Artykuł metodologiczny

Implantacja matrycy podtwardówkowej miękkiej elektrokortykografii (ECoG) i długotrwała rejestracja kory mózgowej u świnek miniaturowych

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/64997

⸱

31 marca 2023

 ,  , 
1Laboratory for Soft Bioelectronic Interfaces, Neuro-X Institute, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę długoterminowej oceny wydajności i bezpieczeństwa miękkich matryc elektrod podtwardówkowych w modelu minipig, opisując metodę i narzędzia chirurgiczne, pooperacyjny rezonans magnetyczny, elektrofizjologię kory słuchowej, właściwości elektrochemiczne implantu oraz immunochemię pośmiertną.

Streszczenie

Zaburzenia i choroby neurologiczne mogą być diagnozowane lub leczone za pomocą matryc elektrokortykografii (ECoG). W padaczce lekoopornej pomagają one wyznaczyć obszar padaczkowy do wycięcia. W długoterminowych zastosowaniach, takich jak interfejsy mózg-komputer, te epickie elektrody są używane do rejestrowania intencji ruchowych mózgu, do kontrolowania robotycznych kończyn sparaliżowanych pacjentów. Jednak obecne sztywne siatki elektrod nie odpowiadają na potrzebę zapisów mózgu w wysokiej rozdzielczości i długoterminowej biointegracji. Ostatnio zaproponowano elastyczne układy elektrod, aby osiągnąć długoterminową stabilność implantu przy wysokiej wydajności. Potrzebne są jednak badania przedkliniczne nad tymi nowymi technologiami implantologicznymi, aby potwierdzić ich długoterminową funkcjonalność i profil bezpieczeństwa w odniesieniu do ich przełożenia na pacjentów. W tym kontekście modele świń są rutynowo wykorzystywane do opracowywania wyrobów medycznych ze względu na ich duże rozmiary narządów i łatwą obsługę zwierząt. Jednak w literaturze opisano tylko kilka zastosowań mózgu, głównie ze względu na ograniczenia chirurgiczne i integrację systemu implantów z żywym zwierzęciem.

Tutaj przedstawiamy metodę długoterminowej implantacji (6 miesięcy) i ocenę miękkich macierzy ECoG w modelu minipig. W badaniu najpierw przedstawiono system implantów, składający się z miękkiego mikrofabrykowanego układu elektrod zintegrowanego z polimerowym portem transdermalnym kompatybilnym z rezonansem magnetycznym (MRI), w którym znajdują się złącza oprzyrządowania do zapisów elektrofizjologicznych. Następnie w badaniu opisano procedurę chirurgiczną, od implantacji podtwardówkowej po rekonwalescencję zwierząt. Skupiamy się na korze słuchowej jako przykładowym obszarze docelowym, w którym potencjały wywołane są indukowane przez stymulację akustyczną. Na koniec opisujemy sekwencję pozyskiwania danych, która obejmuje rezonans magnetyczny całego mózgu, charakterystykę elektrochemiczną implantu, śródoperacyjną i swobodnie poruszającą się elektrofizjologię oraz barwienie immunohistochemiczne pobranych mózgów.

Ten model może być wykorzystany do zbadania bezpieczeństwa i funkcji nowatorskiego projektu protez korowych; obowiązkowe badanie przedkliniczne w celu wyobrażenia sobie translacji na pacjentów ludzkich.

Wprowadzenie

Zaburzenia i choroby neurologiczne mogą być diagnozowane lub leczone za pomocą matryc elektrokortykografii (ECoG). Te siatki elektrod są wszczepione na powierzchni mózgu i pozwalają na rejestrację lub stymulację ludzkiej kory mózgowej1. Na przykład w przypadku padaczki lekoopornej pomagają one wyznaczyć obszar padaczkowy do resekcji2. W długoterminowych zastosowaniach, takich jak interfejsy mózg-komputer, te epikortyczne elektrody są używane do rejestrowania intencji ruchu mózgu, do sterowania kończynami robotycznymi sparaliżowanych pacjentów3. Jednak obecne siatki elektrod są wykonane ze sztywnych metalowych bloków osadzonych w sztywnych podłożach polimerowych i nie odpowiadają na potrzebę zapisów mózgu w wysokiej rozdzielczości i długotrwałej biointegracji podtwardówkowej (>30 dni). Zamiast tego wywołują miejscowe reakcje tkankowe, które prowadzą do zwłóknieniowej enkapsulacji wszczepionego urządzenia, co z czasem prowadzi do gorszej wydajności. Ostatnio zaproponowano elastyczne lub rozciągliwe układy elektrod wykorzystujące cienkie podłoża polimerowe wytwarzane technikami mikrofabrykacji, aby osiągnąć wysoką wydajność w długotrwałych implantacjach poprzez ograniczenie reakcji tkankowej4,5. Potrzebne są jednak badania przedkliniczne nad tymi nowymi technologiami implantologicznymi, aby potwierdzić ich długoterminową funkcjonalność i profil bezpieczeństwa, tak aby można było przewidzieć ich translację na pacjentów. W tym kontekście, modele świnek miniaturowych i świń są rutynowo wykorzystywane do opracowywania urządzeń w innych kontekstach medycznych (np. układu sercowo-naczyniowego, kostnego lub żołądkowego) ze względu na ich duże rozmiary narządów i łatwą obsługę zwierząt6,7,8. Jednak w literaturze opisano tylko kilka zastosowań neurofizjologii ukierunkowanych na mózg, głównie ze względu na ograniczenia podejścia chirurgicznego i integrację systemu implantów na żywym zwierzęciu9,10,11,12. Często nie są one zgodne z przewlekłym implantowaniem u żywych zwierząt, ponieważ wymagałoby to na przykład opracowania złożonego sprzętu, takiego jak wszczepialna wbudowana elektronika. Ponadto nie badają wpływu systemu implantów na tkankę docelową, co ma kluczowe znaczenie dla aspektu bezpieczeństwa biologicznego w badaniach translacyjnych. Model świni jest zbliżony do anatomii człowieka pod względem budowy kory mózgowej, kości czaszki i grubości skóry13. Co więcej, ich zdolność do uczenia się zadań behawioralnych sprawia, że są potężnym modelem do badania strategii rehabilitacji funkcjonalnej lub percepcji sensorycznej14.

Tłumaczenie nowych technologii i terapii na ludzi wymaga oceny bezpieczeństwa i skuteczności, zgodnie z wymogami kompetentnych władz medycznych. Są one zazwyczaj opisane w dokumentach technicznych i normach15, jednak wymagają one jedynie przejścia tych testów i nie badają rzeczywistego efektu implantacji urządzenia lub zbierania innych użytecznych danych równolegle z badaniem bezpieczeństwa. W celu przeprowadzenia pełnego badania bezpieczeństwa biologicznego i wydajności mózgu, przedstawiamy tutaj podłużny i systematyczny zbiór danych obrazowych mózgu, pomiarów elektrofizjologicznych, oceny właściwości elektrochemicznych wszczepionych elektrod oraz histologii pośmiertnej w modelu świniowym. Aby to osiągnąć, należy wziąć pod uwagę kilka aspektów, aby stworzyć kompletny model eksperymentalny: (i) minimalnie inwazyjny dostęp chirurgiczny do implantacji urządzenia wraz ze stabilnym mechanicznie portem transdermalnym do połączenia z elektrodami, (ii) solidny paradygmat zapisu elektrofizjologicznego, który służy jako dane wyjściowe dla wszczepionych elektrod zarówno w znieczuleniu, jak i w warunkach swobodnego ruchu, (iii) obrazowanie in vivo (tomografia komputerowa [CT] i/lub rezonans magnetyczny [MRI]) w różnych punktach czasowych w celu śledzenia ewolucji mózgu i implantu, a także kompatybilności wszczepionego systemu ze sprzętem do obrazowania, oraz (iv) proces przygotowania tkanek w celu ekstrakcji mózgu do analizy histologicznej.

Tutaj opisujemy metodę długotrwałej implantacji (6 miesięcy) i ocenę miękkich matryc ECoG w modelu minipig (pokazanym schematycznie w Rysunek 1). Układy miękkich elektrod zostały przedstawione w naszych poprzednich raportach i są wykonane z cienkich membran silikonowych zatapiających elastyczne cienkie złote folie używane jako ścieżki elektryczne16,17. Kontakt z tkanką odbywa się poprzez mieszaninę nanocząstek platyny osadzonych w matrycy silikonowej, co zapewnia miękki i wydajny interfejs elektrochemiczny z tkanką mózgową18. Implanty są połączone elastycznym tunelowanym podstodniowo przez czaszkę i skórę z portem transdermalnym, w którym znajdują się łączniki na głowie zwierzęcia. Rozmiar i kształt implantu można dostosować do celu i potrzeb badania. Obecne paski elektrod w tym badaniu odzwierciedlają rzeczywisty rozmiar pasków klinicznych. Klinicznie dostępne paski i siatki podtwardówkowe zastosowano jako komparatory przy użyciu tego samego podejścia. Polimerowy port transdermalny kompatybilny z MRI jest umieszczany na czaszce za pomocą systemu podstawy, który mocno zakotwicza go w czaszce. Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę chirurgiczną, od podtwardówkowej implantacji obu półkul do powrotu do zdrowia zwierzęcia. Skupiamy się na korze słuchowej jako przykładowym obszarze docelowym, w którym potencjały wywołane są indukowane przez stymulację akustyczną zarówno w warunkach znieczulonych, jak i swobodnie poruszających się. W różnych punktach czasowych mózg zwierzęcia jest obrazowany w rezonansie magnetycznym (lub CT dla elektrod klinicznych) w znieczuleniu i mierzone są właściwości elektrochemiczne elektrod. Metody charakteryzacji elektrod są wykorzystywane do śledzenia ewolucji implantu i granicy elektroda-tkanka (więcej szczegółów można znaleźć w Schiavone et al.19). Obejmują one chronoamperometrię w celu zbadania zdolności stymulacyjnych kontaktu elektrody, elektrochemiczną spektroskopię impedancji (EIS), która może wskazać ewolucję rezystancyjnych i pojemnościowych składników elektrody, oraz międzykanałowe pomiary rezystancji w celu zbadania awarii hermetycznej enkapsulacji. Na koniec opracowaliśmy rurociąg ekstrakcji tkanek w celu perfuzji mózgu po eutanazji, eksplantacji z założonymi elektrodami, przekroju i przeprowadzenia analizy histologicznej przy użyciu różnych markerów stanu zapalnego. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta umożliwi prowadzenie badań przedklinicznych z solidnym gromadzeniem danych multimodalnych w celu przyszłego klinicznego przełożenia nowych technologii i terapii na mózg.

Protokół

Procedury chirurgiczne i behawioralne zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zatwierdzone przez lokalne (Kanton Genewski) i federalne (szwajcarskie) władze weterynaryjne z numerem autoryzacji GE11120A. W badaniach wykorzystano samice świnek miniaturowych z Getyngi (n = 7) w wieku 2-6 miesięcy (5-8 kg).

1. Planowanie przedoperacyjne

  1. Charakterystyka in vitro systemu implantów miękkich
    1. Chronoamperometria: Zapisz spadek napięcia po wstrzyknięciu dwufazowego impulsu prądu (tj. napięcia przejściowego [VT]) za pomocą oscyloskopu połączonego równolegle z generatorem impulsów. Podłącz kolejno generator impulsów do każdej elektrody i licznika platyny w roztworze soli (sól fizjologiczna buforowana fosforanami [PBS] 1x). Zapoznaj się z krokiem 3.1, aby zapoznać się z ustawieniami.
    2. Spektrogram impedancji elektrochemicznej: Zmierz impedancję elektrochemiczną przy różnych częstotliwościach za pomocą potencjometru. Podłącz potencjometr kolejno do każdej elektrody za pomocą licznika platynowego i elektrody referencyjnej Ag/AgCl w roztworze soli fizjologicznej (PBS 1x). Zapoznaj się z krokiem 3.2, aby zapoznać się z ustawieniami.
    3. Rezystancja międzykanałowa: W stanie suchym zmierz rezystancję prądu stałego (DC) między sąsiednimi kanałami za pomocą ręcznego multimetru.
    4. Wybór implantu: Po wykonaniu trzech wyżej wymienionych pomiarów należy wybrać implant zgodnie z następującymi kryteriami: impedancja przy 1 kHz poniżej 100 kΩ i brak rezystancji międzykanałowej poniżej 1 MΩ.
  2. sterylizacja
    1. Sterylizacja implantów: Umieść wybrane implanty pojedynczo w workach sterylizacyjnych wraz ze znacznikiem sterylizacyjnym i zamknij je. Zastosuj podwójne opakowanie, aby zapewnić sterylność podczas operacji.
      UWAGA: W tym przypadku stosuje się sterylizację gazową nadtlenkiem wodoru (H2O2) ze względu na krótki cykl czasowy i niską temperaturę (55 °C). Alternatywą jest gaz tlenek etylenu (ETO) lub sterylizacja w autoklawie, ale należy zapewnić kompatybilność z systemem implantów.
    2. Sterylizacja narzędzi: Umieść oczyszczone narzędzia w podwójnych workach sterylizacyjnych lub sterylnych pudełkach na narzędzia wraz ze znacznikami sterylizacyjnymi. Sterylizacja w autoklawie jest najczęściej stosowana w przypadku instrumentów, ale możliwymi alternatywami sąH2O2lub ETO.

2. Chirurgiczne wszczepianie miękkich matryc ECoG

  1. znieczulenie
    1. Premedykacja: Odizoluj zwierzę i pościj je przez noc. Wstrzyknąć śródskórnie mieszaninę midazolamu w dawce 0,75 mg/kg, atropiny w dawce 0,25 μg/kg mc. i haldolu w dawce 0,1 mg/kg mc. i poczekać, aż zwierzę zostanie uspokojone. Zważ zwierzę przed kontynuowaniem.
    2. Instalacja przewodu dożylnego (IV):
      1. Umieść zwierzę na stole operacyjnym na poduszce grzewczej. Wywołaj znieczulenie, nakładając maskę na twarz na zwierzę, używając sewofluranu w stężeniu 3%-3,5%.
      2. Umieść przewody do elektrokardiogramu na brzuchu, czujnik saturacji krwi na ogonie i czujnik temperatury w nozdrzu.
      3. Umieść przewód dożylny na żyle usznej i potwierdź dostęp krwi za pomocą strzykawki wypełnionej solą fizjologiczną. Upewnij się, że oczy są nawilżone za pomocą maści.
    3. Intubacja: Wstrzyknąć bolus atrakurium w dawce 0,5 mg/kg, ketaminę w dawce 1 mg/kg i fentanyl w dawce 1-2 μg/kg. Ułóż zwierzę na plecach w celu intubacji. Włóż rurkę 4.5 mm.
    4. Leki: Po intubacji należy przerwać znieczulenie sewofluranem i zainstalować wlew propofolu w dawce 10 mg/kg/h, fentanylu w dawce 2 μg/kg/h, atrakurium w dawce 0,2-0,5 mg/kg/h i soli fizjologicznej w dawce 4-7 mg/kg/h. Rozpocząć infuzję mannitolu w dawce 1 g/kg/h, aby zmniejszyć obrzęk mózgu podczas zabiegu.
      UWAGA: Można zastosować multimodalny schemat analgezji, jeśli jest to zalecane przez lokalną komisję etyki zwierząt.
  2. Przedoperacyjne zdjęcie rentgenowskie
    1. Ułóż zwierzę na brzuchu w pozycji sfinksa. Tymczasowo usuń wszelkie metalowe przedmioty znajdujące się w pobliżu mózgu i czaszki zwierzęcia (np. temperaturę ołowiu w nozdrzu).
    2. Uzyskaj zdjęcie rentgenowskie w płaszczyźnie osiowej i strzałkowej z kontrastem kości. Umieść metalowy przedmiot o znanych wymiarach w strzałkowym polu akwizycji, aby służył jako skala do pomiaru grubości czaszki z przodu i z tyłu mózgu.
    3. Zidentyfikuj położenie zatok czołowych (widoczne przez puste przestrzenie poniżej czaszki) i zaznacz najbardziej wysunięte do tyłu położenie na głowie zwierzęcia za pomocą trwałego markera. Wskaże to najdalszy punkt, w którym można wykonać kraniotomię lub wkręcenie w podejściu chirurgicznym opisanym poniżej.
  3. Aseptyczne przygotowanie pola i skóry: Ogolić całą powierzchnię głowy poza polem operacyjnym. Za pomocą sterylnego wacika dokładnie wyszoruj głowę betadyną. Następnie umieść sterylne serwety na stole instrumentacyjnym i na zwierzęciu, aby odsłonić tylko okno operacyjne. Na koniec ponownie wyszoruj głowę sterylnym wacikiem z użyciem betadyny.
  4. Kraniotomia i durotomia
    1. Cięcie skóry: Naciąć skórę nożem skalpela wzdłuż linii środkowej. Oddziel mięsień i okostną (25 mm bocznie od bregmy po obu stronach i 40 mm przed i z tyłu bregmy) od kości za pomocą tarnika i umieść rozsiewacze, aby uzyskać optymalny dostęp do późniejszego wiercenia.
    2. Pomiary i znakowanie: Zidentyfikuj bregmę i lambdę i oznacz je sterylnym pisakiem chirurgicznym (Rysunek 2A, B). Za pomocą sterylnej linijki nakreśl kontur płata kostnego wyśrodkowany wokół celu implantacji na obu półkulach. W tym konkretnym przypadku wybrano korę słuchową o współrzędnych od -5 mm do -15 mm od bregma i od -4 mm do -20 mm bocznie. Następnie należy dostosować kraniotomię do wielkości implantu i anatomicznych punktów orientacyjnych, ograniczając rozmiar otworu.
    3. Kraniotomia:
      1. Za pomocą wiertła do kości z okrągłym wiertłem tnącym wywierć kontur kraniotomii, biorąc pod uwagę grubość czaszki zmierzoną w kroku 2.2. Owierywać miejsce wiercenia roztworem soli, aby uniknąć przegrzania kości.
      2. Ostrożnie wywierć kontur jednorodnie, aż dotrze do opony twardej. Przy pierwszym przebiciu zakończ wiercenie konturu, aż stanie się wystarczająco cienki, aby prawie się przebić. Następnie użyj płaskiej szpatułki (po stronie środkowej lub bocznej), aby odłamać płat kostny w jednym kawałku, używając krawędzi kraniotomii jako dźwigni. Jeśli napotkasz zbyt duży opór, kontynuuj przerzedzenie kości.
      3. Umieść kawałek kości w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.
      4. Po usunięciu płata kostnego ostrożnie odłup krawędź kraniotomii za pomocą Kerisona, aby uniknąć wcięcia ostrej krawędzi kości w oponę twardą.
      5. W przypadku wystąpienia nadmiernego krwawienia na oponie twardej lub kości, należy użyć odpowiednio pianki żelowej lub wosku kostnego. Umieść mokry kompres (standardowa podkładka w sterylnym roztworze soli fizjologicznej) w kraniotomii i powtórz ten krok na drugiej półkuli (Ryc. 2B).
    4. Durotomia:
      1. Za pomocą igły z zestawu do szycia 6-0 ostrożnie przekłuj i unieś oponę twardą na przednim lub tylnym końcu kraniotomii w połowie odległości między stroną przyśrodkową a boczną i utwórz początek nacięcia nożem kłującym.
      2. Następnie, za pomocą małej płaskiej szpatułki umieszczonej w przestrzeni podtwardówkowej, działającej jako podstawa tnąca w celu ochrony kory, utwórz przednio-tylną szczelinę w oponie twardej, przesuwając się jednocześnie obydwoma narzędziami. Upewnij się, że szczelina jest nieco większa niż szerokość implantu (Rysunek 2C). Jeśli na tym etapie wystąpi jakiekolwiek krwawienie lub uszkodzenie, przykryj go pianką żelową i poczekaj, aż przestanie się utrzymywać.
        UWAGA: Trajektoria szczeliny powinna być dostosowana, jeśli w oponie twardej obecne są duże naczynia krwionośne, aby uniknąć krwawienia.
  5. Implantacji
    1. Wkładanie urządzenia:
      1. Przepłukać implant (rysunek uzupełniający 1A) solą fizjologiczną po obu stronach, aby łatwiej wsunął się w przestrzeń podtwardówkową. Umieść implant nad szczeliną opony twardej i za pomocą małych kleszczy wprowadź poddusznie urządzenie, przesuwając je kolejno po każdej krawędzi.
      2. Ostrożnie przytrzymaj cokół urządzenia i przesuwaj się wraz z implantem, aby nie wytworzyć napięcia utrudniającego wprowadzenie. Gdy krawędź łącznika znajduje się na górze szczeliny, zatrzymaj wkładanie.
    2. Zabezpiecz implant: Aby zabezpieczyć implant na miejscu, umieść tytanowy most na za krawędzią kraniotomii lub w skrzydłach kotwiących i zabezpiecz go jedną lub dwiema tytanowymi za pomocą odpowiedniego śrubokręta (Rysunek 2D).
    3. Uziemienie: Ostrożnie usuń 1 cm izolacji przewodów uziemiających i włóż ją zewnątrzoponowo na tylny koniec kraniotomii (lub w dowolnym miejscu zewnątrzoponowym daleko od kory zainteresowania lub dużych naczyń krwionośnych) (drut w Rysunek 2E)
    4. Powtórzyć kroki 2.4.4. i 2.5.1.-2.5.3 na półkuli przeciwnej.
    5. Śródoperacyjne zdjęcie rentgenowskie w celu potwierdzenia umieszczenia:
      1. Umieść mokrą podkładkę (standardową podkładkę w sterylnym roztworze soli fizjologicznej) w miejscu operacji, aby utrzymać nawilżenie tkanki. Następnie umieść sterylną serwetę chirurgiczną, aby przykryć głowę zwierzęcia.
      2. Wykonaj płaskie zdjęcia rentgenowskie (osiowe i strzałkowe), aby upewnić się, że implanty są dobrze umieszczone i nie są złożone, używając markerów rentgenowskich jako wskaźników. Jeśli nie, zdejmij zasłonę i wysuń urządzenie, aby ponownie je włożyć (ponownie wykonaj kroki 2.4.4. i 2.5.1.-2.5.3).
    6. Zamknięcie opony twardej: Ostrożnie zszyj oponę twardą wokół implantu za pomocą szwu resorbowalnego 3-0 i małego uchwytu na igłę. Zbliż dwie krawędzie opony twardej do siebie tak bardzo, jak to możliwe, bez rozrywania cienkiej błony za pomocą drutu do szwów (Rysunek 2D, E).
    7. Umieszczenie płata kostnego: Zamocuj tytanowy most na przedniej i tylnej części każdego płata kostnego za pomocą tytanowej. Należy uważać, aby zaplanować rozmieszczenie mostków Ti w odniesieniu do umieszczenia nóg podnóżka w kolejnych krokach. Przykręć koniec tytanowych mostów do czaszki (Rysunek 2F, G).
  6. Umieszczenie cokołu i podstawy
    1. Pozycjonowanie: W tej konfiguracji płyta podstawy ma sześć nóg z dwoma otworami na każda (rysunek uzupełniający 1B). Zaplanuj umieszczenie podnóżka na czaszce, aby zoptymalizować położenie (unikaj umieszczania ich na krawędzi kraniotomii lub w mięśniu skroniowym). Pomiń otwory w nogach, jeśli nie można ich wkręcić.
    2. Zabezpieczenie podnóżka: Wkręć tytanowe podnóżka, aż zostaną mocno zamocowane (patrz Rysunek 2H).
    3. Umieszczenie cokołu: Usuń tytanowe mostki nad połączeniowymi i odwróć cokół, aby wylądować na płycie podstawy. Przykręć cokół do podnóżka. Sprawdź, czy cokół jest dobrze osadzony (Rysunek 2I).
  7. Szew i zamknięcie
    1. Oczyszczanie rany: Oczyść przestrzeń podskórną z kości lub innych zanieczyszczeń, spłukując je solą fizjologiczną. Odetnij trochę skóry wokół krawędzi cokołu, aby utworzyć okrągłą krawędź podążającą za cylindrem.
    2. Szwy podskórne: Usuń rozpieracze i złóż płaty skóry razem. Wykonaj szwy podskórne za pomocą niewchłanialnego drutu do szwów 4-0, w odstępach 3 mm za pomocą prostych szwów przerywanych lub prostych szwów ciągłych. Zacznij od cokołu, przesuwając się w jego kierunku po obu stronach nacięcia.
    3. Szwy skórne: Zszyj skórę za pomocą niewchłanialnego drutu do szwów 6-0, ze szwami oddalonymi od siebie o 5 mm. Zacznij od cokołu, przesuwając się w jego kierunku po obu stronach nacięcia. Uważaj, aby uzyskać dobre przyleganie tkanek między dwoma płatami skóry i w pobliżu krawędzi cokołu, aby uniknąć pustki (Rysunek 2J).
    4. Opatrunek na ranę: Ponownie oczyść obszar rany sterylną podkładką i betadyną. Nałóż samoprzylepny, sterylny bandaż na ranę.
  8. Pomiary in vivo: W przypadku pomiarów in vivo należy postępować zgodnie z sekcjami 3, 4 i 5.
  9. Przebudzenie: Po wykonaniu wszystkich pomiarów odłącz zwierzę od wszystkich środków znieczulających, ale trzymaj je pod wentylacją. W celu znieczulenia należy nakleić plaster z buprenorfiną (25 mg/h) na 24 godziny. Umieść zwierzę na poduszce grzewczej pokrytej zasłonami, aby przyspieszyć czas budzenia. Po przywróceniu spontanicznego oddychania należy ekstubować zwierzę i umieścić je pod maską tlenową do czasu odzyskania przytomności (co może zająć od 1 do 4 godzin).
  10. Pooperacyjna opieka nad zwierzętami: Przez 5 dni należy utrzymywać zwierzę pod ścisłym nadzorem. Podawać dawkę cefaleksyny w dawce 75 mg dwa razy dziennie z jedzeniem, oddzielnie od innych zwierząt. Dezynfekcję rany należy przeprowadzać codziennie, nakładając duże ilości betadyny za pomocą nasączonych sterylnych podpasek (najlepiej podczas karmienia).
    UWAGA: Opieka długoterminowa i zakwaterowanie: Operowane zwierzę jest trzymane w izolacji przez 24 godziny. Jest umieszczany z powrotem w swojej pierwotnej grupie społecznej, jeśli zwierzę jest wystarczająco zdrowe, aby wchodzić w interakcje społeczne ze swoimi rówieśnikami. Należy prowadzić codzienną obserwację cokołu i otworu skórnego, aby śledzić integrację urządzenia na głowie. W razie potrzeby oczyść miejsce wokół cokołu dużą ilością betadyny.

3. Charakterystyka in vivo miękkiego implantu

  1. Chronoamperometria: Rejestruj spadek napięcia po wstrzyknięciu dwufazowego impulsu prądu (tj. VT) za pomocą oscyloskopu połączonego równolegle z generatorem impulsów. Podłącz generator impulsów sekwencyjnie do każdej elektrody i przewodu uziemiającego. Wykonać impuls stymulacji przy 100 μA z szerokością impulsu 300 μs przy 100 Hz.
  2. Elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna: Zmierz impedancję elektrochemiczną przy różnych częstotliwościach za pomocą potencjometru. Podłącz generator impulsów sekwencyjnie do każdej elektrody, używając przewodu uziemiającego zarówno jako przeciwelektrody, jak i uziemienia. Ustaw napięcie wzbudzenia na 200 mV i zakres częstotliwości od 1 Hz do 1 MHz, z trzema punktami na dekadę.
  3. Krótkie pomiary międzykanałowe: Zmierz rezystancję prądu stałego między sąsiednimi kanałami za pomocą multimetru ręcznego. In vivo międzykanałowa rezystancja prądu stałego jest mierzona tylko w celu sprawdzenia, czy nie występują niedobory poniżej 1 kΩ, co wskazuje na całkowitą awarię obudowy.

4. Zapis elektrofizjologiczny

  1. Spontaniczna aktywność: Podłącz bezprzewodowy system nagrywania przez cokół i rejestruj podstawową aktywność przez 2-3 minuty. Nagrania te posłużą jako kontrola do analizy słuchowych potencjałów wywołanych.
  2. Słuchowe potencjały wywołane: Oprócz systemu bezprzewodowego włóż głośniki w zamknięte pole w uszach zwierząt. Odtwarzaj impulsową stymulację akustyczną na różnych częstotliwościach (w zakresie od 200 do 20 000 Hz) przy poziomie ciśnienia akustycznego (SPL) około 70 dB w ciągu 120 powtórzeń. Następnie uśrednij nagrania i wyrównaj je w okresie bodźca do analizy.
  3. Sensoryczne potencjały wywołane: Umieść igły w pysku w trzech różnych pozycjach. Wywołaj potencjały sensoryczne, stymulując pysk przez ~30 s za pomocą generatora impulsów o różnych amplitudach, aby uzyskać krzywe rekrutacji.

5. Obrazowanie in vivo

  1. Transport zwierząt: Zwierzę należy przechowywać w znieczuleniu propofolowym, zgodnie z opisem w kroku 2.1. Użyj wózka transportowego, w którym znajduje się respirator, pompa strzykawkowa i monitor parametrów życiowych, aby przetransportować zwierzę z sali operacyjnej do pracowni obrazowania iz powrotem.
  2. Tomografia komputerowa prześwietlenia: Umieść zwierzę na stole skanera i usuń wszelkie metalowe przedmioty wokół głowy (np. czujnik temperatury). Wykonaj tomografię komputerową w najmniejszej rozdzielczości (0,4 mm grubości warstwy) przy użyciu akwizycji izometrycznej z automatycznym wyborem prądu i napięcia w celu uzyskania kontrastu kostnego.
  3. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego: Usuń ze zwierzęcia cały sprzęt zawierający metal (użyj przewodów dożylnych i rurki intubacyjnej kompatybilnych z rezonansem magnetycznym). Utrzymuj zwierzę w wentylacji i znieczuleniu pod swewofluranem w temperaturze 3%-3,5%, używając respiratora umieszczonego na zewnątrz komory MRI i połączonego długą rurką ze zwierzęciem. Przed pierwszą sekwencją wstrzyknąć bolus fentanylu w stężeniu 1-2 μg/kg. Należy użyć trzech sekwencji izometrycznych o najmniejszej rozdzielczości: T1-, T2- i sekwencji ważonych echem spinowym turbo (TSE) (parametry pokazane w pliku uzupełniającym 1).

6. Nagrywanie w swobodnym ruchu

  1. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co w sekcji 4, aby rejestrować sygnały czuwania z mózgu. Podłącz bezprzewodową scenę główną, trzymając zwierzę w ramionach eksperymentatora lub karmiąc zwierzę smakołykami, aby odwrócić jego uwagę. Zapewnij stymulację akustyczną za pomocą zewnętrznych głośników umieszczonych blisko zwierzęcia.

7. Perfuzja i przygotowanie tkanek

  1. OPCJONALNIE: Jeśli zwierzę nie jest jeszcze pod narkozą, postępuj zgodnie z krokiem 2.1 dla protokołu znieczulenia.
  2. Wprowadzenie cewnika do tętnicy szyjnej w celu perfuzji (rysunek uzupełniający 2)
    1. Rozwarstwienie tętnicy szyjnej i żyły szyjnej: Przetnij gardło w linii środkowej za pomocą kauteryzatora/noża. Najpierw przeciąć skórę, a następnie mięsień wzdłuż środkowej białej linii (brak naczyń pod spodem) (rysunek uzupełniający 2A).
    2. Otwórz dalej, używając palców, aby zrobić przestrzeń wokół tchawicy i pod mięśniem. Poszukaj tętnicy szyjnej (bijącej i różowawej); Nerw błędny czasami znajduje się również wokół (biały), a żyła szyjna może znajdować się pod spodem lub z boku (czerwony). Umieścić rozsiewacze (patrz rysunek uzupełniający 2B).
    3. Rozpocznij rozwarstwienie tętnicy szyjnej za pomocą cienkich kleszczy i okrągłych nożyczek. Użyj nożyczek, aby otworzyć tkankę spojówkową. Jeśli nie ma naczyń krwionośnych, przetnij; jeśli są naczynia krwionośne, kauteryzuj i idź do przodu (rysunek uzupełniający 2C, D). Po wystarczającym wypreparowaniu użyj zacisku, aby przejść pod tętnicę szyjną, tak aby była całkowicie odizolowana (rysunek uzupełniający 2E).
    4. Powtórz tę samą operację z żyłą szyjną (rysunek uzupełniający 2F).
    5. Gdy oba naczynia zostaną całkowicie wypreparowane i odizolowane, umieść wokół nich drut do szycia. Nie zamykaj ich jeszcze. Dwa szwy wokół tętnicy szyjnej, jeden u samej podstawy (szew 1 - strona serca do perfuzji mózgu) i jeden po drugiej stronie (szew 2), pokazano na rysunku uzupełniającym 2G.
    6. Umieść jeden szew wokół żyły szyjnej (szew 3), nie zamykany; oznacz druty taśmą do późniejszego przekroju żyły.
    7. Zamknij szew 1 bardzo mocno, w przeciwnym razie będzie krwawić (rysunek uzupełniający 2H). Zawiąż trzy węzły. Umieść zacisk na drucie, aby obciążyć i wytworzyć napięcie w tętnicy szyjnej.
    8. Zacisnąć tętnicę szyjną za pomocą zacisku naczynia po przeciwnej stronie rozwarstwienia tętnicy szyjnej (strona mózgu do perfuzji mózgu; Rysunek uzupełniający 2I). Szew 2 znajduje się pośrodku, jeszcze nie zamknięty.
    9. Użyj czarnych kleszczy, aby złapać i pociągnąć tętnicę szyjną. Za pomocą cienkich nożyczek przeciąć połowę tętnicy szyjnej w pobliżu podstawy rozwarstwienia (w pobliżu szwu 1, strona serca; patrz rysunek uzupełniający 2J). Upewnij się, że sekcja jest tak schludna, jak to możliwe i sięga do samego naczynia, a nie tylko do "pochwy"; W przeciwnym razie cewnik nie przejdzie. Wprowadzić cewnik, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 2K.
    10. Przepłucz i napełnij cewnik, najpierw PBS, aby w cewniku nie pozostało powietrze (rysunek uzupełniający 2K).
    11. Zamknij szew 2 na tyle mocno, aby nie zniknął, ale nie za bardzo, aby cewnik mógł się jeszcze trochę poruszać (rysunek uzupełniający 2L). Następnie zdejmij zacisk naczynia, zakończ wprowadzanie cewnika tak daleko, jak to możliwe, i zakończ zamykanie szwu 2 (mocno zamknij).
    12. W razie potrzeby użyj drutów do szycia przy szwie 1, aby przymocować podstawę cewnika do skóry przy wyjściu z rany jako dodatkowy stopień bezpieczeństwa. Następnie przenieś zwierzę do strefy perfuzji i podłącz je do PBS/heparyny. Kiedy rozpocznie się perfuzja, pociągnij szew 3 i przetnij żyłę szyjną
  3. Eutanazja: Podać dożylnie pentobarbital (90 mg/kg) i przepłukać linię solą fizjologiczną, aby upewnić się, że pełna dawka została podana prawidłowo.
  4. Perfuzja: Za pomocą pompy perfuzyjnej (200 ml/min) podłączyć cewnik do tętnicy szyjnej do PBS/heparyny (1 l dla świni o wadze 15 kg), a następnie do PBS zawierającego 4% paraformaldehydu (PFA) (5 l dla świni o wadze 15 kg). Kiedy rozpocznie się perfuzja, pociągnij szew 3 i przetnij żyłę szyjną.
  5. Pobieranie tkanek
    1. Ścinanie głowy: Po zakończeniu perfuzji oderwij głowę zwierzęcia od ciała za pomocą skalpela, przecinając skórę i mięśnie oraz wkładając ostrze między pierwszy i drugi kręg.
    2. Postfiksacja: Zanurz głowę w 4% PFA w PBS na kolejne 48 godzin w temperaturze 4 °C, a następnie przenieś do PBS przed ekstrakcją mózgu.
    3. Ekstrakcja mózgu i implantu:
      1. Usuń skórę za pomocą skalpela i zacznij ostrożnie ciąć kość za pomocą rongeur, zaczynając od pierwszych kręgów, wzdłuż rdzenia kręgowego do móżdżku. Po odsłonięciu móżdżku ostrożnie usuń kości skroniowe i odsłoń płaty ciemieniowe i czołowe.
      2. W tym momencie przykręć cokół od podstawy i odetnij nóżki podstawy szczypcami. Usuń kość w pobliżu wejścia do czaszki, aby uwolnić system implantu od kości, bez wyciągania implantów z wyjścia opony twardej.
      3. Jeśli implantu są osadzone w kości, przeciąć jak najbliżej wyjścia. Gdy wystarczająco odsłonięta powierzchnia mózgu zostanie odsłonięta, ostrożnie przetnij oponę twardą wzdłuż linii środkowej za pomocą małych nożyczek.
      4. Uwolnij implantu z wyjścia opony twardej. Zrób zdjęcia z umieszczenia implantu na mózgu. Następnie użyj małej łyżki, aby odłączyć mózg od nerwów czaszkowych poniżej. Ostrożnie wydobądź mózg. Usuń implanty z mózgu.
    4. Postfiksacja mózgu: W zależności od jakości perfuzji, ponownie postfiksuj wyekstrahowany mózg przez 24 godziny w 4% PFA w PBS w temperaturze 4 °C. Trzymaj w 0,1 M PBS w temperaturze 4 °C, aż mózg zostanie przecięty.
    5. Cięcie mózgu: Oddziel dwie półkule za pomocą żyletki. Następnie przetnij mózg prostopadło na cztery różne części. Przetnij wszczepioną strefę na pół, aby uzyskać dwa bloki zawierające wszczepioną strefę i obszar kontrolny. Zachowaj pozostałe dwa bloki, jeśli potrzebnych jest więcej suwaków sterujących.
    6. Krioprotekcja mózgu i zamrażanie: Przenieś bloki mózgowe do roztworu 15% sacharozy, a następnie 30% sacharozy w temperaturze 4 °C, aż mózg zanurzy się i osiągnie równowagę. Następnie zamrozić tkankę w izopentanie w temperaturze -55 °C w systemie zamrażania tkanek.

8. Histologia

  1. Cięcie tkanek
    1. Kriostat: Umieść zamrożony mózg w kriosacie i przycinaj, aż zostaną uzyskane pełne sekcje. Następnie pokrój mózg na sekcje 40 μm i zanurz w grupach po trzy po 0,1 M PBS w płytkach studzienkowych. Uważnie zanotuj kolejność talerzy.
    2. Wybór sekcji: Wybierz sekcje w zależności od strefy do analizy (obszar implantacji lub strefa kontrolna). Wyjmij sekcje kolejno z płytek studzienek, używając cienkiej szczotki, aby sprawdzić je pod kątem uszkodzeń. Umieść je w nowych płytkach studzienkowych wypełnionych 0,1 M PBS w celu dalszego barwienia.
  2. Immunohistochemia
    1. Przygotowanie: Inkubować skrawki w 0,3% Triton X/PBS przez 15 minut, a następnie 3% albuminę surowicy bydlęcej (BSA)/PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Przeciwciała pierwszorzędowe: Inkubować tkanki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez 48 godzin w RT (anty-GFAP, szczur, rozcieńczony w 1/300; anty Iba1, królik, rozcieńczony w 1/400; anty-NeuN, świnka morska, rozcieńczona w 1/1,000; wszystko w 1% BSA/PBS). Przykryj płytki studzienek folią aluminiową.
    3. Mycie: Przemyć studzienki 0,1 M PBS trzy razy przez 5 minut.
    4. Przeciwciała drugorzędowe: Inkubować tkanki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555; wszystkie rozcieńczone w stosunku 1/400 w 1% BSA/PBS).
    5. DAPI (4′,6-diamidino-2-fenyloindol): Inkubować tkanki z DAPI przez 15 minut (1/1,000 w 1% BSA/PBS).
    6. Mycie: Umyć studzienki 0,1 M PBS pięć razy przez 15 minut.
    7. Montaż: Zamontuj prowadnice za pomocą nośnika montażowego i szkiełka nakrywkowego. Szkiełka należy przechowywać w ciemności w lodówce w temperaturze 4 °C.
  3. Obrazowania
    1. Obrazowanie całego preparatu: Zobrazuj slajdy w 10-krotnym powiększeniu (wartość odległości roboczej obiektywu = 3 100 μm) za pomocą mikroskopu skanera slajdów na trzech różnych długościach fal (640 nm, 560 nm, 485 nm). Wszystkie informacje o mocy i wzmocnieniu można znaleźć w pliku uzupełniającym 2.
    2. Obrazowanie mikroskopowe: Zobrazuj obszar zainteresowania przy 20-krotnym powiększeniu (apochromat 20x/0,8 M27) za pomocą mikroskopu konfokalnego na czterech długościach fal (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP). Wszystkie informacje o mocy i wzmocnieniu można znaleźć w pliku uzupełniającym 3.

Wyniki

W celu potwierdzenia rozmieszczenia (Rysunek 3A) i funkcjonalności urządzeń, po umieszczeniu postumentu przeprowadza się śródoperacyjne zapisy elektrofizjologiczne. Najpierw, przez 2 min, rejestruje się sygnał bazowy bez stymulacji jako kontrolę aktywności podstawowej. Następnie zwierzę poddaje się stymulacji akustycznej za pomocą impulsów dźwiękowych o różnych częstotliwościach (500-20 000 Hz), a surowe dane są uśredniane w okresie stymulacji w celu zmapowania potencjałów wywołanych słuchowo w obrębie macierzy (np. przy 800 Hz w porównaniu do poziomu bazowego; Rysunek 3B). Przedstawione tutaj dane są nieprzetworzone, jednak w przypadku wystąpienia zbyt dużego poziomu szumów można zastosować filtry zaporowe (notch) i pasmowoprzepustowe. Typowe źródła szumów w bloku operacyjnym obejmują m.in. maty grzewcze, podłączone wiertarki oraz ssawy lub kauteryzatory, które należy usunąć przed rozpoczęciem akwizycji. Podczas zapisów u zwierząt w stanie czuwania należy unikać dużych ruchów mięśniowych w okolicy głowy, takich jak żucie, aby uzyskać czystsze zestawy danych.

Protokół ten stosowano w każdym punkcie czasowym pomiaru, co pozwalało na porównywanie sygnałów z pojedynczego kanału w czasie. Jeden z przykładów zilustrowano na Rysunku 3C, wykazując stabilność i ewolucję odpowiedzi. Zdolność rejestracyjną każdego kontaktu w czasie trwania eksperymentu można ocenić, obliczając odchylenie standardowe sygnału bazowego w każdym punkcie czasowym (Rysunek 3D). W niniejszym badaniu stosunek sygnału do szumu malał i ustabilizował się między dniem 0 a 6. miesiącem, pomimo pewnej zmienności wynikającej z ograniczonego czasu trwania pomiaru (tj. 2 min). Można to dodatkowo skorelować z impedancjami elektrod.

Obrazowanie in vivo jest wykonywane po operacji w celu oceny stanu mózgu i ułożenia implantu. W pierwszej iteracji protokołu nie wykonano śródoperacyjnego zdjęcia rentgenowskiego, co doprowadziło do zgięcia urządzenia, co widoczne jest na Rysunku 4A w sekwencji MRI ważonej obrazem T1 (zob. dodatkowo Rysunek 4B). U zwierzęcia nie zaobserwowano zmian w zachowaniu, jednak z czasem doprowadziło to do powstania włóknistej otoczki wokół urządzenia z powodu makroskopowej kompresji mózgu wokół miejsca implantu (Rysunek 4C). Po tym doświadczeniu wprowadzono śródoperacyjne zdjęcie rentgenowskie, jak pokazano na Rysunku 4D, gdzie widać, że markery radioprzepuszczalne (czarne paski widoczne na implancie na wstawce do Rysunku 4D) są prawidłowo rozmieszczone. Powierzchnia mózgu pozostaje wówczas nienaruszona, co można zaobserwować w pooperacyjnym badaniu MRI na Rysunku 4E. Ogólnie rzecz biorąc, przy zastosowaniu tego systemu implantu i postumentu możliwe jest obrazowanie całego mózgu. Różne sekwencje w płaszczyznach czołowych umożliwiają wizualizację struktur anatomicznych (Rysunek 4F,G; sekwencje MRI T1 i T2) lub obecności płynu i krwi wokół implantu (Rysunek 4H; sekwencja MRI ważona TSE). System postumentu niemal nie generuje artefaktów, z wyjątkiem kilku małych obszarów o niskim kontraście wokół śrub tytanowych (zob. Rysunek 4G). Dodatkowo w badaniu tym jako porównywacze wykorzystano elektrody kliniczne, których nie można obrazować za pomocą MRI ze względu na ryzyko nagrzewania i kwestie bezpieczeństwa. Dlatego w przypadku tych zwierząt wykonano tomografię komputerową (CT), jak pokazano na Rysunku 4I. Elektrody są wyraźnie widoczne, a system postumentu nie wpływa na jakość obrazu.

Po okresie implantacji zwierzę zostaje poddane perfuzji, a mózg zostaje wyekstrahowany. W niniejszym badaniu analiza odpowiedzi zapalnej jest przeprowadzana niezależnie dla każdej półkuli. Podzielenie mózgu na pół ułatwia przygotowanie tkanki przed sekcjonowaniem i daje tę zaletę, że skrawki mogą być umieszczone na standardowych szkiełkach mikroskopowych. Przykład próbki mózgu przedstawiono przed (Rysunek 5A) i po (Rysunek 5B) cięciu w blokach. Zarys implantu jest wyraźnie widoczny i spowodował niewielkie wgłębienie w mózgu. Dzięki cięciu w płaszczyznach równoległych tkanka jest już wyrównana względem kriostatu, a skrawki można łatwo wycinać bez utraty tkanki podczas przycinania (Rysunek 5C). Po barwieniu obrazowany jest cały skrawki tkanki (Rysunek 5D), gdzie na przykład warstwa neuronów jest wyraźnie widoczna w szczegółach (patrz marker NeuN). Pełne sekcje są kruche i mogą czasami prowadzić do utraty części tkanki (patrz dół Rysunka 5D), jednak obszar zainteresowania pozostaje nienaruszony. Przy większym powiększeniu, uzyskanym dzięki obrazowaniu konfokalnemu przy 40x, komórki są wyraźnie zdefiniowane, co umożliwia dokładne badanie markerów zapalnych, na przykład (Rysunek 5E). Można przeprowadzić dalszą analizę ilościową, aby porównać stan zapalny między półkulą kontrolną a implantowaną. Rysunek 6 przedstawia charakterystykę elektrochemiczną implantowanych elektrod. Spektroskopię impedancji elektrochemicznej In vitro miękkiego układu elektrod z modułem impedancji i fazą przedstawiono na Rysunku 6A, a moduł impedancji przy 1 kHz w ciągu 6 miesięcy implantacji pokazano na Rysunku 6B.

Schemat implantacji macierzy ECoG podtwardówkowej, kompatybilnej z MRI, do długoterminowych rejestracji korowych u miniprzysu.
Rycina 1: Schemat eksperymentu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Sekwencja procedury chirurgicznej: kraniotomia, wykonanie nacięcia, ustawienie płytki mocującej i podstawków do badań.
Rycina 2: Małoinwazyjna implantacja miękkiej elektrokortykografii (ECoG) na mózg. (A) Dostęp chirurgiczny do czaszki z zaznaczeniem punktu bregma. (B) Obustronna kraniotomia z widoczną oponą twardą. (C) Nacięcie opony twardej w pierwszej półkuli. (D) Podtwardówkowa implantacja miękkiej ECoG i zamknięcie opony twardej. (E) Nacięcie opony twardej w drugiej półkuli. Fixacja płata kostnego w pierwszej półkuli za pomocą mostków tytanowych. (F) Implantacja miękkiej ECoG w drugiej półkuli i zamknięcie opony twardej. (G) Fixacja płata kostnego w drugiej półkuli. (H) Pozycjonowanie płytki mocującej na czaszce. (I) Fixacja podstawka na płytce mocującej. (J) Zamknięcie skóry wokół podstawy podstawka. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat stymulacji mózgu; wykresy amplitudy AEP i wykresy analizy odpowiedzi; badanie z zakresu neuronauki.
Rysunek 3: Rejestracja potencjałów wywołanych słuchowo. (A) Schemat rozmieszczenia elektrod na powierzchni płata skroniowego. (B) Reprezentatywne mapowanie aktywności podstawowej (szare ślady) oraz potencjałów wywołanych słuchowo w odpowiedzi na stymulację krótkimi impulsami dźwiękowymi o częstotliwości 800 Hz (fioletowy ślad). Każna średnia odpowiada jednemu kanałowi w macierzy miękkiego ECoG. Uśrednianie jest wyzwalane przez analogowy sygnał wejściowy ze stymulacji dźwiękowej. Okresy stymulacji akustycznej „ON” i „OFF” są zaznaczone na jednym kanale w lewym dolnym rogu. (C) Ewolucja w czasie (dzień 0, miesiąc 2 i miesiąc 5) odpowiedzi pojedynczego kanału po bodźcu akustycznym, w porównaniu do sygnału podstawowego w sytuacji braku bodźca (szary). Uśrednianie jest wyzwalane przez analogowy sygnał wejściowy ze stymulacji dźwiękowej. Okresy stymulacji „ON” i „OFF” są zaznaczone na dole. Potencjał wywołany stymulacją „ON” jest oznaczony strzałkami. (D) Odchylenie standardowe na kanał (kolorowe kropki) w poszczególnych punktach czasowych rejestracji podstawowej. Wartości mediany przedstawiono na ciemnoniebiesko. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Sekwencja MRI i CT mózgu; skany T1, T2-zależne, w skali szarości oraz metoda implantacji do diagnostyki.
Rysunek 4: Obrazowanie in vivo mózgu i wszczepionych elektrod. (A) Pooperacyjne MRI T1-zależne w płaszczyźnie czołowej. Strzałka wskazuje zagięty implant. (B) Powiększony fragment A, gdzie zagięcie implantu powoduje wgniecenie w mózgu. (C) MRI T1-zależne po 1 miesiącu implantacji, wykazujące ucisk mózgu z powodu włóknistej enkapsulacji tkanki mózgowej w tym samym miejscu, co w C. (D) Śródoperacyjne zdjęcie rentgenowskie w płaszczyźnie, weryfikujące umiejscowienie implantu i brak zagięć, co potwierdza położenie markerów radioprzepuszczalnych. Wstawka: Zdjęcie implantu z widocznym markerem radioprzepuszczalnym. (E) Pooperacyjne MRI T1-zależne w płaszczyźnie czołowej z optymalnym umiejscowieniem implantu. (F) MRI T1-zależne po 1 miesiącu implantacji. (G) MRI T2-zależne po 1 miesiącu implantacji. Strzałka wskazuje artefakt obrazowy pochodzący od tytanowych śrub utrzymujących płytkę stopową na czaszce. (H) MRI TSE-zależne po 1 miesiącu implantacji. (I) Tomografia komputerowa (CT) zwierzęcia z wszczepionymi elektrodami klinicznymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Przecinanie, zatapianie i immunostaining mózgu myszy; mikroskopia fluorescencyjna; markery GFAP, NeuN, Iba1.
Rysunek 5: Analiza histologiczna mózgu po długoterminowej implantacji. (A) Zdjęcie wyjętej z organizmu i perfundowanej lewej półkuli mózgu. (B) Perfundowany mózg pocięty na bloki przed etapem zamrażania. (C) Zdjęcie konfiguracji do cięcia całych bloków w kriosztacie; możliwe jest cięcie wszystkich „bloków wstępnie pociętych”. (D) Obrazowanie immunostaining całej półkuli (skaner slajdów, obiektyw 20x) oraz(E) powiększenie pierwszych warstw kory (obrazowanie konfokalne, obiektyw 40x) przedstawiające komórki glejowe, astrocyty i neurony. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wyniki spektroskopii impedancyjnej; częstotliwość względem modułu, fazy i impedancji in vivo.
Rysunek 6: Charakterystyka elektrochemiczna implantowanych elektrod. (A) Spektroskopia impedancyjna in vitro macierzy miękkich elektrod (małe szare linie dla każdego kanału, średnia na czerwono) z modułem impedancji (góra) i fazą (dół). (B) Zmiany modułu impedancji przy 1 kHz w ciągu 6 miesięcy implantacji (średnia na niebiesko; szare linie to poszczególne kanały; pomiar in vitro podano jako referencję na czerwono). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Postument kompatybilny z MRI. (A) Przewlekły system połączeń przezskórnych kompatybilny z MRI (postument) umożliwiający dostęp do macierzy elektrod miękkich. (B) Postument z elektrodami zamontowanymi na stopce służącej do kotwiczenia w czaszce. Wstawka: Szczegóły stopki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Dostęp chirurgiczny dla optymalnej perfuzji mózgu. (A) Nacięcie skóry i dostęp do miejsca położenia tętnicy szyjnej oraz żyły szyjnej. (B) Disekcja tkanki wokół naczyń krwionośnych. (C,D) Identyfikacja i disekcja tkanki wokół tętnicy szyjnej i żyły szyjnej. (E) Izolacja tętnicy szyjnej od tkanki pod nią. (F) Izolacja żyły szyjnej od tkanki pod nią. (G) Umieszczenie nici chirurgicznych wokół tętnicy szyjnej (szew 1 i szew 2) oraz żyły szyjnej (szew 3). (H) Zaciśnięcie szwu 3 u podstawy tętnicy szyjnej (od strony serca), aby uniknąć krwawienia podczas otwierania naczynia. (I) Zaciśnięcie tętnicy szyjnej po przeciwnej stronie niż w punkcie H. (J) Przecięcie tętnicy szyjnej. (K) Wprowadzenie cewnika do otworu powstałego w punkcie J. Wstawka: Przygotowany cewnik z solą fizjologiczną przepłukaną strzykawką do końcówki cewnika. (L) Zaciśnięcie szwu 2 w celu utrzymania cewnika w miejscu i wzdłuż tętnicy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Parametry dla sekwencji MRI odpowiednio dla T1- (strony 1-2), T2- (strony 3-4) oraz TSE- (strony 5-6). Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Metadane skanera slajdów do obrazowania całych preparatów barwionych przekrojów mózgu. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Metadane dla obrazowania konfokalnego powiększonego fragmentu barwionych przekrojów mózgu. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przedstawiamy tutaj metodę długotrwałej implantacji i oceny miękkich macierzy ECoG. W tym badaniu zaprojektowaliśmy spójne, minimalnie inwazyjne podejście chirurgiczne do obustronnej implantacji funkcjonalnych siatek elektrod nad płatami skroniowymi (w tym przypadku ukierunkowanymi na korę słuchową). Najpierw oceniliśmy funkcjonalność siatki, z powodzeniem rejestrując potencjały wywołane w czasie trwania badania (6 miesięcy) i śledząc właściwości elektrochemiczne elektrod (patrz rysunek 6). Po drugie, oceniliśmy bezpieczeństwo biologiczne siatek, in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego i stworzenia systemu w pełni kompatybilnego z rezonansem magnetycznym, a także sekcji zwłok, opracowując protokół pobierania tkanek i barwienia immunologicznego.

Aby zminimalizować inwazyjność, zoptymalizowaliśmy wielkość okna kraniotomii. Aby dotrzeć do kory słuchowej znajdującej się na płacie skroniowym i uniknąć resekcji mięśnia skroniowego, opracowaliśmy technikę wsuwania implantu pod oponę twardą. Technika ta pozwala drastycznie zmniejszyć powierzchnię odsłoniętego mózgu i nadal docierać do odległych celów. Chociaż ten rodzaj implantacji może wydawać się ślepy, zastosowanie markerów nieprzepuszczających promieni rentgenowskich na urządzeniach, które są wizualizowane w promieniowaniu rentgenowskim w płaszczyźnie śródoperacyjnej, pozwala na weryfikację położenia i zapewnia, że matryca nie jest złożona pod oponą twardą. Ślizg podtwardówkowy okazał się bezpieczny w większości wykonanych przez nas powtórzeń. Dodatkowo, durotomia w szczelinie minimalizuje wybrzuszenia mózgu w czasie, gdy kraniotomia jest otwarta i ułatwia zamykanie wokół implantu bez konieczności stosowania dodatkowego materiału, takiego jak sztuczna opona twarda, która mogłaby zaburzyć reakcję zapalną. Wreszcie, mocną stroną tego podejścia chirurgicznego jest jego zdolność do transpozycji do różnych obszarów kory mózgowej. Zabawa współrzędnymi, pozycją kraniotomii i rozmiarem urządzenia, które można dostosować, umożliwia tej metodzie celowanie w większość obszaru kory mózgowej.

Przedstawiona tu metoda chirurgiczna, wraz z oceną funkcjonalną i badaniem biointegracji w czasie, nie ogranicza się do technologii miękkich elektrod zastosowanych w niniejszym raporcie. Inne elektrody podtwardówkowe, które są opracowywane do translacji u ludzi, mogą być oceniane za pomocą tego samego protokołu. Siła tej metody polega na tym, że większość elementów, takich jak kabel i cokół, jest modułowa, personalizowana i może być dostosowana do konkretnego testowanego urządzenia. Dodatkowo, sondy wewnątrzkorowe lub głęboko penetrujące mogą być również używane zamiast lub w połączeniu z elektrodami podtwardówkowymi, ponieważ wymaga to jedynie dostosowania geometrii kraniotomii i durotomii. Długoterminowe wyniki można następnie porównać z ich klinicznymi odpowiednikami, tak jak zrobiliśmy to tutaj.

Jednym z głównych ograniczeń prezentowanej metody jest obecność zatok czaszkowych u świnek miniaturowych, które rozwijają się w ciągu pierwszego rokużycia 12. W związku z tym ważnymi aspektami, które należy wziąć pod uwagę, są wiek implantacji, a także wielkość zwierzęcia. Wykonywanie kraniotomii w czaszce osoby dorosłej narusza integralność zatok i prowadzi do wysokiego ryzyka poważnej infekcji w warunkach przewlekłych. Takie zatoki są widoczne na płaskim zdjęciu rentgenowskim i tomografii komputerowej przed operacją. Z drugiej strony, zbyt wczesne wykonanie przewlekłej implantacji u zwierzęcia, które jest zbyt małe, również nie jest optymalne, gdy czaszka przechodzi ogromny wzrost i przebudowę. Postawiliśmy hipotezę, że te "ruchy czaszki" po operacji mogą powodować przesuwanie się i fałdowanie implantu, co ostatecznie jest szkodliwe dla eksperymentu. Stwierdziliśmy tutaj, że miniświnki z Getyngi, które w momencie implantacji mają około 5-6 miesięcy (i 8 kg) powinny dawać najlepsze wyniki.

W celu oceny działania wszczepionego ECoG do zapisów elektrofizjologicznych opracowaliśmy szybki protokół rejestracji słuchowego potencjału wywołanego (AEP), który może być stosowany u zwierząt poruszających się swobodnie i w sedacji. Polega na zaprezentowaniu serii akustycznych impulsów tonów o określonych częstotliwościach w ciągu kilku minut. Zaletą takiego protokołu jest fakt, że można go dostroić do dostępnej długości nagrania poprzez zmniejszenie liczby sondowanych częstotliwości. Jednym z wyzwań podczas rejestrowania sygnałów korowych w znieczuleniu jest to, że poziom świadomości zwierzęcia powinien być brany pod uwagę podczas analizowania i porównywania danych.

Protokół perfuzji był dostosowywany w czasie poprzez obserwację jakości wyekstrahowanego mózgu. Rzeczywiście, okazało się, że łatwiej jest cewnikować tylko tętnicę szyjną, a nie żyłę szyjną. Początkowo w literaturze przedstawiono metody, w których żyła szyjna jest cewnikowana w celu drenażu odpadów20. W praktyce ogranicza to przepływ krwi z mózgu i prowadzi do gorszego pobierania krwi i ogólnej jakości perfuzji. Przecinając żyłę szyjną i pozostawiając płyn do ucieczki w dużym pojemniku, w którym leży zwierzę, zwiększa się wydajność perfuzji.

Opracowaliśmy solidną metodę przygotowania tkanek, która działa z przeciwciałami rutynowo stosowanymi do śledzenia stanu zapalnego. Rozdzieliliśmy te dwie półkule ze względów praktycznych, ponieważ połowa mózgu świni mieści się na standardowych szkiełkach mikroskopowych, a zatem jest kompatybilna z większością urządzeń do obrazowania dostępnych w laboratoriach histologicznych. Dzięki pocięciu mózgu na bloki, możliwy jest bezpośredni dostęp do strefy zainteresowania bez konieczności dalszego cięcia całego mózgu lub przycinania rozległych części tkanki. Wycinki mózgu o wielkości 40 μm można łączyć w standardowych płytkach dołkowych i barwić w sposób swobodnie unoszący się bez większych zmian w protokole spowodowanych barwieniem immunologicznym innych gatunków. Pełne barwienie immunologiczne mózgu można również przewidzieć, stosując na przykład metody CLARITY21.

Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół, który obejmuje spersonalizowane projektowanie implantów aż do implantacji, monitorowanie funkcjonalności i ocenę bezpieczeństwa biologicznego, jest solidny i spójny. Wykazaliśmy tutaj jego wykonalność do badania układu słuchowego, ale można go przetransponować w celu zbadania innych funkcji fizjologicznych. Co więcej, siła naszej metody polega na tym, że nie ogranicza się ona do świnek miniaturowych, ale jest w pełni transpozycyjna na inne gatunki, takie jak owce, kozy czy naczelne. Do pewnego stopnia można go również łatwo dostosować do szczurów.

Oświadczenia

F.F. i S.P.L. są współzałożycielami i udziałowcami firmy Neurosoft Bioelectronics SA zajmującej się opracowywaniem układów miękkich elektrod.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od Fundacji Bertarelli oraz grantu SNSF Sinergia CRSII5_183519. Autorzy pragną również podziękować Katii Galan z EPFL za jej pomoc w opracowaniu protokołu barwienia dla histologii, personelowi Platformy Mikrosystemów Neuronowych Centrum Bio i Neuroinżynierii Wyss w Genewie za pomoc w procesach produkcyjnych, personelowi platformy dla zwierząt w Uniwersyteckim Centrum Medycznym (CMU) na Uniwersytecie Genewskim (UNIGE) za opiekę nad zwierzętami, asysta chirurgiczna i postępowanie pooperacyjne świnki miniaturowej (John Diaper, Xavier Belin, Fabienne Fontao i Walid Habre), członkowie zespołu Centrum Obrazowania Biomedycznego (CIBM) na Uniwersytecie Genewskim (Julien Songeon, François Lazeyras i Rares Salomir), członkowie personelu Oddziału Patologii Szpitala Uniwersyteckiego w Genewie (HUG) (Sami Schranz, Francesca Versili, Ruben Soto i Koralina Egger) oraz Blaise Yvert z Université Grenobles-Alpes za wkład i wymianę informacji na temat przewlekłych eksperymentów z miniświniami. Autorzy pragną podziękować pracownikom Neurosoft Bioelectronics SA za pomoc w procesie wytwarzania oraz za pomoc w eksperymentach z miniświniami (Benoit Huguet i Margaux Roulet).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wiertło do kościBBraunElan 4 z  Rękojeść
Wiertło do kościBBraunNeurocutter GP204R
Wosk kostnyEthiconW31G
CewnikVenisystemsAbbocath 14G
ZeissLSM 880
KriostatLeicaCM1950
GelfoamPfizerGelfoam
Włóż głośnikiEtymoticEtymotic ER2 włóż słuchawki
MultimetrFluke Fluke1700
OscyloskopTektronixMDO3014 Oscyloskop
Pompa perfuzyjnaShenzenLabS3/UD15
PotencjostatGamry InstrumentsReference 600
Przeciwciało pierwotne Anty-GFAPThermofischerAnti-GFAP, Szczur, # 13-0300
Przeciwciało pierwotne anty-Iba1FujifilmAnti Iba1, Królik, 019-19741
Przeciwciało pierwotne Anti-NeuNSigmaAldrichAnti-NeuN, świnka morska, ABN90
Generator impulsówAM SystemsModel 2100 Izolowany stymulator
Nagrywanie sceny głównejSystemy wielokanałoweW2100-HS32
System nagrywaniaSystemy wielokanałoweW2100
ŚrubokrętMedtronicUchwyt: 001201, Wał: 8001205
Przeciwciało drugorzędowe 488ThermofischerKoza anty-szczurza IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 488, # A-11006
Przeciwciało drugorzędowe 555ThermofischerKozia świnia morska IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 555, # A-21435
Przeciwciało drugorzędowe 647ThermofischerGoat anty-królicze IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 647, # A-21245
Skaner slajdówOlympusVS120
SnapfrostExciloneExcilone Snapfrost
Nóż do dźganiaGrzywna Science Tools10316-14
Drut do szycia skórnyEthiconVicryl 2-0
Drut do szycia opony twardejEthiconMersilk 5-0 
Drut do szycia cewnikaEthiconVycril 3-0 bez igły Drut
do szycia do podnoszenia opony twardejEthiconProlene 6-0 z igłą BV-1 Drut
do szycia podskórnyEthiconVicryl 4-0
Most tytanowyMedtronicTiMesh 015-2001-4Wytnij wymagany rozmiar
tytanoweMedtronic9001635, 9001640
System rentgenowskiGEGE OEC 9800 Plus C-Arm
GA861 Mikroskop konfokalny , w domenie mieszanejimpulsów

Bibliografia

  1. Ritaccio, A. L., Brunner, P., Schalk, G. Electrical stimulation mapping of the brain: Basic principles and emerging alternatives. Journal of Clinical Neurophysiology. 35 (2), 86-97 (2018).
  2. Mullin, J. P., Sexton, D., Al-Omar, S., Bingaman, W., Gonzalez-Martinez, J. Outcomes of subdural grid electrode monitoring in the stereoelectroencephalography era. World Neurosurgery. 89, 255-258 (2016).
  3. Vansteensel, M. J., et al. Fully implanted brain-computer interface in a locked-in patient with ALS. The New England Journal of Medicine. 375 (21), 2060-2066 (2016).
  4. Lacour, S. P., Courtine, G., Guck, J. Materials and technologies for soft implantable neuroprostheses. Nature Reviews. Materilas. 1, 16063(2016).
  5. Fallegger, F., Schiavone, G., Lacour, S. P. Conformable hybrid systems for implantable bioelectronic interfaces. Advanced Materials. 32 (15), 1903904(2019).
  6. Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: A review. European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).
  7. Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. Swine as models in biomedical research and toxicology testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
  8. Khoshnevis, M., et al. Development of induced glioblastoma by implantation of a human xenograft in Yucatan minipig as a large animal model. Journal of Neuroscience Methods. 282, 61-68 (2017).
  9. Borton, D., et al. Developing implantable neuroprosthetics: A new model in pig. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society. 2011, 3024-3030 (2011).
  10. Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
  11. Gierthmuehlen, M., et al. Evaluation of mECoG electrode arrays in the minipig: Experimental procedure and neurosurgical approach. Journal of Neuroscience Methods. 202 (1), 77-86 (2011).
  12. Palma, M., et al. Chronic recording of cortical activity underlying vocalization in awake minipigs. Journal of Neuroscience Methods. 366, 109427(2022).
  13. Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C. H., Palomero-Gallagher, N. The telencephalon of the Göttingen minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy. Brain Structure & Function. 222 (5), 2093-2114 (2017).
  14. Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
  15. Shepherd, R. K., Villalobos, J., Burns, O., Nayagam, D. A. X. The development of neural stimulators: A review of preclinical safety and efficacy studies. Journal of Neural Engineering. 15 (4), 041004(2018).
  16. Schiavone, G., et al. Soft, implantable bioelectronic interfaces for translational research. Advanced Matererials. 32 (17), 1906512(2020).
  17. Fallegger, F., et al. MRI-compatible and conformal electrocorticography grids for translational research. Advanced Science. 8 (9), 2003761(2021).
  18. Minev, I. R., Wenger, N., Courtine, G., Lacour, S. P. Research update: Platinum-elastomer mesocomposite as neural electrode coating. APL Materials. 3 (1), 014701(2015).
  19. Schiavone, G., et al. Guidelines to study and develop soft electrode systems for neural stimulation. Neuron. 108 (2), 238-258 (2020).
  20. Musigazi, G. U., De Vleeschauwer, S., Sciot, R., Verbeken, E., Depreitere, B. Brain perfusion fixation in male pigs using a safer closed system. Laboratory Animals. 52 (4), 413-417 (2018).
  21. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Podtwardzeniowa macierz ECoGmodel miniproimplantacja mi kkich elektrodd ugoterminowa implantacjarejestracja z kory s uchowejrejestracja elektrofizjologicznaimplant kompatybilny z MRIprocedura kraniotomiirozw j neuroprotezy
Implantacja matrycy podtwardówkowej miękkiej elektrokortykografii (ECoG) i długotrwała rejestracja kory mózgowej u świnek miniaturowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.