Artykuł metodologiczny

Ocena poziomów autofagii w dwóch różnych modelach komórek trzustki przy użyciu immunofluorescencji LC3

DOI:

10.3791/65005

⸱

28 kwietnia 2023

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Bioquimica y Medicina Molecular Prof Alberto Boveris (IBIMOL), Universidad de Buenos Aires, CONICET, 2Signalling Programme, The Babraham Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest określenie poziomów autofagicznych w raku trzustki i komórkach groniastych trzustki poprzez immunofluorescencję LC3 i kwantyfikację kropek LC3.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autofagia to wyspecjalizowany proces kataboliczny, który selektywnie degraduje składniki cytoplazmatyczne, w tym białka i uszkodzone organelle. Autofagia pozwala komórkom fizjologicznie reagować na bodźce stresowe, a tym samym utrzymywać homeostazę komórkową. Komórki rakowe mogą modulować poziom autofagii, aby przystosować się do niekorzystnych warunków, takich jak niedotlenienie, niedobór składników odżywczych lub uszkodzenia spowodowane chemioterapią. Gruczolakorak przewodowy trzustki jest jednym z najbardziej śmiertelnych rodzajów raka. Komórki raka trzustki mają wysoką aktywność autofagii ze względu na regulację w górę transkrypcji i potranslacyjną aktywację białek autofagii.

Tutaj linia komórkowa PANC-1 została użyta jako model ludzkich komórek raka trzustki, a linia komórek groniastych trzustki AR42J została użyta jako model fizjologiczny wysoce zróżnicowanych komórek ssaków. W badaniu tym wykorzystano immunofluorescencję białka łańcucha lekkiego 3 związanego z mikrotubulami (LC3) jako wskaźnik stanu aktywacji autofagii. LC3 jest białkiem autofagii, które w warunkach podstawowych wykazuje rozproszony wzór dystrybucji w cytoplazmie (znany w tym stanie jako LC3-I). Indukcja autofagii wyzwala koniugację LC3 z fosfatydyloetanoloaminą na powierzchni nowo powstałych autofagosomów, tworząc LC3-II, białko związane z błoną, które pomaga w tworzeniu i rozszerzaniu autofagosomów. Aby określić ilościowo liczbę oznakowanych struktur autofagicznych, wykorzystano oprogramowanie open source FIJI za pomocą narzędzia "3D Objects Counter".

Pomiar poziomu autofagii zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i w komórkach nowotworowych, pozwala nam badać modulację autofagii w różnych warunkach, takich jak niedotlenienie, chemioterapia lub knockdown niektórych białek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makroautofagia (powszechnie nazywana autofagią) to wyspecjalizowany proces kataboliczny, który selektywnie degraduje składniki cytoplazmatyczne, w tym białka i uszkodzone organelle1,2. Autofagia pozwala komórkom fizjologicznie reagować na bodźce stresowe, a tym samym utrzymywać homeostazę komórkową3. Podczas autofagii tworzy się pęcherzyk z podwójną błoną: autofagosom. Autofagosom zawiera cząsteczki ładunku i kieruje je do lizosomu w celu degradacji1,4.

Autofagosomy są ozdobione przez białko autofagiczne, białko związane z mikrotubulami, łańcuch lekki 3 (LC3)5. Gdy autofagia nie jest indukowana, LC3 jest dyfundowany w cytoplazmie i jądrze w konformacji LC3-I. Z drugiej strony, gdy indukowana jest autofagia, LC3 jest sprzężona z fosfatydyloetanoloaminą w błonie struktur autofagicznych6. Ta nowa konformacja LC3 jest znana jako LC3-II1. Przesunięcie konformacji LC3 powoduje zmiany w jego lokalizacji komórkowej i migracji elektroforezy w żelu dodecylowo-siarczanowo-poliakrylamidowym (SDS-PAGE), które można wykryć za pomocą technik takich jak immunofluorescencja i western blot5,7. W ten sposób koniugacja LC3 jest kluczowym wydarzeniem w procesie autofagicznym, które można wykorzystać do pomiaru aktywności autofagicznej.

Komórka groniasta trzustki jest wysoce zróżnicowaną komórką, która w zdrowych warunkach ma niski wskaźnik autofagii. Jednak w różnych warunkach fizjologicznych lub pod wpływem stymulacji farmakologicznej mogą aktywować autofagię. Dlatego określenie poziomów autofagicznych w tej linii komórkowej jest przydatne do badania potencjalnego bezpośredniego lub pośredniego wpływu różnych czynników farmakologicznych lub biologicznych na autofagię8,9.

Gruczolakorak przewodowy trzustki jest jednym z najbardziej śmiertelnych rodzajów raka, biorąc pod uwagę jego późną diagnozę i wysoką oporność na chemioterapię10. Komórki raka trzustki mają wysoką aktywność autofagii ze względu na regulację w górę transkrypcji i potranslacyjną aktywację białek związanych z autofagią11. Komórki raka trzustki mogą dostosowywać poziom autofagii w odpowiedzi na niekorzystne warunki, takie jak niedotlenienie, niedobór składników odżywczych lub uszkodzenia wywołane chemioterapią11. W związku z tym analiza poziomów autofagii w komórkach raka trzustki może pomóc zrozumieć, w jaki sposób przystosowują się one do różnych środowisk i ocenić skuteczność leczenia modulującego autofagię.

To badanie pokazuje metodę przeprowadzania immunofluorescencji LC3 w dwóch różnych modelach komórkowych trzustki. Pierwszy model, komórki PANC-1, posłużył jako model gruczolakoraka przewodowego trzustki. Komórki te leczono gemcytabiną, środkiem chemioterapeutycznym, który, jak wykazano wcześniej, indukuje autofagię, szczególnie w komórkach raka trzustki zawierających onkogenny gen wirusa mięsaka szczura Kirsten (KRAS)12,13. Drugi model, komórki AR42J, służył jako bardziej fizjologiczny model zewnątrzwydzielniczych komórek trzustki. Komórki te różnicowano deksametazonem, aby upodobnić się do groniastych komórek trzustki14. W tych komórkach autofagia została farmakologicznie wywołana za pomocą PP242, który jest silnym inhibitorem mTOR 15. W tym badaniu wykazujemy możliwość zastosowania protokołu opisanego za pomocą dwóch różnych modeli trzustki i jego zdolność do rozróżniania stanów niskiej i wysokiej autofagii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek

  1. Okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm namoczyć w absolutnym etanolu i umieścić je pionowo w dołkach 24-dołkowej płytki.
  2. Zdejmij pokrywę i wystaw płytkę wielodołkową na działanie promieniowania ultrafioletowego przez 15 minut.
  3. Ustaw szkiełka nakrywkowe poziomo i umyj je zmodyfikowanym podłożem Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco.
  4. Zasiewaj niską liczbę pasaży komórek trzustki. Ilość należy dostosować, aby uzyskać 50%-75% zbieżności w dniu fixacji16.
    UWAGA: Zaleca się wysiewanie 2,5 × 104 komórek PANC-1 lub 4 × 104 komórek AR42J na studzienkę, aby utrwalić komórki po 3 dniach.
  5. Hodować komórki w DMEM zawierające 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w inkubatorze w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% dwutlenkiem węgla (CO2).
    UWAGA: W przypadku komórek PANC-1 zaleca się inkubację komórek przez 2 dni między wysiewem komórek a następującymi krokami. Po tym czasie komórki mogą być transfekowane, leczone lub utrwalane. Protokół ten jest przykładem leczenia gemcytabiną w nietransfekowanych komórkach PANC-1 oraz różnicowania i leczenia PP242 w przypadku nietransfekowanych komórek AR42J.

2. Leczenie komórek

  1. Leczenie gemcytabiną komórek PANC-1
    1. Przygotować roztwór 1 μg/μl gemcytabiny w DMEM 2 dni po wysianiu. Potraktować każdą studzienkę 2,6 μl roztworu gemcytabiny o stężeniu 1 μg/μl, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 20 μM.
    2. Inkubować komórki przez 24 godziny w inkubatorze.
  2. Różnicowanie AR42J i leczenie PP242
    1. Przygotować roztwór 4 μg/ml deksametazonu w DMEM.
    2. Potraktować każdą studzienkę 4,9 μl roztworu deksametazonu o stężeniu 4 μg/ml w celu uzyskania końcowego rozcieńczenia 100 nM.
    3. Inkubować komórki przez 48 godzin w inkubatorze.
    4. Usunąć pożywkę i potraktować każdą studzienkę 0,5 μl 1 mM PP242, aby uzyskać końcowe rozcieńczenie 1 μM.
    5. Inkubować komórki przez 2 godziny w inkubatorze.

3. Utrwalanie i przenikanie komórek

  1. Przygotować 24-dołkową płytkę z zimnym metanolem i 6-dołkową płytkę z zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4). Utrzymuj je na lodzie.
  2. Weź każde szkiełko nakrywkowe pęsetą, umyj je dwukrotnie w PBS i inkubuj przez 6 minut w metanolu.

4. Blokowanie komórek

  1. Umyć każde szkiełko nakrywkowe dwukrotnie w PBS i inkubować przez 1 godzinę w 10% płodowej surowicy bydlęcej w PBS (roztwór blokujący).
    UWAGA: W tym kroku protokół może zostać wstrzymany. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać przez noc w lodówce w roztworze blokującym, a protokół można kontynuować następnego dnia.

5. Inkubacja szkiełek nakrywkowych z pierwotnym przeciwciałem

  1. Przygotuj roztwór anty-LC3 w stosunku 1:1,000 w roztworze blokującym i utrzymuj go na lodzie.
  2. Umieść kawałek laboratoryjnej folii uszczelniającej na pokrywie z wieloma dołkami.
  3. Umieścić jedną kroplę (25 μl) na szkiełko nakrywkowe roztworu anty-LC3 na folię uszczelniającą.
  4. Weź każde szkiełko nakrywkowe pęsetą i umieść je nad kroplą przeciwciała pierwotnego, uważając, aby strona komórki stykała się z roztworem.
  5. Przygotuj wilgotną komorę, umieszczając wilgotną kartkę papieru w plastikowym pudełku z płaskim dnem.
  6. Umieść płytkę wielodołkową w komorze wilgotnościowej, przykryj folią i inkubuj przez noc w lodówce.

6. Inkubacja szkiełek nakrywkowych z przeciwciałem drugorzędowym

  1. Wyjąć płytkę wielodołkową z komory wilgotnościowej i umieścić szkiełka nakrywkowe z powrotem w płytce wielodołkowej.
  2. Wykonaj trzy prania za pomocą PBS.
  3. Przygotować roztwór znakowanego fluorescencyjnie środka anty-króliczego o rozcieńczeniu 1:800 w roztworze blokującym i przechowywać go na lodzie chronionym przed światłem.
  4. Umieść kawałek folii uszczelniającej na pokrywie z wieloma dołkami.
  5. Umieścić kroplę (25 μl) na szkiełko nakrywkowe roztworu przeciw królikom na folii uszczelniającej.
  6. Weź każde szkiełko nakrywkowe pęsetą i umieść je nad kroplą przeciwciała pierwotnego, uważając, aby strona komórki stykała się z roztworem.
  7. Inkubować płytkę wielodołkową w komorze wilgotnościowej przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem.

7. Barwienie komórek 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI)

  1. Wyjąć płytkę wielodołkową z komory wilgotnościowej i umieścić szkiełka nakrywkowe z powrotem w płytce wielodołkowej.
  2. Wykonaj trzy prania za pomocą PBS.
  3. Przygotować 300 nM roztwór DAPI w PBS (chroniony przed światłem).
  4. Inkubować każde szkiełko nakrywkowe z roztworem DAPI przez 10 minut.
  5. Wykonaj trzy prania za pomocą PBS. Utrzymuj płytkę wielodołkową chronioną przed światłem.

8. Montaż

  1. Przygotuj dwie zlewki z wodą i kawałkiem papieru.
  2. Umieścić jedną kroplę (10 μl) na szkiełko nakrywkowe roztworu adduktu polialkoholu-winylo-bis(trimetyloaluminium)-1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanowego (PVA-DABCO) na szkiełku podstawowym.
    UWAGA: PVA-DABCO przygotowuje się przez zmieszanie 0,25 M DABCO, 10% W/V PVA, 20% glicerolu i 50% Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) w ultraczystej wodzie.
  3. Weź każde szkiełko nakrywkowe pęsetą, umyj je w każdej zlewce z wodą, wysusz w papierze i umieść na kropli PVA-DABCO (z komórkami stykającymi się z roztworem).
  4. Pozostaw do wyschnięcia na noc, chroniąc przed światłem.

9. Oglądanie mikroskopii konfokalnej i przechwytywanie obrazu

  1. Wizualizuj szkiełka nakrywkowe w odwróconym mikroskopie konfokalnym przy użyciu obiektywu o wartości około 63x17.
  2. Uchwyć reprezentatywne obrazy oznaczonych komórek.

10. Kwantyfikacja kropek LC3

  1. Przeciągnij i upuść każdy plik obrazu zawierający przechwycone kanały, takie jak ".czi", na ekran ImageJ (FIJI), aby go otworzyć. Kliknij przycisk OK w oknie dialogowym i zamknij okno konsoli.
  2. Na karcie Obraz wybierz opcję Kolor > Podziel kanały.
  3. Zamknij obrazy odpowiadające kanałom innym niż obraz LC3.
  4. Na karcie Obraz wybierz opcję Dostosuj balans kolorów >
  5. Przesuń suwak Maksimum w lewo, aż obraz zostanie nasycony, aby uwidocznić kontury komórek.
  6. Narysuj kontur komórki za pomocą narzędzia Zaznaczanie odręczne.
  7. Kliknij przycisk Resetuj, aby zresetować regulację kolorów.
  8. Na karcie Edycja wybierz opcję Wytnij, aby wyciąć wybrany element.
  9. Zamknij obraz bez zapisywania go.
  10. Na karcie Edycja wybierz pozycję Wklej.
  11. Z menu Analizuj wybierz narzędzie Licznik obiektów 3D.
  12. Ustaw próg. W przykładzie przedstawionym w tym badaniu próg jest ustawiony na 2 000.
  13. Ustaw filtr rozmiaru. W tym badaniu jest on ustawiony między 50 a 500.
  14. Upewnij się, że pola Obiekty i Podsumowanie są oznaczone.
  15. Kliknij OK. Liczba kropek zostanie opisana jako Wykryte obiekty w podsumowaniu.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat ideowy protokołu immunofluorescencji LC3. Schemat ideowy przedstawiający ogólny protokół przewidziany dla immunofluorescencji LC3. Figura utworzona za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przeprowadza immunofluorescencję LC3 w liniach komórkowych trzustki w celu określenia poziomów autofagii w różnych warunkach. Wynikiem tego eksperymentu było uzyskanie obrazów komórkowych z kanałów czerwonego i niebieskiego, odpowiadających LC3 i DAPI. Obrazy LC3 wskazują na dystrybucję komórkową tego białka, podczas gdy DAPI pokazuje lokalizację jądrową. Rysunek 2A pokazuje reprezentatywny obraz immunofluorescencji LC3 i jej połączenia z barwieniem DAPI w komórkach PANC-1 w warunkach lec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda opisana w tym protokole pozwala na wizualizację endogennego rozkładu LC3 w komórce i ilościowe określenie poziomów autofagicznych w różnych warunkach. Inna podobna metoda stosowana do analizy rozkładu LC3 i określania aktywacji autofagii obejmuje transfekcję LC3 znakowaną fluorescencją (taką jak RFP-LC3)19. Transfekcja RFP-LC3 ma tę zaletę, że nie wymaga fiksacji (co pozwala na zastosowanie tej metody w obrazowaniu żywych komórek20), jest tańsza i nie zależy od reakt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Uniwersytetu w Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), Narodowej Rady Badań Naukowych i Technologii (CONICET) (2021-2023 GI− 11220200101549CO; oraz PUE 22920170100033) oraz Narodowej Agencji Promocji Nauki i Technologii (PICT 2019-01664).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Corning46-013-CM
Szkiełka nakrywkowe okrągłe 12 mmHDACBR_OBJ_6467
24 Well- Płytka do hodowli komórkowychSorfa220300
Etanol absolutnyBiopack2207.10.00
Alexa Fluor 594 Oślica anty-królicza IgG (H+L)InvitrogenR37119
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyZeissLSM 800
DeksametazonSigma AldrichD4902
DMENSartorius01-052-1A
Surowica bydlęcapłodu NATOCOR Lintc-634
GemcitabinaEli LillyVL7502
LC3B (D11) XP Technologiasygnalizacji komórkowej3868S
MetanolAnedra6197
Parafilm "M" (laboratoryjna folia uszczelniająca)Bemis/CurwoodPM-996
Pen-Strep SolutionSartorius03-031-1B
PP242Santa Cruz BiotechnologySC-301606
Trypsyna EDTAGibco11570626
mAb królika

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146(2018).
  2. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
  3. Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
  4. Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. Digesting the expanding mechanisms of autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).
  5. Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. LC3 and autophagy. Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).
  6. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  7. Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
  8. Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094(2021).
  9. Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
  10. Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. Pancreatic cancer. Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).
  11. Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
  12. Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411(2020).
  13. Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
  14. Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
  15. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1(2021).
  16. Segeritz, C. -P., Vallier, L. Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , Academic Press. Cambridge, MA. 151-172 (2017).
  17. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).
  18. Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
  19. Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
  20. Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484(2013).
  21. Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
  22. Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
  23. Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and measuring autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865(2017).
  24. Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504(2021).
  25. Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
  26. Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305(2020).
  27. Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
  28. Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

PANC 1 CellsAR42J CellsGemcitabine TreatmentConfocal Microscopy3D Objects CounterMethanol FixationDAPI Staining

Powiązane artykuły