Implantacja matrycy podtwardówkowej miękkiej elektrokortykografii (ECoG) i długotrwała rejestracja kory mózgowej u świnek miniaturowych

Summary

Tutaj prezentujemy metodę długoterminowej oceny wydajności i bezpieczeństwa miękkich matryc elektrod podtwardówkowych w modelu minipig, opisując metodę i narzędzia chirurgiczne, pooperacyjny rezonans magnetyczny, elektrofizjologię kory słuchowej, właściwości elektrochemiczne implantu oraz immunochemię pośmiertną.

Abstract

Zaburzenia i choroby neurologiczne mogą być diagnozowane lub leczone za pomocą matryc elektrokortykografii (ECoG). W padaczce lekoopornej pomagają one wyznaczyć obszar padaczkowy do wycięcia. W długoterminowych zastosowaniach, takich jak interfejsy mózg-komputer, te epickie elektrody są używane do rejestrowania intencji ruchowych mózgu, do kontrolowania robotycznych kończyn sparaliżowanych pacjentów. Jednak obecne sztywne siatki elektrod nie odpowiadają na potrzebę zapisów mózgu w wysokiej rozdzielczości i długoterminowej biointegracji. Ostatnio zaproponowano elastyczne układy elektrod, aby osiągnąć długoterminową stabilność implantu przy wysokiej wydajności. Potrzebne są jednak badania przedkliniczne nad tymi nowymi technologiami implantologicznymi, aby potwierdzić ich długoterminową funkcjonalność i profil bezpieczeństwa w odniesieniu do ich przełożenia na pacjentów. W tym kontekście modele świń są rutynowo wykorzystywane do opracowywania wyrobów medycznych ze względu na ich duże rozmiary narządów i łatwą obsługę zwierząt. Jednak w literaturze opisano tylko kilka zastosowań mózgu, głównie ze względu na ograniczenia chirurgiczne i integrację systemu implantów z żywym zwierzęciem.

Tutaj przedstawiamy metodę długoterminowej implantacji (6 miesięcy) i ocenę miękkich macierzy ECoG w modelu minipig. W badaniu najpierw przedstawiono system implantów, składający się z miękkiego mikrofabrykowanego układu elektrod zintegrowanego z polimerowym portem transdermalnym kompatybilnym z rezonansem magnetycznym (MRI), w którym znajdują się złącza oprzyrządowania do zapisów elektrofizjologicznych. Następnie w badaniu opisano procedurę chirurgiczną, od implantacji podtwardówkowej po rekonwalescencję zwierząt. Skupiamy się na korze słuchowej jako przykładowym obszarze docelowym, w którym potencjały wywołane są indukowane przez stymulację akustyczną. Na koniec opisujemy sekwencję pozyskiwania danych, która obejmuje rezonans magnetyczny całego mózgu, charakterystykę elektrochemiczną implantu, śródoperacyjną i swobodnie poruszającą się elektrofizjologię oraz barwienie immunohistochemiczne pobranych mózgów.

Ten model może być wykorzystany do zbadania bezpieczeństwa i funkcji nowatorskiego projektu protez korowych; obowiązkowe badanie przedkliniczne w celu wyobrażenia sobie translacji na pacjentów ludzkich.

Introduction

Zaburzenia i choroby neurologiczne mogą być diagnozowane lub leczone za pomocą matryc elektrokortykografii (ECoG). Te siatki elektrod są wszczepione na powierzchni mózgu i pozwalają na rejestrację lub stymulację ludzkiej kory mózgowej¹. Na przykład w przypadku padaczki lekoopornej pomagają one wyznaczyć obszar padaczkowy do resekcji². W długoterminowych zastosowaniach, takich jak interfejsy mózg-komputer, te epikortyczne elektrody są używane do rejestrowania intencji ruchu mózgu, do sterowania kończynami robotycznymi sparaliżowanych pacjentów³. Jednak obecne siatki elektrod są wykonane ze sztywnych metalowych bloków osadzonych w sztywnych podłożach polimerowych i nie odpowiadają na potrzebę zapisów mózgu w wysokiej rozdzielczości i długotrwałej biointegracji podtwardówkowej (>30 dni). Zamiast tego wywołują miejscowe reakcje tkankowe, które prowadzą do zwłóknieniowej enkapsulacji wszczepionego urządzenia, co z czasem prowadzi do gorszej wydajności. Ostatnio zaproponowano elastyczne lub rozciągliwe układy elektrod wykorzystujące cienkie podłoża polimerowe wytwarzane technikami mikrofabrykacji, aby osiągnąć wysoką wydajność w długotrwałych implantacjach poprzez ograniczenie reakcji tkankowej^4,5. Potrzebne są jednak badania przedkliniczne nad tymi nowymi technologiami implantologicznymi, aby potwierdzić ich długoterminową funkcjonalność i profil bezpieczeństwa, tak aby można było przewidzieć ich translację na pacjentów. W tym kontekście, modele świnek miniaturowych i świń są rutynowo wykorzystywane do opracowywania urządzeń w innych kontekstach medycznych (np. układu sercowo-naczyniowego, kostnego lub żołądkowego) ze względu na ich duże rozmiary narządów i łatwą obsługę zwierząt^6,7,8. Jednak w literaturze opisano tylko kilka zastosowań neurofizjologii ukierunkowanych na mózg, głównie ze względu na ograniczenia podejścia chirurgicznego i integrację systemu implantów na żywym zwierzęciu^9,10,11,12. Często nie są one zgodne z przewlekłym implantowaniem u żywych zwierząt, ponieważ wymagałoby to na przykład opracowania złożonego sprzętu, takiego jak wszczepialna wbudowana elektronika. Ponadto nie badają wpływu systemu implantów na tkankę docelową, co ma kluczowe znaczenie dla aspektu bezpieczeństwa biologicznego w badaniach translacyjnych. Model świni jest zbliżony do anatomii człowieka pod względem budowy kory mózgowej, kości czaszki i grubości skóry¹³. Co więcej, ich zdolność do uczenia się zadań behawioralnych sprawia, że są potężnym modelem do badania strategii rehabilitacji funkcjonalnej lub percepcji sensorycznej¹⁴.

Tłumaczenie nowych technologii i terapii na ludzi wymaga oceny bezpieczeństwa i skuteczności, zgodnie z wymogami kompetentnych władz medycznych. Są one zazwyczaj opisane w dokumentach technicznych i normach¹⁵, jednak wymagają one jedynie przejścia tych testów i nie badają rzeczywistego efektu implantacji urządzenia lub zbierania innych użytecznych danych równolegle z badaniem bezpieczeństwa. W celu przeprowadzenia pełnego badania bezpieczeństwa biologicznego i wydajności mózgu, przedstawiamy tutaj podłużny i systematyczny zbiór danych obrazowych mózgu, pomiarów elektrofizjologicznych, oceny właściwości elektrochemicznych wszczepionych elektrod oraz histologii pośmiertnej w modelu świniowym. Aby to osiągnąć, należy wziąć pod uwagę kilka aspektów, aby stworzyć kompletny model eksperymentalny: (i) minimalnie inwazyjny dostęp chirurgiczny do implantacji urządzenia wraz ze stabilnym mechanicznie portem transdermalnym do połączenia z elektrodami, (ii) solidny paradygmat zapisu elektrofizjologicznego, który służy jako dane wyjściowe dla wszczepionych elektrod zarówno w znieczuleniu, jak i w warunkach swobodnego ruchu, (iii) obrazowanie in vivo (tomografia komputerowa [CT] i/lub rezonans magnetyczny [MRI]) w różnych punktach czasowych w celu śledzenia ewolucji mózgu i implantu, a także kompatybilności wszczepionego systemu ze sprzętem do obrazowania, oraz (iv) proces przygotowania tkanek w celu ekstrakcji mózgu do analizy histologicznej.

Tutaj opisujemy metodę długotrwałej implantacji (6 miesięcy) i ocenę miękkich matryc ECoG w modelu minipig (pokazanym schematycznie w Rysunek 1). Układy miękkich elektrod zostały przedstawione w naszych poprzednich raportach i są wykonane z cienkich membran silikonowych zatapiających elastyczne cienkie złote folie używane jako ścieżki elektryczne^16,17. Kontakt z tkanką odbywa się poprzez mieszaninę nanocząstek platyny osadzonych w matrycy silikonowej, co zapewnia miękki i wydajny interfejs elektrochemiczny z tkanką mózgową¹⁸. Implanty są połączone elastycznym tunelowanym podstodniowo przez czaszkę i skórę z portem transdermalnym, w którym znajdują się łączniki na głowie zwierzęcia. Rozmiar i kształt implantu można dostosować do celu i potrzeb badania. Obecne paski elektrod w tym badaniu odzwierciedlają rzeczywisty rozmiar pasków klinicznych. Klinicznie dostępne paski i siatki podtwardówkowe zastosowano jako komparatory przy użyciu tego samego podejścia. Polimerowy port transdermalny kompatybilny z MRI jest umieszczany na czaszce za pomocą systemu podstawy, który mocno zakotwicza go w czaszce. Tutaj szczegółowo opisujemy procedurę chirurgiczną, od podtwardówkowej implantacji obu półkul do powrotu do zdrowia zwierzęcia. Skupiamy się na korze słuchowej jako przykładowym obszarze docelowym, w którym potencjały wywołane są indukowane przez stymulację akustyczną zarówno w warunkach znieczulonych, jak i swobodnie poruszających się. W różnych punktach czasowych mózg zwierzęcia jest obrazowany w rezonansie magnetycznym (lub CT dla elektrod klinicznych) w znieczuleniu i mierzone są właściwości elektrochemiczne elektrod. Metody charakteryzacji elektrod są wykorzystywane do śledzenia ewolucji implantu i granicy elektroda-tkanka (więcej szczegółów można znaleźć w Schiavone et al.¹⁹). Obejmują one chronoamperometrię w celu zbadania zdolności stymulacyjnych kontaktu elektrody, elektrochemiczną spektroskopię impedancji (EIS), która może wskazać ewolucję rezystancyjnych i pojemnościowych składników elektrody, oraz międzykanałowe pomiary rezystancji w celu zbadania awarii hermetycznej enkapsulacji. Na koniec opracowaliśmy rurociąg ekstrakcji tkanek w celu perfuzji mózgu po eutanazji, eksplantacji z założonymi elektrodami, przekroju i przeprowadzenia analizy histologicznej przy użyciu różnych markerów stanu zapalnego. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta umożliwi prowadzenie badań przedklinicznych z solidnym gromadzeniem danych multimodalnych w celu przyszłego klinicznego przełożenia nowych technologii i terapii na mózg.

Protocol

Procedury chirurgiczne i behawioralne zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zatwierdzone przez lokalne (Kanton Genewski) i federalne (szwajcarskie) władze weterynaryjne z numerem autoryzacji GE11120A. W badaniach wykorzystano samice świnek miniaturowych z Getyngi (n = 7) w wieku 2-6 miesięcy (5-8 kg).

1. Planowanie przedoperacyjne

1. Charakterystyka in vitro systemu implantów miękkich
   1. Chronoamperometria: Zapisz spadek napięcia po wstrzyknięciu dwufazowego impulsu prądu (tj. napięcia przejściowego [VT]) za pomocą oscyloskopu połączonego równolegle z generatorem impulsów. Podłącz kolejno generator impulsów do każdej elektrody i licznika platyny w roztworze soli (sól fizjologiczna buforowana fosforanami [PBS] 1x). Zapoznaj się z krokiem 3.1, aby zapoznać się z ustawieniami.
   2. Spektrogram impedancji elektrochemicznej: Zmierz impedancję elektrochemiczną przy różnych częstotliwościach za pomocą potencjometru. Podłącz potencjometr kolejno do każdej elektrody za pomocą licznika platynowego i elektrody referencyjnej Ag/AgCl w roztworze soli fizjologicznej (PBS 1x). Zapoznaj się z krokiem 3.2, aby zapoznać się z ustawieniami.
   3. Rezystancja międzykanałowa: W stanie suchym zmierz rezystancję prądu stałego (DC) między sąsiednimi kanałami za pomocą ręcznego multimetru.
   4. Wybór implantu: Po wykonaniu trzech wyżej wymienionych pomiarów należy wybrać implant zgodnie z następującymi kryteriami: impedancja przy 1 kHz poniżej 100 kΩ i brak rezystancji międzykanałowej poniżej 1 MΩ.
2. sterylizacja
   1. Sterylizacja implantów: Umieść wybrane implanty pojedynczo w workach sterylizacyjnych wraz ze znacznikiem sterylizacyjnym i zamknij je. Zastosuj podwójne opakowanie, aby zapewnić sterylność podczas operacji.
      UWAGA: W tym przypadku stosuje się sterylizację gazową nadtlenkiem wodoru (_H2O2) ze względu na krótki cykl czasowy i niską temperaturę (55 °C). Alternatywą jest gaz tlenek etylenu (ETO) lub sterylizacja w autoklawie, ale należy zapewnić kompatybilność z systemem implantów.
   2. Sterylizacja narzędzi: Umieść oczyszczone narzędzia w podwójnych workach sterylizacyjnych lub sterylnych pudełkach na narzędzia wraz ze znacznikami sterylizacyjnymi. Sterylizacja w autoklawie jest najczęściej stosowana w przypadku instrumentów, ale możliwymi alternatywami są_H2O2lub ETO.

2. Chirurgiczne wszczepianie miękkich matryc ECoG

1. znieczulenie
   1. Premedykacja: Odizoluj zwierzę i pościj je przez noc. Wstrzyknąć śródskórnie mieszaninę midazolamu w dawce 0,75 mg/kg, atropiny w dawce 0,25 μg/kg mc. i haldolu w dawce 0,1 mg/kg mc. i poczekać, aż zwierzę zostanie uspokojone. Zważ zwierzę przed kontynuowaniem.
   2. Instalacja przewodu dożylnego (IV):
      1. Umieść zwierzę na stole operacyjnym na poduszce grzewczej. Wywołaj znieczulenie, nakładając maskę na twarz na zwierzę, używając sewofluranu w stężeniu 3%-3,5%.
      2. Umieść przewody do elektrokardiogramu na brzuchu, czujnik saturacji krwi na ogonie i czujnik temperatury w nozdrzu.
      3. Umieść przewód dożylny na żyle usznej i potwierdź dostęp krwi za pomocą strzykawki wypełnionej solą fizjologiczną. Upewnij się, że oczy są nawilżone za pomocą maści.
   3. Intubacja: Wstrzyknąć bolus atrakurium w dawce 0,5 mg/kg, ketaminę w dawce 1 mg/kg i fentanyl w dawce 1-2 μg/kg. Ułóż zwierzę na plecach w celu intubacji. Włóż rurkę 4.5 mm.
   4. Leki: Po intubacji należy przerwać znieczulenie sewofluranem i zainstalować wlew propofolu w dawce 10 mg/kg/h, fentanylu w dawce 2 μg/kg/h, atrakurium w dawce 0,2-0,5 mg/kg/h i soli fizjologicznej w dawce 4-7 mg/kg/h. Rozpocząć infuzję mannitolu w dawce 1 g/kg/h, aby zmniejszyć obrzęk mózgu podczas zabiegu.
      UWAGA: Można zastosować multimodalny schemat analgezji, jeśli jest to zalecane przez lokalną komisję etyki zwierząt.
2. Przedoperacyjne zdjęcie rentgenowskie
   1. Ułóż zwierzę na brzuchu w pozycji sfinksa. Tymczasowo usuń wszelkie metalowe przedmioty znajdujące się w pobliżu mózgu i czaszki zwierzęcia (np. temperaturę ołowiu w nozdrzu).
   2. Uzyskaj zdjęcie rentgenowskie w płaszczyźnie osiowej i strzałkowej z kontrastem kości. Umieść metalowy przedmiot o znanych wymiarach w strzałkowym polu akwizycji, aby służył jako skala do pomiaru grubości czaszki z przodu i z tyłu mózgu.
   3. Zidentyfikuj położenie zatok czołowych (widoczne przez puste przestrzenie poniżej czaszki) i zaznacz najbardziej wysunięte do tyłu położenie na głowie zwierzęcia za pomocą trwałego markera. Wskaże to najdalszy punkt, w którym można wykonać kraniotomię lub wkręcenie w podejściu chirurgicznym opisanym poniżej.
3. Aseptyczne przygotowanie pola i skóry: Ogolić całą powierzchnię głowy poza polem operacyjnym. Za pomocą sterylnego wacika dokładnie wyszoruj głowę betadyną. Następnie umieść sterylne serwety na stole instrumentacyjnym i na zwierzęciu, aby odsłonić tylko okno operacyjne. Na koniec ponownie wyszoruj głowę sterylnym wacikiem z użyciem betadyny.
4. Kraniotomia i durotomia
   1. Cięcie skóry: Naciąć skórę nożem skalpela wzdłuż linii środkowej. Oddziel mięsień i okostną (25 mm bocznie od bregmy po obu stronach i 40 mm przed i z tyłu bregmy) od kości za pomocą tarnika i umieść rozsiewacze, aby uzyskać optymalny dostęp do późniejszego wiercenia.
   2. Pomiary i znakowanie: Zidentyfikuj bregmę i lambdę i oznacz je sterylnym pisakiem chirurgicznym (Rysunek 2A, B). Za pomocą sterylnej linijki nakreśl kontur płata kostnego wyśrodkowany wokół celu implantacji na obu półkulach. W tym konkretnym przypadku wybrano korę słuchową o współrzędnych od -5 mm do -15 mm od bregma i od -4 mm do -20 mm bocznie. Następnie należy dostosować kraniotomię do wielkości implantu i anatomicznych punktów orientacyjnych, ograniczając rozmiar otworu.
   3. Kraniotomia:
      1. Za pomocą wiertła do kości z okrągłym wiertłem tnącym wywierć kontur kraniotomii, biorąc pod uwagę grubość czaszki zmierzoną w kroku 2.2. Owierywać miejsce wiercenia roztworem soli, aby uniknąć przegrzania kości.
      2. Ostrożnie wywierć kontur jednorodnie, aż dotrze do opony twardej. Przy pierwszym przebiciu zakończ wiercenie konturu, aż stanie się wystarczająco cienki, aby prawie się przebić. Następnie użyj płaskiej szpatułki (po stronie środkowej lub bocznej), aby odłamać płat kostny w jednym kawałku, używając krawędzi kraniotomii jako dźwigni. Jeśli napotkasz zbyt duży opór, kontynuuj przerzedzenie kości.
      3. Umieść kawałek kości w sterylnym roztworze soli fizjologicznej.
      4. Po usunięciu płata kostnego ostrożnie odłup krawędź kraniotomii za pomocą Kerisona, aby uniknąć wcięcia ostrej krawędzi kości w oponę twardą.
      5. W przypadku wystąpienia nadmiernego krwawienia na oponie twardej lub kości, należy użyć odpowiednio pianki żelowej lub wosku kostnego. Umieść mokry kompres (standardowa podkładka w sterylnym roztworze soli fizjologicznej) w kraniotomii i powtórz ten krok na drugiej półkuli (Ryc. 2B).
   4. Durotomia:
      1. Za pomocą igły z zestawu do szycia 6-0 ostrożnie przekłuj i unieś oponę twardą na przednim lub tylnym końcu kraniotomii w połowie odległości między stroną przyśrodkową a boczną i utwórz początek nacięcia nożem kłującym.
      2. Następnie, za pomocą małej płaskiej szpatułki umieszczonej w przestrzeni podtwardówkowej, działającej jako podstawa tnąca w celu ochrony kory, utwórz przednio-tylną szczelinę w oponie twardej, przesuwając się jednocześnie obydwoma narzędziami. Upewnij się, że szczelina jest nieco większa niż szerokość implantu (Rysunek 2C). Jeśli na tym etapie wystąpi jakiekolwiek krwawienie lub uszkodzenie, przykryj go pianką żelową i poczekaj, aż przestanie się utrzymywać.
         UWAGA: Trajektoria szczeliny powinna być dostosowana, jeśli w oponie twardej obecne są duże naczynia krwionośne, aby uniknąć krwawienia.
5. Implantacji
   1. Wkładanie urządzenia:
      1. Przepłukać implant (rysunek uzupełniający 1A) solą fizjologiczną po obu stronach, aby łatwiej wsunął się w przestrzeń podtwardówkową. Umieść implant nad szczeliną opony twardej i za pomocą małych kleszczy wprowadź poddusznie urządzenie, przesuwając je kolejno po każdej krawędzi.
      2. Ostrożnie przytrzymaj cokół urządzenia i przesuwaj się wraz z implantem, aby nie wytworzyć napięcia utrudniającego wprowadzenie. Gdy krawędź łącznika znajduje się na górze szczeliny, zatrzymaj wkładanie.
   2. Zabezpiecz implant: Aby zabezpieczyć implant na miejscu, umieść tytanowy most na za krawędzią kraniotomii lub w skrzydłach kotwiących i zabezpiecz go jedną lub dwiema tytanowymi za pomocą odpowiedniego śrubokręta (Rysunek 2D).
   3. Uziemienie: Ostrożnie usuń 1 cm izolacji przewodów uziemiających i włóż ją zewnątrzoponowo na tylny koniec kraniotomii (lub w dowolnym miejscu zewnątrzoponowym daleko od kory zainteresowania lub dużych naczyń krwionośnych) (drut w Rysunek 2E)
   4. Powtórzyć kroki 2.4.4. i 2.5.1.-2.5.3 na półkuli przeciwnej.
   5. Śródoperacyjne zdjęcie rentgenowskie w celu potwierdzenia umieszczenia:
      1. Umieść mokrą podkładkę (standardową podkładkę w sterylnym roztworze soli fizjologicznej) w miejscu operacji, aby utrzymać nawilżenie tkanki. Następnie umieść sterylną serwetę chirurgiczną, aby przykryć głowę zwierzęcia.
      2. Wykonaj płaskie zdjęcia rentgenowskie (osiowe i strzałkowe), aby upewnić się, że implanty są dobrze umieszczone i nie są złożone, używając markerów rentgenowskich jako wskaźników. Jeśli nie, zdejmij zasłonę i wysuń urządzenie, aby ponownie je włożyć (ponownie wykonaj kroki 2.4.4. i 2.5.1.-2.5.3).
   6. Zamknięcie opony twardej: Ostrożnie zszyj oponę twardą wokół implantu za pomocą szwu resorbowalnego 3-0 i małego uchwytu na igłę. Zbliż dwie krawędzie opony twardej do siebie tak bardzo, jak to możliwe, bez rozrywania cienkiej błony za pomocą drutu do szwów (Rysunek 2D, E).
   7. Umieszczenie płata kostnego: Zamocuj tytanowy most na przedniej i tylnej części każdego płata kostnego za pomocą tytanowej. Należy uważać, aby zaplanować rozmieszczenie mostków Ti w odniesieniu do umieszczenia nóg podnóżka w kolejnych krokach. Przykręć koniec tytanowych mostów do czaszki (Rysunek 2F, G).
6. Umieszczenie cokołu i podstawy
   1. Pozycjonowanie: W tej konfiguracji płyta podstawy ma sześć nóg z dwoma otworami na każda (rysunek uzupełniający 1B). Zaplanuj umieszczenie podnóżka na czaszce, aby zoptymalizować położenie (unikaj umieszczania ich na krawędzi kraniotomii lub w mięśniu skroniowym). Pomiń otwory w nogach, jeśli nie można ich wkręcić.
   2. Zabezpieczenie podnóżka: Wkręć tytanowe podnóżka, aż zostaną mocno zamocowane (patrz Rysunek 2H).
   3. Umieszczenie cokołu: Usuń tytanowe mostki nad połączeniowymi i odwróć cokół, aby wylądować na płycie podstawy. Przykręć cokół do podnóżka. Sprawdź, czy cokół jest dobrze osadzony (Rysunek 2I).
7. Szew i zamknięcie
   1. Oczyszczanie rany: Oczyść przestrzeń podskórną z kości lub innych zanieczyszczeń, spłukując je solą fizjologiczną. Odetnij trochę skóry wokół krawędzi cokołu, aby utworzyć okrągłą krawędź podążającą za cylindrem.
   2. Szwy podskórne: Usuń rozpieracze i złóż płaty skóry razem. Wykonaj szwy podskórne za pomocą niewchłanialnego drutu do szwów 4-0, w odstępach 3 mm za pomocą prostych szwów przerywanych lub prostych szwów ciągłych. Zacznij od cokołu, przesuwając się w jego kierunku po obu stronach nacięcia.
   3. Szwy skórne: Zszyj skórę za pomocą niewchłanialnego drutu do szwów 6-0, ze szwami oddalonymi od siebie o 5 mm. Zacznij od cokołu, przesuwając się w jego kierunku po obu stronach nacięcia. Uważaj, aby uzyskać dobre przyleganie tkanek między dwoma płatami skóry i w pobliżu krawędzi cokołu, aby uniknąć pustki (Rysunek 2J).
   4. Opatrunek na ranę: Ponownie oczyść obszar rany sterylną podkładką i betadyną. Nałóż samoprzylepny, sterylny bandaż na ranę.
8. Pomiary in vivo: W przypadku pomiarów in vivo należy postępować zgodnie z sekcjami 3, 4 i 5.
9. Przebudzenie: Po wykonaniu wszystkich pomiarów odłącz zwierzę od wszystkich środków znieczulających, ale trzymaj je pod wentylacją. W celu znieczulenia należy nakleić plaster z buprenorfiną (25 mg/h) na 24 godziny. Umieść zwierzę na poduszce grzewczej pokrytej zasłonami, aby przyspieszyć czas budzenia. Po przywróceniu spontanicznego oddychania należy ekstubować zwierzę i umieścić je pod maską tlenową do czasu odzyskania przytomności (co może zająć od 1 do 4 godzin).
10. Pooperacyjna opieka nad zwierzętami: Przez 5 dni należy utrzymywać zwierzę pod ścisłym nadzorem. Podawać dawkę cefaleksyny w dawce 75 mg dwa razy dziennie z jedzeniem, oddzielnie od innych zwierząt. Dezynfekcję rany należy przeprowadzać codziennie, nakładając duże ilości betadyny za pomocą nasączonych sterylnych podpasek (najlepiej podczas karmienia).
    UWAGA: Opieka długoterminowa i zakwaterowanie: Operowane zwierzę jest trzymane w izolacji przez 24 godziny. Jest umieszczany z powrotem w swojej pierwotnej grupie społecznej, jeśli zwierzę jest wystarczająco zdrowe, aby wchodzić w interakcje społeczne ze swoimi rówieśnikami. Należy prowadzić codzienną obserwację cokołu i otworu skórnego, aby śledzić integrację urządzenia na głowie. W razie potrzeby oczyść miejsce wokół cokołu dużą ilością betadyny.

3. Charakterystyka in vivo miękkiego implantu

1. Chronoamperometria: Rejestruj spadek napięcia po wstrzyknięciu dwufazowego impulsu prądu (tj. VT) za pomocą oscyloskopu połączonego równolegle z generatorem impulsów. Podłącz generator impulsów sekwencyjnie do każdej elektrody i przewodu uziemiającego. Wykonać impuls stymulacji przy 100 μA z szerokością impulsu 300 μs przy 100 Hz.
2. Elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna: Zmierz impedancję elektrochemiczną przy różnych częstotliwościach za pomocą potencjometru. Podłącz generator impulsów sekwencyjnie do każdej elektrody, używając przewodu uziemiającego zarówno jako przeciwelektrody, jak i uziemienia. Ustaw napięcie wzbudzenia na 200 mV i zakres częstotliwości od 1 Hz do 1 MHz, z trzema punktami na dekadę.
3. Krótkie pomiary międzykanałowe: Zmierz rezystancję prądu stałego między sąsiednimi kanałami za pomocą multimetru ręcznego. In vivo międzykanałowa rezystancja prądu stałego jest mierzona tylko w celu sprawdzenia, czy nie występują niedobory poniżej 1 kΩ, co wskazuje na całkowitą awarię obudowy.

4. Zapis elektrofizjologiczny

1. Spontaniczna aktywność: Podłącz bezprzewodowy system nagrywania przez cokół i rejestruj podstawową aktywność przez 2-3 minuty. Nagrania te posłużą jako kontrola do analizy słuchowych potencjałów wywołanych.
2. Słuchowe potencjały wywołane: Oprócz systemu bezprzewodowego włóż głośniki w zamknięte pole w uszach zwierząt. Odtwarzaj impulsową stymulację akustyczną na różnych częstotliwościach (w zakresie od 200 do 20 000 Hz) przy poziomie ciśnienia akustycznego (SPL) około 70 dB w ciągu 120 powtórzeń. Następnie uśrednij nagrania i wyrównaj je w okresie bodźca do analizy.
3. Sensoryczne potencjały wywołane: Umieść igły w pysku w trzech różnych pozycjach. Wywołaj potencjały sensoryczne, stymulując pysk przez ~30 s za pomocą generatora impulsów o różnych amplitudach, aby uzyskać krzywe rekrutacji.

5. Obrazowanie in vivo

1. Transport zwierząt: Zwierzę należy przechowywać w znieczuleniu propofolowym, zgodnie z opisem w kroku 2.1. Użyj wózka transportowego, w którym znajduje się respirator, pompa strzykawkowa i monitor parametrów życiowych, aby przetransportować zwierzę z sali operacyjnej do pracowni obrazowania iz powrotem.
2. Tomografia komputerowa prześwietlenia: Umieść zwierzę na stole skanera i usuń wszelkie metalowe przedmioty wokół głowy (np. czujnik temperatury). Wykonaj tomografię komputerową w najmniejszej rozdzielczości (0,4 mm grubości warstwy) przy użyciu akwizycji izometrycznej z automatycznym wyborem prądu i napięcia w celu uzyskania kontrastu kostnego.
3. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego: Usuń ze zwierzęcia cały sprzęt zawierający metal (użyj przewodów dożylnych i rurki intubacyjnej kompatybilnych z rezonansem magnetycznym). Utrzymuj zwierzę w wentylacji i znieczuleniu pod swewofluranem w temperaturze 3%-3,5%, używając respiratora umieszczonego na zewnątrz komory MRI i połączonego długą rurką ze zwierzęciem. Przed pierwszą sekwencją wstrzyknąć bolus fentanylu w stężeniu 1-2 μg/kg. Należy użyć trzech sekwencji izometrycznych o najmniejszej rozdzielczości: T1-, T2- i sekwencji ważonych echem spinowym turbo (TSE) (parametry pokazane w pliku uzupełniającym 1).

6. Nagrywanie w swobodnym ruchu

1. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą, co w sekcji 4, aby rejestrować sygnały czuwania z mózgu. Podłącz bezprzewodową scenę główną, trzymając zwierzę w ramionach eksperymentatora lub karmiąc zwierzę smakołykami, aby odwrócić jego uwagę. Zapewnij stymulację akustyczną za pomocą zewnętrznych głośników umieszczonych blisko zwierzęcia.

7. Perfuzja i przygotowanie tkanek

1. OPCJONALNIE: Jeśli zwierzę nie jest jeszcze pod narkozą, postępuj zgodnie z krokiem 2.1 dla protokołu znieczulenia.
2. Wprowadzenie cewnika do tętnicy szyjnej w celu perfuzji (rysunek uzupełniający 2)
   1. Rozwarstwienie tętnicy szyjnej i żyły szyjnej: Przetnij gardło w linii środkowej za pomocą kauteryzatora/noża. Najpierw przeciąć skórę, a następnie mięsień wzdłuż środkowej białej linii (brak naczyń pod spodem) (rysunek uzupełniający 2A).
   2. Otwórz dalej, używając palców, aby zrobić przestrzeń wokół tchawicy i pod mięśniem. Poszukaj tętnicy szyjnej (bijącej i różowawej); Nerw błędny czasami znajduje się również wokół (biały), a żyła szyjna może znajdować się pod spodem lub z boku (czerwony). Umieścić rozsiewacze (patrz rysunek uzupełniający 2B).
   3. Rozpocznij rozwarstwienie tętnicy szyjnej za pomocą cienkich kleszczy i okrągłych nożyczek. Użyj nożyczek, aby otworzyć tkankę spojówkową. Jeśli nie ma naczyń krwionośnych, przetnij; jeśli są naczynia krwionośne, kauteryzuj i idź do przodu (rysunek uzupełniający 2C, D). Po wystarczającym wypreparowaniu użyj zacisku, aby przejść pod tętnicę szyjną, tak aby była całkowicie odizolowana (rysunek uzupełniający 2E).
   4. Powtórz tę samą operację z żyłą szyjną (rysunek uzupełniający 2F).
   5. Gdy oba naczynia zostaną całkowicie wypreparowane i odizolowane, umieść wokół nich drut do szycia. Nie zamykaj ich jeszcze. Dwa szwy wokół tętnicy szyjnej, jeden u samej podstawy (szew 1 - strona serca do perfuzji mózgu) i jeden po drugiej stronie (szew 2), pokazano na rysunku uzupełniającym 2G.
   6. Umieść jeden szew wokół żyły szyjnej (szew 3), nie zamykany; oznacz druty taśmą do późniejszego przekroju żyły.
   7. Zamknij szew 1 bardzo mocno, w przeciwnym razie będzie krwawić (rysunek uzupełniający 2H). Zawiąż trzy węzły. Umieść zacisk na drucie, aby obciążyć i wytworzyć napięcie w tętnicy szyjnej.
   8. Zacisnąć tętnicę szyjną za pomocą zacisku naczynia po przeciwnej stronie rozwarstwienia tętnicy szyjnej (strona mózgu do perfuzji mózgu; Rysunek uzupełniający 2I). Szew 2 znajduje się pośrodku, jeszcze nie zamknięty.
   9. Użyj czarnych kleszczy, aby złapać i pociągnąć tętnicę szyjną. Za pomocą cienkich nożyczek przeciąć połowę tętnicy szyjnej w pobliżu podstawy rozwarstwienia (w pobliżu szwu 1, strona serca; patrz rysunek uzupełniający 2J). Upewnij się, że sekcja jest tak schludna, jak to możliwe i sięga do samego naczynia, a nie tylko do "pochwy"; W przeciwnym razie cewnik nie przejdzie. Wprowadzić cewnik, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 2K.
   10. Przepłucz i napełnij cewnik, najpierw PBS, aby w cewniku nie pozostało powietrze (rysunek uzupełniający 2K).
   11. Zamknij szew 2 na tyle mocno, aby nie zniknął, ale nie za bardzo, aby cewnik mógł się jeszcze trochę poruszać (rysunek uzupełniający 2L). Następnie zdejmij zacisk naczynia, zakończ wprowadzanie cewnika tak daleko, jak to możliwe, i zakończ zamykanie szwu 2 (mocno zamknij).
   12. W razie potrzeby użyj drutów do szycia przy szwie 1, aby przymocować podstawę cewnika do skóry przy wyjściu z rany jako dodatkowy stopień bezpieczeństwa. Następnie przenieś zwierzę do strefy perfuzji i podłącz je do PBS/heparyny. Kiedy rozpocznie się perfuzja, pociągnij szew 3 i przetnij żyłę szyjną
3. Eutanazja: Podać dożylnie pentobarbital (90 mg/kg) i przepłukać linię solą fizjologiczną, aby upewnić się, że pełna dawka została podana prawidłowo.
4. Perfuzja: Za pomocą pompy perfuzyjnej (200 ml/min) podłączyć cewnik do tętnicy szyjnej do PBS/heparyny (1 l dla świni o wadze 15 kg), a następnie do PBS zawierającego 4% paraformaldehydu (PFA) (5 l dla świni o wadze 15 kg). Kiedy rozpocznie się perfuzja, pociągnij szew 3 i przetnij żyłę szyjną.
5. Pobieranie tkanek
   1. Ścinanie głowy: Po zakończeniu perfuzji oderwij głowę zwierzęcia od ciała za pomocą skalpela, przecinając skórę i mięśnie oraz wkładając ostrze między pierwszy i drugi kręg.
   2. Postfiksacja: Zanurz głowę w 4% PFA w PBS na kolejne 48 godzin w temperaturze 4 °C, a następnie przenieś do PBS przed ekstrakcją mózgu.
   3. Ekstrakcja mózgu i implantu:
      1. Usuń skórę za pomocą skalpela i zacznij ostrożnie ciąć kość za pomocą rongeur, zaczynając od pierwszych kręgów, wzdłuż rdzenia kręgowego do móżdżku. Po odsłonięciu móżdżku ostrożnie usuń kości skroniowe i odsłoń płaty ciemieniowe i czołowe.
      2. W tym momencie przykręć cokół od podstawy i odetnij nóżki podstawy szczypcami. Usuń kość w pobliżu wejścia do czaszki, aby uwolnić system implantu od kości, bez wyciągania implantów z wyjścia opony twardej.
      3. Jeśli implantu są osadzone w kości, przeciąć jak najbliżej wyjścia. Gdy wystarczająco odsłonięta powierzchnia mózgu zostanie odsłonięta, ostrożnie przetnij oponę twardą wzdłuż linii środkowej za pomocą małych nożyczek.
      4. Uwolnij implantu z wyjścia opony twardej. Zrób zdjęcia z umieszczenia implantu na mózgu. Następnie użyj małej łyżki, aby odłączyć mózg od nerwów czaszkowych poniżej. Ostrożnie wydobądź mózg. Usuń implanty z mózgu.
   4. Postfiksacja mózgu: W zależności od jakości perfuzji, ponownie postfiksuj wyekstrahowany mózg przez 24 godziny w 4% PFA w PBS w temperaturze 4 °C. Trzymaj w 0,1 M PBS w temperaturze 4 °C, aż mózg zostanie przecięty.
   5. Cięcie mózgu: Oddziel dwie półkule za pomocą żyletki. Następnie przetnij mózg prostopadło na cztery różne części. Przetnij wszczepioną strefę na pół, aby uzyskać dwa bloki zawierające wszczepioną strefę i obszar kontrolny. Zachowaj pozostałe dwa bloki, jeśli potrzebnych jest więcej suwaków sterujących.
   6. Krioprotekcja mózgu i zamrażanie: Przenieś bloki mózgowe do roztworu 15% sacharozy, a następnie 30% sacharozy w temperaturze 4 °C, aż mózg zanurzy się i osiągnie równowagę. Następnie zamrozić tkankę w izopentanie w temperaturze -55 °C w systemie zamrażania tkanek.

8. Histologia

1. Cięcie tkanek
   1. Kriostat: Umieść zamrożony mózg w kriosacie i przycinaj, aż zostaną uzyskane pełne sekcje. Następnie pokrój mózg na sekcje 40 μm i zanurz w grupach po trzy po 0,1 M PBS w płytkach studzienkowych. Uważnie zanotuj kolejność talerzy.
   2. Wybór sekcji: Wybierz sekcje w zależności od strefy do analizy (obszar implantacji lub strefa kontrolna). Wyjmij sekcje kolejno z płytek studzienek, używając cienkiej szczotki, aby sprawdzić je pod kątem uszkodzeń. Umieść je w nowych płytkach studzienkowych wypełnionych 0,1 M PBS w celu dalszego barwienia.
2. Immunohistochemia
   1. Przygotowanie: Inkubować skrawki w 0,3% Triton X/PBS przez 15 minut, a następnie 3% albuminę surowicy bydlęcej (BSA)/PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
   2. Przeciwciała pierwszorzędowe: Inkubować tkanki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez 48 godzin w RT (anty-GFAP, szczur, rozcieńczony w 1/300; anty Iba1, królik, rozcieńczony w 1/400; anty-NeuN, świnka morska, rozcieńczona w 1/1,000; wszystko w 1% BSA/PBS). Przykryj płytki studzienek folią aluminiową.
   3. Mycie: Przemyć studzienki 0,1 M PBS trzy razy przez 5 minut.
   4. Przeciwciała drugorzędowe: Inkubować tkanki z przeciwciałami drugorzędowymi przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555; wszystkie rozcieńczone w stosunku 1/400 w 1% BSA/PBS).
   5. DAPI (4′,6-diamidino-2-fenyloindol): Inkubować tkanki z DAPI przez 15 minut (1/1,000 w 1% BSA/PBS).
   6. Mycie: Umyć studzienki 0,1 M PBS pięć razy przez 15 minut.
   7. Montaż: Zamontuj prowadnice za pomocą nośnika montażowego i szkiełka nakrywkowego. Szkiełka należy przechowywać w ciemności w lodówce w temperaturze 4 °C.
3. Obrazowania
   1. Obrazowanie całego preparatu: Zobrazuj slajdy w 10-krotnym powiększeniu (wartość odległości roboczej obiektywu = 3 100 μm) za pomocą mikroskopu skanera slajdów na trzech różnych długościach fal (640 nm, 560 nm, 485 nm). Wszystkie informacje o mocy i wzmocnieniu można znaleźć w pliku uzupełniającym 2.
   2. Obrazowanie mikroskopowe: Zobrazuj obszar zainteresowania przy 20-krotnym powiększeniu (apochromat 20x/0,8 M27) za pomocą mikroskopu konfokalnego na czterech długościach fal (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP). Wszystkie informacje o mocy i wzmocnieniu można znaleźć w pliku uzupełniającym 3.

Results

W celu potwierdzenia umiejscowienia (Rysunek 3A) i funkcjonalności urządzeń, zapisy elektrofizjologiczne są wykonywane śródoperacyjnie po umieszczeniu postumentu. Sygnał wyjściowy jest najpierw uzyskiwany w ciągu 2 minut bez bodźców jako kontrola podstawowej aktywności. Po drugie, zwierzę jest stymulowane akustycznie impulsem tonu o różnych częstotliwościach (500-20 000 Hz), a surowe dane są uśredniane w okresie bodźca w celu odwzorowania słuchowych potencjałów wywołanych w całej sieci (np. przy 800 Hz w porównaniu z wartością wyjściową; Rysunek 3B). Pokazane tutaj dane są nieprzetworzone, ale jeśli występuje zbyt dużo szumu, można zastosować filtry wycinające i pasmowoprzepustowe. Typowymi źródłami hałasu na sali operacyjnej są poduszki grzewcze, zatkane wiertła oraz ssaki lub kauteryzatory (między innymi), które należy usunąć przed nabyciem. W nagraniach na jawie należy unikać dużych ruchów mięśni wokół głowy, takich jak żucie, aby uzyskać czystsze zestawy danych.

Ten protokół był stosowany w każdym punkcie czasowym nagrywania, a sygnały dla pojedynczego kanału mogły być porównywane w czasie. Jeden z przykładów jest zilustrowany w Rysunek 3C, pokazujący solidność i ewolucję odpowiedzi. Zdolność zapisu każdego styku w czasie trwania eksperymentu można ocenić, obliczając odchylenie standardowe sygnału linii bazowej w każdym punkcie czasowym (Rysunek 3D). W tym badaniu stosunek sygnału do szumu zmniejszył się i ustabilizował między dniem 0 a miesiącem 6, pomimo pewnej zmienności wynikającej z ograniczonego czasu trwania okresu nagrywania (tj. 2 minuty). Może to być dodatkowo skorelowane z impedancjami elektrod.

Obrazowanie in vivo jest wykonywane po operacji w celu oceny stanu mózgu i umiejscowienia implantu. W pierwszej iteracji protokołu nie wykonano śródoperacyjnego prześwietlenia rentgenowskiego, co skutkowało złożeniem urządzenia, co widać na Rysunek 4A na sekwencji rezonansu magnetycznego ważonej T1 (patrz dodatkowo Figura 4B). Nie zaobserwowano żadnych zmian w zachowaniu zwierzęcia, ale z czasem spowodowało to zwłóknienie wokół urządzenia z powodu makroskopowego ucisku mózgu wokół miejsca implantu (Rysunek 4C). Po tym doświadczeniu wprowadzono śródoperacyjne prześwietlenie rentgenowskie, jak pokazano na Rycina 4D, gdzie markery nieprzepuszczające promieni rentgenowskich (czarne paski widoczne na implancie we wstawce Rysunek 4D) są pokazane jako dobrze ustawione. Powierzchnia mózgu jest wtedy nienaruszona, co można zaobserwować w pooperacyjnym rezonansie magnetycznym w Rysunek 4E. Ogólnie rzecz biorąc, dzięki temu implantowi i systemowi postumentu możliwe jest obrazowanie całego mózgu. Różne sekwencje w płaszczyznach koronalnych pozwalają zobaczyć struktury anatomiczne (Rysunek 4F,G; Sekwencje rezonansu magnetycznego T1 i T2) lub obecność płynu i krwi wokół implantu (Rysunek 4H; Sekwencja MRI ważona TSE). System cokołów nie tworzy prawie żadnych artefaktów, z wyjątkiem kilku małych kontrastowych na czarno pustek wokół tytanowych (patrz Rysunek 4G). Ponadto elektrody kliniczne są używane jako komparatory w tym badaniu, ale nie można ich zobrazować w rezonansie magnetycznym ze względu na ogrzewanie i obawy dotyczące bezpieczeństwa. W związku z tym tomografia komputerowa jest pobierana od tych zwierząt, jak pokazano na Rysunek 4I. Elektrody są dobrze widoczne, a system postumentu nie wpływa na jakość obrazu.

Po okresie implantacji, zwierzę jest poddawane perfuzji, a mózg jest pobierany. W tym badaniu analiza odpowiedzi zapalnej jest przeprowadzana na każdej półkuli niezależnie. Przecięcie mózgu na pół jest łatwiejsze do przygotowania tkanki przed sekcją i ma tę zaletę, że skrawki można montować na standardowych szkiełkach mikroskopowych. Jeden z przykładów próbki mózgu jest pokazany przed (Rysunek 5A) i po (Rysunek 5B) cięciu w bloki. Zarys implantu jest wyraźnie widoczny i utworzył niewielkie wgniecenie w mózgu. Poprzez cięcie w równoległych płaszczyznach, tkanka jest już wyrównana z kriostatem, a skrawki można łatwo przeciąć bez utraty tkanki do przycinania (Rysunek 5C). Po barwieniu obrazowany jest cały wycinek tkanki (Ryc. 5D), gdzie na przykład warstwa neuronu jest wyraźnie widoczna w szczegółach (patrz marker NeuN). Całe sekcje są delikatne i czasami mogą prowadzić do pewnej utraty tkanki (patrz dół Rysunek 5D), ale obszar zainteresowania jest nienaruszony. Przy bliższym przyjrzeniu się, co jest możliwe dzięki obrazowaniu mikroskopii konfokalnej z powiększeniem 40x, komórki są wyraźnie zdefiniowane i umożliwiają dokładne badanie markerów stanu zapalnego, na przykład (Figura 5E). Można przeprowadzić dalszą analizę ilościową w celu porównania stanu zapalnego między półkulami kontrolnymi i implantowanymi. Rysunek 6 pokazuje charakterystykę elektrochemiczną wszczepionych elektrod. Elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna in vitro układu miękkich elektrod z modułem impedancji i fazą jest pokazana na rysunku Rysunek 6A, a moduł impedancji przy 1 kHz w ciągu 6 miesięcy implantacji jest pokazany na rysunku Rysunek 6B.

Rysunek 1: Schemat eksperymentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Minimalnie inwazyjne wszczepienie miękkiego ECoG do mózgu. (A) Chirurgiczny dostęp do czaszki, ze wskazaniem bregma. (B) Obustronna kraniotomia z widoczną oponą twardą. (C) Durotomia szczelinowa na pierwszej półkuli. (D) Podtwardówkowa implantacja miękkiego ECoG i zamknięcie opony twardej. (E) Durotomia szczelinowa na drugiej półkuli. Zespolenie płata kostnego na pierwszej półkuli za pomocą mostów tytanowych. (F) Wszczepienie miękkiego ECoG na drugą półkulę i zamknięcie opony twardej. (G) Unieruchomienie płata kostnego na drugiej półkuli. (H) Umiejscowienie podnóżka na czaszce. (I) Mocowanie cokołu do podnóżka. (J) Zamknięcie skóry wokół podstawy cokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Rejestracja słuchowych potencjałów wywołanych. (A) Schemat rozmieszczenia elektrod na powierzchni płata skroniowego. (B) Reprezentatywne mapowanie podstawowej aktywności (szare ślady) i słuchowych potencjałów wywołanych w odpowiedzi na stymulację impulsem tonalnym o częstotliwości 800 Hz (fioletowy ślad). Każda średnia odpowiada jednemu kanałowi w miękkiej tablicy ECoG. Uśrednianie jest wyzwalane na analogowym sygnale wejściowym ze stymulacji dźwiękowej. Okresy stymulacji akustycznej "ON" i "OFF" są zanotowane na jednym kanale w lewym dolnym rogu. (C) Ewolucja w czasie (dzień 0, miesiąc 2 i miesiąc 5) odpowiedzi pojedynczego kanału po bodźcu akustycznym, w porównaniu z sygnałem wyjściowym, gdy nie jest prezentowany żaden bodziec (szary). Uśrednianie jest wyzwalane na analogowym sygnale wejściowym ze stymulacji dźwiękowej. Okresy stymulacji "ON" i "OFF" są zanotowane na dole. Wywołany potencjał stymulacji "ON" jest oznaczony strzałkami. (D) Odchylenie standardowe na kanał (kolorowe kropki) na punkt czasowy zapisu linii bazowej. Wartości mediany są zaznaczone pogrubioną czcionką w kolorze niebieskim. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obrazowanie in vivo mózgu i wszczepionych elektrod. (A) Pooperacyjny rezonans magnetyczny T1 w płaszczyźnie koronalnej. Strzałka oznacza złożony implant. (B) Powiększona część A, w której fałd implantu tworzy wgniecenie w mózgu. (C) Rezonans magnetyczny zależny od T1 po implantacji po 1 miesiącu, wykazujący ucisk mózgu spowodowany zwłóknieniowym otoczeniem mózgu w tym samym miejscu co C. (D) Śródoperacyjne prześwietlenie rentgenowskie w płaszczyźnie weryfikujące umieszczenie implantu i brak fałdowania, co obserwuje się po umieszczeniu markera nieprzepuszczającego promieni rentgenowskich. Wstawka: Zdjęcie implantu z widocznym markerem nieprzepuszczającym promieni rentgenowskich. (E) Pooperacyjny rezonans magnetyczny T1-zależny od czynnika w płaszczyźnie koronalnej z optymalnym umieszczeniem implantu. (F) Rezonans magnetyczny zależny od T1 po 1 miesiącu implantacji. (G) T2-zależny rezonans magnetyczny po 1 miesiącu implantacji. Strzałka pokazuje artefakt obrazowania z tytanowych przytrzymujących stopę na czaszce. (H) Rezonans magnetyczny zależny od TSE po 1 miesiącu implantacji. (I) Tomografia komputerowa zwierzęcia, któremu wszczepiono elektrody kliniczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Analiza histologiczna mózgu po długotrwałej implantacji. (A) Zdjęcie eksplantowanej i perfundowanej lewej półkuli mózgu. (B) Perfundowany mózg pocięty na bloki przed etapem zamrażania. (C) Zdjęcie układu do cięcia całego bloku na kriostacie; Całe "wstępnie przycięte bloki" można podzielić na sekcje. (D) Obrazowanie immunobarwiące całej półkuli (skaner slajdów, obiektyw 20x) i (E) przybliżanie pierwszych warstw kory mózgowej (obrazowanie konfokalne, obiektyw 40x) pokazujące komórki glejowe, astrocyty i neurony. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Charakterystyka elektrochemiczna wszczepionych elektrod. (A) Spektroskopia impedancji elektrochemicznej in vitro układu miękkich elektrod (małe szare linie dla każdego kanału, średnia na czerwono) z modułem impedancji (na górze) i fazą (na dole). (B) Zmiany modułu impedancji przy 1 kHz w ciągu 6 miesięcy od implantacji (średnia na niebiesko; szare linie to poszczególne kanały; pomiar in vitro podano jako odniesienie w kolorze czerwonym). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Podstawa kompatybilna z MRI. (A) Przewlekły system połączeń transdermalnych (cokół) kompatybilny z MRI w celu uzyskania dostępu do matrycy miękkich elektrod. (B) Cokół z elektrodami zamontowanymi na płycie podstawy w celu zakotwiczenia czaszki. Wstawka: Szczegóły podnóżka. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Dostęp chirurgiczny dla optymalnej perfuzji mózgu. (A) Przecięcie skóry i dostęp do lokalizacji tętnicy szyjnej i żyły szyjnej. (B) Rozwarstwienie tkanki wokół naczyń krwionośnych. (C,D) Identyfikacja i wypreparowanie tkanki wokół tętnicy szyjnej i żyły szyjnej. (E) Izolacja tętnicy szyjnej od tkanki znajdującej się pod spodem. (F) Izolacja żyły szyjnej od tkanki znajdującej się pod spodem. (G) Założenie drutu szwowego wokół tętnicy szyjnej (szew 1 i szew 2) oraz żyły szyjnej (szew 3). (H) Zamknięcie szwu 3 u podstawy tętnicy szyjnej (po stronie serca) w celu uniknięcia krwawienia podczas otwierania naczynia. (I) Zaciśnięcie tętnicy szyjnej po przeciwnej stronie niż H. (J) Przecięcie tętnicy szyjnej. (K) Wprowadzono cewnik do otworu od J. Wstawka: Zagruntowany cewnik z solą fizjologiczną przepłukaną ze strzykawki do końcówki cewnika. (L) Zamknięcie szwu 2 w celu utrzymania cewnika na miejscu i wzdłuż tętnicy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Parametry dla sekwencji MRI T1- (strony 1-2), T2- (strony (3-4) i TSE ważone (strony 5-6). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Metadane dla skanera slajdów do obrazowania całych slajdów poplamionych wycinków mózgu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Metadane do obrazowania konfokalnego powiększonego przekroju barwionych wycinków mózgu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Przedstawiamy tutaj metodę długotrwałej implantacji i oceny miękkich macierzy ECoG. W tym badaniu zaprojektowaliśmy spójne, minimalnie inwazyjne podejście chirurgiczne do obustronnej implantacji funkcjonalnych siatek elektrod nad płatami skroniowymi (w tym przypadku ukierunkowanymi na korę słuchową). Najpierw oceniliśmy funkcjonalność siatki, z powodzeniem rejestrując potencjały wywołane w czasie trwania badania (6 miesięcy) i śledząc właściwości elektrochemiczne elektrod (patrz rysunek 6). Po drugie, oceniliśmy bezpieczeństwo biologiczne siatek, in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego i stworzenia systemu w pełni kompatybilnego z rezonansem magnetycznym, a także sekcji zwłok, opracowując protokół pobierania tkanek i barwienia immunologicznego.

Aby zminimalizować inwazyjność, zoptymalizowaliśmy wielkość okna kraniotomii. Aby dotrzeć do kory słuchowej znajdującej się na płacie skroniowym i uniknąć resekcji mięśnia skroniowego, opracowaliśmy technikę wsuwania implantu pod oponę twardą. Technika ta pozwala drastycznie zmniejszyć powierzchnię odsłoniętego mózgu i nadal docierać do odległych celów. Chociaż ten rodzaj implantacji może wydawać się ślepy, zastosowanie markerów nieprzepuszczających promieni rentgenowskich na urządzeniach, które są wizualizowane w promieniowaniu rentgenowskim w płaszczyźnie śródoperacyjnej, pozwala na weryfikację położenia i zapewnia, że matryca nie jest złożona pod oponą twardą. Ślizg podtwardówkowy okazał się bezpieczny w większości wykonanych przez nas powtórzeń. Dodatkowo, durotomia w szczelinie minimalizuje wybrzuszenia mózgu w czasie, gdy kraniotomia jest otwarta i ułatwia zamykanie wokół implantu bez konieczności stosowania dodatkowego materiału, takiego jak sztuczna opona twarda, która mogłaby zaburzyć reakcję zapalną. Wreszcie, mocną stroną tego podejścia chirurgicznego jest jego zdolność do transpozycji do różnych obszarów kory mózgowej. Zabawa współrzędnymi, pozycją kraniotomii i rozmiarem urządzenia, które można dostosować, umożliwia tej metodzie celowanie w większość obszaru kory mózgowej.

Przedstawiona tu metoda chirurgiczna, wraz z oceną funkcjonalną i badaniem biointegracji w czasie, nie ogranicza się do technologii miękkich elektrod zastosowanych w niniejszym raporcie. Inne elektrody podtwardówkowe, które są opracowywane do translacji u ludzi, mogą być oceniane za pomocą tego samego protokołu. Siła tej metody polega na tym, że większość elementów, takich jak kabel i cokół, jest modułowa, personalizowana i może być dostosowana do konkretnego testowanego urządzenia. Dodatkowo, sondy wewnątrzkorowe lub głęboko penetrujące mogą być również używane zamiast lub w połączeniu z elektrodami podtwardówkowymi, ponieważ wymaga to jedynie dostosowania geometrii kraniotomii i durotomii. Długoterminowe wyniki można następnie porównać z ich klinicznymi odpowiednikami, tak jak zrobiliśmy to tutaj.

Jednym z głównych ograniczeń prezentowanej metody jest obecność zatok czaszkowych u świnek miniaturowych, które rozwijają się w ciągu pierwszego roku^{życia 12}. W związku z tym ważnymi aspektami, które należy wziąć pod uwagę, są wiek implantacji, a także wielkość zwierzęcia. Wykonywanie kraniotomii w czaszce osoby dorosłej narusza integralność zatok i prowadzi do wysokiego ryzyka poważnej infekcji w warunkach przewlekłych. Takie zatoki są widoczne na płaskim zdjęciu rentgenowskim i tomografii komputerowej przed operacją. Z drugiej strony, zbyt wczesne wykonanie przewlekłej implantacji u zwierzęcia, które jest zbyt małe, również nie jest optymalne, gdy czaszka przechodzi ogromny wzrost i przebudowę. Postawiliśmy hipotezę, że te "ruchy czaszki" po operacji mogą powodować przesuwanie się i fałdowanie implantu, co ostatecznie jest szkodliwe dla eksperymentu. Stwierdziliśmy tutaj, że miniświnki z Getyngi, które w momencie implantacji mają około 5-6 miesięcy (i 8 kg) powinny dawać najlepsze wyniki.

W celu oceny działania wszczepionego ECoG do zapisów elektrofizjologicznych opracowaliśmy szybki protokół rejestracji słuchowego potencjału wywołanego (AEP), który może być stosowany u zwierząt poruszających się swobodnie i w sedacji. Polega na zaprezentowaniu serii akustycznych impulsów tonów o określonych częstotliwościach w ciągu kilku minut. Zaletą takiego protokołu jest fakt, że można go dostroić do dostępnej długości nagrania poprzez zmniejszenie liczby sondowanych częstotliwości. Jednym z wyzwań podczas rejestrowania sygnałów korowych w znieczuleniu jest to, że poziom świadomości zwierzęcia powinien być brany pod uwagę podczas analizowania i porównywania danych.

Protokół perfuzji był dostosowywany w czasie poprzez obserwację jakości wyekstrahowanego mózgu. Rzeczywiście, okazało się, że łatwiej jest cewnikować tylko tętnicę szyjną, a nie żyłę szyjną. Początkowo w literaturze przedstawiono metody, w których żyła szyjna jest cewnikowana w celu drenażu odpadów²⁰. W praktyce ogranicza to przepływ krwi z mózgu i prowadzi do gorszego pobierania krwi i ogólnej jakości perfuzji. Przecinając żyłę szyjną i pozostawiając płyn do ucieczki w dużym pojemniku, w którym leży zwierzę, zwiększa się wydajność perfuzji.

Opracowaliśmy solidną metodę przygotowania tkanek, która działa z przeciwciałami rutynowo stosowanymi do śledzenia stanu zapalnego. Rozdzieliliśmy te dwie półkule ze względów praktycznych, ponieważ połowa mózgu świni mieści się na standardowych szkiełkach mikroskopowych, a zatem jest kompatybilna z większością urządzeń do obrazowania dostępnych w laboratoriach histologicznych. Dzięki pocięciu mózgu na bloki, możliwy jest bezpośredni dostęp do strefy zainteresowania bez konieczności dalszego cięcia całego mózgu lub przycinania rozległych części tkanki. Wycinki mózgu o wielkości 40 μm można łączyć w standardowych płytkach dołkowych i barwić w sposób swobodnie unoszący się bez większych zmian w protokole spowodowanych barwieniem immunologicznym innych gatunków. Pełne barwienie immunologiczne mózgu można również przewidzieć, stosując na przykład metody CLARITY²¹.

Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół, który obejmuje spersonalizowane projektowanie implantów aż do implantacji, monitorowanie funkcjonalności i ocenę bezpieczeństwa biologicznego, jest solidny i spójny. Wykazaliśmy tutaj jego wykonalność do badania układu słuchowego, ale można go przetransponować w celu zbadania innych funkcji fizjologicznych. Co więcej, siła naszej metody polega na tym, że nie ogranicza się ona do świnek miniaturowych, ale jest w pełni transpozycyjna na inne gatunki, takie jak owce, kozy czy naczelne. Do pewnego stopnia można go również łatwo dostosować do szczurów.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wiertło do kości	BBraun	Elan 4 z  Rękojeść
Wiertło do kości	BBraun	Neurocutter GP204R
Wosk kostny	Ethicon	W31G
Cewnik	Venisystems	Abbocath 14G
	Zeiss	LSM 880
Kriostat	Leica	CM1950
Gelfoam	Pfizer	Gelfoam
Włóż głośniki	Etymotic	Etymotic ER2 włóż słuchawki
Multimetr	Fluke Fluke	1700
Oscyloskop	Tektronix	MDO3014 Oscyloskop
Pompa perfuzyjna	Shenzen	LabS3/UD15
Potencjostat	Gamry Instruments	Reference 600
Przeciwciało pierwotne Anty-GFAP	Thermofischer	Anti-GFAP, Szczur, # 13-0300
Przeciwciało pierwotne anty-Iba1	Fujifilm	Anti Iba1, Królik, 019-19741
Przeciwciało pierwotne Anti-NeuN	SigmaAldrich	Anti-NeuN, świnka morska, ABN90
Generator impulsów	AM Systems	Model 2100 Izolowany stymulator
Nagrywanie sceny głównej	Systemy wielokanałowe	W2100-HS32
System nagrywania	Systemy wielokanałowe	W2100
Śrubokręt	Medtronic	Uchwyt: 001201, Wał: 8001205
Przeciwciało drugorzędowe 488	Thermofischer	Koza anty-szczurza IgG (H + L) Adsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 488, # A-11006
Przeciwciało drugorzędowe 555	Thermofischer	Kozia świnia morska IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 555, # A-21435
Przeciwciało drugorzędowe 647	Thermofischer	Goat anty-królicze IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 647, # A-21245
Skaner slajdów	Olympus	VS120
Snapfrost	Excilone	Excilone Snapfrost
Nóż do dźgania	Grzywna Science Tools	10316-14
Drut do szycia skórny	Ethicon	Vicryl 2-0
Drut do szycia opony twardej	Ethicon	Mersilk 5-0
Drut do szycia cewnika	Ethicon	Vycril 3-0 bez igły Drut
do szycia do podnoszenia opony twardej	Ethicon	Prolene 6-0 z igłą BV-1 Drut
do szycia podskórny	Ethicon	Vicryl 4-0
Most tytanowy	Medtronic	TiMesh 015-2001-4	Wytnij wymagany rozmiar
tytanowe	Medtronic	9001635, 9001640
System rentgenowski	GE	GE OEC 9800 Plus C-Arm