Celem tego protokołu jest określenie poziomów autofagicznych w raku trzustki i komórkach groniastych trzustki poprzez immunofluorescencję LC3 i kwantyfikację kropek LC3.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena poziomów autofagii w dwóch różnych modelach komórek trzustki przy użyciu immunofluorescencji LC3
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Autofagia to wyspecjalizowany proces kataboliczny, który selektywnie degraduje składniki cytoplazmatyczne, w tym białka i uszkodzone organelle. Autofagia pozwala komórkom fizjologicznie reagować na bodźce stresowe, a tym samym utrzymywać homeostazę komórkową. Komórki rakowe mogą modulować poziom autofagii, aby przystosować się do niekorzystnych warunków, takich jak niedotlenienie, niedobór składników odżywczych lub uszkodzenia spowodowane chemioterapią. Gruczolakorak przewodowy trzustki jest jednym z najbardziej śmiertelnych rodzajów raka. Komórki raka trzustki mają wysoką aktywność autofagii ze względu na regulację w górę transkrypcji i potranslacyjną aktywację białek autofagii.
Tutaj linia komórkowa PANC-1 została użyta jako model ludzkich komórek raka trzustki, a linia komórek groniastych trzustki AR42J została użyta jako model fizjologiczny wysoce zróżnicowanych komórek ssaków. W badaniu tym wykorzystano immunofluorescencję białka łańcucha lekkiego 3 związanego z mikrotubulami (LC3) jako wskaźnik stanu aktywacji autofagii. LC3 jest białkiem autofagii, które w warunkach podstawowych wykazuje rozproszony wzór dystrybucji w cytoplazmie (znany w tym stanie jako LC3-I). Indukcja autofagii wyzwala koniugację LC3 z fosfatydyloetanoloaminą na powierzchni nowo powstałych autofagosomów, tworząc LC3-II, białko związane z błoną, które pomaga w tworzeniu i rozszerzaniu autofagosomów. Aby określić ilościowo liczbę oznakowanych struktur autofagicznych, wykorzystano oprogramowanie open source FIJI za pomocą narzędzia "3D Objects Counter".
Pomiar poziomu autofagii zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i w komórkach nowotworowych, pozwala nam badać modulację autofagii w różnych warunkach, takich jak niedotlenienie, chemioterapia lub knockdown niektórych białek.
Wprowadzenie
Makroautofagia (powszechnie nazywana autofagią) to wyspecjalizowany proces kataboliczny, który selektywnie degraduje składniki cytoplazmatyczne, w tym białka i uszkodzone organelle1,2. Autofagia pozwala komórkom fizjologicznie reagować na bodźce stresowe, a tym samym utrzymywać homeostazę komórkową3. Podczas autofagii tworzy się pęcherzyk z podwójną błoną: autofagosom. Autofagosom zawiera cząsteczki ładunku i kieruje je do lizosomu w celu degradacji1,4.
Autofagosomy są ozdobione przez białko autofagiczne, białko związane z mikrotubulami, łańcuch lekki 3 (LC3)5. Gdy autofagia nie jest indukowana, LC3 jest dyfundowany w cytoplazmie i jądrze w konformacji LC3-I. Z drugiej strony, gdy indukowana jest autofagia, LC3 jest sprzężona z fosfatydyloetanoloaminą w błonie struktur autofagicznych6. Ta nowa konformacja LC3 jest znana jako LC3-II1. Przesunięcie konformacji LC3 powoduje zmiany w jego lokalizacji komórkowej i migracji elektroforezy w żelu dodecylowo-siarczanowo-poliakrylamidowym (SDS-PAGE), które można wykryć za pomocą technik takich jak immunofluorescencja i western blot5,7. W ten sposób koniugacja LC3 jest kluczowym wydarzeniem w procesie autofagicznym, które można wykorzystać do pomiaru aktywności autofagicznej.
Komórka groniasta trzustki jest wysoce zróżnicowaną komórką, która w zdrowych warunkach ma niski wskaźnik autofagii. Jednak w różnych warunkach fizjologicznych lub pod wpływem stymulacji farmakologicznej mogą aktywować autofagię. Dlatego określenie poziomów autofagicznych w tej linii komórkowej jest przydatne do badania potencjalnego bezpośredniego lub pośredniego wpływu różnych czynników farmakologicznych lub biologicznych na autofagię8,9.
Gruczolakorak przewodowy trzustki jest jednym z najbardziej śmiertelnych rodzajów raka, biorąc pod uwagę jego późną diagnozę i wysoką oporność na chemioterapię10. Komórki raka trzustki mają wysoką aktywność autofagii ze względu na regulację w górę transkrypcji i potranslacyjną aktywację białek związanych z autofagią11. Komórki raka trzustki mogą dostosowywać poziom autofagii w odpowiedzi na niekorzystne warunki, takie jak niedotlenienie, niedobór składników odżywczych lub uszkodzenia wywołane chemioterapią11. W związku z tym analiza poziomów autofagii w komórkach raka trzustki może pomóc zrozumieć, w jaki sposób przystosowują się one do różnych środowisk i ocenić skuteczność leczenia modulującego autofagię.
To badanie pokazuje metodę przeprowadzania immunofluorescencji LC3 w dwóch różnych modelach komórkowych trzustki. Pierwszy model, komórki PANC-1, posłużył jako model gruczolakoraka przewodowego trzustki. Komórki te leczono gemcytabiną, środkiem chemioterapeutycznym, który, jak wykazano wcześniej, indukuje autofagię, szczególnie w komórkach raka trzustki zawierających onkogenny gen wirusa mięsaka szczura Kirsten (KRAS)12,13. Drugi model, komórki AR42J, służył jako bardziej fizjologiczny model zewnątrzwydzielniczych komórek trzustki. Komórki te różnicowano deksametazonem, aby upodobnić się do groniastych komórek trzustki14. W tych komórkach autofagia została farmakologicznie wywołana za pomocą PP242, który jest silnym inhibitorem mTOR 15. W tym badaniu wykazujemy możliwość zastosowania protokołu opisanego za pomocą dwóch różnych modeli trzustki i jego zdolność do rozróżniania stanów niskiej i wysokiej autofagii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie komórek
- Namoczyć okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm w etanolu absolutnym, a następnie umieścić je pionowo w dołkach płytki 24-dołkowej.
- Zdjąć pokrywę i poddać płytkę wielodołkową działaniu promieniowania ultrafioletowego przez 15 min.
- Ułożyć szkiełka nakrywkowe poziomo i przemyć je pożywką Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
- Wysiać komórki trzustki o niskim numerze pasażu. Ilość należy dostosować tak, aby w dniu fiksacji uzyskać 50%-75% konfluencji16.
UWAGA: W celu fiksacji komórek po 3 dniach zaleca się wysiać 2,5 × 104 komórek PANC-1 lub 4 × 104 komórek AR42J na dołek. - Kulturować komórki w pożywce DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze uwilgotnionej z 5% dwutlenku węgla (CO2).
UWAGA: W przypadku komórek PANC-1 zaleca się inkubację komórek przez 2 dni pomiędzy wysianiem a kolejnymi etapami. Po tym czasie komórki można poddać transfekcji, traktowaniu lub fiksacji. Niniejszy protokół przedstawia traktowanie gemcytabiną nietransfekowanych komórek PANC-1 oraz różnicowanie i traktowanie PP242 nietransfekowanych komórek AR42J.
2. Traktowanie komórek
- Leczenie komórek PANC-1 gemcytabiną
- Przygotować roztwór gemcytabiny o stężeniu 1 µg/µL w DMEM 2 dni po wysianiu komórek. Do każdej studzienki dodać 2,6 µL roztworu gemcytabiny (1 µg/µL), aby uzyskać stężenie końcowe 20 µM.
- Inkubować komórki przez 24 h w inkubatorze.
- Różnicowanie komórek AR42J i leczenie PP242
- Przygotować roztwór deksametazonu o stężeniu 4 µg/mL w DMEM.
- Do każdej studzienki dodać 4,9 µL roztworu deksametazonu (4 µg/mL), aby uzyskać stężenie końcowe 100 nM.
- Inkubować komórki przez 48 h w inkubatorze.
- Usunąć medium i do każdej studzienki dodać 0,5 µL PP242 o stężeniu 1 mM, aby uzyskać stężenie końcowe 1 µM.
- Inkubować komórki przez 2 h w inkubatorze.
3. Fixacja i permeabilizacja komórek
- Przygotować płytkę 24-dołkową z zimnym metanolem oraz płytkę 6-dołkową z zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4). Przechowywać je w lodzie.
- Każde szkiełko nakrywkowe wyjąć pęsetą, dwukrotnie przemyć w PBS, a następnie inkubować przez 6 min w metanolu.
4. Blokowanie komórek
- Przemyć każde szkiełko nakrywkowe dwukrotnie w PBS, a następnie inkubować przez 1 h w 10% płodowej surowicy bydlęcej w PBS (roztwór blokujący).
UWAGA: Na tym etapie procedurę można przerwać. Szkiełka nakrywkowe można przechowywać przez noc w lodówce w roztworze blokującym, a protokół kontynuować następnego dnia.
5. Inkubacja szkiełek nakrywkowych z przeciwciałem pierwszorzędowym
- Przygotować roztwór przeciwciała anty-LC3 w stężeniu 1:1 000 w roztworze blokującym i przechowywać go w lodzie.
- Na pokrywie płytki wielodobowej położyć kawałek laboratoryjnej folii uszczelniającej.
- Na folię uszczelniającą nanieść jedną kroplę (25 µL) roztworu anty-LC3 na każde szkiełko nakrywkowe.
- Za pomocą pęsety pobrać każde szkiełko nakrywkowe i położyć je na kropli przeciwciała pierwszorzędowego, dbając o to, aby strona z komórkami stykała się z roztworem.
- Przygotować komorę wilgotnościową, umieszczając wilgotny kawałek papieru w plastikowym pudełku o płaskim dnie.
- Umieścić płytkę wielodobową w komorze wilgotnościowej, przykryć ją folią i inkubować przez noc w lodówce.
6. Inkubacja szkiełek podstawowych z przeciwciałem wtórnym
- Wyjmij płytkę wielodołkową z komory wilgotnościowej i umieść szkiełka nakrywki z powrotem w płytce.
- Przeprowadź trzy płukania buforem PBS.
- Przygotuj roztwór znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała antykróliczego w rozcieńczeniu 1:800 w roztworze blokującym i przechowuj go w lodzie, chroniąc przed światłem.
- Na pokrywce płytki wielodołkowej połóż fragment folii uszczelniającej.
- Na folię uszczelniającą nanieś jedną kroplę (25 µL) roztworu przeciwciała antykróliczego na każde szkiełko nakrywki.
- Za pomocą pęsety weź każde szkiełko nakrywki i połóż je na kropli przeciwciała pierwszorzędowego, dbając o to, aby strona z komórkami stykała się z roztworem.
- Inkubuj płytkę wielodołkową w komorze wilgotnościowej przez 2 h w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem.
7. Barwienie komórek 4′,6-diamidino-2-fenyloindolem (DAPI)
- Wyjmij płytkę wielodołkową z komory wilgotnościowej i umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem w płytce.
- Przeprowadź trzy płukania roztworem PBS.
- Przygotuj 300 nM roztwór DAPI w PBS (chroniąc go przed światłem).
- Inkubuj każde szkiełko nakrywkowe w roztworze DAPI przez 10 min.
- Przeprowadź trzy płukania roztworem PBS. Przechowuj płytkę wielodołkową w warunkach chroniących przed światłem.
8. Montaż
- Przygotuj dwa zlewki z wodą oraz arkusz papieru.
- Nanieś na szkiełko jedną kroplę (10 µL) roztworu adduktu alkoholu poliwinylowego-bis(trimetyloglinianu glinu)-1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanu (PVA-DABCO) na każde szkiełko nakrywkę.
UWAGA: PVA-DABCO przygotowuje się poprzez połączenie 0,25 M DABCO, 10% w/v PVA, 20% glicerolu oraz 50% Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) w wodzie ultraczystej. - Chwyć każdą nakrywkę pęsetą, przemyj ją w obu zlewkach z wodą, osusz za pomocą papieru, a następnie nałóż na kroplę PVA-DABCO (tak, aby komórki miały kontakt z roztworem).
- Pozostaw do wyschnięcia na noc, chroniąc przed światłem.
9. Obserwacja i akwizycja obrazów za pomocą mikroskopii konfokalnej
- Poddać szkiełka nakrywki obrazowaniu za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego, używając obiektywu o powiększeniu około 63x17.
- Wykonąć reprezentatywne zdjęcia znakowanych komórek.
10. Kwantyfikacja kropek LC3
- Przeciągnij i upuść każdy plik obrazu zawierający zarejestrowane kanały, np. w formacie ".czi", na ekran programu ImageJ (FIJI), aby go otworzyć. Kliknij Ok w oknie dialogowym i zamknij okno Console.
- Z karty Image wybierz Color > Split Channels.
- Zamknij obrazy odpowiadające kanałom innym niż obraz LC3.
- Z karty Image wybierz Adjust > Color Balance
- Przesuń suwak Maximum w lewo, aż obraz zostanie nasycony, aby zwizualizować kontury komórek.
- Obrysuj komórkę za pomocą narzędzia Freehand Selection.
- Kliknij przycisk Reset, aby zresetować ustawienia kolorów.
- Z karty Edit wybierz Cut, aby wyciąć zaznaczony element.
- Zamknij obraz bez zapisywania go.
- Z karty Edit wybierz Paste.
- W menu Analyze wybierz narzędzie 3D Objects Counter.
- Ustaw próg (threshold). W przykładzie przedstawionym w niniejszym badaniu próg został ustawiony na 2,000.
- Ustaw filtr wielkości (size filter). W niniejszym badaniu został on ustawiony w przedziale od 50 do 500.
- Upewnij się, że pola Objects oraz Summary są zaznaczone.
- Kliknij Ok. Liczba kropek zostanie opisana jako Objects Detected w sekcji Summary.
Rysunek 1: Schemat procedury immunofluorescencji LC3. Schemat przedstawiający ogólny protokół immunofluorescencji LC3. Rysunek utworzony za pomocą BioRender.com. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Niniejszy protokół opisuje przeprowadzenie immunofluoroscencji LC3 w liniach komórkowych trzustki w celu określenia poziomu autofagii w różnych warunkach. Wynikiem tego eksperymentu było uzyskanie obrazów komórkowych z kanałów czerwonego i niebieskiego, odpowiadających odpowiednio LC3 i DAPI. Obrazy LC3 wskazują rozkład komórkowy tego białka, natomiast DAPI pokazuje lokalizację jąder komórkowych. Rysunek 2A przedstawia reprezentatywny obraz immunofluoroscencji LC3 oraz obraz złożony z barwie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda opisana w tym protokole pozwala na wizualizację endogennego rozkładu LC3 w komórce i ilościowe określenie poziomów autofagicznych w różnych warunkach. Inna podobna metoda stosowana do analizy rozkładu LC3 i określania aktywacji autofagii obejmuje transfekcję LC3 znakowaną fluorescencją (taką jak RFP-LC3)19. Transfekcja RFP-LC3 ma tę zaletę, że nie wymaga fiksacji (co pozwala na zastosowanie tej metody w obrazowaniu żywych komórek20), jest tańsza i nie zależy od reakt...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z Uniwersytetu w Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), Narodowej Rady Badań Naukowych i Technologii (CONICET) (2021-2023 GI− 11220200101549CO; oraz PUE 22920170100033) oraz Narodowej Agencji Promocji Nauki i Technologii (PICT 2019-01664).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| Szkiełka nakrywkowe okrągłe 12 mm | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Well- Płytka do hodowli komórkowych | Sorfa | 220300 | |
| Etanol absolutny | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Oślica anty-królicza IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy | Zeiss | LSM 800 | |
| Deksametazon | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Surowica bydlęca | płodu NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Technologia | sygnalizacji komórkowej | 3868S | |
| Metanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (laboratoryjna folia uszczelniająca) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Pen-Strep Solution | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| Trypsyna EDTA | Gibco | 11570626 |
Bibliografia
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146(2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
- Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
- Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. Digesting the expanding mechanisms of autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).
- Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. LC3 and autophagy. Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
- Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094(2021).
- Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
- Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. Pancreatic cancer. Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).
- Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
- Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411(2020).
- Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
- Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1(2021).
- Segeritz, C. -P., Vallier, L. Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , Academic Press. Cambridge, MA. 151-172 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).
- Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
- Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
- Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484(2013).
- Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
- Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
- Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and measuring autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865(2017).
- Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504(2021).
- Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
- Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305(2020).
- Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
- Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
