glikol polietylenowy (PEG)1. Komórki roślinne zachowują wiele ze swojej funkcjonalności nawet po usunięciu ściany komórkowej. W związku z tym protoplasty są używane w różnych roślinach do badania funkcji genów i białek2,3, aby zrozumieć transdukcję sygnału4, oraz zidentyfikować możliwe cele hodowli roślin5. Protoplasty są również wygodnym narzędziem do badań przesiewowych konstruktów edycji genomu u różnych gatunków roślin uprawnych, w tym pszenicy i ziemniaka6,7. Krótko mówiąc, testy przejściowe w protoplastach są niezbędne w biotechnologii rolniczej.
Kukurydza (Zea mays L.) jest światowym liderem pod względem tonażu upraw zbóż; jako taka, jest głównym przedmiotem podstawowych i stosowanych badań nad roślinami8. Jednak w przeciwieństwie do roślin modelowych, takich jak Nicotiana tabacum9, przejściowa ekspresja transgenu w nienaruszonych liściach kukurydzy nie jest rutynowo wykonywana. Protoplasting został wykorzystany do uzyskania i transfekcji komórek mezofilu liści kukurydzy10,11. Poprzednie metody osiągały wydajność transfekcji do 75% przy użyciu elektroporacji i produkowały transfekowane protoplasty w skali dziesiątek tysięcy10,15.
Ten protokół szczegółowo opisuje, jak protoplastować miliony komórek mezofilu kukurydzy i transfekować je z wydajnością porównywalną do poprzednich metod. Główne etapy to uprawa etiolowanych sadzonek kukurydzy, zbieranie tkanki liści, trawienie ściany komórkowej rośliny i dostarczanie plazmidowego DNA do komórek za pomocą PEG. Kluczowym wkładem tego protokołu jest możliwość zwiększenia skali transfekcji protoplastów przy jednoczesnym utrzymaniu żywotności komórek wymaganej do testów funkcjonalnych. Umożliwia to wykorzystanie eksperymentów na skalę genomu, takich jak masowo równoległe testy reporterowe, które mogą testować funkcję setek tysięcy regionów w całym genomie kukurydzy. Metoda ta została ostatnio wykorzystana do zbadania dużych bibliotek cis-regulatorowych elementów DNA, w tym wzmacniaczy i promotorów12,13,14.
Protokół
1. Wzrost materiału roślinnego
- Ziarna kukurydzy opłucz dwukrotnie wodą z kranu. Namocz ziarna w wodzie z kranu na noc w temperaturze pokojowej.
- Następnego dnia napełnij tackę startową na 72 komórki nasion zwilżonym mchem wermikulitowo-torfowym w stosunku 1:1. Opłucz ziarna raz i posadź je czubkiem do dołu, po jednym ziarnie na komórkę.
- Rośnie w warunkach długiego dnia (16 godzin światła, 8 godzin ciemności) w temperaturze 25 °C przez 3 dni.
- Przenieś do stałej ciemności w temperaturze 25 °C i rośnie przez 9-11 dni.
2. Izolacja plazmidu
- Przekształć komercyjną chemicznie kompetentną E. coli za pomocą plazmidu (plazmidów) zgodnie z instrukcjami producenta.
- Wyhodować przekształconą E. coli w 50 ml płynnej pożywki LB z odpowiednimi antybiotykami przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
- Granulować E. coli przez odwirowywanie przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze pokojowej. Wyodrębnij plazmidy za pomocą dostępnego w handlu zestawu do izolacji plazmidu midiprep.
- Oszacuj stężenie plazmidowego DNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.
UWAGA: Materiał nadający się do transfekcji powinien mieć stężenie ≥800 ng/μl i A260/A280 ≥1,8.
3. Izolacja protoplastów
- Przygotować 20 ml roztworu enzymu.
- Dodać 2,18 g mannitolu, 0,30 g celulazy R-10 i 0,06 g macerozymu R-10 do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Odwróć, aby wymieszać proszki. Dodaj dejonizowany H2O do 15 ml. Dodać 200 μl 1 M MES o pH 5,7. Wirować do mieszania.
- Podgrzewać roztwór w temperaturze 55 °C przez 10 min. Schłodzić w temperaturze pokojowej przez 10 min.
- Dodać 20 μl 1 M CaCl2, 0,02 g albuminy surowicy bydlęcej i 100 μl 1 M β-merkaptoetanolu.
- Napełnić do 20 ml dejonizowanymH2O. Wlać do zawinięta w folię zlewki o pojemności 250 ml.
- Wyjmij sadzonki kukurydzy z ciemności. Wytnij je kilka centymetrów nad ziemią za pomocą nowej żyletki. Umieść odcięte końce w wodzie. Przechowuj je w ciemności w temperaturze pokojowej, gdy nie są używane.
- Wybierz drugi i trzeci liść każdej sadzonki, uważając, aby wykluczyć liście z brązowymi lub uszkodzonymi obszarami. Wybierz 12-16 liści. Odetnij ~1 cm od czubka każdego liścia i wyrzuć. Następnie odetnij 10 cm odcinek z każdego liścia.
UWAGA: Jeśli potrzeba więcej tkanki, użyj dodatkowych 20 ml objętości roztworu enzymatycznego w dodatkowej zlewce o pojemności 250 ml. Zbyt duża ilość materiału liściowego w danej ilości roztworu enzymatycznego może zmniejszyć żywotność. - Ułóż sekcje liści jeden na drugim, tak aby podstawowe końce były razem. Zacisnąć wiązkę razem na podstawowym końcu za pomocą spinacza do segregatora. Ułóż wiązkę liści na kawałku białego papieru.
- Chwyć liście ~1 cm od dystalnego końca. Za pomocą nowej żyletki pokrój liście od dystalnego końca prostopadłego do żył w cienkie (0,5-1 mm) plasterki. Unikaj siekania prosto w dół, ale raczej rób krótkie, wysunięte do przodu plasterki przez tkankę.
- Wymień żyletki, gdy widoczne pozostałości zaczną osadzać się na papierze. Widoczny pozostał wskazuje na zacieranie tkanki z powodu ostrza lub złej techniki.
- Po odcięciu ~2 cm długości wiązki liści, niezwłocznie przenieś plastry do zlewki z roztworem enzymu. Nie pozwól, aby materiał wyschł, ponieważ zmniejszy to liczbę uzyskanych protoplastów. Delikatnie zakręć roztworem enzymu, aby zwilżyć materiał.
- Umieść foliową pokrywkę na zlewce, aby zablokować światło. Powtarzaj proces krojenia i przenoszenia, aż cała wiązka zostanie przycięta blisko spinacza do segregatora.
- Przenieś zlewkę z roztworem enzymu do słoika dzwonowego. Infiltrować próżnię w zakresie od -50,8 kPa do -67,7 kPa w stosunku do ciśnienia otoczenia przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
- Przenieś zlewkę do wytrząsarki stołowej. Wstrząsać z prędkością 40 obr./min przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej. Delikatnie zakręć zlewką ręcznie. Po całkowitym strawieniu roztwór enzymatyczny będzie wyglądał na lekko mleczny. Jeśli roztwór jest nadal klarowny, kontynuuj wytrząsanie z prędkością 40 obr./min przez maksymalnie jedną dodatkową godzinę. Nie przekraczać 3,5 godziny.
- Podczas trawienia przygotuj roztwór mannitol + MES + MgCl2 (MMG), roztwór glikolu polietylenowego (PEG) i roztwór do inkubacji.
- MMG: Dodać 5,47 g mannitolu, 200 μl 1 M MES o pH 5,7 i 750 μl 1 M MgCl2 do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Napełnij do 50 ml destylowanym H2O. Vortex do rozpuszczenia. Ułóż na lodzie.
- Roztwór do inkubacji: Dodać 5,47 g mannitolu, 200 μl 1 M MES o pH 5,7 i 200 μl 1 M KCl do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Napełnij do 50 ml destylowanym H2O. Vortex do rozpuszczenia. Ułóż na lodzie.
- Roztwór PEG: Dodać 0,44 g mannitolu, 1,0 g PEG i 400 μl 1 M CaCl2 do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Napełnij do 4 ml destylowanymH2O. Vortex do wymieszania. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez 30 minut, aż do całkowitego rozpuszczenia. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Potrząsaj roztworem enzymu przy 80 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Umieścić zlewkę z roztworem enzymu na lodzie. Nie zdejmuj foliowego pokrycia. Dodaj 20 ml lodowatego MMG do roztworu enzymu. Przefiltrować przez sitko o pojemności 40 μm do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
UWAGA: Trzymaj wszystkie roztwory na lodzie przez kolejne kroki, aż do dodania PEG. Trzymaj protoplasty przykryte folią, aby zminimalizować ekspozycję na światło. - Podzielić filtrat na równe objętości po 10 ml każda. Wlej każdą objętość do okrągłodennej szklanej probówki wirówkowej i wiruj przez 4 minuty przy 100 x g w temperaturze pokojowej.
- Odrzucić supernatant i dodać 1 ml lodowatego MMG do każdej probówki. Ponownie zawiesić granulki, delikatnie obracając i stukając w rurki. Połączyć próbki w jedną okrągłodenną szklaną probówkę wirówkową. Dodaj MMG do całkowitej objętości 5 ml. Wirować przez 3 minuty w temperaturze 100 x g w temperaturze pokojowej.
- Umyć 5 ml MMG i wirować przez 3 minuty w temperaturze 100 x g w temperaturze pokojowej.
- Powtórz pranie z 5 ml MMG i wiruj przez 3 minuty w 100 x g w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu drugiego płukania sprawdzić, czy supernatant jest klarowny. Jeśli nadal jest mętny, wykonaj trzecie pranie.
- Zawiesić protoplasty w 1 ml MMG. Przykryj luźno folią i trzymaj na lodzie.
- Określ wydajność protoplastów i sprawdź żywotność.
- W probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml dodaj razem 4 μl protoplastów i 72 μl MMG.
- W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dodaj 1 μl 0,5% roztworu podstawowego dioctanu fluoresceiny (FDA) do 49 μl MMG, aby uzyskać 20-krotny roztwór roboczy. Dodać 4 μl roztworu roboczego FDA do probówki z rozcieńczonymi protoplastami. Inkubować przez 5 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
- Załadować 11 μl mieszaniny protoplastów na hemocytometr. Umieść pod mikroskopem światła jasnego pola. Wizualnie potwierdź, że komórki nie mają ścian komórkowych. Następnie policz liczbę protoplastów. Użyj tej liczby, aby oszacować całkowitą liczbę uzyskanych protoplastów. Następnie policz liczbę protoplastów, które fluoryzują na zielono w świetle UV po zabarwieniu FDA. Udane izolacje protoplastów dają żywotność na poziomie 70%-90%.
4. Transfekcja za pośrednictwem PEG
- Zaczynając od szacowanego stężenia protoplastów z kroku 3.17, dostosuj do ~10 000 protoplastów/μl. Jeśli stężenie jest niskie, odwirować przez 3 minuty przy 100 x g i ponownie zawiesić w MMG do stężenia ~10 000 protoplastów/μl.
- Wymieszaj ~ 1 000 000 protoplastów z 15 μg DNA w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Uzupełnić mieszaninę MMG do 114,4 μl i inkubować na lodzie przez 30 minut.
- Ponownie zawieś protoplasty, stukając w bok probówki. Dodaj 105,6 μl 25% roztworu PEG do protoplastów, aby osiągnąć końcową masę/objętość 12% PEG. Delikatnie wymieszaj, odwracając 5-10 razy. Protoplasty w roztworze PEG są kruche; Nie potrząsaj rurką. Inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Transfekcja może być skalowana w górę do wielokrotności objętości podanych w krokach 4.2 i 4.3. Na przykład 10 milionów protoplastów i 150 μg DNA można zawiesić w 1 444 μl MMG i potraktować 1 056 μl roztworu PEG w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. - Rozcieńczyć 5 objętościami roztworu do inkubacji. Delikatnie wymieszaj przez odwrócenie. Wirować przez 4 minuty w 100 x g w temperaturze pokojowej.
UWAGA: W przypadku zwiększania skali podziel protoplasty na wiele okrągłodennych szklanych probówek zawierających nie więcej niż 10 ml każda, aby zapewnić pełne granulowanie. Proporcjonalnie zwiększyć objętość roztworu inkubacyjnego używanego do mycia. - Usunąć szwadron przez pipetowanie. Przemyć 1-5 ml roztworu do inkubacji i wirować przez 3 minuty w temperaturze 100 x g.
- Zawiesić protoplasty w roztworze inkubacyjnym do stężenia 500-1000 komórek/μl.
- Inkubować protoplasty w ciemności przez noc (~16 godzin) w temperaturze pokojowej.
5. Odzysk protoplastu i weryfikacja ekspresji
- Wirować protoplasty przez 4 minuty w temperaturze 100 x g w temperaturze pokojowej. UWAGA: W przypadku zwiększania skali podziel protoplasty na wiele okrągłodennych szklanych probówek zawierających nie więcej niż 10 ml każda.
- Przemyć 1-5 ml roztworu do inkubacji i wirować przez 3 minuty w temperaturze 100 x g.
- Zawiesić ponownie i połączyć w 1-5 ml roztworu do inkubacji.
- Jeśli protoplasty są transfekowane fluorescencyjnym genem reporterowym (np. GFP), należy pobrać podwielokrotność, aby sprawdzić skuteczność transfekcji. Za pomocą hemocytometru najpierw policz całkowitą liczbę protoplastów za pomocą mikroskopii światła jasnego pola. Następnie policz frakcję fluorescencyjnych protoplastów w świetle UV.
- Odwirowywać protoplasty przez 3 minuty przy 100 x g w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Protoplasty są teraz gotowe do dalszych zastosowań, takich jak ekstrakcja RNA za pomocą fenolu i izotiocyjanianu guanidyny.
Wyniki
Tkanką najlepiej nadającą się do izolacji protoplastów są drugi i trzeci liść siewek w wieku 10–11 dni (Rysunek 1). W niniejszej pracy uzyskano około 10 milionów protoplastów z 16 fragmentów liści, z których każdy miał długość 10 cm. Liczba wyizolowanych protoplastów zależy od masy materiału liściowego oraz szerokości plastrów liści poddawanych trawieniu w roztworze enzymatycznym.
Pod mikroskopem świetlnym w kontraście jasnego pola nieuszkodzone protoplasty mają kształt zbliżony do sferycznego, a na ich powierzchni widoczne są plastydy (Rysunek 2A). Przed przystąpieniem do transfekcji żywotność można sprawdzić, barwiąc niewielką porcję protoplastów diacetatem fluoresceiny (FDA). Protoplasty zabarwione FDA, które fluorescują pod wpływem światła UV, uznaje się za żywotne (Rysunek 2B,C). Nie wszystkie protoplasty, które wyglądają na nieuszkodzone, są nadal żywotne, a niektóre żywotne protoplasty mogą znajdować się w procesie obumierania poprzez ewakuolację (Rysunek 2C). W tych komórkach wakuola pęcznieje i zostanie ostatecznie wyrzucona poza błonę komórkową.
Rysunek 3 przedstawia protoplasty przekształcone za pomocą pJT01, plazmidu ekspresyjnego kukurydzy o wielkości 4,3 kb pochodzącego z CD3-911 (ABRC)15. Transfekcja prowadzi do ekspresji sGFP z przyłączonym sygnałem lokalizacji jądrowej na C-końcu pochodzącym z c-Myc (Rysunek 3A). Odsetek protoplastów wykazujących ekspresję sGFP mierzono w wielu eksperymentach przy użyciu komory licznikowej. Mediana wydajności transfekcji osiągnięta tą metodą wyniosła 40% po inkubacji przez noc (n = 9, Rysunek 4, Tabela 1), co jest wynikiem porównywalnym z wcześniej opisanymi metodami15. W zależności od zastosowania eksperymentalnego, jeśli plazmid lub biblioteka plazmidów nie zawiera reportera fluorescencyjnego, zaleca się uwzględnienie kontroli pozytywnej w celu potwierdzenia transfekcji.
Rycina 1: Reprezentatywna etiolowana siewka kukurydzy hodowana w ciemności przez 10 dni po kiełkowaniu. Strzałki wskazują drugi i trzeci liść, które najlepiej nadają się do izolacji protoplastów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 2: Mikroskopia fluorescencyjna żywotności protoplastów po izolacji. (A) Obraz w polu jasnym protoplastów bezpośrednio po izolacji. (B) Sygnał fluorescencyjny protoplastów barwionych FDA. (C) Nałożenie obrazu w polu jasnym i fluorescencji ukazujące żywotne protoplasty. Strzałka wskazuje protoplast przechodzący ewakuolację. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Mikroskopia fluorescencyjna protoplastów po transfekcji sGFP. (A) Obraz protoplastów w polu jasnym po transfekcji. (B) Sygnał fluorescencyjny przetransfekowanych protoplastów w kanale GFP. (C) Nałożenie obrazu w polu jasnym i fluorescencji, pokazujące przekształcone protoplasty. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Procent protoplastów wykazujących fluorescencję GFP po 16 h inkubacji. Wydajność transfekcji różniła się w zależności od niezależnych prób, przy czym najniższa wydajność wynosiła około 20%, a najwyższa blisko 50%. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
| Próba | Policzone komórki GFP | Całkowita liczba policzonych komórek | procent GFP |
| 1 | 104 | 261 | 39.8 |
| 2 | 148 | 298 | 49.5 |
| 3 | 84 | 258 | 32.6 |
| 4 | 137 | 271 | 50.6 |
| 5 | 127 | 299 | 42.5 |
| 6 | 107 | 235 | 45.5 |
| 7 | 83 | 360 | 23.1 |
| 8 | 134 | 549 | 24.4 |
| 9 | 61 | 201 | 30.3 |
| Średnia | 109 | 304 | 36 |
| Odchylenie standardowe | 29 | 102 | 10 |
Tabela 1: Reprezentatywna wydajność transfekcji protoplastów. Dane z dziewięciu niedawnych prób protoplastyki przeprowadzonych w laboratorium autorów.
Plik uzupełniający 1: Plik tekstowy w formacie GenBank z sekwencją pJT01.Plazmid ekspresyjny sGFP o wielkości 4,3 kb służy jako kontrola pozytywna w transfektowanych protoplastach kukurydzy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Jak informowaliśmy wcześniej, jakość materiału roślinnego używanego do protoplastów ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości protoplastów 16,17,18. Bardzo ważne jest, aby wybrać zdrowe, nieskazitelne liście. W pracy wykorzystano popularną badawczą odmianę kukurydzy B73. Nie testowaliśmy innych odmian. Siewki kukurydzy użyte do tego protokołu były uprawiane w ciemności, ponieważ etiolowane liście wytwarzają protoplasty o większej żywotności 16 godzin po transfekcji w porównaniu z protoplastami z zielonych liści. W przypadku zastosowań, które nie wymagają inkubacji przez noc, możliwe byłoby użycie zielonego lub zazieleniającego materiału liściowego.
Krytycznym krokiem jest prawidłowe pokrojenie materiału liściowego na cienkie plasterki przed trawieniem enzymatycznym. Proces ten zwiększa powierzchnię komórek mezofilu, które mają być wystawione na działanie roztworu enzymu, co zwiększa liczbę odzyskanych protoplastów. Dystalne końcówki liści są odrzucane, a cienkie (≤1 mm) plastry są cięte nowymi żyletkami, które są wymieniane natychmiast, gdy zaczynają się tępić. Dla danej ilości tkanki cieńsze plastry dają więcej protoplastów, pod warunkiem, że zastosuje się odpowiednią technikę w celu zminimalizowania zgniatania liści.
Ważne jest również prawidłowe mycie protoplastów, ponieważ są one dość delikatne po usunięciu ściany komórkowej. Po strawieniu wszystkie roztwory są trzymane na lodzie, a wyrosłe w ciemności protoplasty są chronione przed światłem. Osmolarność i pH są buforowane przez przemywanie roztworem MMG. Aby wyizolować protoplasty z mniej gęstych szczątków komórkowych, wirowanie odbywa się przy 100 x g. Protoplasty odwirowane przy 200 x g wykazują podobną żywotność po izolacji, ale niższą żywotność następnego dnia i również przekształcają się o około połowę. Zalecamy sprawdzenie żywotności protoplastów poprzez barwienie FDA (dioctan fluoresceiny) natychmiast po izolacji; Normalna żywotność waha się od 70% do 90%. Protoplasty o żywotności mniejszej niż 40% po izolacji dają niewiele transformantów.
Granulowanie i mycie są łatwiejsze podczas pracy z wieloma protoplastami, ponieważ po transfekcji uzyskuje się wyraźnie widoczną osadkę. Z tego powodu transfekcję przeprowadza się przy użyciu 1 miliona lub więcej protoplastów. Podczas zwiększania skali protokołu należy wybrać naczynie o odpowiedniej wielkości do etapów inkubacji (1,5 ml, 15 ml lub 50 ml probówki wirówkowej), a objętość roztworu użytego do etapów płukania powinna być odpowiednio przeskalowana. W każdym przypadku korzystne jest odwirowanie ≤10 ml podwielokrotności, aby upewnić się, że protoplasty nie pozostaną w supernatancie. Jedną z innowacji tego protokołu jest usunięcie 1-godzinnego etapu inkubacji i mycia w roztworze W5, który jest wymieniony w innych protokołach14,19, co okazało się niepotrzebne w naszych rękach.
Jak wykazano w innych badaniach, zarówno ilość, jak i jakość DNA mają kluczowe znaczenie dla udanej transfekcji19. W przypadku plazmidów w zakresie 4-6 kb stosuje się 15 μg DNA na 1 milion protoplastów. Niskiej jakości preparaty DNA mogą skutkować zmniejszoną żywotnością po transfekcji, dlatego zalecamy użycie komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA podczas izolowania plazmidów od bakterii. Inkubacja protoplastów przez noc odbywa się w temperaturze pokojowej w ciemności, aby umożliwić transkrypcję plazmidu lub biblioteki plazmidów przy jednoczesnej minimalizacji stresu. Po całonocnej inkubacji odzyskuje się około połowy liczby pierwotnie transfekowanych protoplastów. Protoplasty rozcieńcza się do stężenia 500-1000 komórek/μl do inkubacji przez noc. Protoplasty pozostawione do inkubacji przez noc w stężeniach wyższych niż 1000 komórek/μl mają niższe wskaźniki regeneracji i niższą żywotność. Przy wyższych stężeniach szczątki uszkodzonych i martwych protoplastów mogą przyczyniać się do śmierci sąsiednich protoplastów. Mycie protoplastów po całonocnej inkubacji służy zarówno usunięciu tych zanieczyszczeń, jak i usunięciu nadmiaru plazmidu.
Protokoły takie jak te mają to ograniczenie, że nie wszystkie gatunki roślin lub typy tkanek są podatne na protoplastykę. Co więcej, różnice w ekspresji genów mogą być indukowane przez proces protoplastu.
Podsumowując, szczegółowo opisaliśmy prosty i skalowalny protokół izolacji i transfekcji milionów żywotnych protoplastów z podstawowej uprawy rolnej Z. mays. Metoda ta może transfekować znacznie więcej protoplastów za pomocą PEG, a wydajność transformacji jest prawie tak wysoka, jak metody oparte na elektroporacji15. Większa liczba transformantów netto umożliwia testowanie setek lub tysięcy konstruktów w eksperymentach na dużą skalę, takich jak masowo równoległe testy reporterowe12,13. Przyszłe eksperymenty na skali genomu kukurydzy pozwolą naukowcom lepiej zrozumieć ekspresję genów kukurydzy i jej regulację.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Interdyscyplinarne Szkolenie w Naukach Genomicznych Narodowego Instytutu Badań nad Ludzkim Genomem (grant szkoleniowy T32 nr. HG000035 do J.T.) oraz Narodowy Instytut Zdrowia (NIGMS 1R35GM139532 do C.Q.) oraz przez Narodową Fundację Nauki (RESEARCH-PGR IOS-1748843 i PlantSynBio 2240888 do CQ). Dziękujemy Andrei Gallovatti z Rutgers University za dar nasion kukurydzy.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki wirówkowe z podziałką 1,5 ml | VWR | 490004-444 | |
| 15 ml stożkowa probówka wirówkowa Falcon | Corning | 05-527-90 | |
| 250 ml Zlewka ze szkła pyrexowego | Fisher | 50-121-5005 | |
| Sitko do komórek z nylonowej siatki 40 um | Fisher | 22363547 | |
| 50 ml Probówka Falcon | Corning | 14-432-22 | |
| 72 taca do rozmnażania komórek | T.O. Plastics | 725607C | |
| Folia aluminiowa | VWR | 89107-732 | |
| Słoik dzwonowy | Bel-Art | F42022-0000 | |
| Wirówka stołowa | Eppendorf | 5424-R | |
| Beta-merkaptoetanol | Sigma-Aldrich | M6250-250ML | Rozpuść w ultraczystym H2O, aby uzyskać roztwór podstawowy 1M. Przechowywać w temperaturze pokojowej. |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2*2H2O) | PhytoTech Labs | C135 | Rozpuścić w ultraczystym H2O, aby uzyskać 1M roztwór podstawowy. Przechowywać w temperaturze pokojowej. |
| Celulaza Onozuka R-10 | Duchefa Biochemie | C8001.0010 | |
| D-Mannitol | PhytoTech Labs | M562 | |
| Prosektorium | Reichert | Microstar IV | |
| Dioctan fluoresceiny (FDA) | Thermofischer Scientific | F1303 | Rozpuścić w acetonie w stężeniu 0,5% wagowo-objętościowym, aby uzyskać 1000X roztwór podstawowy. Chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza. |
| Systemy oświetlenia fluorescencyjnego | Prior | Lumen200 | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Leica | MDG36 | |
| Wirówka o dużej pojemności | Eppendorf | 5810 R | |
| Macerozyme | Duchefa Biochemie | M8002.0005 | |
| Chlorek magnezu (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M292-1KG | Rozpuść w ultraczystym H2O, aby uzyskać zapas 1M rozwiązanie. Przechowywać w temperaturze pokojowej. |
| Nasiona kukurydzy | B73 | USDA-ARS | https://npgsweb.ars-grin.gov/gringlobal/accessiondetail?accid=PI+550473 |
| Średni klips do spoiwa | Uline | S-24649 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M5287-250G | Rozpuścić w ultraczystym H2O, aby uzyskać 1M roztwór podstawowy. Dostosuj pH do 5,7 za pomocą KOH. Chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze pokojowej. |
| Mikropipeta 20-200 uL | Gilson | F123601G | |
| Nanodrop Spektrofotometr mikroobjętościowy | Thermofischer Scientific | ND-1000 | |
| NEB 5-alfa kompetentny E. coli | New England BioLabs | C2987H | |
| Hemocytometr Neubauera | Daigger Scientific | EF16034F | |
| nr 9 Jednoostrzowa żyletka | Excel | 20009 | |
| Wytrząsarka orbitalna | VWR | 89032-104 | |
| Glikol poli(etylenowy) 4,000 | Sigma-Aldrich | 81240-1KG | |
| Chlorek potasu (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | Rozpuścić w ultraczystym H2O, aby uzyskać roztwór podstawowy 1M. Przechowywać w temperaturze pokojowej. |
| Profesjonalny wermikulit | NK Lawn & Garden | G208 | |
| Okrągłodenna szklana probówka wirówkowa 30 ml | Kimble Chase | 45500-30 | |
| Gumowy adapter do probówek wirówkowych Corex | Corning | CLS8445AO | |
| Mech torfowiec | Premier Horticulture | 0128P | |
| Odczynnik TRIzol | Thermofischer Scientific | 15596018 | |
| Rurki próżniowe Tygon | VWR | 76336-844 | |
| Wakuometr | Wika | 4269978 |
Bibliografia
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: A useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Wang, S., Tiwari, S. B., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. AUXIN RESPONSE FACTOR7 restores the expression of auxin-responsive genes in mutant Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts. The Plant Cell. 17 (7), 1979-1993 (2005).
- Hirner, A., et al. Arabidopsis LHT1 is a high-affinity transporter for cellular amino acid uptake in both root epidermis and leaf mesophyll. The Plant Cell. 18 (8), 1931-1946 (2006).
- Hwang, I., Sheen, J. Two-component circuitry in Arabidopsis cytokinin signal transduction. Nature. 413 (6854), 383-389 (2001).
- Tan, M. -L. M. C., Rietveld, E. M., van Marrewijk, G. A. M., Kool, A. J. Regeneration of leaf mesophyll protoplasts of tomato cultivars (L. esculentum): Factors important for efficient protoplast culture and plant regeneration. Plant Cell Reports. 6 (3), 172-175 (1987).
- Brandt, K. M., Gunn, H., Moretti, N., Zemetra, R. S. A streamlined protocol for wheat (Triticum aestivum) protoplast isolation and transformation with CRISPR-Cas ribonucleoprotein complexes. Frontiers in Plant Science. 11, 769(2020).
- Nadakuduti, S. S., et al. Evaluation of methods to assess in vivo activity of engineered genome-editing nucleases in protoplasts. Frontiers in Plant Science. 10, 110(2019).
- OECD, Food and Agriculture Organization of the United Nations. OECD-FAO Agricultural Outlook 2021-2030. OECD, Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Paris, France. (2021).
- Gallois, P., Marinho, P. Leaf disk transformation using Agrobacterium tumefaciens-expression of heterologous genes in tobacco. Plant Gene Transfer and Expression Protocols. 49, 39-48 (1995).
- Schäffner, A. R., Sheen, J. Maize rbcS promoter activity depends on sequence elements not found in dicot rbcS promoters. The Plant Cell. 3 (9), 997-1012 (1991).
- Sheen, J. Molecular mechanisms underlying the differential expression of maize pyruvate, orthophosphate dikinase genes. The Plant Cell. 3 (3), 225-245 (1991).
- Jores, T., et al. Identification of plant enhancers and their constituent elements by STARR-seq in tobacco leaves. The Plant Cell. 32 (7), 2120-2131 (2020).
- Jores, T., et al. Synthetic promoter designs enabled by a comprehensive analysis of plant core promoters. Nature Plants. 7 (6), 842-855 (2021).
- Ricci, W. A., et al. Widespread long-range cis-regulatory elements in the maize genome. Nature Plants. 5 (12), 1237-1249 (2019).
- Sheen, J. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiology. 127 (4), 1466-1475 (2001).
- Jeon, J. M., et al. Efficient transient expression and transformation of PEG-mediated gene uptake into mesophyll protoplasts of pepper (Capsicum annuum L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 88 (2), 225-232 (2007).
- Pindel, A. Optimization of isolation conditions of Cymbidium protoplasts. Folia Horticulturae. 19, 79-88 (2007).
- Ren, R., et al. Highly efficient leaf base protoplast isolation and transient expression systems for orchids and other important monocot crops. Frontiers in Plant Science. 12, 626015(2021).
- Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nature Protocols. 2 (7), 1565-1572 (2007).
Przedruki i uprawnienia
